KR20220036254A - 돌단풍(Aceriphyllum rossii) 유래 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 또는 그의 유도체를 포함하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
돌단풍(Aceriphyllum rossii) 유래 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 또는 그의 유도체를 포함하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 또는 그의 유도체를 포함하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로 보다 구체적으로는, 돌단풍(Aceriphyllum rossii) 유래의 3α-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산(3α-hydroxyolean-12-en-27-oic acid, AR-3) 또는 아세리필릭산(aceriphyllic acid A, AR-5)를 포함하며, 파골 세포의 형성 또는 골 손실을 억제함으로써 골 용해성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 돌단풍(Aceriphyllum rossii) 유래 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 또는 그의 유도체를 포함하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 3α-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산(3α-hydroxyolean-12-en-27-oic acid, AR-3) 및 아세리필릭산(aceriphyllic acid A, AR-5)을 포함하는 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산을 포함하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
뼈는 뼈 리모델링으로 알려진 과정인 파골 세포 및 조골 세포 활동의 균형을 통하여 구조와 기능을 유지한다 (Hadjidakis, D.J. 등, 2006; Raggatt, L.J. 등, 2010). 파골 세포는 골수의 조혈 전구체로부터 유래되고 단핵구 파골 세포 전구체 세포의 분화를 통해 형성된다. 파골 세포는 신체에서 뼈를 흡수할 수 있는 유일한 세포로, 뼈 표면에서 여러 효소의 분비를 통해 뼈 매트릭스를 분해할 수 있다. 그러나 과도한 파골 세포 활성은 뼈 손실을 유발하여 류마티스 관절염, 종양의 뼈 전이, 골다공증 및 Paget's 질환과 같은 수많은 병리학적 뼈 질환을 유발한다.
파골 세포의 분화는 두 가지 중요한 사이토카인인 대식세포 콜로니 자극 인자(Macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)와 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-Β ligand)에 의해 조절된다 (Suda, T. 등, 2003). M-CSF는 초기 대식세포/파골 세포 전구체의 생존 및 증식을 매개하고 RANK (Receptor activator of nuclear factor kappa-Β) 발현을 유도한다. 한편, RANKL은 이들 전구체의 세포막 RANK 수용체와의 상호 작용 과정을 통해 파골 세포 생성하는 데에 필수적이다. RANKL과 RANK의 결합은 TRAF6 (TNF-receptor-associated factor 6)와 함께 MAPK(Mitogen-activated protein kinase) 및 NF-κB (nuclear factor-κB)와 같은 다운스트림 신호 전달 분자의 활성화를 초래하여 c-Fos와 NFATc1을 활성화시킨다 (Lomaga, M.A. 등, 1999). NFATc1의 활성화는 MMP-9 (matrix metallopeptidase-9), OSCAR (osteoclast-related receptor), TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 및 DC-STAMP (dendritic cell-specific transmembrane protein)를 포함하는 파골세포 형성과 기능에 중요한 다양한 파골 유전자의 발현을 직접적으로 제어한다 (Boyle, W.J. 등, 2003).
한편, 천연물은 신약 발견의 훌륭한 원천으로 활용되어왔다. 천연물은 사람의 질병을 치료하기 위한 약물로 직접 이용되거나 신약개발의 귀중한 역할을 할 수 있다 (Koehn, F.E. 등, 2005). 트리테르펜은 가장 흥미로운 천연물 중 하나로, 특히 펜타사이클릭 트리테르펜은 인간의 건강에 유익하여 전 세계적으로 식이 보충제 또는 치료제로 판매되고 있으며 많은 관심을 받고 있다 (Muffler, K. 등, 2011).
돌단풍(Aceriphyllum rossii)으로부터 여러 유효한 트리테르펜이 분리되었다. 돌단풍은 한국 고유종으로, 한국에서 계곡을 따라 축축한 암석에서 자라는 다년초이며, 어린 잎과 줄기는 나물로 사용되어왔다. 이전 연구에서 돌단풍에서 여러 아실-CoA와 함께 트리테르펜 및 플라보놀 배당체, 콜레스테롤 아실-트랜스퍼라제 억제 및 항산화 활성이 보고되었다 (Han, J. T. 등, 2002, 2004). 또한, Le Thi Kim Van 등은 돌단풍으로부터 분리한 올레안 타입의 트리테르페노이드가 유방암 세포주, 폐암 세포주에서 세포독성을 나타낸다고 보고하였다 (Le Thi Kim Van 등, 2009).
본 발명자그룹은 천연물에서 파골 세포 형성을 막을 수 있는 새로운 유형의 화학 물질을 찾은 결과, 범의귀과의 돌단풍(Aceriphyllum rossii Engler)에서 유래된 화합물이 RANKL-유도 파골세포 형성을 억제하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
종래선행기술인 한국공개특허 제1020200033241호에는 한속단 및 참당귀의 복합 추출물 분획물을 유효 성분으로 포함하는 항산화, 항염증 또는 파골세포 분화 억제용 조성물 및 관절염 (arthritis) 치료용 조성물이 기재되어 있으나, 본 발명의 돌단풍(Aceriphyllum rossii) 유래 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산을 포함하는 파골 세포 형성 또는 뼈 손실 억제용 약학 조성물과는 차이가 있다.
한국등록특허 제1739838호에는 마전자(馬錢子, nux vomica), 산수유(Cornus officinalis)에 많이 함유되어 있는 천연 유래의 단일화합물인 로가닌을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제용 시약 조성물이 기재되어 있으나, 역시 본 발명의 구성과는 상이하다.
Hadjidakis, D.J.; Androulakis, I.I. Bone remodeling. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006, 1092, 385-396.
Raggatt, L.J.; Partridge, N.C. Cellular and molecular mechanisms of bone remodeling. J. Biol. Chem. 2010, 285, 25103-25108.
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Lomaga, M.A.; Yeh, W.C.; Sarosi, I.; Duncan, G.S.; Furlonger, C.; Ho, A.; Morony, S.; Capparelli, C.; Van, G.; Kaufman, S.; van der Heiden, A.; Itie, A.; Wakeham, A.; Khoo, W.; Sasaki, T.; Cao, Z.; Penninger, J.M.; Paige, C.J.; Lacey, D.L.; Dunstan, C.R.; Boyle, W.J.; Goeddel, D.V.; Mak, T.W. TRAF6 deficiency results in osteopetrosis and defective interleukin-1, CD40, and LPS signaling. Genes Dev. 1999, 13,1015-1024.
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Muffler, K.; Leipold, D.; Scheller, M.C.; Haas, C.; Steingroewer, J.; Bley, T.; Neuhaus, H.E.; Mirata, M.A.; Schrader, J.; Ulber, R. Biotransformation of triterpenes. Process Biochem. 2011, 46, 1-15.
Han, J. T.; Kim, H. Y.; Park, Y. D.; Lee, Y. H.; Lee, K. R.; Kwon, B. M. Aceriphyllic acid A, A new ACAT inhibitory triterpenoid, from Aceriphyllum rossii., Planta Med. 2002, 68, 558-561.
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Le Thi Kim Van, Tran Manh Hung, Phuong Thien Thuong, Tran Minh Ngoc, Jin Cheol Kim, Han-Su Jang, Xing Fu Cai, Sei Ryang Oh, Byung-Sun Min, Mi Hee Woo, Jae Sue Choi, Hyeong Kyu Lee, and KiHwan Bea, Oleanane-Type Triterpenoids from Aceriphyllum rossii and Their Cytotoxic Activity, J. Nat. Prod. 2009, 72, 1419-1423.
IkSoo LEE, Jae Kuk YOO, MinKyun NA, Byung Sun MIN, JongPill LEE, Bong Sik YUN, WenYi JIN, HongJin KIM, UiJung YOUN, Quan Cheng CHEN, Kyung Sik SONG, Cytotoxicity of Triterpenes Isolated from Aceriphyllum rossii. (2007), CHEMICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN, 55(9), 1376-1378.
본 발명의 목적은 돌단풍(Aceriphyllum rossii) 유래 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 또는 그의 유도체를 포함하는 파골 세포 형성 또는 뼈 손실 억제용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 또는 그의 유도체를 포함하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
보다 구체적으로 본 발명은 돌단풍(Aceriphyllum rossii) 유래의 3α-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산(3α-hydroxyolean-12-en-27-oic acid, AR-3) 또는 아세리필릭산 A(aceriphyllic acid A, AR-5)를 포함하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 골 용해성 질환은 류마티스성 관절염, 골다공증, 골조소증, 인공관절에 의한 골용해, 암세포에 의한 골용해성 전이, 골수성 백혈병에 의한 골용해성 병변, 골감소, 골손실 및 골용해성 치주질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상일 수 있다. 상기 골 용해는 골소주 개수(trabecular number) 및 골 체적비(BS/BV)가 감소하거나, 골소주 거리(trabecular space)가 증가하는 것일 수 있으며, 본 발명의 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 이러한 골소주 개수, 골 체적비(BS/BV) 감소를 억제하거나, 골소주 거리(trabecular space)의 증가를 억제시킴으로써 골 용해성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 파골 세포 수를 감소시키거나, 파골 세포의 필라멘트 액틴 링 형성을 억제하여 파골 세포의 성숙을 저해하거나, 골 재흡수 피트 형성을 억제하여 또는 파골 세포 형성을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 c-Src, CtsK 및 c-Fos의 발현을 억제하는 것일 수 있다. Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src(c-Src) 및 Cathepsin K(CtsK) 는 파골 세포 마커로 알려져 있으며, RANKL 처리에 의하여 발현이 유도된다. 또한 RANKL은 초기 신호 전달과정에서 NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로를 포함하며, MAPK 신호 전달 경로의 활성화는 AP-1 전사 인자를 유도한다. c-Jun 및 c-Fos 전사 인자의 이종이량체로, AR-5는 RANKL-유도 c-Fos 발현을 억제하여 RANKL-유도된 초기 신호전달을 억제할 수 있다.
본 발명의 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 NFATc1 활성을 억제할 수 있다. Nuclear Factor of Activated T Cells 1 (NFATc1)는 파골 세포 형성(osteoclastogenesis) 과정의 주요 전사 인자로, NFATc1의 활성화는 파골 세포 형성 과정에서 재흡수 피트(resorption pit) 형성에 관여하는 CtsK, MMP-9, OSCAR, TRAP 및 DC-STAMP를 포함한 수많은 골 유전자 유전자의 유도를 직접적으로 조절하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 NFATc1 활성을 억제할 수 있으며, TRAP, MMP-9, CtsK 및 DC-STAMP를 포함하는 NFATc1 표적 유전자의 발현 수준을 유의하게 감소시켜 파골 세포 형성을 저해할 수 있다.
본 발명의 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 파골 세포 전구체의 이동을 억제하는 것을 특징으로 하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 파골 세포 전구체의 이동은 또한 파골 세포 생성의 주요 과정 중 하나로, M-CSF 또는 RANK 리간드와 같은 사이토카인 자극에 의하여 파골세포 전구체 단핵구는 골표면으로 이동하여 부착하게 되고, 이들은 서로 융합하여 거대 세포로 분화하면서 골 재흡수과정을 중개한다. 본 발명의 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 이러한 파골 세포 전구체의 이동을 억제함으로써 골 용해성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명은 또한 돌단풍(Aceriphyllum rossii) 유래 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 또는 그의 유도체를 포함하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 돌단풍(Aceriphyllum rossii) 은 한국 고유종으로 축축한 암석 위에서 자라는 다년생 초본이다. 돌단풍 전체 식물을 물, C1~4의 저급 알코올, 아세톤(acetone), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 디에틸아세테이트(diethyl acetate), 디에틸에테르(diethyl ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform) 및 헥산(hexane)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 C1~4의 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등일 수 있다.
상기 추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 상기한 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 원심분리, 여과, 농축 후 동결 건조하여 냉장실에 보관하면서 그대로 사용할 수도 있고, 상기 1차 추출물을 감압 증류 및 동결건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한, 상기 1차 추출물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel columnchromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻고, 이를 정제하여 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산(3α-hydroxyolean-12-en-27-oic acid, AR-3) 또는 그의 유도체를 얻을 수 있다.
본 발명의 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 약학 조성물로 제조될 수 있다. 상기 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 약학 조성물은 전체 약학 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~50중량%, 더 바람직하게는 0.001~40중량%, 가장 바람직하게는 0.001~30중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 액제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 감미제, 산미제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 가용화된 데커시놀에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제, 산미제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 500㎎/㎏/일의 범위이다. 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이며, 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 및 피부 도포에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 3α-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산(3α-hydroxyolean-12-en-27-oic acid, AR-3) 또는 아세리필릭산 A(aceriphyllic acid A, AR-5)는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
본 발명은 3α-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산(3α-hydroxyolean-12-en-27-oic acid, AR-3) 또는 아세리필릭산 A(aceriphyllic acid A, AR-5)를 포함하는 골 용해성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품은 3α-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 또는 아세리필릭산 A가 전체 식품 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~50중량%, 더 바람직하게는 0.001~30중량%, 가장 바람직하게는 0.001~10중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
본 발명은 돌단풍(Aceriphyllum rossii) 유래 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 또는 그의 유도체를 포함하는 파골 세포 형성 또는 뼈 손실 억제용 약학 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 3α-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산(3α-hydroxyolean-12-en-27-oic acid, AR-3) 또는 아세리필릭산 A(aceriphyllic acid A, AR-5)가 파골 세포 형성을 억제하고 뼈 손실을 억제하는 것을 확인하였으며, 이를 토대로 보다 안전하고 효율적인 골 용해성 골 질환의 예방 또는 치료 조성물을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 돌단풍(A. rossii)으로부터 분리된 5종의 olean-12-en-27-oic acid 또는 그의 유도체의 화학구조이다.
도 2는 RANKL-유도 파골세포형성에 대한 olean-12-en-27-oic acid 또는 그의 유도체의 효과를 나타낸 결과이다.
도 3은 BMM에서 RANKL-유도 파골세포형성이 각 농도의 AR-3 (A) 및 AR-5 (B)에 의하여 억제되는 것을 나타낸 것이다.
도 4는 BMM에서 각 농도의 AR-3 (A) 및 AR-5 (B)에 의하여 RANKL-유도 c-Src 및 CtsK 증가를 억제하는 것을 나타낸 c-Src 및 CtsK의 웨스턴 블롯팅 사진 및 이를 튜불린으로 표준화한 결과이다. (C)는 AR-3 및 AR-5 처리가 BMM의 세포생존률에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5는 BMM에서 RANKL-유도 액틴링 형성이 각 농도의 AR-3 (A) 및 AR-5 (B)에 의하여 억제되는 것을 나타낸 것이다.
도 6은 RANKL-처리된 BMM에서 골재흡수 피트 영역이 각 농도의 AR-3 (A) 및 AR-5 (B)에 의하여 감소하는 것을 나타낸 것이다.
도 7은 AR-3 및 AR-5 처리가 생체 내 LPS로 인한 골 손실을 억제하는 것을 나타낸 것이다. LPS 주사 9 일 후에 마우스의 대퇴골의 3 차원 이미지이다 (스케일 막대 : 1mm).
도 8은 AR-3 및 AR-5 처리가 LPS 처리 마우스 대퇴골의 섬유주 수 (Tb. N), 섬유주간 공간 (Tb. Sp) 및 섬유주 뼈 부피/조직 부피 (BS/TV)에 미친 영향을 나타낸 것이다.
도 9는 도 7 및 8의 마우스 대퇴골을 고정, 탈석회화하고 절편하여 TRAP (100x)로 염색한 것이다.
도 10은 AR-3 (A) 및 AR-5 (B)가 RANKL-유도 NFATc1 활성화 및 표적 유전자 발현을 억제하는 것을 나타낸 NFATc1의 웨스턴 블롯팅 사진 및 이를 튜불린으로 표준화한 결과이다.
도 11은 BMM에서 RANKL-유도 TRAP, MMP-9, DC-STAMP 및 CtsK의 mRNA 발현 수준에 AR-3 (A) 및 AR-5 (B)가 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 12는 RANKL 및 M-CSF로 자극된 BMM 세포를 고정하고 항-NFATc1 항체로 염색한 다음 Alexa Fluor 488- 접합 이차 항체를 사용했습니다. DAPI를 사용하여 핵을 염색한 사진이다.
도 13은 RANKL 자극 후, 1, 3, 5일에 각각 AR-5을 처리하였을 때 파골세포형성억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 14는 BMM의 RANKL 유도 이동에 대한 AR-5 (0, 1, 3, 10 μM)의 효과를 나타낸 것이다.
도 15는 AR-5가 RAW264.7 세포에서 RANKL로 유도된 p-ERK, p-JNK 및 p-p38 MAPK의 발현에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯 및 이를 정량화한 그래프이다.
도 16은 AR-5가 RAW264.7 세포에서 RANKL로 유도된 c-Fos (A) 및 IκBα (B)의 발현에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯 및 이를 정량화한 그래프이다.
도 2는 RANKL-유도 파골세포형성에 대한 olean-12-en-27-oic acid 또는 그의 유도체의 효과를 나타낸 결과이다.
도 3은 BMM에서 RANKL-유도 파골세포형성이 각 농도의 AR-3 (A) 및 AR-5 (B)에 의하여 억제되는 것을 나타낸 것이다.
도 4는 BMM에서 각 농도의 AR-3 (A) 및 AR-5 (B)에 의하여 RANKL-유도 c-Src 및 CtsK 증가를 억제하는 것을 나타낸 c-Src 및 CtsK의 웨스턴 블롯팅 사진 및 이를 튜불린으로 표준화한 결과이다. (C)는 AR-3 및 AR-5 처리가 BMM의 세포생존률에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5는 BMM에서 RANKL-유도 액틴링 형성이 각 농도의 AR-3 (A) 및 AR-5 (B)에 의하여 억제되는 것을 나타낸 것이다.
도 6은 RANKL-처리된 BMM에서 골재흡수 피트 영역이 각 농도의 AR-3 (A) 및 AR-5 (B)에 의하여 감소하는 것을 나타낸 것이다.
도 7은 AR-3 및 AR-5 처리가 생체 내 LPS로 인한 골 손실을 억제하는 것을 나타낸 것이다. LPS 주사 9 일 후에 마우스의 대퇴골의 3 차원 이미지이다 (스케일 막대 : 1mm).
도 8은 AR-3 및 AR-5 처리가 LPS 처리 마우스 대퇴골의 섬유주 수 (Tb. N), 섬유주간 공간 (Tb. Sp) 및 섬유주 뼈 부피/조직 부피 (BS/TV)에 미친 영향을 나타낸 것이다.
도 9는 도 7 및 8의 마우스 대퇴골을 고정, 탈석회화하고 절편하여 TRAP (100x)로 염색한 것이다.
도 10은 AR-3 (A) 및 AR-5 (B)가 RANKL-유도 NFATc1 활성화 및 표적 유전자 발현을 억제하는 것을 나타낸 NFATc1의 웨스턴 블롯팅 사진 및 이를 튜불린으로 표준화한 결과이다.
도 11은 BMM에서 RANKL-유도 TRAP, MMP-9, DC-STAMP 및 CtsK의 mRNA 발현 수준에 AR-3 (A) 및 AR-5 (B)가 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 12는 RANKL 및 M-CSF로 자극된 BMM 세포를 고정하고 항-NFATc1 항체로 염색한 다음 Alexa Fluor 488- 접합 이차 항체를 사용했습니다. DAPI를 사용하여 핵을 염색한 사진이다.
도 13은 RANKL 자극 후, 1, 3, 5일에 각각 AR-5을 처리하였을 때 파골세포형성억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 14는 BMM의 RANKL 유도 이동에 대한 AR-5 (0, 1, 3, 10 μM)의 효과를 나타낸 것이다.
도 15는 AR-5가 RAW264.7 세포에서 RANKL로 유도된 p-ERK, p-JNK 및 p-p38 MAPK의 발현에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯 및 이를 정량화한 그래프이다.
도 16은 AR-5가 RAW264.7 세포에서 RANKL로 유도된 c-Fos (A) 및 IκBα (B)의 발현에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯 및 이를 정량화한 그래프이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
1. 재료 및 방법
1.1. 화학 물질, 시약 및 항체
항-NFATc1, 항-c-Fos, 항-p38, 항-포스포-p38, 항-JNK, 항-포스포-JNK, 항-ERK, 항-포스포-ERK 및 항-α-튜불린에 대한 항체는 셀 시그널링 테크놀로지 (Danvers, MA, USA)로부터 입수하였다. 항-β-액틴, 항-CtsK 및 항-c-Src에 대한 항체는 산타 크루즈 바이오 테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology) (Cruz, CA, USA)로부터 입수하였다. Alexa Fluor 488 염소 항-토끼 이차 항체 및 FITC (플루오레세인 이소티오시아네이트)-접합된 팔로이딘은 Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. M-CSF는 Prospec (East Brunswick, NJ, USA)으로부터 입수하였다. RANKL은 R&D 시스템 (Minneapolis, MN, USA)으로부터 입수하였다. DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) 및 케르세틴은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 입수 하였다. AR-1, AR-2, AR-3, AR-4 및 AR-5는 LEE 등의 방법(2007)으로 돌단풍(A. rossii)에서 분리하였으며, 그 화학 구조를 도 1에 도시하였다.
1.2. 세포 배양
RAW 264.7 세포를 10 % 열-불활성화 FBS (Cambrex, Charles City, IA, USA) 및 페니실린(100 units/mL)-스트렙토마이신 (100 μg/mL)이 보충된 DMEM (Hyclone, Logan, USA, UT)에서 배양하였다. 골수 세포는 6 주령 수컷 ICR 마우스 (DBL, 충북 음성, Korea)의 대퇴골 및 경골로부터 분리되었다. 간략하게 설명하면, 골수 세포를 10 % FBS, 스트렙토마이신 (100 μg / mL), 페니실린 (100 unit/mL) 및 M-CSF (10 ng/mL)를 함유하는 α-MEM에서 5% CO2의 가습된 배양기에서 37℃로 배양하였다. 부유 세포를 M-CSF(30 ng/mL)로 3 일 동안 배양 한 후, 부착성 골수 유래 대식세포 (BMM)를 추가 실험에 사용하였다.
1.3. 시험관 내 파골세포 생성 분석
시험관 내 파골 세포 생성을 분석하였다. BMM을 RANKL (100 ng/mL) 및 M-CSF (30 ng/mL)의 존재하에 시험 화합물과 함께 배양하였다. 화합물 및 배양 배지를 2 일마다 6 일 동안 교환하였다. RAW 264.7 세포를 RANKL (100 ng/mL)의 존재하에 시험 화합물과 함께 배양하였다. 화합물 및 배양 배지를 2 일마다 총 4 일 동안 교체하였다. 배양 종료 시, 세포를 고정시키고, 투과시킨 후, 산 포스파타제 백혈구 키트 (Sigma-Aldrich)로 염색하였다. TRAP-양성 다핵 세포 (> 5 핵)는 파골 세포로 분류하였다.
1.4. 세포 생존력 측정
BMM에 대한 시험 화합물의 세포 독성 효과는 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)-기반 검정을 사용하여 평가하였다. 간단히 설명하면, 먼저 BMM을 5×105 cell/mL의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하고 30 ng/mL M-CSF의 존재하에 시험 화합물을 처리하였다. 72 시간 동안 배양 한 후, MTT (0.5 mg/mL)를 첨가하고 3 시간 동안 추가로 배양하였다. 불용성 포마잔 생성물을 디메틸 설폭 사이드에 용해시키고 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
1.5. 뼈 흡수 분석
뼈 재흡수 분석을 실시하였다. BMM을 OsteoAssay Surface 96-웰 플레이트 (Corning Incorporated, Corning, NY, USA)에 5 × 105 cell/mL의 밀도로 시딩하고 상이한 농도의 AR-3 및 AR-5의 존재하에 M-CSF (30 ng/mL) 및 RANKL (100 ng/mL)로 자극하였다. 화합물 및 배양 배지를 2 일마다 교체하였다. 7 일 후, 세포를 웰로부터 완전히 제거하고 플레이트를 증류수를 사용하여 완전히 세척하였다. 흡수 피트를 모델 H550L 현미경 (Nikon Corporation, Tokyo, Japan)을 사용하여 캡쳐하고 ImageJ 소프트웨어 (Java 1.6.0_20 (64 비트); NIH, Bethesda, MD, USA)로 정량화 하였다.
1.6.
액틴
링 형성 분석
BMM (106 cell/mL)을 커버 유리 상에 시딩하고, 상이한 농도의 AR-3 및 AR-5의 존재하에 7 일 동안 M-CSF (30 ng/mL) 및 RANKL (100 ng/mL)로 자극하였다. 화합물 및 배양 배지를 2 일마다 교체하였다. 세포를 투과시키고, FITC-팔로이드로 염색한 후, 실장하였다. 외부 아르곤 레이저, HeNe 레이저 그린 및 HeNe 레이저 레드가 장착된 인버티드 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (OLYMPUS FV1000)을 사용하여 이미지를 캡처했다. 이미지는 UPLSAPO 60X NA1.35 오일 침지 대물 렌즈 (OLYMPUS)를 사용하여 콜로니 중앙부에서 캡처하였다.
1.7. 세포 이동 분석
상처 치유 이동 분석을 위해, BMM을 6- 웰 플레이트에서 배양하고 10 μL 마이크로 피펫 팁을 사용하여 스크래칭함으로써 합류 단층에서 선형 상처를 생성하였다. 배지로 3 회 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거한 후, 상이한 농도의 AR-5의 존재하에 M-CSF (30 ng / mL) 및 RANKL (100 ng / mL)로 세포를 자극하였다. 5 시간 인큐베이션 후, 세포를 고정시키고 상처 가장자리 폐쇄를 현미경으로 측정하고, 이동된 세포의 수를 비히클로만 처리된 대조군으로 표준화하였다.
1.8.
웨스턴
블롯
분석
전체 세포 용해물의 제조를 위해, 프로테아제 억제제 칵테일의 존재하에 세포를 용해 완충제 (50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 1 % Nonidet P-40, 1 mM EDTA 및 150 mM NaCl)에서 용해시켰다 (시그마 알드리치). 용해물을 소듐 도데실 설페이트-폴리 아크릴 아미드 겔에서 전기영동시킨 후 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 웨스턴 블롯은 1 차 항체 (1 : 1,000 희석)와 함께 밤새 인큐베이션하였고, 2 차 항체(홀스래디시 퍼옥시다제 (1 : 2,000 희석)에 접합된 항-토끼 또는 항-마우스) 를 사용하여 강화된 화학 발광 시스템 (ThermoFisher Scientific)으로 신호를 가시화하였다. (미국 일리노이 록퍼드). 밴드 강도는 Image J 소프트웨어 (NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량화되었다.
1.9. 면역 형광 및 공 초점 현미경
세포를 PBS에서 1 회 세척하고, 실온에서 20 분 동안 신선한 4 % 파라 포름 알데히드에 고정시킨 다음, 0.5 % TritonX-100에 투과시켰다. 세포를 1 % 염소 혈청을 함유하는 PBS에 배양하여 비특이적 부위를 차단시킨 후, 항 -NFATc1 (1 : 200 희석)에 대한 항체를 세포와 반응시켰다. PBS로 4 회 세척 한 후, 세포를 실온에서 4 시간 동안 Alexa Fluor 488 염소 항-토끼 이차 항체 (1 : 250 희석)와 배양한 후, 세척하고 DAPI로 염색하였다. 공초점 이미지는 외부 아르곤 레이저, HeNe 레이저 그린 및 HeNe 레이저 레드가 장착된 OLYMPUS FV1000 컨버티드 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 얻었다. 이미지는 UPLSAPO 60X NA1.35 오일 침지 대물 렌즈 (OLYMPUS)를 사용하여 콜로니 중앙부에서 캡처하였다.
1.10.
역전사
qPCR
분석
세포를 수집하고 제조업체의 프로토콜 (Qiagen, Valencia, CA, USA)에 따라 RNeasy Mini 키트를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 제 1 가닥 cDNA는 1㎍의 총 RNA로부터 제조되었다. TOPreal qPCR 2X PreMIX (SYBR Green; Enzynomics, Inc., Daejeon, Korea) 및 Rotor-Gene Q real-time PCR cycler (Qiagen)를 사용하여 실시간 qPCR 분석을 수행하였다. 사용된 프라이머는 CtsK, 5'-GAC ACC CAG TGG GAG CTA TG-3 '(센스) 및 5'-AGA GGC CTC CAG GTT ATG GG-3'(안티센스); TRAP, 5'-ACT TGC GAC CAT TGT TAG CC-3 '(센스) 및 5'-TTC GTT GAT GTC GCA CAG AG-3'(안티센스); MMP-9, 5'-TGG GCA AGC AGT ACT CTT CC-3 '(센스) 및 5'-AAC AGG CTG TAC CCT TGG TC-3'(안티센스); β-actin, 5'-GGG AAA TCG TGC GTG ACA TCA AAG-3 '(센스) 및 5'-AAC CGC TCC TTG CCA ATA GT-3'(안티센스) 이었다. DC-STAMP 용 프라이머는 오리진 (Origene) (미국 메릴랜드 주 락빌 소재)에서 구입하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 10 분, 95 ℃에서 10 초, 60 ℃에서 15 초 및 72 ℃에서 20 초 사이클을 40 회 반복하였다. 모든 반응을 3 회 수행하고 β-액틴을 내부 대조군으로 사용하였다. 2-ΔΔCq 방법을 사용하여 상대 유전자 발현을 결정하였다.
1.11. 동물 실험
모든 실험 프로토콜은 강원 대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다 (IACUC 승인 번호 KW-180119-3). 6 주령의 ICR-마우스를 대조군 비히클 처리, 비히클 + LPS 처리, AR-3 + LPS 처리 및 AR-5 + LPS 처리 그룹 (n = 4/그룹)으로 무작위로 나누었다. 첫번째 LPS (5 mg/kg) 주사 전, 1 시간 동안 마우스에 AR-3 (50 및 100 mg/kg, 옥수수 오일에 용해), AR-5 (20 및 50 mg/kg, 옥수수 오일에 용해) 또는 대조군 비히클 (옥수수 오일)을 경구 투여하였고, 이 후, 8일간 격일로 급이하였다. LPS는 2 일 및 6 일에 주사되었다. 마우스는 9 일째에 해부되었다. 마우스의 대퇴골을 수집하여 4 % 파라 포름알데히드에 고정시켰다. 각 마우스의 손상되지 않은 대퇴골 골간단 영역은 90μA의 전류, 45 kVp의 소스 전압 및 7 μm의 등방성 분해능을 갖는 NFR-Polaris-S160 장치 (나노 포커스 레이; 한국 기초 과학 연구소 춘천 센터)를 사용하여 고해상도 마이크로 CT 분석에 의해 평가되었다. 대퇴 스캔은 성장 플레이트로부터 2 mm 이상, 스캔 당 총 350 개의 섹션으로 수행되었다. 3 차원 재구성 후, INFINITT-Xelis 소프트웨어를 사용하여 정량 분석을 통해 골소주 갯수 (trabecular number; Tb.N), 골 미네랄 밀도 (BMD), 골소주 거리 (trabecular space; Tb.Sp) 및 골 체적비(Bone Surface/Bone Volume)를 검사하였다 (버전 1.7; INFINITT Healthcare co., Ltd., Seoul, Korea). 조직 학적 분석을 위해, 대퇴골을 하루에 4 % 파라 포름 알데히드 (Sigma)에 고정시키고, 3 주 동안 12 % EDTA로 석회를 제거하고, 파라핀을 주입하였다. 5μm 두께의 섹션을 준비하고 TRAP을 사용하여 염색하고 파골 세포 형성을 조사하였다.
1.12. 통계 분석
데이터는 평균 ± 표준 오차 (SE)로 표현되었다. SPSS 버전 14.0 (SPNN Inc., 미국 일리노이 주 시카고)을 사용하여 두 그룹 간의 차이를 조사하기 위해 일원 분산 분석 및 터키 검정에 의해 통계적 유의성을 평가하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
2. 결과
2.1. AR-3 및 AR-5의 RAW 264.7 세포에서
RANKL
-유도 파골 세포 형성 억제
천연 생성물로부터 신규한 항골 세포 형성 화합물을 확인하기 위해, 본 발명자들은 RAW 264.7 세포에서 A. rossii 로부터 단리된 5 개의 올린-12-en-27-oic 산 유도체의 항-파골 세포 형성 효과를 평가하였다. RANKL을 이용한 자극은 RAW 264.7 세포를 다핵성 TRAP 양성 파골 세포로 효율적으로 분화시켰다. AR-1, AR-2 및 AR-4에 대한 RAW 264.7 세포에서 TRAP-양성 다핵 파골 세포 수의 유의한 감소는 없었다. 그러나, AR-3 또는 AR-5로 RAW 264.7 세포를 처리하는 경우, 농도 의존적 방식으로 TRAP- 양성 다핵 파골 세포의 수가 감소하였다 (도 2).
2.2. AR-3 및 AR-5의 마우스
BMM에서
RANKL
-유도 파골 세포 형성 억제
AR-3 및 AR-5가 RANKL-유도 파골 세포 형성을 억제할 수 있음을 추가로 확인하기 위해, AR-3 및 AR-5가 1 차 배양 BMM에서 RANKL-유도 파골 세포를 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다. 마우스 BMM을 M-CSF 및 RANKL으로 자극한 결과, 전구체로부터 파골 세포의 분화가 유도되었다. 그러나, AR-3 또는 AR-5를 BMM에 처리하는 경우, 농도 의존적으로 TRAP-양성 다핵 파골 세포의 형성이 억제되었다 (도 3). AR-3 및 AR-5의 IC50 값은 각각 2.9±0.3 및 2.6±0.2 μM 이었다. 양성 화합물로는 RANKL에 의해 유발된 파골 세포 생성 억제제인 퀘르세틴이 사용되었다. 퀘르세틴의 IC50 값은 1.9±0.3 μM 로 TRAP-양성 다핵 파골 세포의 수를 감소시켰다.
Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src(c-Src) 및 Cathepsin K(CtsK) 는 파골 세포 마커로 RANKL 처리에 의하여 발현이 유도된다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 RANKL-유도된 c-Src 및 CtsK 발현에 AR-3 및 AR-5의 효과를 확인하였다. AR-3 또는 AR-5 처리는 농도 의존적 방식으로 RANKL-유도된 c-Src 및 CtsK 발현을 억제하였다 (도 4A, 4B).
다음으로, 본 발명자들은 AR-3 및 AR-5가 BMM에 대한 이들 세포의 세포 독성 효과로 인해 ARNK 및 AR-5가 RANKL-유도된 파골 세포 형성을 억제할 가능성을 결정하기 위해 BMM의 세포 생존력에 대한 AR-3 및 AR-5의 효과를 확인하였다. 그러나, 이들 화합물은 BMM의 세포 생존력을 감소시키지 않고 오히려 본 연구에서 사용된 농도에서 BMM의 세포 생존력을 증가시켰다 (도 4C). 종합적으로, 이들 결과는 2 개의 3-hydroxyolean-12-en-27-oic acid인 AR-3 및 AR-5가 BMM의 세포 생존력을 감소시키지 않으면서 항 파골 세포 생성 효과를 발휘할 수 있음을 시사한다.
2.3. AR-3 및 AR-5의 마우스
BMM에서
RANKL
-유도된 파골 세포 성숙 억제
AR-3 및 AR-5가 성숙한 파골 세포의 가장 명백한 특징인 필라멘트 액틴 링 형성을 억제할 수 있는지 여부를 결정하였다. RANKL 및 M-CSF에 의한 BMM의 자극은 FITC- 팔로이딘 염색에 의해 나타난 바와 같이 명확한 액틴-링 구조를 형성하였다. 그러나, AR-3 및 AR-5는 농도 의존적으로 액틴 링 구조의 크기 및 수를 상당히 감소시켰다 (도 5A, 5B). AR-3 및 AR-5가 성숙한 파골 세포의 RANKL- 유도된 파골 세포 성숙을 억제하는지 여부를 추가로 확인하기 위해, 재흡수 피트 형성 분석을 수행하였다. AR-3 및 AR-5의 3-hydroxyolean-12-en-27-oic acid는 농도에 따라 재흡수 피트의 밀도를 현저하게 감소시켰다 (도 6A, 6B). 이러한 결과는 AR-3 및 AR-5가 RANKL-유도된 파골 세포의 성숙을 억제하여 골 흡수 활성을 억제할 수 있음을 시사한다.
2.4. AR-3 및 AR-5의 생체 내
LPS
-유도 골 손실 억제
염증 유발 골 손실 마우스 모델을 사용하여 생체 내에서 파골 세포 형성 억제에 대한 AR-3 및 AR-5의 효과를 평가하였다. AR-3 또는 AR-5의 존재 및 부재하에 마우스를 각각 LPS로 처리하고 9 일 후, 대퇴골을 마이크로 CT로 검사하였다. 3 차원 분석 결과, LPS 투여가 대퇴골에서 현저한 소주골(trabecular bone) 손실을 야기한 것으로 밝혀졌다. 그러나, AR-3 또는 AR-5를 경구 투여한 경우, LPS-유도 된 골 손실이 상당히 억제되었다 (도 7). 도 8의 마이크로-CT 이미지 분석에서 보는 바와 같이, LPS 주사 후 골소주의 개수 (Tb.N) 및 골 체적비(BS/BV)의 감소는 AR-3 또는 AR-5 처리된 마우스에서 회복되었다. LPS-유도 골소주 거리(Tb.Sp)의 증가는 또한 용량-의존적 방식으로 AR-3 또는 AR-5 투여에 의해 감소되었다 (도 8). 또한, 조직학적 분석을 통해 LPS에 의해 증가된 TRAP-양성 파골 세포수가 AR-3 또는 AR-5 처리된 마우스에서 상당히 감소되는 것을 확인하였으며 (도 9), 이를 통해 AR-3 및 AR-5 가 생체 내에서 파골 세포 생성을 저해하는 것을 확인하였다.
2.5. AR-3 및 AR-5의
RANKL
-유도
NFATc1
활성화 억제
osteoclastogenesis의 주요 전사 인자인 Nuclear Factor of Activated T Cells 1 (NFATc1)의 활성화는 osteoclastogenesis 동안 재흡수 피트 형성에 관여하는 CtsK, MMP-9, OSCAR, TRAP 및 DC-STAMP를 포함한 수많은 골 유전자 유전자의 유도를 직접적으로 조절한다. 따라서, AR-3 및 AR-5가 NFATc1 및 그의 표적 유전자의 RANKL-유도된 발현을 억제하는지 여부를 조사하였다. 실험 결과, AR-3 및 AR-5는 NFATc1의 RANKL-유도된 발현 수준을 농도 의존적 방식으로 감소시키는 것을 확인하였다 (도 10A, 10B). 또한, 실시간 qPCR 분석은 AR-3 및 AR-5가 RANKL-유도된 파골 세포 형성 동안 농도 의존적으로 TRAP, MMP-9, CtsK 및 DC-STAMP를 포함하는 NFATc1 표적 유전자의 발현 수준을 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다 (도 11A, 11B). 면역 형광 분석은 또한 AR-5가 NFATc1의 RANKL-유도된 핵 전좌를 유의하게 억제함을 보여 주었다 (도 12). 이러한 결과는 AR-3 및 AR-5가 NFATc1 활성화 억제를 통해 RANKL-유도된 파골 세포 형성을 저해하는 것을 시사한다.
2.6. AR-5의 분화의 초기 및 후기 단계에서의
RANKL
-유도된 파골 세포 형성 및 이동 억제
본 발명자들은 AR-3 및 AR-5는 시험 관내 및 생체 내에서 유사한 정도로 RANKL-유도된 파골 세포 형성을 억제하는 것을 확인하고, AR-5의 RANKL-유도 파골 세포 형성 억제 기작을 추가로 조사하였다. AR-5가 파골 세포 형성의 초기 또는 후기 단계를 억제하는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 RANKL 자극 후 1 일부터 5 일까지 각각 다른 시간에 AR-5을 처리하여 RANKL-유도된 파골 세포 형성에 대한 효과를 조사 하였다. 도 13에서 보는 바와 같이, AR-5는 치료 1 일, 3 일 및 5 일에 RANKL-유도 파골 세포 형성 및 재흡수 피트 형성을 유의하게 감소시켰다. 이는 AR-5가 파골 세포 형성의 초기 및 후기 단계에서 RANKL-유도 파골 세포 형성을 억제함을 시사한다.
파골 세포 전구체의 이동은 또한 파골 세포 생성 동안 중요한 과정이다. 따라서, AR-5가 RANKL-유도된 BMM의 이동을 억제하는지 여부를 결정하였다. RANKL에 의한 BMM의 자극에 따라 이동된 세포의 수가 증가하였다. 그러나, AR-5는 농도 의존적으로 RANKL- 유도된 BMM의 이동을 유의하게 억제하였다 (도 14).
2.7. AR-5의
ERK
및
JNK
MAPK의
RANKL
-유도 활성화 억제
본 발명자들은 NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로를 포함하는 RANKL-유도된 초기 신호 전달에서의 AR-5의 효과를 조사하였다. RANKL 처리에 의해 ERK, p38 및 JNK MAPK의 인산화 수준이 증가되었다. 그러나, AR-5 전처리는 농도-의존적으로 ERK 및 JNK MAPK의 인산화 수준을 유의하게 감소시켰다 (도 15). 그러나, AR-5는 RANKL-유도된 p38 MAPK 인산화를 억제하지 않았다.
MAPK 신호 전달 경로의 활성화는 AP-1 전사 인자의 유도를 유발할 수 있으며, 이는 c-Jun 및 c-Fos 전사 인자의 이종이량체이다. 따라서, AR-5가 RANKL-유도 c-Fos 발현을 억제하는지 여부를 조사하였다. AR-5는 RANKL- 유도된 c-Fos 발현을 농도 의존적으로 억제하였다 (도 16A). 이와 대조적으로, AR-5는 IκBα 단백질의 RANKL-유도 분해를 억제하지 않았다 (도 16B). 이러한 결과는 AR-5가 NF-κB 활성에 의한 것이 아닌, MAPK/AP-1 신호 전달 경로를 억제함으로써 RANKL-유도 파골 세포 형성을 억제할 수 있음을 보여준다.
RANK/RANKL 신호 전달의 상승의 결과로 파골 세포의 과도한 활성은 류마티스 성 관절염 및 골다공증과 같은 골 용해성 뼈질환을 야기한다. 본 발명에서 발명자들은 돌단풍(A. rossii)으로부터 분리된 2 개의 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 유도체인 AR-3 및 AR-5가 시험 관내 RANKL-유도된 파골 세포 형성 및 기능을 억제하는 것 뿐만 아니라 마우스 모델에서 LPS- 유도된 골 손실을 억제하는 것을 확인함으로써 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 유도체가 골 용해성 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 확인하였다.
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제제예
1. 약학적 제제>
제제예
1-1. 정제의 제조
본 발명의 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 유도체, AR-3 또는 AR-5 200㎎을 락토즈 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄하여 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활성 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
제제예
1-2. 주사액제의 제조
본 발명의 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 유도체, AR-3 또는 AR-5 100㎎, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
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제제예
2. 건강기능식품의 제조>
제제예
2-1. 건강기능식품의 제조
본 발명의 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 유도체, AR-3 또는 AR-5 2g, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70㎍, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2㎍, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50㎍, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산 마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎, 염화마그네슘 24.8㎎을 섞어 과립으로 제조하였으나, 용도에 따라 다양한 제형으로 변형시켜 제조할 수 있다. 또한, 상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 제조할 수 있다.
제제예
2-2. 건강기능성 음료의 제조
본 발명의 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 유도체, AR-3 또는 AR-5 1g, 구연산 0.1g, 프락토올리고당 100g, 정제수 900g을 섞어 통상의 음료 제조방법에 따라 교반, 가열, 여과, 살균, 냉장하여 음료를 제조하였다.
Claims (10)
- 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 또는 그의 유도체를 포함하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산의 유도체는, 3α-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산(3α-hydroxyolean-12-en-27-oic acid, AR-3) 또는 아세리필릭산 A(aceriphyllic acid A, AR-5)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 골 용해성 질환은 류마티스성 관절염, 골다공증, 골조소증, 인공관절에 의한 골용해, 암세포에 의한 골용해성 전이, 골수성 백혈병에 의한 골용해성 병변, 골감소, 골손실 및 골용해성 치주질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 파골 세포 수의 감소, 파골세포의 필라멘트 액틴 링의 형성 억제, 골 재흡수 피트의 형성 억제 또는 파골 세포 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 골소주 개수(trabecular number), 골 체적비(BS/BV) 감소를 억제하거나, 골소주 거리(trabecular space)를 증가를 억제시키는 것을 특징으로 하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 c-Src, CtsK 또는 c-Fos의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 NFATc1 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 파골 세포 전구체의 이동을 억제하는 것을 특징으로 하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 또는 그의 유도체는 돌단풍(Aceriphyllum rossii) 유래 화합물인 것을 특징으로 하는 골 용해성 질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 3-하이드록시올레안-12-엔-27-오익산 또는 그의 유도체를 포함하는 골 용해성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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| KR101739838B1 (ko) | 2017-03-29 | 2017-05-26 | 아주대학교산학협력단 | 로가닌을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제용 시약 조성물 |
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