KR100690500B1

KR100690500B1 - 조구등 추출물을 포함하는 혈관형성 촉진 및 골유합효과를 갖는 골절의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100690500B1
Application number: KR1020050113070A
Authority: KR
Inventors: 이재동; 박동석; 백용현; 양하루; 조은미
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2005-11-24
Filing date: 2005-11-24
Publication date: 2007-03-09

Abstract

본 발명은 혈관형성 촉진효과 및 골유합 효과를 갖는 골절 예방 및 치료에 유용한 조구등 추출물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명의 조구등 추출물은 혈관세포의 성장, 이동, 분화 및 성장인자의 분비를 증가시켜 혈관세포 증식활성을 나타내며, 골아세포에서의 세포의 성장과 성장인자 증가, 알칼라인 포스포타아제 (ALP) 및 I형 콜라겐(Col I) 분비 활성, 오스테오칼신 (OCN), 오스테오폰틴 (OPN), 타입 I 콜라겐 (Col I)등의 mRNA 발현 증가, 골석화 (osteocalcification) 및 무기질 침착(mineralization)의 촉진효과 등의 골아세포의 증식으로 골유합 효과를 가져, 골절의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

조구등, 혈관세포, 골아세포, 골유합, 골절, 약학조성물, 건강기능식품

Description

조구등 추출물을 포함하는 혈관형성 촉진 및 골유합 효과를 갖는 골절의 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising the extract of Uncaria rhynchophylla having angiogenesis activity and bone fusion effect for preventing and treating fracture}

도 1은 조구등 추출물 처리군의 혈관세포 증식정도를 농도별로 나타낸 그래프이고,

도 2는 혈관세포 이동정도를 처리군(A: 음성대조군, B: 조구등추출물, C: 양성대조군)별로 나타낸 도이고,

도 3은 실험군 별 혈관세포 분화정도를 나타낸 도이고,

도 4는 혈관세포성장인자의 발현정도를 농도별로 나타낸 도이고,

도 5는 메트리겔을 이용하여 조구등 추출물의 생체 내 혈관형성촉진활성을 확인한 도이고,

도 6은 조구등 추출물 처리시 SaOS-2 세포의 생존율 변화 및 알카라인 포스파아제(ALP) 활성정도를 농도별로 나타낸 도이고,

도 7은 SaOS-2 세포에서 혈관성장인자(VEGF)의 분비활성을 처리 시간별(A), 처리농도별(B)로 나타낸 도이고,

도 8은 SaOS-2 세포에서 혈관성장인자(VEGF)의 mRNA 발현정도를 처리 시간별 (A), 처리농도별(B)로 나타낸 도이고,

도 9은 SaOS-2 세포에서 콜라겐 분비활성 정도를 처리 시간별(A), 처리농도별(B)로 나타낸 도이고,

도 10은 SaOS-2 세포에서 골기질 관련 mRNA 발현정도를 처리 시간별(A), 처리농도별(B)로 나타낸 도이고,

도 11은 SaOS-2세포에서 칼슘의 침착정도를 아린자린 레드 S(Alinzarin Red S) 용액으로 염색하고(A), 대조군과 비교하여 그래프(B)로 나타낸 것이다.

본 발명은 조구등 추출물을 함유하는 혈관형성 촉진 및 골아세포 증식으로 골유합 효과를 갖는 골절의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

관절염이나 골절, 골다공증에 상용되는 약재들은 소화장애, 위장관 장애 및 신장기능 감소 등과 같은 전신적인 부작용을 유발하여 환자의 연령이 증가할수록 부작용 발생의 빈도가 높아져 노년층에 많은 골관절질환의 치료시 장기간에 걸친 전신 투여는 많은 문제점을 내포하고 있다.

따라서 골절 및 골다공증의 치료에 있어 효과는 우수하면서 부작용을 극소화하며 관절조직보호 효과가 우수한 새로운 처방의 필요성이 대두되고 있으며 이에 따라 한약물의 신약개발에 대한 세계 각국의 관심이 집중되고 있다.

혈관신생 (Angiogenesis)은 기존의 혈관에서 새로운 혈관이 만들어지는 일련 의 과정으로, 혈관을 구성하고있는 내피세포의 이동(migration)과 세포간 장벽인 ECM(extracellular matrix)을 통과하는 침윤(invasion), 성장(proliferation), 혈관이 만들어지는 단계인 분화(tube-like formation)의 단계를 거치며 이에 대한 유도물질과 억제물질간의 균형에 의하여 정교하게 조절되는 것으로 알려져있다(Schott RJ, Morrow LA, Cardiovascular Research, 27, pp1155-1161, 1993). 이는 고도로 조절되는 과정으로 상처치유과정 및 배 또는 황체 엑스의 발생을 제외한 정상상태에서는 거의 일어나지 않는다(Findly, 1986; Forkman and Shing, 1992). 전반적으로 혈관형성은 연관된 기저막의 효소에 의한 퇴화로 시작되는 몇 가지의 단계와 연관되어 있다. 게다가, 혈관신생에는 혈소판-유래성장인자(platelet-derived growth factor), BMP-2 (bone morphogenic protein-2), VEGF (vascular endothelial growth factor), 및 bFGF, FGF-2 (basic fibroblast growth factor) 같은 혈관신생인자에 의한 적절한 자극이 필요하다(Forkman and Shing, 1992; Ferrara, 1992; Burgess and Maciag, 1989).

혈류공급의 영향을 비교적 많이 받는 근골격계에서도 혈관생성의 중요성이 부각되면서 치료성 혈관신생이 각광을 받기 시작하였고, 골유합, 골형성, 골이식, 국소 허혈성 골괴사 등에서 이미 혈관형성의 촉진이 치료에 도움을 주는 것으로 알려져 활용되고 있는 실정이다 (안재훈 등, 대한정형외과학회지, 34, pp631-642, 1999). 모세혈관에서 혈장단백질을 투과를 증가시키는 사이토카인으로 세포의 분열과 이동을 촉진, 세포소멸의 억제를 통해 새로 형성된 혈관의 생존을 유지시키며, 혈관세포의 이동을 촉진시켜 새로운 세포의 발생 및 분화를 촉진시키는 VEGF는 최 근 십년간의 연구에서 뼈 성장의 조절에 대한 역할이 많은 관심을 가져왔고, 최근 VEGF 가 BMP-2보다 조골세포의 증식에 더 강력한 유도활성을 갖는다고 보고되었다(Midy V., and Plouet J., Biochemical Biophysics Research Communication 199, pp380-386, 1994). 또한 메다 등이 VEGF 및 BMP-2 같은 골 동화 요소의 발현이 스타틴을 촉진시키고, 조골세포의 증식 및 석회화를 촉진시키는 것을 발표했다(Maeda t., Kawane T. et al., Endocrinology, 144, pp681-692, 2001).

bFGF 는 세포의 이동, 분화 및 많은 종류의 발생과정과 연관된 유사분열인자, 혈관신생인자 및 생존인자로 많은 종류의 세포 및 조직에 다면발현의 역할을 한다 (Schweigerer et al., 1987; Voldavsky et al., 1987). 게다가 최근 연구에는 상처의 치유법(Tsuboi and Rifkin, 1990)으로써 bFGF의 사용, 허혈성 심장혈관질환(Murayama et al., 2002; Horvath et al., 2002) 및 골절치유(Nakamura et al., 1998)에 적용가능하며, 임상실험이 진행중이라 보고되고 있다.

골은 석회화된 견고한 표면과 골수로 불리는 내부의 세포 성분이 결합된 특수조직이다. 생리적으로 상이한 이 두 구조의 결합은 일생을 두고 지속되는 골의 재형성(bone remodeling) 과정에 기인한 것인데, 이는 골에 가해지는 호르몬이나 물리적 자극에 의해 골수에 있는 파골세포(osteoclast)들의 골의 표면으로 모여 골을 파들어 가면서 파괴하는 골흡수(bone resorption)와 흡수가 일어난 자리에 모여든 조골세포(osteoblast)에 의한 골기질의 합성(bone formation)으로 설명된다(Park JS., Natl Nutr., 215, pp25-31, 2000).

골표면에 위치하고 있는 조골세포는 세포막에 당단백 효소인 ALP(alkaline phosphatase)를 가지고 있으며 Ⅰ형 콜라겐(collagen), 오스테오칼신(osteocalcin; OCN), 오스테오폰틴(osteopontin, OPN), 본 시알로프로테인(bone sialoprotein)과 같은 골기질 물질을 분비하고 석회화시키는 역할을 한다(Collier FM, Huang WH et al,, Endocrinology, 139, pp1258-1267, 1998).

이에 본 발명자들은 조구등 추출물이 골아세포의 증식을 촉진시키고, VEGF mRNA 및 단백질 분비를 증가시키는 것을 확인하였고, 골아세포의 증식의 후기 지표로 골아세포의 성숙과 밀접한 연관이 있는 OCN (Franceschi R.T., Iyer B.S, Journal of bone Mineral Research, 7, p235-246, 1992), 호르몬 및 사이토카인의 발현을 증식, 무기질 증식에 관여(Hunter G.K., Hauschka P.V. et al., Biochemical Journal, 317, p59-64, 1996)하는 OPN mRNA의 발현을 증가시키고, 골아세포가 합성하고 분비하는 주요 골기질성분이며 세포외 대형분자인 I형 콜라겐을 증가시키는 것을 관찰하여 골절 치료 및 예방용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

조구등(Uncaria rhynchophylla Miq.)은 꼭두서니과(Rubiacea)에 속하는 덩굴성 목본식물로 가시가 달린 가지를 한방에서는 생약재로 사용하는데, 진경 및 진정효능을 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 고혈압에 의하여 유발된 현기증과 두통 등에 널리 사용되어져 왔다(Tang, W., Eisendrand, G. Chinese drugs of plant origin. pp997, 1992). 조구등의 주성분으로서 린코필린(rhynchophyllin) 등 수종의 옥시인돌(oxyindole)계 알카로이드 화합물이 분리, 보고되었다(Aimi, N., Yamanaka, E., Chem. Pharm. Bull. 25, pp2067-2077, 1977). 그러나 조구등의 골 절에 대한 활성 보고는 거의 없는 실정이다.

본 발명은 혈관세포의 성장, 이동, 분화 및 성장인자의 분비를 촉진시켜 혈관세포 증식활성을 나타내며, 골아세포에서의 세포의 성장확인 및 성장인자 증가, 알칼라인 포스포타아제 (ALP)및 I형 콜라겐 (Col I)의 분비 활성, 오스테오칼신 (OCN), 오스테오폰틴 (OPN), I형 콜라겐 (Col I)등의 mRNA 발현을 증가, 골석화 (osteocalcification) 및 무기질 침착(mineralization) 촉진의 골아세포 증식활성을 나타내어 골유합 효과를 가지는 조구등 추출물을 유효성분으로 함유하는 골절 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 조구등 추출물을 유효성분으로 함유하는 골절의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 골절의 예방 및 치료용 조성물은 혈관형성, 골아세포 증식으로 인한 골유합 효과를 갖는 조성물임을 특징으로 한다.

상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 에탄올과 물의 혼합용매에 가용한 추출물을 포함한다.

본 발명의 조구등으로부터 추출물을 분리하는 방법은 하기와 같다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

예를 들어, 본 발명의 조구등 추출물은 조구등을 음건하여 마쇄한 후, 건조된 시료의 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 5 내지 15배 분량의 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:5의 혼합비(㎏/L)를 갖는 물과 에탄올의 혼합용매로, 실온에서 약 0.5 내지 20시간, 바람직하게는 1 내지 10시간 동안 교반추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 열수 추출한 후 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 극성용매에 가용한 추출물을 얻는다.

상기와 같은 방법으로 얻어진 조구등 추출물은 혈관세포의 성장, 이동, 분화 및 성장인자의 분비를 증가시켜 혈관세포 증식활성을 나타내며, 골아세포에서의 세포의 성장과 성장인자 증가, 알칼라인 포스포타아제 (ALP) 활성 증가, 오스테오칼신 (OCN), 오스테오폰틴 (OPN), 타입 I 콜라겐 (Col I)등의 mRNA 발현을 증가, 골석화 (osteocalcification) 및 무기질 침착(mineralization) 촉진의 조골세포 증식활성을 나타내어 골유합 효과를 갖는 골절의 예방 및 치료효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

본 발명은 상기 제조방법으로 얻어지는 조구등 추출물을 유효성분으로 함유하고 혈관형성 촉진 및 골유합 활성을 나타내는 골절 예방 및 치료에 효과적인 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 골절 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 ~ 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조구등 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조구등 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조구등 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 골절 예방 및 치료의 효과를 나타내는 상기 조구등 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품을 제공한다. 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등이 있다.

또한, 골절의 예방 및 치료 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 조구등 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조구등 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 조구등 추출물 제조

경희의료원 한방병원에서 구입한 조구등을 약 1.0 cm 정도의 크기로 세절하여 250 g을 고루 섞은 후, 2 L의 50%(v/v) 에탄올을 가해 24시간 실온에 침지하였다. 상층액을 걸러 감압농축기(Eyela, Tokyo, 일본)를 이용하여 농축한 후, -20℃에서 동결 건조하여 분말상태의 조구등 추출물 35g 을 수득하였다. 조구등 추출물은 DMSO에 녹여 사용하였고, 최종 DMSO의 농도는 배양 배지의 0.5%이하로 실험에 사용하였다(이하 UR 이라 명명함).

참고예 1. 세포 배양

1-1. 혈관세포의 배양

경희의료원 산부인과에서 분리 받은 산모의 탯줄 정맥으로부터 혈관세포를 분리하고 코르드 버퍼(Cord buffer; 0.2% glucose phosphate buffered saline)로 혈관을 세척 후, 0.2% 타입 I 콜라게나아제(Sigma-Aldrich Co., MO. USA)를 정맥에 약 5ml 가량 넣은 후 37 ℃에서 5분간 방치했다. 실온에서 코르드 버퍼 20 ml을 정맥에 넣고 다른 반대편에서 분리되어 나온 혈관세포를 수집하고, 다시 한번 코르드 버퍼만을 혈관에 주입하여 37 ℃에서 반응시킨 후 혈관 세포인 HUVEC세포를 수집하고 세척하여, 0.1% 젤라틴(gelatin)이 코팅된 조직배양 플라스크(T75cm²)에 주입하였다. 배양배지는 EGM^TM-2 완전배지(Cambrex, MD, USA)를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하고, confluent 상태가 되면 트립신-EDTA용액을 분리하여 세포를 분리하고, 3 내지 6 패세지의 세포를 실험에 사용하였다.

1-2. SaOS-2 세포 배양

사람유래 조골세포인 SaOS-2세포는 ATCC사 (USA)에서 수득하였으며, 15% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen Corporation, CA, USA)가 첨가된 McCoy's 5a배지에서 배양되었다.

참고예 2. RT-PCR

트리졸l 시약(Invitrogen Corporation, CA, USA)을 이용하여 RNA를 준비하고, 1㎍ 총 RNA 역전사는 42 ℃에서 60분간 수행하였다. oligo(dT)₁₂ 프라아머, dNTP (10 mM), 0.1M 디티오트레이톨(dithiotreitol), 역전사효소, RNase 저해제가 포함된 RNA 버퍼에서 각각의 cDNA의 특정 프라이머를 이용한 PCR (Polymerase Chain Reaction)은 2.5 unit TaKaRa Taq^TM, 1.5 mM dNTP, 1 x PCR buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1 % Triton X-100), 20 pmol 각 프라이 를 섞고 증류수로 전체를 10 ㎕로 맞춘 다음 RT-PCR (TaKaRa Biotechnology, Seoul, Korea)시스템으로 72℃에서 15분간 PCR을 실시하였다. PCR에 의하여 생성된 산물은 같은 부피의 1.8 % 아가로스 겔에서 전기영동을 실시하고 Et-Br(ethidium bromide)로 염색하여 특정 밴드(band)를 확인하였다. β-Actin는 지표유전자로 사용하였고, Gel Doc EQ (BIO-RAD Laboratories, Milan, Italy)를 이용하여 정량하였다.

RT- PCR에서 사용된 프라이머의 서열목록

유전자		프라이머의 서열
VEGF	정방향	5'-CTGTGCAGGCTGC TGTAACG-3'
VEGF	역방향	5'-GTTCCCGAAACCCTGAGGAG-3'
OPN	정방향	5'-CAGCCA TGAATTTCACAGCC-3'
OPN	역방향	5'-GGGAGTTTCCATGAAGCCAC-3'
OCN	정방향	5'-CATGAGAGCCCTCACA-3'
OCN	역방향	5'-AGAGCGACA CCCTAGAC-3'
Col I	정방향	5'-TGACCTCAAGATGTGCCACT-3'
Col I	역방향	5'-GGGAG TTTCCATGAAGCCAC-3'
β-Actin	정방향	5'-CCATCATGAAGTGTGACGTG -3'
β-Actin	역방향	5'-ACATCTGCTGGAAG GTGGAC-3'

참고예 3. 통계분석

모든 실험 결과는 평균± SD로 나타내었고, 유의성이 인정될 경우 Student's t-test를 사용하여 p < 0.05 수준 이하에서 유의성 검정을 실시하였다.

실험예 1. 혈관세포 증식활성 (in vivo)

1-1. 혈관세포증식 측정

혈관세포증식 정도는 BrdU 어세이 방법을 이용하여 측정하였다(Magaud, J-P., Sargent, I., et al., J. Immunol. Methods 106, pp95-100).

혈관세포를 0.1% 젤라틴으로 코팅된 96 웰 플래이트에 각 웰당 5x10³씩 분주하고 EGM^TM-2 완전배지(Cambrex, MD, USA)에서 배양하였다. 배양 24시간 후 배지를 제거하고 2%의 FBS 및 3 unit/ml 헤파린이 첨가된 EBM(Cambrex, MD, USA)배지로 대체하였다. 0.01, 0.1, 1, 10, 100 ㎍/㎖ 의 농도의 조구등 추출물을 처리하고, 양성대조군으로 bFGF(R&D system Inc., MN, USA) 5ng/㎖을 처리하였다. 72시간 배양 후 10㎕ BrdU를 각각 웰에 첨가하고, 6시간 더 배양한 후, 세포를 고정하고 항-BrdU-POD를 첨가하여 반응시키고, TMB 기질로 발색하여 반응을 종료하였다. 세포 성장은 ELISA 판독기 480 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 대조군에 대한 시료처리군의 흡광도의 %로 표시하여 하기 도 1에 나타내었다.

실험결과 하기 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 조구등 추출물은 농도 의존적으로 혈관세포증식을 촉진시킴을 확인하였고, 고농도처리(100㎍/㎖) 처리시에도 세포의 증식에 영향을 미치지 않아, 안전한 약물임을 확인할 수 있었다.

1-2. 혈관세포의 이동측정

혈관세포의 이동은 혈관형성 촉진을 나타내는 지표로 활용된다. 혈관세포의 이동정도 측정은 화학주성 이동 어세이(chemotactic migration assay)방법을 이용하여 측정하였다.

성장인자로 알려진 bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor)는 세포의 성장을 촉진하는 헤파린 결합된 성장인자의 하나로, 실험관 내 실험에서 다양한 형태의 세포의 증식을 야기하며, 생체 내에서는 확실한 혈관신생 활성을 입증함으로 bFGF를 양성대조군으로 사용하여 실험을 실시하였다.

혈관세포 계대배양시 패새지(passage) no. 4-5를 사용한다. 1x10⁶/ml 의 농도 혈관세포를 48 웰 보이덴 배양기(boyden chamber) 아래칸에 30 ul씩 분주하고 젤라틴, 라미닌(laminin), 콜라겐(collagen)등이 코팅된 막을 방치하고 2시간 배양하였으며, 배양기 위칸에는 음성대조군, 양성대조군과 함께 각각의 약물을 농도별로 분주한 후 2시간 배양하였다. 배양 후, 막을 고정시키고, 디프 퀵 용액(Diff Quik solution) I & II (Sysmex Co., Kobe, Japan)으로 염색 후 현미경으로 관찰하고 사진촬영(x100, Axiovert 200, ZEISS, Germany) 후 이동된 혈관의 개수를 세었다.

실험결과, 하기 도 2에 나타낸 바와 같이 25㎍/㎖농도에서 bFGF 처리군과 유사한 혈관세포 이동활성을 나타내어 본 발명의 조구등 추출물이 뛰어난 혈관형성 촉진활성을 확인할 수 있었다.

1-3. 혈관세포의 분화측정

혈관세포 분화정도는 유사튜브 형성 어세이(tube-like formation assay)방법을 이용하여 측정하였다.

혈관세포를 매트리겔(Matrigel; Becton Dickinson)이 코팅된 48 웰 플래이트에 시료와 함께 2x10⁴세포/웰 의 농도로 분주하고 튜브가 형성되는지를 관찰하면서 배양하였다. 약 12시간-16시간 후 양성대조군인 bFGF의 처리군이 완전히 튜브를 형성하면 세포를 고정하고, 디프 퀵 용액(Diff Quik solution) I 으로 핵을 염색하여 현미경으로 관찰하여 사진촬영(100x)후 도 3a 내지 3c에 나타내고, 사이언 이미지(scion image)로 정량하여 도 3d에 나타내었다.

본 발명의 조구등 추출물은 양성대조군인 bFGF처리군과 유사한 튜브형성효과를 나타내어 혈관세포 생성에 유의적인 효과를 확인할 수 있었다.

1-4. 성장인자 발현정도 측정

혈관세포에서 조구등(UR) 추출물 처리시 성장인자 bFGF(basic Fibroblast growth factor) 발현에 어떤 영향을 미치는지를 ELISA 어세이 (R&D system) 방법을 이용하여 알아보았다.

HUVEC 세포를 48 웰 플래이트에 1x10⁴세포/웰 농도로 분주하여 배양한 후 각각의 웰에 실시예의 시료를 0.1 내지 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 72 시간 배양후, 배양액을 일부 취하여 rhFGF(fibroblast growth factor) 항체가 표지된 플래이트에 분주하여 반응시켰다. 반응시킨 세포를 세척 한 후, 퍼옥시다제-부착된 염소 항-쥐(peroxidase-labelled goat anti-mouse) Ig G와 반응시키고 다시 세척 하고, TMB 기질을 이용하여 발색시키고 반응을 종료시킨 후 ELISA 판독기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 bFGF의 발현정도를 확인하였다.

실험결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 조구등(UR)추출물은 세포내의 성장인자인 bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor)를 농도 의존적으로 증가시키고, 낮은 농도에서도 성장인자 처리군과 유사한 발현정도를 나타내어 혈관세포의 증식에 탁월한 효과를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 혈관형성정도 측정(in vitro)

생체 내에서 혈관형성에 본 발명의 조구등(UR) 추출물 처리가 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위해 매트리겔 플러그 어세이(Matrigel plug assay)를 이용하였다.

6주된 C57BL6 쥐(샘타코, male, Jacson Laboratory)에 0.5 ㎖의 매트리겔, 매트리겔에 50㎍/㎖의 조구등 추출물, 메트리겔에 10 ng/㎖의 bFGF를 혼합하여 주입하였다. 7일 후, 실험쥐를 희생하고, 매트리겔 플러그를 제거한 후, 10% 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 묻었다. 플러그의 부분을 현미경관찰을 위해 H-E염색(hematoxylin-eosin staining)으로 염색하고, 실험에 관한 사전 정보를 갖고 있지 않은 병리학자들에게 염색 부분에 대해 진단하게 하였다. 신생혈관형성을 정량하기 위해 헤모글로빈 진단 키트(Youngdong Diagnotics, Youngin, Korea)를 이용하여 사용자 지침서에 따라 헤모글로빈(Hb) 존재량을 정량하였다.

실험결과 도 5 에 나타난 바와 같이, 50㎍/㎖ 조구등(UR) 추출물 처리한 메트리겔에서 육안으로 확인 가능한 유의적인 혈관형성을 관찰할 수 있었고, 성장인자인 bFGF 처리군과 유사한 헤모글로빈 농도를 확인하여 혈관형성에 탁월한 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 3. 골아세포 증식활성 측정

WST-8(Dojindo Lab., Tokyo, 일본)을 이용하여 본 발명의 조구등(UR) 추출물의 세포에 대한 영향을 측정하였다. 1x10⁴세포/ 웰 농도의 SaOS-2세포를 96 웰 플래이트에 분주한 후 42시간 배양하고, 조구등(UR) 추출물을 농도별(0.01, 0,1, 1, 10, 100 ㎍/㎖)로 100㎕씩 첨가하여 72시간 배양하였다. 10㎕의 WST-8 (water - soluble tetrazolium salt) 염색약을 첨가하여 약 2시간 더 배양하여 WST-8 포르마잔이 형성되어 발색되면 450nm에서 ELISA 판독기로 흡광도를 정량한다. 세포생존율은 대조군에 대한 시료처리군의 흡광도의 %로 측정하여 하기 도 6의 그래프에 나타내었다.

조구등(UR) 추출물은 0~100㎍/㎖ 농도의 범위에서 3일동안 SaOS-2 세포의 생존율에 영향을 미치지 않아, 세포독성이 없는 안전한 약물임을 확인할 수 있었다.

실험예 4. ALP(혈청 효소) 활성 측정

ALP(alkaline phosphatase)는 골형성의 지표가 되는 효소로써 조골 세포의 분화 중기에 생성된다(Aubin J.E., Liu F. et al., Bio Pharm Bull, 20, pp988-991, 1997). 조골세포의 분화에 조구등(UR)추출물이 어떤 변화를 미치는지 확인하기 위해서 ALP 활성변화를 측정하였다.

ALP 활성은 세포내의 알카라인 포스타아제(alkaline phosphatase)가 p-니트로페닐포스타아제(p-nitrophenylphosphate)를 p-니트로페놀(nitrophenol)과 포스패이트(phosphate)로 분해하여 발색하는 정도를 시중판매 가능한 키트(Sigma-Aldrich Co., MO, USA)를 이용하여 측정하였다 SaOS-2세포를 0.1% 트리톤 X-100(Triton X-100) 용액으로 용해시키고, 초음파 처리후 12,000g, 4℃에서 10분간 원심 분리하였다. 상등액을 반응 버퍼와 함께 37℃에서 3분간 배양한 후 0.1N NaOH를 이용하여 반응을 정지시키고, 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 p-니트로페놀(nitrophenol; Sigma-Aldrich Co., MO, USA)로 작성하였고, 수치는 단백질 농도로 표준화 하였다.

실험결과 하기 도 6에 보이는 바와 같이, 본 발명의 조구등(UR) 추출물은 조골세포에 처리 3일 경과 후, 농도 의존적으로 ALP 활성을 증가시키고, 10㎍/㎖에서 가장 최대의 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 5. 혈관성장인자 발현정도 측정

VEGF는 SaOS-2 세포의 배양후기에 세포에 의해 합성되는 혈관생성촉진인자로, 조구등추출물이 VEGF의 발현에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 실시하였다.

조골세포-유사(Osteoblast-like) 세포주인 SaOS-2를 48 웰 플래이트에 세포를 1x10⁴세포/ 웰 농도로 분주하여 배양한 후 각각의 웰에 조구등(UR) 추출물을 농도별로 처리하고 72 시간 배양하였다.

5-1. 단백질 분비 활성측정

배양액을 VEGF (vascular endothelial growth factor) 면역검출법을 위하여 -70℃에 보관하였다. VEGF는 상업적으로 이용 가능한 ELISA (R&D systems INC., MN, USA) 키트를 이용하였다. 항체가 표지된 플래이트에 분주하여 반응시키고 PBS로 세척하여 퍼옥시다제-부착된 염소 항-쥐 (peroxidase-labelled goat anti-mouse) Ig G를 반응시키고 다시 세척하였다. TMB 기질을 이용하여 발색시키고 반응을 종료시킨 후 ELISA 판독기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 하기 도 7에 나타내었다.

실험결과 도 7A에 보이는 바와 같이, UR 추출물 처리군의 반응 초기에는 음성대조군과 큰 차이 없었으나, 7일째부터 VEGF의 분비가 유의성 있게 증가하여 반응 2주째 되는 날은 양성대조군인 혈관성장인자인 VEGF 처리군과 유사한 분비를 확인 할 수 있었고, 도 7B에서 보이는 바와같이, UR 추출물 농도 의존적으로 VEGF 분비가 증가됨을 확인할 수 있었다.

5-2. mRNA 발현 측정

RT PCR법을 이용하여 VEGF의 발현정도를 알아보았다. 1㎍/㎖의 조구등 추출물 처리시에 도 8A에 보이는 바와 같이 3일, 7일, 14일 모두 증가하였고, 7일 간의 배양시 도 8B에 보이는 바와 같이 농도 의존적으로 발현이 증가하였다.

실험예 6. 골기질 분비활성 측정

Ⅰ형 콜라겐(collagen), 오스테오칼신(osteocalcin; OCN), 오스테오폰틴(osteopontin, OPN) 및 본 시알로프로테인(bone sialoprotein)은 조골세포에서 분비되는 골기질 물질로 OCN, OPN, Col I 활성정도는 조골세포 증식의 판정요소 그 농도가 증가하면 골세포의 성장 및 분화가 활발함을 알려준다(Collier FM, Huang WH et al,, Endocrinology, 139, pp1258-1267, 1998). 본 발명의 UR 추출물의 투여가 OCN, OPN, Col I을 활성에 영향을 미치는지 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 하였다.

골아세포-유사(Osteoblast-like) 세포주인 SaOS-2를 48 웰 플래이트에 세포를 1x10⁴세포/ 웰 농도로 분주하여 배양한 후, 각각의 웰에 1㎍/㎖의 조구등 추출물을 처리하고 14일간 배양하였다. 3일 간격으로 배양액을 교환하고 14일째에 배양액을 수집하여 타입 I 콜라겐의 분비활성을 측정하고, 세포로부터 RNA을 추출하여 OCN, OPN, Col I mRNA 발현정도를 RT-PCR로 분석하였다.

6-1. Col I의 분비정도 측정

조골세포-유사(Osteoblast- like) 세포주인 SaOS-2를 48 웰 플래이트에 세포를 1x10⁴세포/ 웰 농도로 분주하여 배양한 후 각각의 웰에 조구등 추출물을 농도별로 처리하고 72 시간 배양하였다.

Sircol 콜라겐 어세이 (Biocolor Ltd, Valley Business Centre, Northern Ireland)법을 이용하여 콜라겐분비정도를 측정하였다. 배양액을 Sirius Red 염색약이 포함된 황산에서 30분간 실온에서 반응시켰다. 반응된 혼합물을 원심 분리하여, 용해한 후 540nm에서 흡광도를 측정하였고, 대조군의 표준 값과 시료의 최대높이를 퍼센트로 환산하여 계산하였다.

실험결과 하기 도 9에 나타낸 바와 같이, UR 추출물처리 세포에서 7일째 콜라겐 I의 분비는 거의 증가하지 않았으나, 14일째에는 농도 의존적으로 분비가 증가하였다.

6-2. mRNA 발현정도 측정

RT PCR법을 이용하여 OCN, OPN, Col I의 mRNA 발현정도를 알아보았다. 1㎍/㎖의 조구등(UR) 추출물 처리시에 도 10A에 보이는 바와 같이 3일에서 7일까지는 영향을 받지 않았으나, 14일에는 현저한 증가를 확인할 수 있었다. 14일 간의 배양시 도 10B에 보이는 바와 같이 농도 의존적으로 발현이 증가하였다.

실험예 7. 칼슘의 침착정도 측정

칼슘 침착정도는 무기질화를 확인하는 척도로 그 정도가 증가하면 조골세포 증가가 활발함을 알려준다. 본 발명의 UR 추출물의 투여가 칼슘 침착정도를 활성시키는지 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 하였다.

24 웰 플래이트에 1% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신, 50㎍/㎖ 아스코르빈산, 10mM β-글리세롤포스페이트(glycerolphosphate)가 첨가된 배지의 SaOS-2 세포를 1x10⁴세포/ 웰 농도로 분주하여 배양한 후 각각의 웰에 조구등(UR)추출물을 농도별로 첨가하여 약 14일간 배양하였다. 배양액은 사용하였으며 3일 간격으로 배양액을 교환해 주었다. 배양후 메탄올로 세포를 고정시키고, 0.4% 아린자린 레드 S(Alinzarin Red S)용액으로 염색하여 칼슘의 침착정도로 무기질화를 확인하였으며, 현미경으로 관찰 후 사진촬영(200x)하였다.

실험결과, 조직에 칼슘침착형성은 조구등 추출물 처리 14일 후부터 현저히 관찰할 수 있었으며(도 11A참조), 농도 의존적으로 세포에 칼슘침착이 증가함을 확인할 수 있었다(도 11B 참조).

실험예 8. 랫트에 대한 경구투여 반복투여 독성실험

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 반복투여 독성실험을 다음과 같이 실시하였다.

군당 6 마리씩의 동물에 실시예 1의 조구등 추출물을 0.5% 메틸셀루로즈 용액에 현탁시켜 2g/kg의 용량으로 1일 1회 2주간 경구 투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 조구등 추출물은 모든 랫트에서 2000 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소 치사량(LD₅₀)은 2000 mg/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명의 추출물을 함유하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

조구등 추출물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

조구등 추출물 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

조구등 추출물 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

조구등 추출물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

조구등 추출물 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

조구등 추출물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

조구등 추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

본 발명의 조구등 추출물은 혈관세포의 성장, 이동, 분화 및 성장인자의 분비를 증가시켜 혈관세포 증식활성을 나타내며, 조골세포에서의 세포의 성장과 성장인자 증가, 알칼라인 포스포타아제 (ALP) 활성 증가, 오스테오칼신 (OCN), 오스테오폰틴 (OPN), 타입 I 콜라겐 (Col I)등의 mRNA 발현을 증가, 골석화 (osteocalcification) 및 무기질 침착(mineralization)촉진 등의 조골세포의 증식시키는 골유합 효과를 나타내어 골절 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

조구등 추출물을 유효성분으로 함유하는 골절의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매에 가용한 추출물인 약학조성물.
조구등 추출물을 유효성분으로 함유하는 골절의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제3항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 건강기능식품.