KR102183207B1 - 단화 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단화(Anthocephalus chinensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 단화 추출물 또는 이의 분획물은 천연물에서 유래되어 독성이 적으면서도, 파골세포의 형성 또는 분화 억제활성이 우수하므로 골손실에 의해 유도되는 또는 골손실을 유발하는 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

단화 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating bone disease comprising extracts of Anthocephalus chinensis or fractions thereof}
본 발명은 단화 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물 및 사료 조성물에 관한 것이다.
인체의 골조직은 조골세포에 의한 골 재형성(Bone formation)과 파골세포에 의한 골 재흡수(Bone resorption) 과정과 같은 골의 리모델링(Bone remodeling)이 평생 동안 끊임없이 반복되어 이루어진 역동적인 기관이다. 골 조직은 연골과 골격계를 구성하며 기계적 기능으로 지지와 근 부착의 역할을 하고, 생체기관 및 골수를 보호하는 기능을 하며, 칼슘과 인 이온의 항상성 유지를 위해 이들을 보존하는 기능을 담당한다. 이와 같은 기능을 하는 골 조직은 교원질, 당단백질과 같은 세포기질과 조골세포, 파골세포 및 골세포 등 여러 종류의 세포들로 이루어진다. 이들 중 파골세포는 조혈모세포로부터 유래한 세포로서 노화된 골의 흡수를 담당하며, 조골세포는 골수 내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래한 세포로서 골 형성에 주된 역할을 담당한다.
이 중 파골세포는 마우스의 RAW264.7 단핵구 세포가 RANKL(receptor activator of nuclear factor ĸB(RANK) ligand)에 의해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclasts)로 분화된다. 이러한 분화 과정은 세포 외부의 RANKL이 RANK에 결합하여 미토겐 활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK)의 활성을 촉진하고, 이는 NF-ĸB라는 전사 인자가 핵 내로 들어가서 파골세포 분화와 관련된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 등의 발현을 증가시킴으로써 가능한데, 이러한 과정으로 형성된 다핵 파골세포는 무기질골(mineralized bone)을 흡수하는 역할을 한다. 또한, RANKL이 RANK에 결합하면 TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)의 활성을 촉진시켜 MARK, 또는 NF-ĸB, AP-1, NFATc1과 같은 전사인자들의 활성을 촉진시킨다(LEE ZH, KIM HH. Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts. Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 30, 305, 211-4). 따라서 RANKL에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 차단은 골다공증을 비롯한 골질환의 치료를 위한 치료적 접근 방법 중의 하나로 인지되고 있다.
파골 세포는 골 내에서 조골세포와의 불균형으로 인하여 비정상적인 골조직의 파괴 및 흡수를 유발하고 이로 인하여, 뼈의 질량 및 골밀도가 감소하는 골다공증(osteoporosis), Qudptj 석회가 탈실되는 골연화증(osteomalacia), 정상적인 골조직이 섬유성 결합조직과 미성숙한 골소주로 대체되는 섬유이형성증(fibrous dysplasia), 치조골이 소실되는 치주질환(periodontal disease), 관절의 파괴 및 변형을 초래하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)등의 원인이 되는 것으로 알려져 있다.
현재 골다공증과 같은 파골세포에 의한 골 손상 칠에 포사맥스(Fosamax, 성분명: aledronate), 악토넬(Actonel, 성분명: risedronate), 조메타(Zometa, 성분명: zoledronate) 등과 같은 비스포스포네이트(bisphosphonate) 계열의 치료제가 널리 이용되고 있다. 그러나 최근 비스포스포네이트 계열의 약제들을 복용하는 환자들에게서 턱뼈 괴사(osteonecrosis), 중증 심방 세동, 뼈 또는 관절의 무력화, 근골격의 통증 등 다양한 부작용이 발생하는 사례가 해마다 증가하고 있다(Br J Cancer 98:1736-1740(2008)). 유방암, 전립선암 등에서 뼈로 전이된 암세포에 의해서도 파골세포의 형성이 촉진되어 심각한 골질환들이 발생하는데 이를 치료하기 위한 약물은 개발되어 있지 않은 실정이다. 따라서, 기존의 비스포스포네이트 계열의 약제들의 단점을 보완하고, 독성이 적으며 파골세포의 형성 및 분화를 효과적으로 억제할 수 있는 약제들의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 천연물로부터 유래하여 독성이 적고, 파골세포의 형성 또는 분화를 억제할 수 있는 화합물을 찾고자 예의 노력한 결과, 단화 추출물 또는 이의 분획물이 파골세포의 형성 또는 분화를 현저하게 억제함으로써 골손실에 의해 유도되는 또는 골손실을 유발하는 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 단화 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 단화 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 단화 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 단화 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 단화 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 단화 추출물 또는 이의 분획물을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "단화(Anthocephalus chinensis)"는 상록성의 중형 또는 대형 수목으로 수피는 회색으로 평활하고 약간 갈라지며 내피는 담황색으로 섬유질이며 쓴맛이 있다. 뿌리 또는 잎이 의약 목적으로 사용되며, Breania chinensis라는 학명도 함께 사용되며, 카담(kadam), 라란(laran), 카드왈(kadwal), 카담바(cadamba) 등과 같은 이름으로 불리기도 한다. 단화의 항암, 항염, 항산화 효과에 대한 연구가 진행되고 있으나, 단화의 골질환에 대한 효능은 아직 보고된 바 없다. 본 발명의 목적상 단화는 종류에 제한되지 않으며, 재배한 것을 사용하거나 시중에서 구입한 것을 사용하거나 그 출처에 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명자들은 천연에 존재하는 천연자원들로부터 우수한 골질환의 예방 또는 치료효과를 나타나는 물질을 이용한 다양한 연구 수행 결과, 단화 추출물이 파골세포의 분화 또는 골 흡수를 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다. 이를 통해 단화 추출물이 골질환 예방 또는 치료를 약학적 조성물로 사용될 수 있음을 알 수 있었다. 상기 골질환 예방 또는 치료효과를 가지는 단화 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 지금까지 전혀 알려지지 않고, 본 발명자에 의해 최초로 개발되었다는 점에서 그 의의가 매우 크다고 할 수 있다.
본 발명에서 용어, "추출물"은 상기 단화를 추출 처리한 것을 의미하는 것이고, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물, 정제물 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함할 수 있다. 또한 상기 단화의 천연, 잡종, 변종식물의 다양한 기관, 예를 들어 뿌리, 근경, 지상부, 줄기, 잎, 열매 등으로부터 추출될 수 있다.
본 발명의 단화 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 침지추출, 열수추출, 냉침추출, 환류냉각추출 또는 초음파추출 등의 방법을 이용할 수 있다.
상기 단화 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 탄소수 6(C6)의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 추출하는 유기용매에 따라 유효성분의 추출 정도와 손실 정도가 차이가 날 수 있으므로, 적절한 유기용매를 선택하여 사용할 수 있다. 구체적으로 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출할 수 있다. 보다 구체적으로 에탄올을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 용매 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위하여 추출물을 여과시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 예로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
추출액의 농축에는 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다.
농축 후 건조단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조 또는 적외선건조 등이 방법을 사용할 수 있다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 골질환 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이의 조합 등이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 증류수, 알코올 등의 극성용매; 헥산, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄 등의 비극성용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 분획 용매 중 알코올을 사용하는 경우에는 바람직하게는 탄소수 1(C1) 내지 탄소수 6(C6)의 알코올을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "골질환"은 골손실 또는 골밀도 감소에 의해 유도되는 모든 질환을 포함하는 것으로, 구체적으로는 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 골관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 치주질환(periodontal disease), 골용해(osteolysis), 섬유이형성증(fibrous dysplasia), 파제트병(Paget's disease), 골형성부전증(osteogenesis imperfect), 고칼슘혈증(hypercalcemia) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 골질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 골질환 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은 파골세포의 분화 또는 골 흡수를 억제하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 조성물은 파골세포의 분화 표지 마커로 알려져 있는 NFATc1, c-Fos, TRAP, DC-STAMP, Cathepsin K의 발현을 효과적으로 억제함으로써 골 질환의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "파골세포(osteoclast)"는 대식 세포 전구체(macrophage precursor)로부터 파생되는 세포로서 파골세포 전구 세포들은 대식 세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), NF-ĸB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL) 등에 의해 파골세포로 분화되며 융합을 통해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclast)를 형성하는 것을 의미한다. 파골세포는 αvβ3 인테그린(integrin) 등을 통해 골(bone)에 결합하며 산성 환경을 조성하는 한편 각종 콜라게네이즈(collagenase) 및 프로테아제(protease)를 분비하여 골 흡수(bone resorption)를 일으킨다. 파골세포는 완전히 분화된 세포로 증식하지 않으며 약 2주간의 수명이 다하면 세포 사멸(apoptosis)를 일으킨다.
본 발명의 실시예에서는 파골세포로 분화한 마우스 단핵구 세포에 본 발명의 조성물을 투여한 후, 파골세포 분화 표지 인자인 TRAP(tarrate-resistant acid phosphate) 염색을 실시한 결과, 농도 의존적으로 TRAP 활성을 현저하게 저해시킴으로써, 파골세포 형성을 억제함을 확인하였다(도 2 및 도 3). 또한, 파골세포의 분화 과정에 관여하는 마커들의 mRNA 발현 양상을 확인하기 위하여 RT-PCR 분석을 수행한 결과, 본 발명의 단화 추출물 및 분획물을 처리한 경우, 파골세포의 분화 마커들의 발현이 현저하게 감소됨을 확인하였다(도 4).
이와 같이 본 발명의 조성물은 TRAP 활성 억제를 통해 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하므로, 파골세포의 활성 증가에 의한 골다공증과 같은 골 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리락틱액시드(Poly Lactic Acid), 폴리-L-락틱액시드(poly-L-lactic acid), 광물유 등을 들 수 있다.
상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 담체의 형태로는 각종 부정형의 담체, 마이크로 스피어, 나노파이버 등을 포함할 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당 되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함된 단화 추출물 또는 이의 분획물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.01 내지 100 중량%, 0.01 내지 50 중량%, 보다 구체적으로 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 골질환의 예방 또는 치료 효과를 나타내므로, 이를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법은 골질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "개체"는 골질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물, 예를 들어, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소, 조류, 어류 등을 의미하고, 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 상기 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 경구, 정맥 내, 피하, 피 내, 비강 내, 복강 내, 근육 내, 경피 등으로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법 및 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 치료방법으로 단화 추출물을 포함하는 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 익상편 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
또한, 상기 약학적 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 성인 1인당 1㎎/㎏ 내지 200㎎/㎏, 구체적으로 1㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏, 더욱 구체적으로 20 내지 40㎎/㎏로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 단화 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 단화 추출물 또는 이의 분획물을 골질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명에서 용어, "개선"은 단화 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 예방 또는 치료되는 골질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강기능식품 등의 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함하며, 본 발명의 단화 추출물 또는 이의 분획물을 포함할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다. 또한 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 한편, 건강식품은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품은 건강 보조 목적의 식품을 의미하는데, 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하다. 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어날 수 있다.
상기 식품 조성물 제조 시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 단화 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 단화 추출물 또는 이의 분획물을 골질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단. 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다. 또한 상기 의약외품은 피부외용제 또는 개인위생용품을 포함할 수 있다.
상기 피부외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패치제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 겔의 형태로 제조되어 사용될 수 있으며, 상기 개인위생용품에는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔 또는 세정겔일 수 있다. 또한 본 발명의 의약외품 조성물의 또 다른 예로 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제가 있다.
본 발명의 단화 추출물 또는 이의 분획물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물 또는 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있으며 유효성분 혼합량은 사용목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 단화 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 단화 추출물 또는 이의 분획물을 골질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박 류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 단화 추출물 또는 이의 분획물은 천연물에서 유래되어 독성이 적으면서도, 파골세포의 형성 또는 분화 억제활성이 우수하므로 골손실에 의해 유도되는 또는 골손실을 유발하는 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 단화 추출물의 처리 농도에 따른 세포 독성(세포 생존률)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 단화 추출물의 처리 농도에 따른 분화된 파골세포의 TRAP 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 단화 추출물의 처리 농도에 따른 TRAP 양성 세포 수를 나타낸 그래프이다.
도 4는 단화 추출물의 처리에 따른 파골세포 분화 마커(NFATc1, c-Fos, TRAP, DC-STAMP, Cathepsin K)의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 그래프이다.
도 5는 단화 추출물의 처리에 따른 파골세포 분화 마커(NFATc1, c-Fos)의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 확인한 사진이다.
도 6은 단화 추출물의 처리에 따른 MAP kinase(p38, ERK, JNK)의 인산화 수준을 웨스턴 블롯으로 확인한 사진이다.
실험의 정량적인 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다. 통계적인 차이는 Student's t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.05 이하인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하여 별표(*)로 표시하였다(p values *<0.05, **<0.01, ***<0.001 versus control).
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험재료
재조합 마우스 RANKL(receptor activator of nuclear factor-ĸB ligand)과 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor)은 R&D System(MN)에서 구입하였고, 세포 배양배지, 우태아혈청(FBS), 및 페니실린/스트렙토마이신은 Inbitrogen Life Technologies(NY)에서 구입하였다. CCK-8 분석 키트는 Dojindo Molecular Technologies(ML)로부터 구입하였고, 역전사 및 실시간 PCR(real-time PCR) master mix 에 사용되는 모든 시약은 Enzynomics(KR)사의 것이다. NFATc1 단일클론 항체 및 액틴 다클론항체는 SantaCruz Biotechnology(CA, USA)로부터 구입하였다.
실시예 1: 단화 추출물 및 분획물의 제조
단화는 2012년 방글라데시, 다카(Dhaka), 바나니 (Banani) 지역의 카코리-바나니(Kakoli-Banani) 도로 주변에서 확보하여 종 동정은 방글라데시의 식물전문가인 Md Salah Uddin 박사가 현지에서 형태적으로 동정하였다. 동정된 단화는 99.9% 메틸 알코올에 넣어 45℃에서 3일 동안 추출되었다. 추출 시 15분의 소니케이션(sonication) 후, 2시간 정지과정을 10회/1일 과정을 거쳤다. 이후, 무형광 솜 필터를 이용하여 여과를 하고, 45℃에서 회전 증발기(rotary evaporator; N-1000SWD; EYELA)를 활용하여 농축을 하고, 모듈 스핀 40(Biotron co.)를 활용하여 24시간 동안 건조하였다. 이후, 추출물은 -4℃ 저온실에 보관하였고, 실험에 사용된 추출물은 20 mg/tube 형태로 용매를 제거한 뒤, DMSO로 녹여 50 mg/ml의 농도로 희석하여 사용하였다.
실시예 2: 파골세포의 배양 및 분화
5주령 마우스의 넙다리뼈와 정강뼈를 분리하고 뼈속질 공간을 1cc 주사기를 이용하여 항생제(100 units/mL 페니실린, 100mg/mL 스트렙토마이신)가 포함된 a-MEM 배지로 세척하여 골수세포를 얻었다. 분리된 골수세포는 10% FBS, 항생제, M-CSF(30ng/ml)가 포함된 α-MEM(α-minimum essential medium) 배지에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 부착된 세포를 포식세포(bone marrow macrophage, BMM)로 사용하였다.
포식세포는 RANKL(10ng/ml)과 M-CSF(30ng/ml)을 첨가하여 배양하고 실시예 1에서 제조한 단화 추출물 및 분획물을 농도 별(0, 2.5, 5, 10, 20 및 40μg/ml)로 처리하였다. 4일 후, 배양한 세포는 TRAP(tartarate resistance acid phosphatase) 용액(Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포는 파골세포로 간주하였다.
실험예 1: 단화 추출물 및 분획물의 세포독성 평가
포식세포는 1Х104/well의 밀도로 96-well plate에서 단화 추출물 및 분획물과 M-CSF(30ng/ml)를 첨가하여 3일간 배양하였다. 3일 후, CCK 용액 50μl를 각각의 well에 첨가하고 4시간 배양 후 ELISA reader(Molecular Device, CA, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 확인하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군의 생존률 100%에 대하여 단화 추출물 및 분획물을 농도 별(0, 2.5, 5, 10, 20 및 40μg/ml)로 처리한 결과, 모든 농도에서 약 100%의 세포 생존률을 나타내어 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
이러한 결과는 추후에 확인할 파골세포 형성 억제활성 포식세포 상에서의 독성 효과 때문이 아니라, 단화 추출물 및 분획물에 의한 파골세포의 억제활성임을 보여주는 것이다.
실험예 2: 단화 추출물 및 분획물의 파골세포 형성 억제활성 분석
실험예 2-1: TRAP 억제활성 분석
다핵 파골세포는 실시예 1의 단화 추출물 및 분획물을 10분 동안 3.7% 포르말린으로 고정하고 0.1% Triton X-100으로 세포막의 투과성이 높아지면 TRAP용액을 처리하여 붉게 염색하였다. 상기 염색된 파골세포는 3개 이상의 핵을 갖는 것만 파골세포로 인정하였다. TRAP 활성도는 TRAP이 염색된 파골세포에 3mM 파라-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl phosphate,Sigma Aldrich, USA)가 함유된 TRAP 완충용액(100mM sodium citrate pH 5.0, 50mM sodium tartrate)을 처리하여 37℃에서 5분간 반응시키고 반응된 상층액을 새로운 플레이트에 옮긴 후 0.1N NaOH를 동량으로 첨가해 405nm에서 흡광도를 확인하였다.
도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, RANKL에 의하여 유도된 붉게 염색된 파골세포에 단화 추출물을 처리하면 농도 의존적으로 TRAP 활성도를 억제하면서 붉게 염색된 파골세포 수를 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다.
이는 단화 추출물 및 분획물이 RANKL-유도 파골세포 형성을 억제함을 시사하는 것이다.
실험예 2-2: 파골세포 분화관련 유전자 발현 억제활성 (RT-PCR)
파골세포의 분화 과정에 관여하는 핵심적인 분화 마커들의 mRNA 발현 양상을 확인하기 위하여 RT-PCR 분석을 수행하였고, 구체적으로 NFATc1, c-Fos, TRAP, DC-STAMP, Cathepsin K의 양상을 확인하였다.
RNA는 상기 실시예 2에서 배양한 세포들에서 TRIzol(Invitrogen) 용액으로 제조사의 방법에 따라 분리하였다. 분리한 RNA 1μg은 oligo dT primer, dNTP, 버퍼, dithiothreitol, RNase inhibitor와 Superscript Ⅱ reverse transcriptase를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA는 프라이머를 이용하여 SYBR green을 이용한 real-time PCR 증폭으로 결과를 얻었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 세포 중 마커의 발현 수준을 0으로 하였을 때, 파골세포의 분화를 유도하는 RANKL 처리(Vehicle)시 모든 마커들의 발현 향상이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 본 발명에 따른 단화 추출물 및 분획물(20μg/ml)을 처리한 경우, 증가한 모든 파골세포의 분화 마커들의 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2-3: 파골세포 분화관련 단백질 발현 억제활성 (웨스턴 블롯)
파골세포의 분화 과정에 관여하는 핵심적인 분화 마커 중 NFATc1 및 c-Fos의 단백질 발현 양상을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
구체적으로 실시예 2에서 배양한 세포는 용해 버퍼(50mM tris-Cl, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 1% Triton X-100, 1mM sodium fluoride, 1mM sodium vanadate, 1% deoxycholate, 및 protease inhibitors)를 이용하여 용해하였고, 원심분리(14,000rpm)를 수행하여 순수한 단백질을 얻었다. 단백질은 DC Protein assay kit(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량하고 동량의 단백질은 10% SDS-polyacrilamide gel에서 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF 막(Amersham Biosciences)으로 옮기고 항체를 이용하여 단백질 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, NFATc1 및 c-Fos의 단백질 발현은 RANKL의 처리로 증가하였으며, 단화 추출물 및 분획물을 처리한 결과 NFATc1 및 c-Fos의 단백질 발현이 현저하게 감소한다는 것을 확인할 수 있었다.
이는 단화 추출물 및 분획물이 NFATc1 및 c-Fos의 단백질 발현을 억제시키고, 나아가 파골세포 형성을 억제시킴을 시사하는 것이다.
실험예 2-4: 파골세포 분화 신호 전달 체계 (웨스턴 블롯)
파골세포의 분화 신호 전달 체계인 MAP 키나아제 중 p38, ERK 및 JNK의 인산화 양상을 확인하고, 단화 추출물 및 분획물이 어느 신호 전달 체계를 통해 파골세포의 분화에 작용하는 것인지를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
구체적으로 실시예 2에서 배양한 세포는 용해 버퍼(50mM tris-Cl, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 1% Triton X-100, 1mM sodium fluoride, 1mM sodium vanadate, 1% deoxycholate, 및 protease inhibitors)를 이용하여 용해하였고, 원심분리(14,000rpm)를 수행하여 순수한 단백질을 얻었다. 단백질은 DC 단백질 어세이 키트(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량하고 동량의 단백질은 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF 막(Amersham Biosciences)으로 옮기고 항체를 이용하여 단백질 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, p38, ERK 및 JNK의 인산화는 RANKL을 처리하면 5분 내로 이루어지고, 단화 추출물을 처리한 결과 p38 및 JNK의 인산화는 약하게 일어나고 ERK의 인산화는 지연되는 것을 확인 할 수 있었다.
단화 추출물의 파골세포 분화 억제는 RANKL에 의한 MAP 키나아제의 인산화 억제로 기인됨을 알 수 있었다.
이상의 결과를 통해 본 발명에 따른 단화 추출물 및 분획물이 파골세포 형성 또는 분화의 억제 활성을 가짐을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

  1. 단화(Anthocephalus chinensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 조성물은 10μg/ml 이상으로 포함되고 파골세포의 분화를 억제하는 것이 특징인, 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 탄소수 6(C6)의 알코올 또는 이의 혼합용매를 사용하여 추출하는 것인, 약학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 파골세포 분화에 관여하는 단백질의 발현을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  6. 단화(Anthocephalus chinensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
    상기 조성물은 10μg/ml 이상으로 포함되고 파골세포의 분화를 억제하는 것이 특징인, 식품 조성물.
  7. 단화(Anthocephalus chinensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물로서,
    상기 조성물은 10μg/ml 이상으로 포함되고 파골세포의 분화를 억제하는 것이 특징인, 의약외품 조성물.
  8. 단화(Anthocephalus chinensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 개선용 사료 조성물로서,
    상기 조성물은 10μg/ml 이상으로 포함되고 파골세포의 분화를 억제하는 것이 특징인, 사료 조성물.
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Title
Anthocephalus Cadamba: A Review, Pharmacognosy Journal | January 2011 | Vol 2 | Issue 18
Asian Pacific Journal of Tropical Medicine
Kadamba-Neolamarckia Cadamba Benefits & Uses, Better ayurveda, Dr.Anu Saini, 인터넷 사이트: https://www.betterayurveda.com/kadamba-neolamarckia-cadamba-benefits-uses/*
Trends In Carbohydrate Research, Vol.4, No.1, pp. 42-46, 2012.01.31

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