KR20180006747A

KR20180006747A - 암에 대한 방사선 치료 증진용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20180006747A
Application number: KR1020160087524A
Authority: KR
Inventors: 장항석; 김석모; 박기청
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2016-07-11
Filing date: 2016-07-11
Publication date: 2018-01-19
Also published as: KR101916283B1

Abstract

본 발명은 암에 대한 방사선 치료 효과를 증진시킬 수 있는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 히스톤 탈아세틸화 저해제(Histone Deacetylation inhibitor, HDAC inhibitor) 및 키나아제 저해제(kinase inhibitor)를 유효 성분으로 포함하는 암에 대한 방사선 치료 증진용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

암에 대한 방사선 치료 증진용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for enhancing the radiotherapy of cancer}

본 발명은 암에 대한 방사선 치료 효과를 증진시킬 수 있는 약학적 조성물에 관한 것이다.

암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리나라의 경우, 질병 사망원인 중 제 1위의 질병으로서 연간 약 10만 명 이상이 진단되고, 약 6만 명 이상이 사망하고 있다.

현재 암 환자 중 국내 35 %, 미국의 경우 50 % 정도가 방사선 치료를 받고 있으며, 국내에서도 방사선 치료를 받는 암 환자의 비중이 꾸준히 증가하고 있고, 암 치료에 있어 방사선 치료의 중요성 또한 증가하고 있다. 이와 같이 방사선 치료는 현재 다양한 종류의 암에 필수적인 치료방법으로 알려져 있으나 암세포의 방사선 저항성, 저산소증 세포의 존재는 종래 암 방사선치료에서 국부적 실패를 일으키는 중요한 인자이다 (Int. J. Radiation oncology Biol. Phys., 1988, 14, 831-833). 또한, 이러한 방사선 항암 치료의 실패에 따라 방사선량을 증가시킨 고선량 방사선 조사 치료 시 인체정상조직의 파괴 등 방사선 치료의 부작용이 나타나는 문제점이 대두되었다.

따라서, 방사선 치료 시 그 효율성을 증대시킬 수 있는 방사선 치료 증진제 및 방사선 증감성 화합물에 관한 연구들이 계속 진행되고 있다 (Oncogene, 2004, 23, 1599-1607; Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., 2006, 64(5), 1466-1474; Clin, Cancer Res, 2007, 13(16), 4891-4899).

한편, 갑상선 암은 남성보다는 특히 여성에게 많이 발병되는 암으로써 국가암정보센터의 암 발병률을 살펴보면 2002년 기준 여성 전체 암의 7.4%를 차지하고 있다. 최근 대한갑상선 질병학회에 보고된 자료에 의하면 2006년 기준 국내 암 발병률의 4위를 차지하고 있으며 여성의 경우는 1위를 차지하고 있다.

이러한 갑상선 암은 내분비계의 가장 흔한 악성종양으로 유두암 (Papillary carcinoma), 여포암 (Follicular carcinoma), 허들세포암 (Hurthle cell neoplasm, 여포 선암종), 역형성암 (Anaplastic carcinoma, 미분화 갑상선암), 수질암 (Medullary thyroid carcinoma) 등이 포함된다.

갑상선 암의 원인으로는 방사선 노출, 성호르몬 등으로 알려져 있으나 아직 정확한 원인에 대한 규명은 이루어지지 않고 있다. 갑상선 암은 다른 암에 비해 발병률이 높기는 하지만 진단이 조기에 이루어져 조기에 수술을 할 수 있다면 생존률이 높은 편에 속한다. 하지만, 이미 진행된 암에 있어서는 특히 방사능 요오드(RAI) 치료에 반응하지 않는 경우 치료가 어려운 문제점이 있다.

따라서, 최근 갑상선 암을 보다 효과적으로 치료하기 위한 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

본 발명의 일 목적은 암에 대한 방사선 치료 효과를 증진시킬 수 있는 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 방사선 치료 증진제로서 투여하여 방사선 치료 효과를 증진시킬 수 있는 암의 방사선 치료 방법을 제공하고자 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 히스톤 탈아세틸화 저해제(Histone Deacetylation inhibitor, HDAC inhibitor) 및 키나아제 저해제(kinase inhibitor)를 유효 성분으로 포함하는 암에 대한 방사선 치료 증진용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 히스톤 탈아세틸화 저해제는 유전자 발현 조절 기작에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 히스톤 탈아세틸화 효소(Histone deacetylase; HDAC)의 활성을 저해하는 것으로, 히스톤의 과아세틸화(Hypoacetylation)와 이에 따른 유전자 발현의 변화를 유도한다. 상기 히스톤 탈아세틸화 저해제는 a) 금속(특히, 아연)과 결합 가능한 영역(domain), b) 상기 히스톤 탈아세틸화 효소의 채널을 채울 수 있는 링커(linker), 및 c) 히스톤 탈아세틸화 효소 활성 영역의 가장자리에서 구조체들과 상호 작용할 수 있는 표면 인지 영역의 구조적인 특징을 갖고 있다(J. Med. Chem., 2003, 46(24), 5097-5116). 본 발명에서 상기 히스톤 탈아세틸화 저해제로는 하기 화학식 1로 표시되는 (N-하이드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노마이드)((N-hydroxy-7-(2-naphthylthio) heptanomide))일 수 있다:

[화학식 1]

또한, 본 발명에서 상기 키나아제 저해제(kinase inhibitor)는 VEGFR, PDGFR 및 Raf를 표적으로 하는 멀티 키나아제 저해제일 수 있고, 바람직하게는 소라페닙(일반명 Sorafenib; 상품명 Nexavar, 넥사바)일 수 있다. 본 발명에서 상기 소라페닙은 하기 화학식 2로 표시되며, 4-(4-(3-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레이도)페녹시)-N-메틸피콜리나마이드(4-(4-(3-(4-Chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl)ureido)phenoxy)-N-methylpicolinamide)일 수 있다:

[화학식 2]

또한, 본 발명에서 상기 히스톤 탈아세틸화 저해제와 키나아제 저해제는 1:1~100의 중량비로 사용될 수 있고, 바람직하게는 1:2~20의 중량비로 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 히스톤 탈아세틸화 저해제 중에서도 특히 (N-하이드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노마이드)와, 키나아제 저해제 중에서도 특히 4-(4-(3-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레이도)페녹시)-N-메틸피콜리나마이드를 병용 투여할 경우, 시너지 효과에 의하여 암에 대한 방사선 치료 시 암 세포 뿐만 아니라, 항암제에 대한 내성이나 암의 재발을 야기한다고 알려진 암 줄기세포의 성장 또한 효과적으로 억제하여, 최종적으로는 암을 예방 또는 치료할 수 있으며, 더 나아가서는 항암제에 대한 내성이나, 암의 전이 또는 암의 재발을 방지할 수 있다.

본 발명에서 방사선 치료의 대상이 되는 암의 종류는 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, 갑상선암, 유방암, 담도암, 담낭암, 췌장암, 대장암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 혈액암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 암일 수 있고, 바람직하게는 갑상선암일 수 있다.

본 발명에서, "치료"는 방사선을 조사하여 암 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학적 조성물을 이용하여 암 증상을 차단하거나, 암 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 다른 항암제와도 추가로 병용 투여할 수 있으며, 이를 통해서 암에 대한 방사선 치료 효과를 더욱 증강시킬 수 있다.

여기서 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.

본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 방사선 치료 증진용 약학적 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계; 및 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 암에 대한 방사선 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 제공하는 방사선 치료 증진용 약학적 조성물을 투여한 뒤 방사선을 조사하는 경우 시너지 효과에 따라 방사선 치료 효과를 현저히 증진시킬 수 있으며, 구체적으로는 암 세포뿐만 아니라, 항암제에 대한 내성이나 암의 재발을 야기한다고 알려진 암 줄기세포의 성장 또한 효과적으로 억제하여, 최종적으로는 암을 예방 또는 치료할 수 있으며, 더 나아가서는 항암제에 대한 내성이나, 암의 전이 또는 암의 재발을 방지할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 방사선 치료의 대상이 되는 동물은 인간, 가축, 및 애완동물을 포함한 임의의 포유류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 방사선 조사는 종래 암의 방사선 치료를 위해 사용되었던 임의의 방사선 조사 방법 혹은 추후 개발되는 암에 대한 방사선 조사 방법이 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물을 투여한 뒤 방사선 치료를 하는 경우, 방사선 치료 효과가 현저히 증진되어, 암 세포뿐만 아니라, 항암제에 대한 내성이나 암의 재발을 야기한다고 알려진 암 줄기세포의 성장 또한 효과적으로 억제하여, 최종적으로는 암을 예방 또는 치료할 수 있으며, 더 나아가서는 항암제에 대한 내성이나, 암의 전이 또는 암의 재발을 방지할 수 있다.

도 1의 (a)는 실험예 1에서 약물 처리 농도에 따른 8505C 세포 생존율의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 1의 (b)는 실험예 1에서 약물 처리 농도에 따른 KSA1 세포 생존율의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2의 (a)는 실험예 2에서 약물 처리 시간에 따른 별 8505C 세포수의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2의 (b)는 실험예 2에서 약물 처리 시간에 따른 별 KSA1 세포수의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3의 (a)는 실험예 3에서 8505C 세포를 접종하고, 각 약물의 처리 후 시간에 따른 종양의 부피의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3의 (b)는 실험예 3에서 KSA1 세포를 접종하고, 각 약물의 처리 후 시간에 따른 종양의 부피의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4의 (a)는 실험예 3에서 8505C 세포를 접종하고 각 약물의 처리 후 40일이 경과한 뒤 측정된 종양의 무게를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4의 (b)는 실험예 3에서 KSA1 세포를 접종하고 각 약물의 처리 후 40일이 경과한 뒤 측정된 종양의 무게를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5의 (a)는 실험예 4에서 8505C 세포를 접종하고 각 약물의 처리 후 시간에 따른 마우스의 몸무게의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5의 (b)는 실험예 4에서 KSA1 세포를 접종하고 각 약물의 처리 후 시간에 따른 마우스의 몸무게의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

[준비예 1] KSA1 세포의 준비

연세대학교 의과대학 강남 세브란스 병원(서울, 대한민국)에서 생화학적 및 조직학적으로 미분화성 갑상선암(anaplastic thyroid cancer, ATC)으로 판정받은 환자로부터 종양 조직을 얻었다. 구체적으로는 상기 ATC 초기 위치 및 전이 위치로부터 종양을 제거하는 외과적 절제 수술에 의하여 종양 덩어리를 수득한 뒤, 1일 경과 후 항진균제 및 항생제를 첨가한 식염수에 보관하였다. 이후, 상기 종양 덩어리로부터 정상적인 조직과 지방을 제거하고, 종양 조직만을 1X HBSS로 세척하였다. 종양 조직을 해리 배지(dissociation medium) 내에서 분쇄하였다. 이때, 상기 해리 배지로 1mg/ml 콜라게나아제 타입 Ⅳ(Sigma, USA)로 보충된 20% FBS가 첨가된 DMEM/F12를 사용하였고, 분쇄되어 부유하고 있는 종양 세포는 50ml 1X HBSS로 세척하면서 멸균된 70-마이크론 포어 나일론 세포 스트레이너(cell strainer)(BD Falcon)를 이용하여 걸러낸 뒤, 1,400rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 이 후, 수득된 세포를 10% 소태아혈청(Hyclone) 및 2% 페니실린/스트렙토마이신 용액(Gibco, Grand Island, NY, USA)가 추가된 RPMI-1640(Hyclone, South Logan, UT, USA) 배지에서 재부유시켰다.

[준비예 2] 8505C 세포의 준비

환자 유래 악성 갑상선 종양 세포주 8505C을 ATCC(American Type Culture Colleciton)로부터 구입한 뒤, 10% 소태아혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.

[실험예 1]세포 생존율 평가(Cell viability assay)

HNHA 및 소라페닙의 처리에 따라 방사선 조사 시 세포 생존율의 변화는 MTT 어쎄이를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 8505C 및 KSA1 세포 각각을 96-웰 플레이트에 각 웰 당 5 X 10³ 개의 세포수로 분주한 뒤, 70% 컨플루언시(confluency)가 되도록 밤새 배양하였다. HNHA, 소라페닙 및 HNHA과 소라페닙의 1:1 농도비 혼합물을 0 ~ 64μM의 농도로 처리하였고, 음성 대조군으로는 아무런 처리를 하지 않았다. 이 후, 세포에 Faxitron X-레이(Faxitro Bioptics, AZ, USA)를 조사(RT)하였다. 방사선 조사 후 48시간이 경과한 뒤, MTT를 첨가하여 추가로 배양하였고, 이후 490nm에서 흡광도를 측정하여 각 세포주 별 세포 생존율 변화를 도 1의 (a) 및 (b)에 그래프로 나타내었다. 또한, 약물 처치에 대한 세포 민감도는 50%의 세포 저해가 나타나는 약물 농도(IC₅₀)로 표현하여 하기 표 1에 나타내었다. 모든 실험은 3회 실시하였다. 데이터는 운반체-처리된 세포(vehicle-treated cell)에서 관찰된 신호의 퍼센티지로 나타내되, 3번 반복된 실험의 평균(SEM) 값에 대하여 평균±표준편차로 나타낸 것이다.

세포주	조직 병리학 (Histopathology)	유래	세포 민감도 IC₅₀(μM)
세포주	조직 병리학 (Histopathology)	유래	HNHA	소라페닙	HNHA+RT	소라페닙+RT	HNHA+소라페닙+RT
8505C	미분화성 갑상선암	인간	16.19 (±0.6)	10.17 (±0.6)	6.71 (±0.1)	7.12 (±0.9)	2.74 (±0.6)
KSA1	미분화성 갑상선암	인간	18.16 (±0.4)	12.14 (±0.5)	8.14 (±1.3)	10.33 (±0.7)	4.08 (±0.2)

상기 표 1에서 보는 바와 같이, HNHA 및 소라페닙을 병용 처리한 후 방사선을 조사한 경우가, HNHA 또는 소라페닙만을 단독으로 처리한 경우나, 혹은 이들을 각각 처리한 뒤 방사선을 조사한 경우에 비하여, IC₅₀이 현저히 감소되어 매우 낮은 농도로도 50%의 세포 저해 효과를 확인할 수 있다.

또한, 도 1에서 보는 바와 같이, 갑상선 암 줄기세포로 알려져 있으며, 항암제에 대하여 저항성을 보이는 8505C 세포(Endocrine Journal 2014, 61 (5), 481-490)와, ATC 환자 유래 KSA1 세포 모두에서 HNHA 또는 소라페닙을 단독으로 처리한 뒤 방사선을 조사한 경우보다, HNHA와 소라페닙을 병용 처리한 후 방사선을 조사한 경우가 세포 생존율이 농도에 비례하여 현저히 감소하는 것을 볼 수 있다.

[실험예 2]세포 증식 평가

HNHA 및 소라페닙의 처리에 따른 세포 증식능의 변화는 트리판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion method)를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 8505C 및 KSA1 세포 각각을 6-웰 플레이트에 분주한 후, HNHA, 소라페닙, 및 HNHA과 소라페닙의 혼합물을 하기 표 2에 나타낸 농도로 처리하고, Faxitron X-레이(Faxitro Bioptics, AZ, USA)를 조사(RT)하였다. 이 후 24시간 동안 배양하한 뒤, 배지를 제거하고 0.04% 트리판 블루(trypan blue)를 첨가하여 7일 동안 추가로 배양하면서 매일 헤마토사이토미터(heamocytometer)를 이용하여 살아있는 세포수를 측정하여 그 결과를 도 2의 (a) 및 (b)에 나타내었다.

구분	HNHA(μM)	소라페닙(μM)
비교예 1	-	-
비교예 2	2.28	-
비교예 3	-	5.14
실시예 1	0.87	0.87

도 2에서 보는 바와 같이, 갑상선 암 줄기세포로 알려져 있으며, 항암제에 대하여 저항성을 보이는 8505C 세포와, ATC 환자 유래 KSA1 세포 모두에서 방사선만 조사한 경우나, HNHA 또는 소라페닙을 단독으로 처리한 후 방사선을 조사한 경우에 비하여 HNHA와 소라페닙을 병용 처리한 후 방사선을 조사한 경우가 세포 증식 억제 효과가 현저히 뛰어난 것을 볼 수 있다.

[실험예 3]인간 갑상선암 세포의 동물 이식모델

8505C 및 KSA1 세포를 인-비트로에서 배양한 뒤, BALB/c 누드 암컷 마우스의 왼쪽 위 옆구리의 피하에 배양한 세포를 2.0 X 10⁷cell/마우스가 되도록 주입하였다. 7일 후, 10마리씩 그룹화한 뒤, 각 그룹별로 25mg/kg HNHA, 80mg/kg 소라페닙, 및 6.5mg/kg HNHA와 25mg/kg 소라페닙의 혼합물을 2일에 한번씩 주입하여 총 10~12회 주입하였다. 이 후, Small Animal Radiation Research Platform (SARRP) [High-resolution, small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities/PMID; 18640502]을 이용하여 마우스를 처리하였다. 즉, 종양 부위에 1cm 직경의 원형 빔을 3Gy의 3 연속 일일 선량으로 조사하였다. 40일 간 캘리퍼스(calipers)를 이용하여 매일 종양의 부피를 측정하였다. 여기서, 종양의 부피는 하기 공식을 이용하여 평가하였다. 또한, 40일 후 마우스를 해부하여 종양의 무게를 측정하였다. 상기 실험은 특정한 무균의 조건(specific pathogen-free, SPF) 하에서 수행되었다. 각 세포주별 종양의 부피 변화는 도 3에, 40일 후 측정된 종양의 무게는 도 4에 그래프로 나타내었다.

종양의 부피 = L X S²/2

(단, L은 가장 긴 직경, S는 가장 짧은 직경을 의미한다)

도 3 및 도 4에서 보는 바와 같이 8505C 및 KSA1 세포 모두에서 방사선만 조사한 경우나, HNHA와 소라페닙 각각을 단독으로 처리한 뒤 방사선을 조사한 경우에 비하여 HNHA와 소라페닙을 병용 처리한 후 방사선을 조사한 경우가 종양의 성장 억제 효과가 현저히 뛰어난 것을 볼 수 있다.

[실험예 4]인-비보 독성 평가(In vivo toxicity assay)

8505C 및 KSA1 세포를 인-비트로에서 배양한 뒤, BALB/c 누드 암컷 마우스의 왼쪽 위 옆구리의 피하에 배양한 세포를 2.0 X 10⁷cell/마우스가 되도록 주입하였다. 7일 후, 10마리씩 그룹화한 뒤, 각 그룹별로 25mg/kg HNHA, 80mg/kg 소라페닙, 및 6.5mg/kg HNHA와 25mg/kg 소라페닙의 혼합물을 복강 혹은 경구 투여하였다. Small Animal Radiation Research Platform (SARRP) [High-resolution, small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities/PMID; 18640502]을 이용하여 마우스를 처리하였다. 즉, 종양 부위에 1cm 직경의 원형 빔을 3Gy의 3 연속 일일 선량으로 조사하였다. 독성 또는 치명성의 외부 신호를 확인하기 위하여 마우스를 정기적으로 모니터링하였다. 케이지별로 마우스를 5마리씩 넣고, 22℃, 40~60% 습도에서 12시간 주기로 빛을 조절해주었다. 40일 간 마우스의 몸무게의 변화를 측정하여 그 결과를 주입한 각 세포주 별로 도 5의 (a) 및 (b)에 그래프로 나타내었다.

일반적으로 약물의 부작용 발생시 간독성으로 인한 몸무게 변화가 크게 발생하지만, 도 5의 (a) 내지 (b)에서 보는 바와 같이 HNHA와 소라페닙을 병용 처리한 후 방사선을 조사한 경우에도 몸무게의 변화가 크게 발생하지 않아 부작용이 없는 것을 알 수 있다.

단, 상기 실험에 있어서 통계적 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)를 이용하여 수행하였고, 면역조직화학 결과는 일원 변량 분석(ANOVA)과 Bonferroni post hoc 테스트로 얻었다. 값들은 평균±SEM으로 나타내었고, P 값이 0.05 미만인 경우 유의한 결과인 것으로 판단하였다.

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims

히스톤 탈아세틸화 저해제(Histone Deacetylation inhibitor, HDAC inhibitor) 및 키나아제 저해제(kinase inhibitor)를 유효 성분으로 포함하는 암에 대한 방사선 치료 증진용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 히스톤 탈아세틸화 저해제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인, 약학적 조성물:
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 키나아제 저해제는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인, 약학적 조성물:
[화학식 2]
제1항에 있어서,
상기 히스톤 탈아세틸화 저해제와 키나아제 저해제는 1:1~100의 중량비로 포함되는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 암은 암 줄기세포를 포함하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 암은 갑상선암, 유방암, 담도암, 담낭암, 췌장암, 대장암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 혈액암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 약학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 암은 갑상선암인, 약학적 조성물.
히스톤 탈아세틸화 저해제(Histone Deacetylation inhibitor, HDAC inhibitor) 및 키나아제 저해제(kinase inhibitor)를 유효 성분으로 포함하는 암에 대한 방사선 치료 증진용 약학적 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계; 및
방사선을 조사하는 단계를 포함하는 암에 대한 방사선 치료 방법.
제8항에 있어서,
상기 히스톤 탈아세틸화 저해제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인, 치료 방법:
[화학식 1]
제8항에 있어서,
상기 키나아제 저해제는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인, 치료 방법:
[화학식 2]
제8항에 있어서,
상기 암은 암 줄기세포를 포함하는, 치료 방법.
제8항에 있어서,
상기 암은 갑상선암, 유방암, 담도암, 담낭암, 췌장암, 대장암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 혈액암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 치료 방법.