KR101941045B1 - 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 히스톤 탈아세틸화 저해제(Histone Deacetylation inhibitor, HDAC inhibitor) 및 혈관내피 세포증식인자 수용체(vascular endothelial cell growth factor receptor, VEGFR) 키나아제 저해제(kinase inhibitor)를 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 히스톤 탈아세틸화 저해제와 혈관 내피세포 증식 인자 수용체 키나아제 저해제를 함께 사용하여 암 세포 또는 암 줄기세포의 증식을 효과적으로 억제하여, 암을 예방 또는 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 항암제에 대한 내성이나, 암의 전이 또는 재발 또한 방지할 수 있다.

Description

암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing and treating cancer}
본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암 세포 또는 암 줄기세포의 성장을 효과적으로 억제하여 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있으며, 더 나아가 내성암의 내성을 극복할 수 있는 약학적 조성물에 관한 것이다.
암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리나라의 경우, 질병 사망원인 중 제1위의 질병으로서 연간 약 10 만 명 이상이 진단되고, 약 6 만 명 이상이 사망하고 있다.
이러한 암의 유발 인자인 발암물질로는 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발 원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다. 현재 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 암 세포만을 선택적으로 제거하지 못하므로, 암의 발생 후 이의 치료뿐 아니라, 암의 발생을 예방하기 위한 독성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 절실히 필요하다.
한편, 갑상선 암은 남성보다는 특히 여성에게 많이 발병되는 암으로써 국가암 정보센터의 암 발병률을 살펴보면 2002년 기준 여성 전체 암의 7.4%를 차지하고 있다. 최근 대한갑상선 질병학회에 보고된 자료에 의하면 2006년 기준 국내 암 발병률의 4위를 차지하고 있으며 여성의 경우는 1위를 차지하고 있다.
이러한 갑상선 암은 내분비계의 가장 흔한 악성종양으로 유두암 (Papillary carcinoma), 여포암 (Follicular carcinoma), 허들세포암 (Hurthle cell neoplasm, 여포 선암종), 역형성암 (Anaplastic carcinoma, 저분화 갑상선암), 수질암 (Medullary thyroid carcinoma) 등이 포함된다.
갑상선 암의 원인으로는 방사선 노출, 성호르몬 등으로 알려져 있으나 아직 정확한 원인에 대한 규명은 이루어지지 않고 있다. 갑상선 암은 다른 암에 비해 발병률이 높기는 하지만 진단이 조기에 이루어져 조기에 수술을 할 수 있다면 생존률이 높은 편에 속한다. 하지만, 이미 진행된 암에 있어서는 특히 방사능 요오드(RAI) 치료에 반응하지 않는 경우 치료가 어려운 문제점이 있다.
따라서, 최근 갑상선 암을 보다 효과적으로 치료하기 위한 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
[비특허문헌 1]
Cancer Res, 64, 제6626-6634쪽 (2004.09.15.)
본 발명의 일 목적은 암 세포 또는 암 줄기세포의 성장을 효과적으로 억제하여 암 세포의 증식, 침윤 및 전이를 억제함에 따라 최종적으로는 암을 예방 및/또는 치료할 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 암 세포 또는 암 줄기세포에 있어서 암 치료용 약물에 대한 내성의 생성을 방지하거나 혹은 이미 생성된 내성을 극복하여 암 치료용 약물에 대한 감수성을 증진시킬 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 히스톤 탈아세틸화 저해제(Histone Deacetylation inhibitor, HDAC inhibitor) 및 혈관내피 세포증식인자 수용체(vascular endothelial cell growth factor receptor, VEGFR) 키나아제 저해제(kinase inhibitor)를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "히스톤 탈아세틸화 저해제"는 유전자 발현 조절 기작에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 히스톤 탈아세틸화 효소(Histone deacetylase; HDAC)의 활성을 저해하는 것으로, 히스톤의 과아세틸화(Hypoacetylation)와 이에 따른 유전자 발현의 변화를 유도한다. 상기 히스톤 탈아세틸화 저해제는 a) 금속(특히, 아연)과 결합 가능한 영역(domain), b) 상기 히스톤 탈아세틸화 효소의 채널을 채울 수 있는 링커(linker), 및 c) 히스톤 탈아세틸화 효소 활성 영역의 가장자리에서 구조체들과 상호 작용할 수 있는 표면 인지 영역의 구조적인 특징을 갖고 있다(J. Med. Chem., 2003, 46(24), 5097-5116). 본 발명에서 상기 히스톤 탈아세틸화 저해제로는 하기 화학식 1로 표시되는 N-하이드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노마이드(N-hydroxy-7-(2-naphthylthio)heptanomide) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염일 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112017076768376-pat00001
본 발명에서 상기 화학식 1로 표시되는 N-하이드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노마이드는 'HNHA'라고 불리우며, 히스톤 디아세틸라제(histone deacetylase, HDAC) 활성의 세포 투과성 억제제로, 세포 주기의 진행을 억제하며 히스톤 하이퍼아세틸화(histone hyperacetylation) 및 p21 전사를 유도한다. HNHA는 종양 성장을 억제하며, 인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)의 성장을 억제하고, 튜브 형성과 HUVECs의 이동을 억제한다.
본 발명에서 상기 "혈관 내피세포 증식 인자 수용체(이하, 'VEGFR'이라 한다.)”는 혈관 신생의 발병의 조절에 수반되는 것으로 공지되어 있다. 특히 고형 종양은 충분한 혈액 공급에 의존하므로, VEGFR 및 이에 따른 혈관 신생의 억제는 상기 종양의 치료에 대한 임상 조사 중에 있고, 유망한 결과를 보여준다. 상기 VEGFR의 경로 저해 물질은 VEGFR에 직접적으로 작용하여 경로를 저해하는 물질이거나, 키나아제 저해제와 같이 VEGFR의 경로(pathway)를 차단할 수 있는 물질을 포함하는 의미이다. 본 발명에서는 VEGFR 티로신 키나아제 저해제를 사용하며, 보다 바람직하게 상기 VEGFR 티로신 키나아제 저해제는 렌바티닙(일반명 Lenvatinib; 상품명 Lenvima, 렌비마) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염일 수 있다. 여기서 상기 렌바티닙은 하기 화학식 2로 표시되는 4-[3-클로로-4-(사이클로프로필카바모일아미노)페녹시]-7-메톡시퀴놀린-6-카복사마이드(4-[3-chloro-4-(cyclopropylcarbamoylamino)phenoxy]-7-methoxyquinoline-6-carboxamide)일 수 있다:
[화학식 2]
Figure 112017076768376-pat00002
본 발명에서 상기 화학식 2로 표시되는 렌바티닙은 티로신 키나아제와 결합하여 혈관 내피세포 증식 인자 및 그 수용체의 활성을 억제하고, 혈관 신생과 관련된 다른 키나아제 수용체를 억제하여, 종양의 성장 및 암의 진행을 억제할 수 있다.
본 발명에서 상기 N-하이드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노마이드 및/또는 렌바티닙은 선택적으로 염 형태로 사용될 수 있다. 무기산 염 또는 유기산 염의 형태로 사용될 수 있으나, 염의 형태를 특별히 한정하는 것은 아니다. 예컨대, 상기 염은 메탄설폰산염(렌바티닙 메실레이트), 염산염, 황산염, 시트르산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 질산염, 중황산염, 인산염, 과인산염, 이소니코틴산염, 아세트산염, 젖산염, 살리실산염, 주석산염, 판토테산염, 아스코르브산염, 숙신산염, 말레산염, 푸마르산염, 글루콘산염, 사카린산염, 포름산염, 벤조산염, 글루타민산염, 에탄설폰산염, 벤젠설폰산염, p-톨루엔선폰산염, 팜산염(pamoate) 등이다.
본 발명에서 상기 히스톤 탈아세틸화 저해제 중에서도 특히 N-하이드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노마이드와, 혈관 내피세포 증식 인자 수용체 키나아제 저해제는 렌바티닙을 병용 투여할 경우, 암 세포의 증식을 효과적으로 억제하여, 암을 예방 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 히스톤 탈아세틸화 저해제와 혈관 내피세포 증식 인자 수용체 키나아제 저해제는 1:0.01~100의 몰비로 사용될 수 있다.
본 발명에서 예방 또는 치료의 대상이 되는 암의 종류는 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, 갑상선암, 유방암, 담도암, 담낭암, 췌장암, 대장암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 혈액암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 암일 수 있고, 바람직하게는 갑상선암일 수 있으며, 보다 바람직하게는 유두 갑상선암(papillary thyroid cancer, PTC)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 히스톤 탈아세틸화 저해제 및 혈관내피 세포증식인자 수용체 키나아제 저해제를 유효 성분으로 포함하는 암 줄기세포의 성장 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 히스톤 탈아세틸화 저해제는 상기 화학식 1로 표시되는 N-하이드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노마이드일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 키나아제 저해제는 상기 화학식 2로 표시되는 4-[3-클로로-4-(사이클로프로필카바모일아미노)페녹시]-7-메톡시퀴놀린-6-카복사마이드, 즉 렌바티닙일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 N-하이드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노마이드 및/또는 렌바티닙은 선택적으로 염 형태로 사용될 수 있다. 무기산 염 또는 유기산 염의 형태로 사용될 수 있으나, 염의 형태를 특별히 한정하는 것은 아니다. 예컨대, 상기 염은 메탄설폰산염(렌바티닙 메실레이트), 염산염, 황산염, 시트르산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 질산염, 중황산염, 인산염, 과인산염, 이소니코틴산염, 아세트산염, 젖산염, 살리실산염, 주석산염, 판토테산염, 아스코르브산염, 숙신산염, 말레산염, 푸마르산염, 글루콘산염, 사카린산염, 포름산염, 벤조산염, 글루타민산염, 에탄설폰산염, 벤젠설폰산염, p-톨루엔선폰산염, 팜산염(pamoate) 등이다.
또한, 본 발명에서 상기 히스톤 탈아세틸화 저해제와 혈관 내피세포 증식 인자 수용체 키나아제 저해제는 1:0.01~100의 몰비로 사용될 수 있다.
본 발명에서 성장 억제의 대상이 "암 줄기세포"란 줄기세포 특유의 능력인 자가재생이나 분화능력을 가지고 있는 포괄적인 의미의 암 세포를 의미한다.
상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 치료 및 예방 대상이 되는 암은 그 발생 부위에 따라 갑상선암, 유방암, 담도암, 담낭암, 췌장암, 대장암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 혈액암 및 간암 등 일 수 있으나, 바람직하게는 갑상선암일 수 있고, 보다 바람직하게는 저분화 갑상선암(anaplastic thyroid cancer, ATC)일 수 있으며, 종양의 분화 및/또는 증식 등 암의 진행이 본 발명에서 기술하는 암 줄기세포에 의존적인 암의 종류라면 이에 제한되지 않는다.
이러한 암 세포로 분화할 수 있는 암 줄기세포는 악성 종양 조직 내에 1 ~ 2% 정도로 존재하며 정상줄기세포의 특성인 자가복제 능력 (self-renewal)과 다른 세포로 분화할 수 있는 전분화능 (pluripotent)을 가지고 있으나 자가 조절 기능에 이상이 있어 세포분열 활성화로 세포 수를 증가하게 되고 스스로 악성 종양 세포로 분화하는 것으로 보고되었다.
1997년 백혈병에서 암 줄기세포(cancer stem cell)의 존재가 밝혀진 이래로 (Blood, 1997), 유방암 (PNAS, 2003), 뇌종양 (Nature, 2004), 전립선암 (Cancer Res, 2005), 대장암 (Nature, 2007), 흑색종 (Nature, 2008)에서도 암 줄기세포가 존재한다는 증거들이 제시되었고. 종양에 포함되어있는 소수의 암 줄기세포가 종양의 악성화, 항암저항성 및 재발의 주된 원인으로 부각되었다.
암 줄기세포들은 다른 암 세포들과 구별되는 표지 인자(marker)가 존재하며, 암 줄기세포의 표지 인자(cancer stem cell marker)로는 하기 표 1과 같이 다양한 암 종 특이적인 암 줄기세포 표지 인자가 알려져 있다.
암종 암 줄기세포 표지인자 출처
교모세포종 CD133
신장암 CD105, CD133 Contemp Oncol (Pozn). 2015; 19(1A): A44-A51
갑상선암 ABCG2, MRP1, LRP 및 CXCR4 J Clin Pathol. 2014 Feb;67(2):125-33
급성골수성백혈병 (AMM) CD34+/CD38-
다발성골수종 (multiple myeloma) CD133-
유방암 CD44+/CD24-/low Breast Cancer Res. 2007; 9(3): 303
대장암 CD133+
전립선암 CD44+/α2β1hi/CD133+
흑색종 (melanoma) ABCB5+
본 발명에서 성장 억제의 대상이 되는 암 줄기세포로는 상기 열거된 암의 줄기세포를 모두 포함할 수 있지만, 특히 갑상선암 줄기세포일 수 있다.
상기한 암 줄기세포들은 끊임없이 자기 재생(self-renewal)을 하며, 실험동물 모델에서 천개 미만의 적은 세포수로도 종양을 만들 수 있으며 악성 종양 세포로서의 능력을 보유하고 있다. 또한 암 치료법인 항암제 치료와 방사선 치료에 놀라울 정도로 저항성을 가지고 있어, 암 줄기세포의 제거는 암 치료의 성패를 가늠할 수 있는 바로미터로 점차 인식되고 있다. 최근에는 수술, 방사선 치료, 항암화학요법 등 기존의 여러 치료 방법을 이용해 암 세포들을 사멸시키더라도 암 줄기세포들을 모두 사멸시키지 못한다면 남아있는 암 줄기세포들로부터 다시 암이 재발할 수 있다는 것으로 인식되고 있다. 이러한 암의 재발을 방지하기 위하여 종양을 재생성할 수 있는 능력을 가진 암 줄기세포를 타겟으로 하는 화학요법 및 이를 바탕으로 암을 치료하고자 하는 치료프로토콜 개발에 관심이 높아지고 있다.
정상 조직에서의 줄기세포는 자가 재생 (self-renewal) 기전에 의해 세포 성장과 분화를 조절하지만, 암 줄기세포는 종양세포 주변의 종양 미세환경 인자에 영향을 받아 비정상적인 자가분열(Self-renewal) 및 유지(maintenance) 경로를 활성화하여 급격히 집적됨으로써 악성화되고, 항암치료에 대한 저항성을 획득하게 되며 궁극적으로 암의 재발을 야기한다고 제시되고 있다. 그러나 아직까지 암 줄기세포의 집적 및 유지를 조절하는 종양 미세 환경 인자의 실체와 상호작용에 대한 구체적인 기전 연구는 진행되지 못하고 있다.
본 발명에서 상기 히스톤 탈아세틸화 저해제 중에서도 특히 N-하이드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노마이드와, 혈관 내피세포 증식 인자 수용체 키나아제 저해제는 렌바티닙을 병용 투여할 경우, 암 줄기세포의 성장을 효과적으로 억제하여, 더 나아가서는 약물에 대산 암의 내성이나, 암의 재발 또는 전이를 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서, "암 줄기세포의 성장 억제"란 암 줄기세포 유지(mainternance) 억제, 암 줄기세포 악성화(malignance) 억제 및 암 줄기세포 침윤 활성(invasive) 억제 등의 의미를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 히스톤 탈아세틸화 저해제 및 혈관내피 세포증식인자 수용체 키나아제 저해제를 유효 성분으로 포함하는 내성암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 히스톤 탈아세틸화 저해제는 상기 화학식 1로 표시되는 N-하이드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노마이드일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 키나아제 저해제는 상기 화학식 2로 표시되는 4-[3-클로로-4-(사이클로프로필카바모일아미노)페녹시]-7-메톡시퀴놀린-6-카복사마이드, 즉 렌바티닙일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 N-하이드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노마이드 및/또는 렌바티닙은 선택적으로 염 형태로 사용될 수 있다. 무기산 염 또는 유기산 염의 형태로 사용될 수 있으나, 염의 형태를 특별히 한정하는 것은 아니다. 예컨대, 상기 염은 메탄설폰산염(렌바티닙 메실레이트), 염산염, 황산염, 시트르산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 질산염, 중황산염, 인산염, 과인산염, 이소니코틴산염, 아세트산염, 젖산염, 살리실산염, 주석산염, 판토테산염, 아스코르브산염, 숙신산염, 말레산염, 푸마르산염, 글루콘산염, 사카린산염, 포름산염, 벤조산염, 글루타민산염, 에탄설폰산염, 벤젠설폰산염, p-톨루엔선폰산염, 팜산염(pamoate) 등이다.
또한, 본 발명에서 상기 히스톤 탈아세틸화 저해제와 혈관 내피세포 증식 인자 수용체 키나아제 저해제는 1:0.01~100의 몰비로 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 "내성암"이란, 암 치료용 약물, 특히 항암제 치료에 대하여 극히 낮은 감수성을 나타내어, 상기 치료법에 의해 증세가 호전, 완화, 경감 또는 치료증상을 나타내지 않는 암을 의미한다. 상기 내성암은 특정한 치료법에 대하여 처음부터 내성을 가질 수도 있고, 최초에는 내성을 나타내지 않았으나, 긴 시간의 치료로 인하여 암 세포 내의 유전자 변이 등에 의하여 동일한 치료에 대해 더이상 감수성을 나타내지 않게 되어 발생할 수도 있다. 일반적으로 진행된 암 세포나 암 줄기세포의 경우 섬유아세포 증식인자(fibroblast growth factor, FGFR) 신호 기전의 활성화에 의해 중재되는 상피 중간엽 전이(epithelial mesenchymal transition, EMT) 유도로 약제에 대하여 내성을 가지게 된다. 본 발명에서는 상기 히스톤 탈아세틸화 저해제 중에서도 특히 N-하이드록시-7-(2-나프틸티오)헵타노마이드와, 혈관 내피세포 증식 인자 수용체 키나아제 저해제는 렌바티닙을 병용 투여할 경우, FGFR 신호 기전을 효과적으로 억제하여 그에 따라 EMT 활성 또한 억제하여 약제의 내성이 생기는 것을 방지하거나 혹은 기 생성된 내성을 극복하여 항암제에 대한 감수성을 증진시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 예방 및 치료의 대상이 되는 내성암은 항암제에 대하여 내성을 갖는 암으로, EMT 아형일 수 있고, 암종의 경우 그 발생 부위에 따라 갑상선암, 유방암, 담도암, 담낭암, 췌장암, 대장암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 혈액암 및 간암 등 일 수 있으나, 바람직하게는 갑상선암일 수 있으며, 보다 바람직하게는 유두 갑상선암 또는 저분화 갑상선암일 수 있다.
본 발명에서 "암 치료용 약물"이란 암을 치료하기 위한 약물로, 항암제일 수 있고, 그 종류를 특별히 한정하지는 않으나, 바람직하게는 담도암 또는 췌장암의 치료용 약물일 수 있다. 구체적인 예를 들면, 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 카페시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 보리노스텟, 엔티노스텟, 5FU 및 카르무스틴 일 수 있으며, 바람직하게는 젬시타빈(Gemcitabine), 시스플라틴(Cisplatin), 5FU, 카페시타빈(Capecitabine), 올살리플라틴(Olsaliplatine), 보리노스텟(Vorinistat) 및 엔티노스텟(Entinostat) 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 보다 바람직하게는 젬시타빈(gemcitabine), 시스플라틴(Cisplatin), 5-FU, 카페시타빈(Capecitabine), 올살리플라틴(Olsaliplatine), 보리노스텟(Vorinistat) 및 엔티노스텟(Entinostat)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "내성 극복"이란, 특정 약물에 대한 내성을 획득한 암 세포의 치료용 약물에 대한 감수성을 증가시키는 작용을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 특정 약물은 암 치료용 약물, 특히 항암제를 의미한다. 상기 감수성의 증가는 내성이 없는 암세포에 대해 성장억제 등의 효과를 보이는 농도와 비교하여, 내성을 획득한 암세포의 성장억제 및 세포사멸 등의 효과를 보이는 농도가 동등하거나 그 이상으로 상승시키는 정도에 이르는 것을 의미한다. 상기 내성 극복과 동의어로서 "내성억제", "내성해제", "저항성 해제" 및 "감수성 증강" 등이 있다.
본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학적 조성물을 이용하여 암 증상을 차단하거나, 암 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학적 조성물을 조사하여 암 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 다른 항암제와도 추가로 병용 투여할 수 있으며, 이를 통해서 암 세포 및 암 줄기세포에 대한 성장 억제 효과를 더욱 증강시킬 수 있다.
여기서 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 히스톤 탈아세틸화 저해제와 혈관 내피세포 증식 인자 수용체 키나아제 저해제를 함께 사용하여 암 세포 또는 암 줄기세포의 증식을 효과적으로 억제하여, 암을 예방 또는 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 항암제에 대한 내성이나, 암의 전이 또는 재발 또한 방지할 수 있다.
도 1의 (a) 및 (b)는 본 발명의 일 실시예에 따라 환자 유래 유두 갑상선암(PTC) 세포인 GSP1 세포에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 처리한 후 암 세포의 수의 변화 및 생존율의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2의 (a) 및 (b)는 본 발명의 일 실시예에 따라 환자 유래 저분화 갑상선암(ATC) 세포인 GSA1 세포에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 처리한 후 암 세포의 수의 변화 및 생존율의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3의 (a) 및 (b)는 본 발명의 일 실시예에 따라 환자 유래 저분화 갑상선암(ATC) 세포인 GSA2 세포에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 처리한 후 암 세포의 수의 변화 및 생존율의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 GSP1 세포에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 처리한 후 p53, p21, 사이클린 D1, CDK 4-양성 조절자, 세포 증식 마커 Ki-67, 인산화된 NF-?B p65, Bcl-2, Apaf- 및 클리브드-카스파제 3의 발현 수준의 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 GSA1 세포에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 처리한 후 p53, p21, 사이클린 D1, CDK 4-양성 조절자, 세포 증식 마커 Ki-67, 인산화된 NF-?B p65, Bcl-2, Apaf- 및 클리브드-카스파제 3의 발현 수준의 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 GSA2 세포에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 처리한 후 p53, p21, 사이클린 D1, CDK 4-양성 조절자, 세포 증식 마커 Ki-67, 인산화된 NF-?B p65, Bcl-2, Apaf- 및 클리브드-카스파제 3의 발현 수준의 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 GSP1 세포에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 처리한 후 PKC, MEK, p-ERK1/2, Vimentin, E-cadherin, Snail 및 Zeb1의 의 발현 수준의 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 GSA1 세포에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 처리한 후 PKC, MEK, p-ERK1/2, Vimentin, E-cadherin, Snail 및 Zeb1의 의 발현 수준의 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 GSA2 세포에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 처리한 후 PKC, MEK, p-ERK1/2, Vimentin, E-cadherin, Snail 및 Zeb1의 의 발현 수준의 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 GSP1 세포에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 처리한 후 면역 형광 염색법에 의하여 β-카테닌의 핵 위치를 분석한 사진을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 GSA1 세포에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 처리한 후 면역 형광 염색법에 의하여 β-카테닌의 핵 위치를 분석한 사진을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 GSA2 세포에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 처리한 후 면역 형광 염색법에 의하여 β-카테닌의 핵 위치를 분석한 사진을 나타낸 것이다.
도 13의 (a), (b) 및 (c)는 본 발명의 일 실시예에 따라 GSP1 세포를 이식한 마우스 모델에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 처리한 후 종양의 부피 변화, 마우스의 몸무게 변화 및 종양의 무게 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 14의 (a), (b) 및 (c)는 본 발명의 일 실시예에 따라 GSA1 세포를 이식한 마우스 모델에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 처리한 후 종양의 부피 변화, 마우스의 몸무게 변화 및 종양의 무게 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15의 (a), (b) 및 (c)는 본 발명의 일 실시예에 따라 GSA2 세포를 이식한 마우스 모델에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 처리한 후 종양의 부피 변화, 마우스의 몸무게 변화 및 종양의 무게 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
환자/조직 샘플로부터 종양 세포 분리 및 1차 배양
연세대학교 강남 세브란스 병원의 갑상선암 센터에서 생화학적 및 조직학적으로 유두 갑상선암(papillary thyroid cancer, PTC) 또는 저분화 갑상선암(anaplastic thyroid cancer, ATC)으로 판정받은 하기 표 2의 환자로부터 종양 덩어리를 확보한 뒤 하기의 과정을 거쳐 유두 갑상선암인 GSP1 세포와, 줄기세포성 갑상선암으로 알려진 저분화 갑상선암인 GSA1 및 GSA2 세포를 얻었다. 구체적으로, 상기 종양 덩어리는 갑상선 암의 원발 부위 및 전이 부위의 외과적 절제술 중에 확보하였다. 절제술 다음날에 획득한 종양 덩어리를 항진균제 및 항생제를 포함하는 생리 식염수에 보관한 뒤 실험실로 이동하였다. 상기 종양 덩어리로부터 정상 조직과 지방을 제거한 뒤, 종양 조직을 1X HBSS로 세척하였다. 종양 조직을 튜브 내에서 해리 배지와 함께 분쇄하였다. 해리 배지는 콜라게나제 Ⅳ형(Sigma, USA) 1mg/ml 및 20% FBS를 포함하는 DMEM/F12를 사용하였다. 분쇄되어 부유하는 종양 세포를 50ml 1X HBSS로 세척하며 멸균 70-마이크로 포어 나일론 세포 스트레이너(BD Falcom)로 여과한 후 1400 rpm으로 5분 동안 원심 분리하였다. 세포를 10% 소태아 혈청(Hyclone, South Logan, UT, USA) 및 2% 페니실린/스트렙토마이신 용액(Gibco, Grand Island, NY, USA)를 포함하는 RPMI-1640(Hyclone) 배지에 재부유시켰다. 세포 생존율은 트립판 블루 염색 배제법에 의하여 측정하였다.
구분 GSP1 GSA1 GSA2
진단 시 나이 31 74 56
성별 여성 여성 남성
1차 질병 부위 갑상선 갑상선 갑상선
암 기(stage) IVc IVc IVc
1차 병변 유두 갑상선암 저분화 갑상선암 저분화 갑상선암
배양 시 사용한 샘플의 분류 새로운 종양 새로운 종양 새로운 종양
종양 덩어리 확보처 대한민국 서울 강남 세브란스 병원 대한민국 서울 강남 세브란스 병원 대한민국 서울 강남 세브란스 병원
세포 배양
상기와 같이 환자로부터 유래된 유두 갑상선암(PTC) 세포 및 저분화 갑상선암(ATC) 세포인 GSP1, GSA1 및 GSA2 세포를 분리한 뒤, 10% 소태아 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.
세포 생존율 분석
세포 증식은 MTT 어쎄이를 이용하여 측정하였다. GSP1, GSA1 및 GSA2 세포를 96-웰 플레이트에 6 X 103 세포로 접종한 뒤 80% 컨플루언시에 도달할 때까지 밤새 배양하였다. 세포에 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 최종 농도가 0~100 μM이 되도록 처리하였다. 세포 생존율을 측정하기에 앞서 세포에 MTT 시약을 처리한 뒤 프로토콜에 따라 배양한 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생균수를 트립판 블루 배제법으로 측정하였다. 데이터는 처리된 세포에서 관찰된 시그널의 퍼센티지로 나타내었고, 3번의 반복 실험 끝에 평균±표준 편차로 나타내었다.
면역 형광 분석법 및 공초점 이미지
상기 세포 생존율 분석에서와 같이 다양한 약물이 처리된 GSP1, GSA1 및 GSA2 세포의 β-카테닌의 발현 수준을 면역 형광 염색법으로 분석하였다. 유리 바텀 디쉬(glass bottom dish)(MatTek, Ashland, MA)에서 성장한 세포를 4% 포름알데히드 용액(R&D systems, UK)에서 10분 동안 고정시킨 뒤 인산 완충 식염수(PBS) 내에서 0.5% 트리톤X-100로 10분 동안 투과화시켰다. 슬라이드를 대기-건조시킨 뒤 PBS로 세척하고, 3% 소혈청 알부민을 포함하는 PBS 내에서 항-β-카테닌 항체(1:25, abcam)과 함께 배양시켰다. PBS로 세척 후 슬라이드를 Alexa 488(1:200, Molecular Probes, Eugene, USA)와 함께 배양시켰다. 세포 내 핵을 Hoechst 33342(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)로 염색하여 시각화하였다. 공초점 현미경(LSM Meta 700)을 이용하여 이미지를 관찰하였고, Zeiss LSM 이미지 브라우저 소프트웨어, 버전 4.2.0121로 분석하였다.
면역블롯 분석
상기 세포 생존율 분석에서와 같이 다양한 약물이 처리된 GSP1, GSA1 및 GSA2 세포를 차가운 인산 완충 식염수로 2회 세척한 뒤 단백질 추출 버퍼(Pro-Prep, iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 얼음 상에서 용해시켰다. 세포 내 각 단백질의 농도는 BCA 어쎄이(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)로 측정하였다. 8~10% 폴리아크릴아마이드 겔에서 단백질을 동일한 양(20 ㎍)으로 분리하였다. 용해된 단백질을 PVDF 막(Millipore, Bedford, MA) 상에서 전기-이동시켰다. 이후 막을 5% 무지방 우유를 포함하는 TBST를 이용하여 상온에서 1시간 동안 블록시킨 뒤 Ki-67(Abcam), 사이클린 D1 (Santa Cruz Biotechnology), CDK4 (Santa Cruz Biotechnology), p21 (Santa Cruz Biotechnology), p53 (Santa Cruz Biotechnology), PKC, MEK, p-ERK 1/2 (Santa Cruz Biotechnology), ERK 1/2 (Santa Cruz Biotechnology), Apaf-1 (Abcam), p-NFκB (Santa Cruz Biotechnology), Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology), Caspase 3 (Santa Cruz Biotechnology), Vimentin (Abcam), E-cadherin (Abcam), Snail (Abcam), Zeb1 (Abcam) 및 β-actin (Santa Cruz Biotechnology)에 대한 1차 항체를 적정한 농도로 처리하여 4℃에서 밤새 배양하였다. 이후, 막을 TBS-5로 3~5회 세척한 뒤 HRP(Santa Cruz)와 컨쥬게이트된 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 세척 후 ELC 시약(Santa Cruz)을 이용하여 블럿을 형성시킨 뒤 코닥 X-OMAT AR 필름(Eastman Kodak, Rochester, US)에 3~5분 동안 노출시켰다.
세포 주기의 유세포 분석
세포를 10% 소태아혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지에서 HNHA; 렌바티닙; HNHA 및 렌바티닙(1:1의 몰비); 소라페닙; HNHA 및 소라페닙(1:1의 몰비);을 40시간 동안 처리한 뒤 트립신 처리법에 따라 세포를 수확한 후 70% 에탄올로 고정시켰다. 총 DNA를 위하여 세포를 40 ㎍/ml 프로피디움 요오드화물 및 100 ㎍/ml RNase Ⅰ을 포함하는 PBS를 이용하여 37℃에서 30분 동안 세포를 염색하였다. FACSCalibur Flow Cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).를 이용하여 세포 주기 분포를 분석하였다. sub-G0/G1, G0/G1, S, and G2/M 기에 있는 세포 비율을 MacOSX의 FlowJo v8 소프트웨어 (Tree Star, Ashland, OR, USA)로 분석하였다. 상기 실험은 3번 반복하여 수행하였고, 결과는 평균으로 나타내었다.
인간 갑상선 암세포 이식
환자 유래 GSP1, GSA1 및 GSA2 세포를 in vitro에서 배양한 뒤 발브시 누드 마우스 암컷의 왼쪽 위 옆구리 지역의 피하에 3.5 X 106 세포/마우스의 양으로 주입하였다. 11일 경과 후 종양이 성장한 마우스(n=10/군)에 2일마다 10mg/kg 렌바티닙과 40mg/kg 소라페닙을 단독으로 경구투여(P.O.)하거나, 25mg/kg HNHA을 복강주사(I.P.)한 뒤 상기 렌바티닙과 소라페닙을 경구투여 하였다. 캘리퍼를 이용하여 종양 사이즈를 매일 측정하고, 종양 부피를 하기 식 (1)을 이용하여 측정하였다.
[식 (1)]
LXS2/2
상기 식 (1)에서, L은 종양의 가장 긴 직경을 의미하고, S는 가장 짧은 직경을 의미한다.
실험 기간 동안에 마우스를 특정 멸균(specific pathogen-free, SPF) 조건하에서 사육하였고, 모든 실험은 연세대학교 동물 실험 위원회의 승인을 받았다.
통계적 분석
GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 면역 조직 화학 결과는 Bonferroni 사후 검증(post hoc) 테스트에 따라 일원 분류 분산 분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 수행하였고, 각 실험에 따른 값들은 평균±SEM으로 나타냈으며, P 값<0.05인 경우 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
HNHA 및 렌바티닙에 의한 암 세포 증식 억제의 시너지 효과 분석
환자 유래 유두 갑상선암(PTC) 세포 및 저분화 갑상선암(ATC) 세포에 HNHA 및 렌바티닙을 병용 투여하는 경우 항암 효과에 시너지 효과가 부여되는 지 확인하기 위하여, GSP1, GSA1 및 GSA2 세포에 HNHA, 렌바티닙, 소라페닙 또는 이들을 병용으로 처리한 후 MTT 어쎄이에 의하여 시간에 따른 암 세포의 수 및 생존율의 변화를 분석하여 그 결과를 도 1 내지 3에 (a) 및 (b)로 나타내었고, IC50을 측정하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
세포주 조직병리학 동물 세포 증식 IC50(μM)
소라페닙 렌바티닙 HNHA HNHA+소라페닙 HNHA+렌바티닙
GSP1 유두 갑상선암 인간 9.42(±0.2) 10.51(±0.1) 5.15(±0.4) 4.95(±0.5) 3.84(±0.3)
GSA1 저분화 갑상선암 인간 23.51(±0.2) 41.54(±0.5) 20.05(±0.4) 9.63(±0.1) 6.49(±0.2)
GSA2 저분화 갑상선암 인간 21.11(±0.3) 35.13(±0.2) 18.33(±0.3) 11.47(±0.5) 7.32(±0.5)
도 1 내지 3 및 상기 표 3에서 보는 바와 같이, HNHA와 렌바티닙을 병용 투여한 경우 이들을 단독으로 투여한 경우나, 소라페닙을 단독으로 투여한 경우보다 암 세포 및 생존율이 현저히 감소하였고, IC50 또한 현저히 낮은 값을 보였으며, HNHA와 소라페닙을 병용 투여한 경우보다도 암 세포 증식율은 현저히 감소시키는 것을 볼 수 있었다.
HNHA 및 렌바티닙에 의한 암 세포 자멸( apoptosis ) 유도 및 세포 주기 차단(arrest)
환자 유래 유두 갑상선암(PTC) 세포 및 저분화 갑상선암(ATC) 세포에 HNHA 및 렌바티닙을 병용 투여하는 경우 세포 주기에 어떠한 영향을 미치는 지 확인하기 위하여, GSP1, GSA1 및 GSA2 세포에 HNHA, 렌바티닙, 소라페닙 또는 이들을 병용으로 처리한 후 유세포 분석에 의해 각 주기별 세포 비율을 측정하여 그 결과를 하기 표 4 내지 6에 나타내었다. 또한, 면역블롯 분석을 통해 GSP1, GSA1 및 GSA2 세포에 각 처리 후 세포 주기 차단자(cell cycle arrestors)로 알려진 p53 및 p21, 세포 주기의 양성 조절자(cell cycle positive regulators)로 알려진 사이클린 D1 및 CDK 4-양성 조절자, 세포 증식 마커 Ki-67, 항-세포 자멸 마커인 인산화된 NF-κB p65 및 Bcl-2와, 세포 자멸 마커인 Apaf- 및 클리브드-카스파제 3의 발현 수준을 분석하여 그 결과를 도 4 내지 6에 나타내었다.
GSP1 세포
처리 약물 Sub-G0G1 G0G1 S G2/M
대조군 2.4±0.01 35.9±0.03 34.8±0.02 26.9±0.02
소라페닙 18.4±0.03 43.4±0.04 22.6±0.05 15.6±0.02
렌바티닙 25.2±0.02 45.5±0.01 19.4±0.02 9.9±0.05
HNHA 33.4±0.04 48.7±0.01 11.4±0.05 6.5±0.05
HNHA+소라페닙 61.4±0.01 27.8±0.06 6.8±0.03 4.0±0.03
HNHA+렌바티닙 69.4±0.02 23.7±0.01 4.6±0.01 2.3±0.04
GSA1 세포
처리 약물 Sub-G0G1 G0G1 S G2/M
대조군 1.3±0.02 45.5±0.01 30.2±0.03 23.0±0.03
소라페닙 14.2±0.01 46.3±0.02 20.0±0.02 19.5±0.03
렌바티닙 19.5±0.04 49.5±0.02 15.8±0.05 15.2±0.06
HNHA 26.8±0.05 46.7±0.02 15.9±0.05 10.6±0.01
HNHA+소라페닙 51.8±0.05 31.5±0.04 11.5±0.02 5.2±0.06
HNHA+렌바티닙 67.2±0.05 21.3±0.05 8.2±0.04 3.3±0.02
GSA2 세포
처리 약물 Sub-G0G1 G0G1 S G2/M
대조군 0.7±0.05 41.2±0.02 41.9±0.02 16.2±0.04
소라페닙 4.5±0.02 40.8±0.01 39.7±0.03 15.0±0.01
렌바티닙 15.9±0.02 48.4±0.05 26.2±0.03 9.5±0.01
HNHA 23.4±0.01 51.3±0.03 20.5±0.01 4.8±0.04
HNHA+소라페닙 45.7±0.02 35.4±0.01 14.8±0.05 4.1±0.02
HNHA+렌바티닙 59.3±0.02 30.7±0.03 7.9±0.02 2.1±0.01
상기 표 4 내지 6에서 보는 바와 같이, HNHA와 렌바티닙을 병용 투여한 경우 이들을 단독으로 투여하거나 소라페닙을 단독으로 투여한 경우보다, 더 나아가서는 HNHA와 소라페닙을 병용 투여한 경우 보다 암 세포의 주기를 Sub-G0G1로 유도하여, 암 세포의 자멸을 유도하고 최종적으로는 암 세포의 생존율을 현저히 감소시키는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 4 내지 6에서 보는 바와 같이 GSP1, GSA1 및 GSA2 세포에서, HNHA와 렌바티닙을 병용 투여한 경우는, 이들을 단독으로 투여한 경우나 소라페닙을 단독으로 투여한 경우, 혹은 HNHA와 소라페닙을 병용 투여한 경우보다 세포 주기 차단자인 p53 및 p21의 발현 수준이 현저히 증가되었고, 세포 주기 양성 조절자인 사이클린 D1 및 CDK4의 발현 수준은 현저히 감소되었으며, 세포 증식 마커인 Ki-67과 항-세포 자멸 마커인 인산화된 NF-κB p65 및 Bcl-2의 발현 수준 역시 현저히 감소하였고, 반면에 세포 자멸 마커인 Apaf- 및 클리브드-카스파제 3의 발현 수준은 현저히 증가한 것을 볼 수 있었다.
이를 통하여 본 발명에 따른 HNHA와 렌바티닙의 조합은 이미 진행된 암에서 효과적인 억제제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
HNHA 및 렌바티닙에 의한 약제 내성 극복 (1)
일반적으로 섬유아세포 증식인자(fibroblast growth factor, FGFR) 신호 기전은 약제 내성과 관련된 타겟 유전자 발현, 생물학적 과정에 있어서 진화적으로 보존된 신호 캐스케이드에 해당한다고 알려져 있다.
이에, 본 발명에 따른 HNHA 및 렌바티닙의 조합이 상기 FGFR 신호 전달을 억제함에 따라 상피 중간엽 전이(epithelial mesenchymal transition, EMT)를 억제할 수 있는 지 확인하기 위하여, 면역블롯 분석을 통해 GSP1, GSA1 및 GSA2 세포에 각 처리 후 FGFR 신호 기전 관련 마커인 PKC, MEK 및 p-ERK1/2와 EMT 신호 기전 관련 마커인 Vimentin, E-cadherin, Snail 및 Zeb1의 발현 수준을 분석하여 그 결과를 도 7 내지 9에 나타내었다.
도 7 내지 9에서 보는 바와 같이, GSP1, GSA1 및 GSA2 세포에서, HNHA와 렌바티닙을 병용 투여한 경우는, HNHA, 렌바티닙 또는 소라페닙을 단독으로 투여한 경우나 HNHA와 소라페닙을 병용 투여한 경우보다 FGFR 신호 기전 관련 마커인 PKC, MEK 및 p-ERK1/2의 발현 수준이 현저히 억제되었고, 그 결과 EMT 신호 기전 관련 마커인 Vimentin, E-cadherin, Snail 및 Zeb1의 발현 수준 또한 현저히 감소된 것을 볼 수 있었다.
이를 통하여, 진행된 암 세포나 암 줄기세포의 경우 FGFR 신호 기전의 활성화에 의해 중재되는 EMT 유도로 약제에 대하여 내성을 가지게 되나, 본 발명에 따라 HNHA와 렌바티닙을 병용 투여 하는 경우 FGFR 신호 기전을 효과적으로 억제하여 그에 따라 EMT 유도 또한 억제하여 약제 내성을 극복할 수 있음을 알 수 있다.
HNHA 및 렌바티닙에 의한 약제 내성 극복 (2)
β-카테닌은 잘 알려진 다중-조절자로, 종양 형성에 중요한 역할을 하는 진화적으로 보존된 분자이며, 암 환자의 나쁜 예후와도 연관되어 있다. β-카테닌의 핵 위치(nuclear localization)는 약제 내성과 관련된 타겟 유전자 발현을 현저히 증가시킨다. 진행된 갑상선 암세포 또한 β-카테닌의 핵 위치에 의한 EMT 활성화에 따라 약제 내성을 얻게 된다.
이에, 면역 형광 분석법을 통해 본 실험에서 사용된 GSP1, GSA1 및 GSA2의 3종의 세포에 대하여 β-카테닌의 핵 위치를 분석하여 그 결과를 도 10 내지 12에 나타내었다.
도 10 내지 12에서 보는 바와 같이, 유두 갑상선암 세포인 GSP1 세포가 저분화 갑상선암 세포인 GSA1 및 GSA2 세포에 비하여 β-카테닌의 핵 위치가 감소한 것을 볼 수 있었다. 또한, 상기 β-카테닌의 핵 위치는 FGFR 억제제인 렌바티닙을 투여한 경우가 FGFR 억제제가 아닌 HNHA 또는 소라페닙을 단독 혹은 병용으로 투여한 경우보다 감소하였고, 상기 렌바티닙과 HNHA를 병용 투여한 경우는 더욱 현저히 감소하였다.
이를 통하여 본 발명에 따라 HNHA와 렌바티닙을 병용 투여 하는 경우 FGFR 신호 기전의 억제를 통해 EMT 활성을 억제함에 따라 약제 내성 또한 극복할 수 있음을 알 수 있다.
갑상선 암세포 이식 모델에서 HNHA 및 렌바티닙의 종양 성장 억제 효과
in vivo에서 HNHA 및 렌바티닙의 항암 시너지 효과를 확인하기 위하여, GSP1, GSA1 및 GSA2 세포를 이식한 마우스 이종이식 종양 모델을 구축하였다. 이후, 상기 마우스에 HNHA, 렌바티닙, 소라페닙 또는 이들을 병용으로 처리한 후 종양의 부피 변화, 마우스의 몸무게 변화, 및 종양의 무게 변화를 측정하여 그 결과를 이식한 세포주의 종류에 따라 도 13 내지 15에 나타내었다.
도 13 내지 15에서 보는 바와 같이, 갑상선 암세포 이식 마우스 모델에 HNHA와 렌바티닙을 병용 투여한 경우는 HNHA, 렌바티닙 또는 소라페닙을 단독으로 투여한 경우보다 종양 부피 및 무게가 현저히 감소한 것을 볼 수 있었고, 이러한 종양 감소 효과는 HNHA와 소라페닙을 병용 투여한 경우보다도 우수한 것을 볼 수 있었다. 단, HNHA와 렌바티닙을 병용 투여한 경우에도 다른 처리(단독 투여 또는 HNHA와 소라페닙의 병용 투여)한 경우와 비교하여 마우스 몸무게 차이는 미미한 것을 볼 수 있었다.
이를 통하여 본 발명에 따른 HNHA와 렌바티닙의 조합은 갑상선 암의 효과적인 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (16)

  1. 히스톤 탈아세틸화 저해제(Histone Deacetylation inhibitor, HDAC inhibitor) 및 혈관내피 세포증식인자 수용체(vascular endothelial cell growth factor receptor, VEGFR) 키나아제 저해제(kinase inhibitor)를 유효 성분으로 포함하며,
    상기 히스톤 탈아세틸화 저해제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이고,
    상기 혈관내피 세포증식인자 수용체 키나아제 저해제는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인, 갑상선암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112018109944549-pat00022

    [화학식 2]
    Figure 112018109944549-pat00023
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 히스톤 탈아세틸화 저해제와 상기 혈관내피 세포증식인자 수용체 키나아제 저해제는 1:0.01~100의 몰비로 포함되는, 약학적 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 갑상선암은 유두 갑상선암인, 약학적 조성물.
  8. 히스톤 탈아세틸화 저해제(Histone Deacetylation inhibitor, HDAC inhibitor) 및 혈관내피 세포증식인자 수용체(vascular endothelial cell growth factor receptor, VEGFR) 키나아제 저해제(kinase inhibitor)를 유효 성분으로 포함하며,
    상기 히스톤 탈아세틸화 저해제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이고,
    상기 혈관내피 세포증식인자 수용체 키나아제 저해제는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인, 내성 갑상선암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112018109944549-pat00024

    [화학식 2]
    Figure 112018109944549-pat00025
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제8항에 있어서,
    상기 히스톤 탈아세틸화 저해제와 상기 혈관내피 세포증식인자 수용체 키나아제 저해제는 1:0.01~100의 몰비로 포함되는, 약학적 조성물.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 내성 갑상선암은 항암제에 대하여 내성을 갖는 갑상선암인, 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 섬유아세포 증식인자(fibroblast growth factor, FGFR) 신호 기전을 억제하여 상피 중간엽 전이(epithelial mesenchymal transition, EMT) 활성을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  14. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20090110913A (ko) * 2007-02-15 2009-10-23 노파르티스 아게 Ｌｂｈ589와 암을 치료하기 위한 다른 치료제와의 조합물
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