TW201722420A - 橙黃醯胺雙肽衍生物用於治療或預防血管新生相關疾病 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種橙黃醯胺(aurantiamide)雙肽衍生物在治療或預防血管新生相關疾病之用途。因此，橙黃醯胺雙肽衍生物可以用作血管新生抑制劑，藉此預防或治療侵襲性及轉移性癌症及眼新血管生成(特別是黃斑變性，諸如年齡相關之黃斑變性(AMD)的病理性新血管生成)。

Description

橙黃醯胺雙肽衍生物用於治療或預防血管新生相關疾病

本發明係有關治療或預防血管新生相關疾病。特定言之，本發明係關於橙黃醯胺雙肽衍生物在治療或預防血管新生相關疾病中之用途。

血管新生在生理性病況(諸如胚胎發育、生殖、組織修復及骨重構)中起到重要作用。相比之下，血管新生被公認為構成多種致命及致衰弱人類疾病(包括癌症、年齡相關之黃斑變性(AMD)及各種發炎疾病)基礎之共同點。腫瘤血管新生已展示出會促進微環境中之癌症進展及癌轉移。病理性血管新生亦為AMD之主要病因，其為老年人群體中視覺嚴重損失的最常見不可逆病因之一。新生血管性AMD之特徵為侵入視網膜下腔之脈絡膜新生血管(CNV)，通常引起泌出及出血。

新血管生成涉及循環內皮祖細胞(EPC)自骨髓募集至缺氧部位以及先存在的內皮細胞之出芽。EPC為循環中之細胞群體，且執行血管新生及血管重構，因為其能夠分化成內皮細胞且形成血管。晚期EPC具有更致力於內皮系分化且促進血管新生之優點。此外，已提出早期EPC會經由製造可能會活化鄰近內皮細胞之血管生成細胞激素(例如VEGF及IL-8)來改進血管新生/血小管生成。近來，據報導EPC藉由干 預血管生成開關來介導早期腫瘤生長及晚期轉移性進展。累積的證據指示EPC在AMD期間促進缺血缺氧組織中之新血管生成。此等發現建立EPC在病理性血管新生中之作用且支持EPC靶向療法可為阻斷血管新生相關疾病之有前景的策略。

雙肽衍生物Fmoc-10a(9H-茀-9-基)甲基(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基胺基甲酸酯)為橙黃醯胺衍生物，其由苯丙胺醇及苯丙胺酸構成，且為蜆殼花椒(Zanthoxylum dissitum)、天葵(Semiaquilegia adoxoides)及火炭母(Polygonum chinensis)之主要組分。橙黃醯胺展現抗細菌、消炎(Chiao-Ting Yen等人，European Journal of Medicinal Chemistry 44(2009)1933-1940)、抗氧化及抗HIV作用。近來，許多雙肽展示出對抗癌細胞之細胞毒性作用(Chiao-Ting Yen等人，European Journal of Medicinal Chemistry 45(2010)2494-2502)。舉例而言，苯丙胺酸芥肽(Peptichemio，PTC)及硼替佐米(Bortezomib，VELCADE^®)已經開發及銷售用於治療癌症。

本發明提供一種抑制、改善、預防或治療血管新生相關疾病之方法，其包含向個體投與有效量之本文所述之式(I)化合物或其互變異構體、立體異構體或對映異構體、或其溶劑合物、前藥或醫藥學上可接受之鹽。

在一些實施例中，該式(I)化合物係選自(S)-1-((S)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-1-側氧基-3-苯基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-1-側氧基-3-苯基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((S)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-側氧基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-側氧基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((S)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-(萘-2-基)- 1-側氧基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-(萘-2-基)-1-側氧基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((S)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；及(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；或其互變異構體、立體異構體或對映異構體、或其溶劑合物、前藥或醫藥學上可接受之鹽。在另一實施例中，該化合物為(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯。

在一個實施例中，該血管新生相關疾病為侵襲性及轉移性血管新生相關癌症或眼新血管生成。

在一些實施例中，該侵襲性及轉移性血管新生相關癌症包括(但不限於)口腔癌、腦癌、乳癌、腎癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、肝癌(諸如肝細胞癌)及黑素瘤。在另一實施例中，該侵襲性及轉移性血管新生相關癌症為黑素瘤。在一些實施例中，對於侵襲性及轉移性血管新生相關癌症，該投藥可與手術、放射線療法或化學療法組合、在其之前或在其之後使用。

在一個實施例中，眼新血管生成為黃斑變性。黃斑變性較佳為濕性黃斑變性。濕性黃斑變性更佳地為AMD。在一個實施例中，對於黃斑變性，該投藥係以玻璃體內、眼內或眼周途徑進行。在另一實施例中，該化合物調配成注射劑或點眼劑。

圖1 A至E展示出Fmoc-10a抑制晚期EPC之血管生成作用。A.Fmoc-10a之化學結構。B.使用MTT分析，Fmoc-10a以濃度依賴性方式抑制晚期EPC之細胞生長。C.使用LDH分析，Fmoc-10a不誘導晚期EPC中之LDH釋放。D.使用Transwell遷移分析，Fmoc-10a抑制晚期EPC之細胞遷移。E.使用管形成分析，Fmoc-10a消除晚期EPC之毛 細管狀結構。資料表示為五次獨立實驗之平均值±SEM。*，p<0.01，與對照組相比。

圖2 A及B展示出Fmoc-10a抑制早期EPC之血管生成潛能。A及B.使用CFU-希爾分析，Fmoc-10a抑制早期EPC之群落形成單位(CFU)。C.使用趨化運動分析，Fmoc-10a抑制早期EPC之趨化性。資料表示為四次獨立實驗之平均值±SEM。

圖3 A及B展示出Fmoc-10a離體及在活體內抑制血管新生。A.使用主動脈環出芽分析，Fmoc-10a消除VEGF誘導之血管出芽。B.使用活體內小鼠DIVAA模型，Fmoc-10a減弱VEGF誘導之微血管形成。資料表示為三次獨立實驗之平均值±SEM。*，p<0.01，及**，p<0.001，與媒劑組相比。

圖4 A至D顯示Fmoc-10a抑制黑素瘤癌症之細胞侵襲、VEGF釋放、腫瘤生長及轉移。A.Fmoc-10a顯著抑制B16F10黑素瘤細胞之細胞侵襲。B.Fmoc-10a濃度依賴性抑制VEGF自B16F10黑素瘤細胞釋放。C.使用腫瘤異種移植模型，Fmoc-10a誘導B16F10黑素瘤生長之劑量依賴性抑制。D.使用實驗癌轉移模型，Fmoc-10a抑制B16F10細胞之肺群落數目。資料表示為三個獨立實驗之平均值±S.E.M.。*，p<0.05，**，p<0.01，及***，P<0.001，與媒劑組相比。

圖5 A及B顯示Fmoc-10a抑制AMD動物模型中之脈絡膜新血管生成(CNV)。A.執行氧誘導視網膜病變(OIR)之小鼠模型以在氧過多條件下誘導7天大小鼠之視網膜新血管生成。視網膜新血管生成之整體裝片(whole-mount)分析顯示氧過多顯著增加同工凝集素(isolectin)之螢光。Fmoc-10a顯著阻斷小鼠之氧過多誘導之病理性新血管生成，且癌思停(Avastin)(10μg)用作陽性對照。B.視網膜中新血管生成之定量偵測係自四個獨立實驗呈現。資料表示為平均值±S.E.。*，p<0.001，與常氧組相比；#，p<0.05，與在氧過多下之媒劑處理組相 比。

本發明至少部分基於發現橙黃醯胺雙肽衍生物抑制血管新生。因此，橙黃醯胺雙肽衍生物可以用作血管新生抑制劑，藉此預防或治療侵襲性及轉移性血管新生相關癌症(特別是黑素瘤之轉移)及眼新血管生成(特別是黃斑變性，諸如年齡相關之黃斑變性(AMD)之病理性新血管生成)。

為方便起見，此處收集在本發明之情形下使用之某些術語。除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有如本發明所屬之一般技術者通常理解之相同含義。

除非上下文以其他方式明確規定，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」在本文中用以包括複數參照物。

如本文所用之術語「治療(treatment或treating)」欲意謂獲得所需藥理學及/或生理作用，例如改善與疾病相關之症狀。該作用可在完全或部分預防疾病或其症狀方面為預防性的及/或在部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良影響方面為治療性的。如本文所用之「治療」包括對哺乳動物(特定言之人類)之疾病的防治性(例如預防性)、治癒性或緩解性治療；且包括：(1)對在易患疾病但尚未診斷為患有該疾病之個體中存在的該疾病或病況之防治性(例如預防性)、治癒性或緩解性治療；(2)抑制疾病(例如藉由遏制其進展來抑制)；或(3)緩解疾病(例如減輕與疾病相關的症狀)。

術語「投與(administered)」、「投與(administering)」或「投與(administration)」在本文中可互換使用以指傳遞模式，包括(但不限於)靜脈內、肌內、腹膜內、動脈內、皮下或經皮投與本發明之試劑(例如化合物或組合物)。

如本文中所用之術語「預防(prevent)」、「預防(preventing)」及 「預防(prevention)」係指預防疾病或病症或其一或多種症狀的發作、復發或擴散。在某些實施例中，該術語係指在存在或不存在一或多種其他額外活性劑之情況下，在症狀發作之前，尤其對處於本文提供之疾病或病症風險下的患者，用本文提供之化合物或抗體或劑型治療或投與本文提供之化合物或抗體或劑型。該等術語涵蓋具體疾病之症狀之抑制或減少。就此而言，術語「預防」可與術語「預防性治療」互換使用。

除非另外指明，否則如本文所用之術語「共投與」及「與……組合」包括同步、同時或在無特定時限內依序投與兩種或兩種以上治療劑。

如本文所用之術語「有效量」係指在特定劑量及時間段下有效達成關於疾病治療所需結果之量。有效量之試劑不需要治癒疾病或病況，但將提供疾病或病況之治療，使得該疾病或病況之發作得以延遲、受阻或預防，或改善該疾病或病況症狀。有效量可為單一劑量或分成呈適合形式的兩個或兩個以上劑量，其欲在整個指定時間段中以一次、兩次或大於兩次投與。

如本文所用之術語「個體」或「患者」係指可用本發明之方法治療之動物，包括人類物種。除非特定地指明一種性別，否則術語「個體」或「患者」意欲指男性及女性兩種性別。因此，術語「個體」或「患者」包含可得益於本發明之治療方法的任何哺乳動物。

如本文所用之術語「血管新生相關疾病」係指特徵為病理性血管新生之病症。特徵為病理性血管新生之病症係指其中單獨或與其他組合之不正常或異常血管新生促成病症之起因、起源或症狀的病症。

如本文中所用，術語「組合療法」係指兩種或兩種以上不同醫藥劑以重疊方案投與以使個體同時暴露於兩種藥劑之情形。

如本文所用，術語「抑制」意謂防止某事發生，延遲某事發生 出現及/或降低某事發生之程度或可能性。因此，「抑制血管新生」及「抑制新血管系(neovasculature)形成」意欲涵蓋預防、延遲及/或降低血管新生發生之可能性以及降低新血管之數目、生長速率、大小等。

如本文所用，術語「黃斑變性」係指由於視網膜之損壞而引起視野中心(黃斑)視覺喪失之醫學病況。「濕性黃斑變性」(亦稱為新血管型或滲出型)係指涉及來自視網膜後方脈絡膜之血管生長的黃斑變性。在濕性黃斑變性中，視網膜有時可能剝離。「年齡相關之黃斑變性」(AMD)係指最常見形式之黃斑變性，其通常在晚年開始，黃斑中有特徵黃色沈積物。

如本文所用，術語「轉移(metastasis)」(有時縮寫為「mets」；複數「metastases」)係指腫瘤細胞自一個器官或組織擴散至另一部位。該術語亦指由於轉移而在新部位形成之腫瘤組織。「轉移性癌症」為自其原始或原發部位擴散之癌症，且亦可稱為「繼發性癌症」或「繼發性腫瘤」。一般而言，轉移性腫瘤係以其起源之原發性腫瘤之組織命名。

術語「醫藥學上可接受」在本文中用於指在醫學判斷範疇內，適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症、且與合理益處/風險比相匹配之化合物、物質、組合物及/或劑型。

如本文所使用，「醫藥學上可接受之鹽」係指所揭示之化合物的衍生物，其中母體化合物藉由製得其酸鹽或鹼鹽而改質。醫藥學上可接受之鹽之實例包括(但不限於)鹼性殘基(諸如胺、吡啶、嘧啶及喹唑啉)之礦物質或有機酸鹽；酸性殘基(諸如羧酸)之鹼金屬或有機鹽；及其類似物。

在一個態樣中，本發明提供一種抑制、改善、預防或治療血管 新生相關疾病之方法，其包含向個體投與有效量之以下式(I)化合物， 其中R為-(CH₂)_1-4苯基，其中苯基未經取代或經一至三個羥基、NH₂、NO₂或烷基取代；-(CH₂)_1-4吲哚基；-(CH₂)_1-4萘基；或異丙基， 或其互變異構體、立體異構體或對映異構體、或其溶劑合物、前藥或醫藥學上可接受之鹽。

在一些實施例中，R為-CH₂苯基、-CH₂吲哚基、-CH₂萘基或異丙基。在另一實施例中，R為異丙基。

在一些實施例中，式(I)化合物係選自：(S)-1-((S)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-1-側氧基-3-苯基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-1-側氧基-3-苯基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((S)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-側氧基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-側氧基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((S)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-(萘-2-基)-1-側氧基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-(萘-2-基)-1-側氧基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((S)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基胺 基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；及(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯

或其互變異構體、立體異構體或對映異構體、或其溶劑合物、前藥或醫藥學上可接受之鹽。

在另一實施例中，該化合物為(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯。該化合物之 化學結構為。

血管新生涉及新微血管自先存在的血管生長或出芽，且涉及新生血管生長之血小管生成為許多生理性及病理性病況所必需的，該等病況包括胚胎發生、侵襲性及轉移性癌症、類風濕性關節炎、糖尿病性視網膜病變、肥胖症、動脈粥樣硬化、缺血性心臟及肢體疾病以及創傷癒合。超過70種疾病已鑑別為血管新生依賴性(Carmeliet,Nature,438：932-6,2005)。新血管之不正常發展已涉及許多病理生理學過程。舉例而言，血管之不正常生長與腸閉鎖、消化性潰瘍、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬、增殖性視網膜病變及動脈粥樣硬化相關。由於血管新生涉及多種病理性過程，故本發明方法可適用於治療、改善或預防諸如侵襲性及轉移性癌症及眼新血管生成(諸如黃斑變性)之疾病。

在一些實施例中，侵襲性及轉移性癌症為血管新生相關癌症。根據一些實施例，侵襲性及轉移性血管新生相關癌症包括(但不限於)口腔癌、腦癌、乳癌、腎癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、肝癌、肝細胞癌及黑素瘤。

在一個實施例中，眼新血管生成為黃斑變性。黃斑變性為65歲及65歲以上人視力損失及失明之主要病因。黃斑變性通常以年齡相關之形式發生(通常稱作AMD)，但亦會發生青少年的黃斑變性。在AMD中，黃斑為造成急劇的中央視力退化之視網膜的一部分。

如「新生血管性」名稱所表明，濕性黃斑變性之特徵為新血管生長異常，例如在黃斑上生長。此類新血管可在視網膜下生長，血液及體液滲漏。此類滲漏導致感光視網膜細胞永久性損傷，該等細胞死亡且在中央視力中產生盲點。濕性黃斑變性可進一步分成兩類。在濕性黃斑變性之隱性形式中，在視網膜下生長之新血管不顯著且滲漏較不明顯，通常產生較不嚴重之視力下降。在濕性黃斑變性之典型形式中，血管生長及結疤具有極其清楚、可描繪之輪廓，其可在視網膜下觀測到。經典濕性黃斑變性亦稱為經典脈絡膜新生血管且通常導致更嚴重的視力損失。

鑒於血管新生在濕性黃斑變性中之作用，其包含許多AMD情況，本發明方法可適用於治療及/或預防此類病症。濕性黃斑變性之當前療法涉及血管新生抑制劑，視情況與光動力療法(PDT)組合以使藥物靶向特定細胞。亦使用光凝來治療濕性黃斑變性，其中使用較高能量雷射光束以在具有不正常血管之視網膜區域中產生小燒傷。

本發明化合物可利用可有效地將本發明之化合物或組合物傳輸至適當或所需作用部位之任何途徑向哺乳動物、較佳人類投與，該途徑為諸如經口、經鼻、經肺、經皮，諸如被動或離子導入傳遞，或非經腸，例如經直腸、積存、皮下、靜脈內、肌肉內、鼻內、腦內、眼用溶液或軟膏。根據本發明之給藥方案可由單一劑量或經一段時間的複數個劑量組成。投與可為每日、每週(或以一些其他多天間隔)或按間斷的時程一次或多次。欲投與之本文所述之化合物或其醫藥組合物之確切量將隨各個體而變化。

可能需要降低眼新血管生成疾病中之血管新生程度。在一些實施例中，本文所述之化合物可傳遞至眼。傳遞至眼可例如使用玻璃體內、眼內及/或眼周途徑(諸如玻璃體內注射劑、結膜下注射劑等)達成。將本文所述之化合物局部施加至眼亦可例如使用點眼劑達成。眼投與途徑可尤其適用於治療眼新血管生成疾病，諸如黃斑變性。

視投與途徑而定，有效劑量可根據以下計算：體重；體表面積；原發器官/腫瘤大小；及/或待治療之個體之癌轉移之數目、大小及/或類型。最終給藥方案將由主治醫師考慮會改變藥物作用之各種因素來確定，該等因素例如為藥物之比活性；患者之損傷及反應之強度；患者之年齡、健康狀況、體重、性別及飲食；任何存在之感染的嚴重度；投藥時間；其他療法之使用(或不使用)；及其他臨床因素。

本發明之方法可與其他療法組合使用(亦即，根據本發明之治療可與一或多種所需治療劑或醫療程序同時、在其之前或在其之後投與)。用於此類組合方案之療法(治療劑或程序)之具體組合將考慮所需治療劑及/或程序之相容性以及欲達成之所需治療作用。

舉例而言，對於侵襲性及轉移性癌症，本發明之方法可與其他程序一起使用，包括手術、放射線療法(例如γ輻射、神經元波束放射線療法、電子束放射線療法、質子療法、近接療法、全身性放射性同位素)、化學療法、內分泌療法、高溫及超低溫療法，視待治療之腫瘤而定。

本發明之方法還可與第二抗癌劑之一或多種其他組合同時、分開或在其之後使用。第二抗癌劑包括(但不限於)抗代謝產物(例如5-氟尿嘧啶、甲胺喋呤、氟達拉賓(fludarabine)、阿糖胞苷(cytarabine)(亦稱為胞嘧啶阿拉伯糖苷或Ara-C)及高劑量阿糖胞苷)、抗微管劑(例如長春花生物鹼(vinca alkaloid)，諸如長春新鹼(vincristine)及長春鹼(vinblastine)；及紫杉烷(taxane)，諸如太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多 西他賽(docetaxel))、烷化劑(例如二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、美法侖(melphalan)、美法侖、異環磷醯胺(ifosfamide)、卡莫司汀(carmustine)、阿紮胞苷(azacitidine)、地西他濱(decitabine)、白消安(busulfan)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、達卡巴嗪(dacarbazine)、異環磷醯胺、及亞硝基脲(諸如卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、雙氯乙基亞硝基脲及羥脲)、鉑試劑(例如順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、賽特鉑(satraplatin)(JM-216)及CI-973)、蒽環黴素(anthracycline)(例如多柔比星(doxorubicin)及道諾黴素(daunorubicin))、抗腫瘤抗生素(例如絲裂黴素(mitomycin)、博萊黴素(bleomycin)、艾達黴素(idarubicin)、阿黴素(adriamycin)、道諾黴素(daunomycin)(亦稱為道諾黴素(daunorubicin)、紅比黴素(rubidomycin)或柔紅黴素(cerubidine))及米托蒽醌(mitoxantrone))、拓撲異構酶抑制劑(例如依託泊苷(etoposide)及喜樹鹼(camptothecin))、嘌呤拮抗劑或嘧啶拮抗劑(例如6-巰基嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氯法拉濱(clofarabine)及吉西他濱(gemcitabine))、細胞成熟劑(例如三氧化二砷及維甲酸(tretinoin))、DNA修復酶抑制劑(例如鬼臼毒素(podophyllotoxine)、依託泊苷(etoposide)、伊立替康(irinotecan)、拓撲替康(topotecan)及替尼泊苷(teniposide))、阻止細胞存活之酶(例如天冬醯胺酶及培門冬酶)、組蛋白脫乙醯基酶抑制劑(例如伏立諾他(vorinostat))、任何其他細胞毒性劑(例如磷酸雌莫司汀(estramustine phosphate)、地塞米松(dexamethasone)、潑尼氮芥(prednimustine)及丙卡巴肼(procarbazine))、激素(例如地塞米松、強的松(prednisone)、甲基潑尼龍(methylprednisolone)、他莫昔芬(tamoxifen)、亮丙立德(leuprolide)、氟他胺(flutamide)及甲地孕酮(megestrol))、單株抗體(例 如吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、阿侖單抗(alemtuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)及釔-90-替伊莫單抗泰澤坦(yttrium-90-ibritumomab tiuxetan))、免疫調節劑(例如沙立度胺(thalidomide)及來那度胺(lenalidomide))、Bcr-Abl激酶抑制劑(例如AP23464、AZD0530、CGP76030、PD180970、SKI-606、伊馬替尼(imatinib)、BMS354825(達沙替尼(dasatinib))、AMN107(尼羅替尼(nilotinib))及VX-680)、激素促效劑或拮抗劑、部分促效劑或部分拮抗劑、激酶抑制劑、手術、放射線療法(例如γ輻射、中子束放射線療法、電子束放射線療法、質子療法、近接療法及全身性放射性同位素)、內分泌療法、生物學反應調節劑(例如干擾素、介白素及腫瘤壞死因子)、高溫及超低溫療法、及減弱任何不良影響之試劑(例如止吐藥)。在一個實施例中，抗癌劑或癌症治療劑為細胞毒性劑、抗代謝物、抗葉酸物、HDAC抑制劑、DNA插入劑、DNA交聯劑、DNA烷化劑、DNA裂解劑、拓撲異構酶抑制劑、CDK抑制劑、JAK抑制劑、抗血管生成劑、Bcr-Abl抑制劑、HER2抑制劑、EGFR抑制劑、VEGFR抑制劑、PDGFR抑制劑、HGFR抑制劑、IGFR抑制劑、c-Kit抑制劑、Ras路徑抑制劑、PI3K抑制劑、多靶向激酶抑制劑、mTOR抑制劑、抗雌激素、抗雄激素、芳香酶抑制劑、生長抑素類似物、ER調節劑、抗微管蛋白劑、長春花生物鹼、紫杉烷、HSP抑制劑、Smoothened拮抗劑、端粒酶抑制劑、抗轉移劑、免疫抑制劑、生物製劑(諸如抗體或激素療法)。

血管新生在癌症及黃斑變性之進展中起到重要作用。本發明指示橙黃醯胺雙肽化合物深度抑制人類早期及晚期內皮祖細胞之血管生成功能。該等化合物亦展現離體及在活體內兩種情況下之有前景的抗血管生成作用。特定言之，該等化合物為阻斷黑素瘤之腫瘤生長及癌轉移以及AMD之病理性新血管生成的新穎血管新生抑制劑。

實例

材料與方法：

人類CD34陽性內皮祖細胞之分離及培育

此研究符合赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)中關於人類組織使用中概述之原則。倫理學批准由臺灣臺北的馬偕紀念醫院(Mackay Memorial Hospital,Taipei,Taiwan)之機構審查委員會(Institutional Review Board)授予。在收集周邊血液(80mL)之前自健康供體獲得知情同意書。周邊血液單核細胞(PBMC)藉由離心在Ficoll-PaqueTM plus(GE Healthcare)上根據製造商之說明書而自其他血液組分分級分離。獲得且培養CD34陽性祖細胞。簡言之，細胞使用CD34微珠粒套組及MACSTM細胞分離系統(均來自Miltenyi Biotec)自PBMC分離。CD34陽性EPC維持在MV2完全培養基(PromoCell)中，該培養基由內皮基礎培養基、20%胎牛血清、hEGF、VEGF、hFGF-B、IGF-1、抗壞血酸及肝素組成。將1×10⁶個細胞/cm²接種於經纖維結合蛋白塗佈之培養皿(BD Biosciences)上且在37℃培育箱中在加濕95%空氣及5%CO₂氛圍下維持。

細胞增殖分析

將EPC(5×10³個細胞/孔)接種至96孔盤上。在24小時培育之後，移除培養基，且細胞在不存在或存在Fmoc-10a之情況下與含有2%FBS的新鮮MV2完全培養基一起培育48小時。細胞與MTT(0.5mg/mL)一起培育2小時。甲臢晶體利用二甲亞碸(DMSO)溶解，且在550nm下用ELISA讀取器量測吸光度。

細胞毒性分析

EPC在不存在或存在Fmoc-10a之情況下用含有2%FBS之MV2完全培養基處理48小時。LDH釋放百分比由在Fmoc-10a處理之後培養基中之LDH活性與細胞溶解物中之LDH活性的比率計算。

細胞遷移分析

將EPC(5×10⁴個細胞/孔)接種至具有MV2完全培養基之上部腔室上，接著在具有含有2%FBS之具有指定濃度Fmoc-10之MV2完全培養基的底部腔室中培育。在16小時處理之後，機械移除過濾器上側上之細胞，且將遷移在下側上之細胞用4%甲醛固定，接著用0.5%結晶紫染色10分鐘。細胞遷移藉由用倒置相差顯微鏡在10個隨機視野中計數染色細胞數目來定量且進行攝影。

毛細管形成分析

將用於促進EPC分化成毛細管狀結構之基質膠(BD Biosciences,Bedford,MA)添加至48孔盤中。經基質膠塗佈之48孔盤在37℃下培育30分鐘以允許聚合。在凝膠形成之後，每孔接種EPC(6×10⁴個細胞)於含有2%FBS之具有指定濃度Fmoc-10a之MV2完全培養基中的聚合基質膠層上，接著在37℃下培育10-16小時。毛細管形成之顯微照片用倒置相差顯微鏡採集。管形成藉由在每孔3個隨機視野中藉由使用Image-Pro Plus軟體量測每一管之長軸來定量。

群落形成分析

將經分離之PBMC再懸浮在MV2完全培養基中。在2天之後，收集非附著細胞，且再接種至經纖維結合蛋白塗佈之24孔盤上。五天後，計數每孔早期EPC之群落形成單位(CFU)之數目。

早期EPC趨化性分析

早期EPC之趨化運動使用Transwell評估。下層過濾器表面經明膠塗佈。將存在或不存在MV2完全培養基之Fmoc-10a置放於下層孔中。腔室在37℃下培育4小時。細胞用冷甲醇固定且用0.5%結晶紫染色。

主動脈環出芽分析

主動脈收集自8至10週齡史泊格多利大白鼠(Sprague-Dawley rat)。在澈底洗滌之後，將主動脈切成1mm環片段。將主動脈環置放 於48孔盤中，該等盤預塗佈130μl基質膠且在37℃下聚合。該等孔隨後再用50μl基質膠覆蓋以用於密封。接著將具有或不具有Fmoc-10a之VEGF(20ng/ml)添加至孔中。每3天更換培養基。在第8天觀測出芽內皮細胞且攝影。出芽血管之面積利用Image-Pro Plus軟體定量地量測。

定向活體內血管新生分析(DIVAA)

手術矽酮試管在4℃下用含有具有或不具有Fmoc-10a之VEGF的基質膠填充。接著，將經麻醉小鼠(C57BL/6小鼠)之腰部背刮毛且滅菌準備。製得5mm皮膚切口且用無菌止血鉗形成10mm深的皮下凹穴。DIVAA試管在37℃下培育1小時以允許凝膠形成且接著植入至小鼠之背側中。在15天之後，獲取DIVAA試管且攝影。新血管藉由用德拉布金法(Drabkin method)量測栓塞之血紅素來定量。所有涉及動物實驗之程序均由馬偕醫學院(Mackay Medical College)之機構動物護理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。

黑素瘤細胞之培養

小鼠黑素瘤細胞株(B16F10)獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas,VA)且培養在含有10%FBS、青黴素(100單位/ml)、鏈黴素(100μg/ml)及L-麩醯胺酸(2mM)中之DMEM。將細胞維持在37℃含有5%CO2之加濕空氣中。

侵襲分析

過濾器上側經濃度為125μg/cm²之基質膠(BD Biosciences，Bedford,MA)塗佈。將B16F10細胞(5×10⁴個細胞/孔)接種至具有無血清培養基之上部腔室上，接著在具有含有10%FBS之不存在或存在Fmoc-10a之培養基的底部腔室中培育。在16小時處理之後，機械移除過濾器上側上之細胞，且將遷移在下側上之細胞用4%甲醛固定，接著用0.5%結晶紫染色10分鐘。最後，侵襲之細胞藉由用倒置相差顯微 鏡在10個隨機視野中計數染色細胞數目來定量且進行攝影。

VEGF ELISA分析

B16F10細胞用各種濃度之Fmoc-10a或媒劑處理24小時，且接著收集上清液以檢查血管內皮生長因子(VEGF)蛋白之量。VEGF小鼠ELISA套組(Novex,Invitrogen)根據製造商之說明書使用。

皮下異種移植模型

將體積為100μL之B16F10細胞(2×10⁶個)皮下注射至C57BL/6小鼠之右側腹中。在9天之後，當腫瘤直徑達至2mm時，小鼠每日藉由腹膜內注射來隨機給予媒劑或指定劑量之Fmoc-10a。每日量測腫瘤大小及體重。腫瘤體積根據下式計算：V=(長度×寬度²/2)。根據動物倫理委員會(Animal Ethics Committee)，當動物中出現不堪忍受之情形時，應停止實驗。

實驗癌轉移模型

將B16F10細胞(2×10⁶個)緩慢注射至C57BL/6小鼠之側尾靜脈中以引發腫瘤癌轉移。自腫瘤細胞注射之前3天至腫瘤細胞注射之後21天(處死之日)每日向小鼠腹膜內投與Fmoc-10a(1.5或4.5mg/kg)。

氧誘導之視網膜病變(OIR)

OIR之小鼠模型已在與視網膜缺血疾病(包括AMD)相關之研究中及在評估抗血管生成化合物之功效的研究中廣泛用於誘導視網膜新血管生成。簡言之，出生後(P7)之BALB/c裸鼠與其哺乳母鼠(nursing dam)一起經歷氧過多(75%氧氣)持續5天(P12)，且接著經歷室內空氣以製造視網膜新血管生成。在返回至常氧後發生新血管生成且在P17達至峰值。OIR模型中之所有小鼠在安樂死時經由左心室穿刺用5ml若丹明(rhodamine)結合之葡聚糖灌注固定。接著，執行視網膜血管之血管造影，且製備視網膜整體裝片以對視網膜病變特徵進行評分。

實例1 Fmoc-10a抑制人類晚期EPC之細胞增殖、遷移及管形成且無細 胞毒性作用.

在48小時處理之後，Fmoc-10a以濃度依賴性方式抑制晚期EPC之細胞增殖(圖1A及B)。另外，Fmoc-10a甚至在高濃度(30μM)下亦不誘導晚期EPC之LDH釋放(圖1C)。Fmoc-10a在16小時處理之後顯著抑制晚期EPC之細胞遷移及管形成(圖1D及E)。此等結果指示Fmoc-10a具有在不以細胞毒性方式起作用的情況下阻斷活體外血管新生之能力。

實例2 Fmoc-10a抑制人類早期EPC之群落形成及趨化運動

出現證據展現早期EPC藉由介導血管生成開關來促進血管新生及血小管生成。Fmoc-10a顯著抑制早期EPC之周邊處的CFU-希爾(CFU-Hill)群落及伸長之紡錘狀細胞(圖2A及B)。Fmoc-10a亦顯著抑制早期EPC之趨化性(圖2C)。此等結果指示Fmoc-10a具有阻斷早期EPC之血管生成開關之藥理學功能。

實例3 Fmoc-10a離體及在活體內抑制血管新生.

血管內皮生長因子(VEGF)為調節血管新生之最強力的血管生成因子。Fmoc-10a顯著消除來自主動脈環之VEGF誘導之血管出芽(圖3A)。此外，藉由分析血紅素含量，Fmoc-10a濃度依賴性地減弱基質膠栓塞中之微血管形成。此等結果指示Fmoc-10a離體及在活體內阻斷VEGF誘導之血管新生(圖3B)。

實例4 Fmoc-10a在活體外及活體內抑制黑素瘤之腫瘤生長及癌轉移.

黑素瘤為侵襲性皮膚癌且亦幾乎為皮膚癌相關之死亡原因。儘管黑素瘤為相對罕見的癌症，但黑素瘤之臭名昭著的侵襲性係歸因於其顯著的轉移性傾向。惡性黑素瘤已充分記錄為高血管生成腫瘤類型，清楚地展示新血管形成作為非典型黑素細胞之疾病進展中之重要步驟。血管生成生長因子(諸如VEGF)在黑素瘤中過度表現且已發現與疾病進展及預後相關。吾人展現Fmoc-10a顯著抑制黑素瘤細胞中之細胞侵襲及VEGF製造(圖4A及B)。Fmoc-10a以劑量依賴性方式強力 阻斷黑素瘤細胞之腫瘤生長(圖4C)。此外，Fmoc-10a實質上抑制黑素瘤癌症之肺部癌轉移(圖4D)。此等結果指示Fmoc-10a經由抑制黑素瘤細胞中之VEGF製造及侵襲特性以及黑素瘤微環境中之血管新生抑制展現出新穎抗腫瘤及抗癌轉移活性。

實例5 Fmoc-10a抑制AMD動物模型中之脈絡膜新生血管(CNV).

新血管生成在AMD中起重要作用。眼新生血管性疾病之治療利用靶向VEGF之玻璃體內療法而得到澈底改變。Fmoc-10a如癌思停般顯著阻斷小鼠之氧過多誘導之病理性新血管生成(圖5)。此等結果指示Fmoc-10a為具有治療血管新生相關疾病(諸如AMD)之潛能的有前景的血管新生抑制劑。

靶向EPC以阻斷血管新生為用於血管新生相關疾病之目前有吸引力的治療方法。本文中，本發明人已展示Fmoc-10a(橙黃醯胺雙肽化合物)深度抑制人類早期及晚期EPC之血管生成功能。Fmoc-10a亦展現離體及在活體內兩種情況下之有前景的抗血管生成作用。Fmoc-10a為阻斷黑素瘤之腫瘤生長及癌轉移以及AMD之病理性新血管生成的新穎血管新生抑制劑。因此，本發明將具有應用於治療血管新生相關疾病(尤其黑素瘤癌症及AMD)之極大潛能。

Claims (15)

1. 一種抑制、改善、預防或治療血管新生相關疾病之方法，其包含向個體投與有效量之以下式(I)化合物， 其中R為-(CH₂)_1-4苯基，其中苯基未經取代或經一至三個羥基、NH₂、NO₂或烷基取代；-(CH₂)_1-4吲哚基；-(CH₂)_1-4萘基；或異丙基，或其互變異構體、立體異構體或對映異構體、或其溶劑合物、前藥或醫藥學上可接受之鹽。
2. 如請求項1之方法，其中R為-CH₂苯基、-CH₂吲哚基、-CH₂萘基或異丙基。
3. 如請求項1之方法，其中R為異丙基。
4. 如請求項1之方法，其中該式(I)化合物係選自：(S)-1-((S)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-1-側氧基(oxo)-3-苯基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-1-側氧基-3-苯基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((S)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-側氧基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-側氧基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((S)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-(萘-2-基)-1-側氧基丙- 2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-(萘-2-基)-1-側氧基丙-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；(S)-1-((S)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；及(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯；或其互變異構體、立體異構體或對映異構體、或其溶劑合物、前藥或醫藥學上可接受之鹽。
5. 如請求項1之方法，其中該化合物為(S)-1-((R)-1-羥基-3-苯基丙-2-基胺基)-3-甲基-1-側氧基丁-2-基胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲酯，
6. 如請求項1之方法，其中該血管新生相關疾病為侵襲性及轉移性血管新生相關癌症或眼新血管生成。
7. 如請求項6之方法，其中該侵襲性及轉移性血管新生相關癌症為侵襲性及轉移性口腔癌、腦癌、乳癌、腎癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、肝癌、肝細胞癌及黑素瘤。
8. 如請求項6之方法，其中該侵襲性及轉移性血管新生相關癌症為黑素瘤。
9. 如請求項6之方法，其中該投藥於癌症係與手術、放射線療法或化學療法組合、在其之前或在其之後使用。
10. 如請求項6之方法，其進一步包含同時、分開或隨後投與第二抗癌劑以用於治療侵襲性及轉移性血管新生相關癌症。
11. 如請求項6之方法，其中該眼新血管生成為黃斑變性。
12. 如請求項11之方法，其中該黃斑變性為濕性黃斑變性。
13. 如請求項12之方法，其中該濕性黃斑變性為年齡相關之黃斑變性(AMD)。
14. 如請求項11之方法，其中該投藥係以玻璃體內、眼內或眼周途徑。
15. 如請求項11之方法，其中該化合物係調配成注射劑或點眼劑。