ES2275647T3 - Diantraquinonas policiclicas como agentes anti-cancerosos y anti-angiogenicos. - Google Patents
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Abstract
Uso de un compuesto de heliantrona o de un derivado del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos oftalmológicos asociados con la angiogénesis y para la prevención o inhibición de la reestenosis, compuesto que tiene la fórmula general (I): en la que R es seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxilo C1-C10, NH-alquilo C1-C10 y NH-hidroxialquilo (C1-C10); R'' es seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo y alcoxilo C1-C10; y R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, cloro, bromo, alquilo C1-C10, alcoxilo C1-C10 y alcoxicarbonilo C1-C10.
Description
Diantraquinonas policíclicas como agentes
anti-cancerosos y
anti-angiogénicos.
El presente invento se refiere a ciertas
aplicaciones terapéuticas de compuestos de helioantrona.
El descubrimiento de las vías de transducción de
señales que activan la proliferación celular en respuesta a
interacciones entre factores de crecimiento y los correspondientes
receptores celulares desencadenó una amplia búsqueda de inhibidores
que pudieran interferir en esta cascada en malignidades en que
células malignas experimentan una proliferación descontrolada. Las
señales químicas de esta cascada han sido identificadas como
fosforilación de proteínas en restos de tirosina, catalizada por un
grupo de enzimas colectivamente denominadas proteína tirosina
quinasas (PTK; del inglés, protein tyrosine
kinases), o en restos de serina/treonina por las proteína
quinasas A, B y C. La proteína quinasa C (PKC) es además un
importante transductor de señales celulares que contiene un dominio
catalítico que fosforila sustratos y un dominio regulador que
controla su actividad. Flavonas polihidroxiladas tales como la
genisteína y la quercetina fueron identificadas como inhibidores de
las quinasas de fosforilación (Losiewicz et al., 1.994).
Las perilenoquinonas son un grupo único de
inhibidores de quinasas (Diwu et al., 1.994). El primero de
estos compuestos que fue evaluado a fondo fue la hipericina, un
potente agente fotodinámico del que los presentes inventores
descubrieron inicialmente que era virucida para retrovirus (Lavie
et al., 1.989; Meruelo et al., 1.988), y
posteriormente se descubrió que lo era para todos los virus con
envoltura lipídica (Tang et al., 1.990). Estudios
adicionales permitieron identificar la hipericina como un inhibidor
dependiente de la luz, potente e irreversible de la proteína
quinasa C (PKC), particularmente cuando la PKC está translocada a la
membrana celular después de una activación celular, actividad
inhibidora de PKC de la hipericina que está posiblemente
relacionada con su actividad antirretrovírica (Takahashi et
al., 1.989).
La hipericina es capaz de actuar en sistemas
biológicos en la oscuridad, posiblemente a causa de un bajo
potencial redox, y esto parece permitir la captura electrónica de
reacciones de transferencia fisiológicas (Lavie et al.,
1.994). La combinación única de propiedades de la hipericina impulsó
su actual evaluación clínica en pruebas clínicas de fase II como un
agente antitumoral en el tratamiento del glioma maligno (Couldwell
et al., 1.994). Esta neoplasia depende de la señalización de
PKC para la proliferación celular. La hipericina es además un
potente agente fotosensibilizador capaz de generar oxígeno singlete
y radicales libres (Hadjur et al., 1.994). Estas propiedades
también la hacen útil en la terapia fotodinámica (PDT; del inglés,
photodynamic therapy) de tumores superficiales
accesibles a la irradiación lumínica.
Desafortunadamente, la hipericina sólo es activa
en la mitad de los casos y, además, puede causar graves efectos
secundarios, tal como una prolongada sensibilidad a la luz después
del tratamiento, un estado médicamente conocido como hipericismo,
Sería deseable obtener agentes fotosensibilizadores e inhibidores de
la transducción de señales implicadas en la proliferación celular
adicionales que pudieran provocar su efecto citotóxico con mayor
eficacia en comparación con los agentes existentes y,
potencialmente, con menos efectos secundarios y de menor
gravedad.
Los presentes inventores han descrito
previamente que ciertos derivados de heliantrona pueden ser útiles
en la terapia fotodinámica (PDT) de tumores para, junto con
irradiación lumínica, provocar la destrucción de los tumores
(Publicación PCT WO 99/06347).
Aunque las propiedades fotodinámicas han sido
implicadas en el mecanismo de las actividades biológicas de la
hipericina, muchas de estas actividades tienen también lugar en la
oscuridad. Efectos tales como la inhibición del crecimiento de
células de glioma maligno son independientes de la luz (Couldwell
et al., 1.994); la actividad virucida de la hipericina
frente al citomegalovirus murino, aunque muy potenciada por la luz,
ha sido también documentada en la oscuridad (Hudson et al.,
1.991).
En ninguna parte de la técnica fundamental se
enseña ni sugiere que diantraquinonas policíclicas perihidroxiladas
sean útiles para la inhibición de metástasis tumorales y la
prevención de la angiogénesis. Por lo tanto, existe la necesidad
insatisfecha y muy reconocida de inhibidores de la angiogénesis que
bloqueen específicamente la proliferación de estructuras
vasculares, sustancialmente sin afectar a otros procesos
fisiológicos, incluyendo la inhibición de la angiogénesis asociada
con el crecimiento o el desarrollo tumoral, la reestenosis y
trastornos oftalmológicos.
El presente invento se basa en el sorprendente
hallazgo de que ciertos derivados de heliantrona son capaces, en
concentraciones micromolares, de inhibir la transducción de señales
para la proliferación celular y el desarrollo celular a través del
ciclo de replicación celular, lo que indica que pueden ser
utilizados como agentes antineoplásicos para el tratamiento del
cáncer en ausencia de irradiación lumínica.
Se basa además en el sorprendente hallazgo de
que las heliantronas interfieren en el proceso de la angiogénesis
(formación de nuevos vasos sanguíneos) tanto en el ojo como en la
formación de tumores primarios y, particularmente, de metástasis,
lo que indica que pueden ser utilizadas para el tratamiento de
trastornos oftalmológicos asociados con la angiogénesis y para el
tratamiento de tumores primarios en ausencia de irradiación
lumínica.
De esta manera, un objeto del presente invento
es proporcionar composiciones farmacéuticas que comprendan
derivados de heliantrona eficaces como inhibidores de la
angiogénesis y adecuados para el tratamiento de trastornos
oftalmológicos asociados con la angiogénesis y para la inhibición de
la reestenosis. Otro objeto del presente invento es proporcionar
dichas composiciones farmacéuticas que comprenden dichos derivados
de heliantrona eficaces como agentes anticancerosos en ausencia de
irradiación lumínica.
Se revela ahora que composiciones que comprenden
los derivados de heliantrona de los que, en el Documento WO
99/06347, se describe previamente que actúan como agentes
anticancerosos junto con luz en terapia fotodinámica, son
inesperadamente eficaces también en ausencia de irradiación
lumínica. Se revela ahora que las composiciones poseen una
actividad antiangiogénica hasta ahora desconocida.
Se revela ahora que la heliantrona y derivados
de la misma interfieren en el proceso de la angiogénesis tumoral.
Este descubrimiento hace a estos compuestos útiles como modalidades
de tratamiento para pacientes de cáncer que son sometidos a la
extirpación quirúrgica de tumores primarios para evitar el
crecimiento de metástasis incurables. Se ha establecido que la
cirugía estimula el crecimiento de micrometástasis que eran
mantenidas latentes por inhibidores de factores de crecimiento
secretados por los tumores primarios. Estos compuestos pueden evitar
el crecimiento metastásico al interferir en la producción o
actividad del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF;
del inglés, vascular endothelial growth
factor) o de otros factores angiogénicos. Se sabe que el
VEGF, un potente agente aumentador de la permeabilidad vascular,
ejerce in vivo un papel esencial en la neovascularización
patológica asociada con muchas enfermedades, incluyendo la
neovascularización tumoral, la artritis reumatoide y la retinopatía
diabética.
El presente invento proporciona, en un aspecto,
el uso de un compuesto de heliantrona o de un derivado del mismo
para la preparación de una composición farmacéutica para el
tratamiento de trastornos oftalmológicos asociados con la
angiogénesis y para la prevención o inhibición de la reestenosis,
compuesto que tiene la fórmula general (I):
en la que R es seleccionado del
grupo que consiste en hidroxilo, alcoxilo
C_{1}-C_{10}, NH-alquilo
C_{1}-C_{10} y
NH-hidroxialquilo
(C_{1}-C_{10}); R' es seleccionado del grupo que
consiste en hidroxilo y alcoxilo C_{1}-C_{10};
y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} son
independientemente seleccionados del grupo que consiste en
hidrógeno, hidroxilo, cloro, bromo, alquilo
C_{1}-C_{10}, alcoxilo
C_{1}-C_{10} y alcoxicarbonilo
C_{1}-C_{10}.
En un segundo aspecto, el presente invento se
refiere al uso del compuesto de heliantrona de fórmula general (I)
para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la
proliferación de células endoteliales o musculares lisas vasculares
asociada con la reestenosis.
En un tercer aspecto, el presente invento se
refiere al uso del compuesto de heliantrona de fórmula general (I)
para la preparación de una composición farmacéutica para el
tratamiento de tumores en ausencia de irradiación lumínica.
Son ejemplos de dichos compuestos, como las
realizaciones actualmente más preferidas del presente invento, la
10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona
y la
10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona,
de las fórmulas A y B siguientes:
\hskip2,5cm A.
Dimetil-tetrahidroxiheliantrona \hskip0,5cm B.
Dimetil-tetrametoxiheliantrona
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, los trastornos
oftalmológicos asociados con la angiogénesis son, pero no se limitan
a, retinopatías, incluyendo, pero sin limitarse a, la retinopatía
diabética, degeneración macular e infecciones oculares,
particularmente bacterianas.
En una realización preferida, la prevención de
la reestenosis es particularmente tras una angioplastia coronaria
trasluminal percutánea.
La Figura 1 muestra los efectos de diversas
concentraciones de
10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrametoxi-heliantrona
(dimetil-TMH) e hipericina sobre la viabilidad de
células de glioblastoma humano U251 en oscuridad completa.
La Figura 2 muestra los efectos de diversas
concentraciones de dimetil-TMH sobre la viabilidad
de células de neuroblastoma LAN5 en oscuridad completa.
La Figura 3 muestra los efectos de diversas
concentraciones de dimetil-TMH e hipericina sobre la
viabilidad de células de glioblastoma U87MG en oscuridad
completa.
La Figura 4 muestra los efectos de diversas
concentraciones de dimetil-TMH y TMH sobre la
viabilidad de células de glioblastoma U87MG en oscuridad completa
durante 48 horas.
La Figura 5 muestra los efectos fotodinámicos,
dependientes de la luz, de la dimetil-TMH sobre la
viabilidad de linfocitos de sangre periférica (PBL; del inglés,
peripheral blood lymphocytes) humanos
posmitóticos primarios en la oscuridad y conjuntamente con luz.
Las Figuras 6A-D muestran los
efectos de dimetil-TMH 10 \muM sobre células de
glioblastoma humano U251 en cultivo sin tratamiento (6A) y después
de un tratamiento durante 24 horas (6B), 48 horas (6C) y 72 horas
(6D).
Las Figuras 7A-C muestran los
efectos de dosis-respuesta de
dimetil-TMH 10 \muM (7B) y 20 \muM (7C) sobre
células de glioblastoma humano U251 en cultivo. El testigo (7A)
corresponde a células sin tratamiento.
La Figura 8 muestra el porcentaje de
supervivencia de ratones BALB/c a los que se habían inoculado
células de carcinoma de células escamosas, después de un
tratamiento con dimetil-TMH.
Las Figuras 9A-C muestran el
porcentaje de supervivencia de ratones BALB/c a los que se habían
inoculado células de adenocarcinoma de mama inducido con
DA-3^{HI}, después de un tratamiento con
hipericina, los días 89 (9A) y 100 (9B) después de la cirugía.
Las Figuras 10A-B son
fotografías de ojos de ratas después de una angiogénesis inducida
con heparanasa, sin tratamiento alguno (10A, testigo) y después de
un tratamiento con hipericina (10B).
Las hasta ahora desconocidas características de
los compuestos de heliantrona fueron detectadas mientras se
estudiaban los efectos de la hipericina y de derivados de
heliantrona sobre tumores de adenocarcinoma de mama inducidos en
ratones con la línea celular DA-3^{HI} y sobre
tumores de carcinoma escamoso anaplásico murino inducidos con la
línea celular SQ-2. Ambos tumores son muy
metastásicos y, si son quirúrgicamente resecados una vez que han
alcanzado un diámetro superior a 5 mm, los ratones pasarán a
desarrollar metástasis en los pulmones y el hígado. Las metástasis
causan la muerte de los animales en un periodo de aproximadamente
dos meses después de la cirugía. Aunque el uso de hipericina no es
acorde con el invento, será discutido a continuación a modo de
comparación.
Aunque estos dos tipos de tumores no son
inhibidos por la hipericina, se descubrió inesperadamente que, si
los tumores son quirúrgicamente extirpados cuando alcanzan un
diámetro de 8-10 mm, 2-4 inyecciones
de hipericina en el peritoneo protegen a los ratones de una muerte
debida a metástasis. Por lo tanto, la hipericina evita el
desarrollo de metástasis.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Además, al intentar entender por qué los tumores
primarios resultan menos afectados por la hipericina mientras las
metástasis son potentemente inhibidas, se descubrió inesperadamente
que la hipericina y también la
10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona
y su derivado
10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona
evitaban la neovascularización (capacidad del tumor para inducir la
formación de nuevos vasos sanguíneos con objeto de proporcionar un
suministro de sangre y nutrientes a los tumores en crecimiento). Al
evitarse el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos para suministro a
la metástasis en crecimiento, el foco metastásico en rápido
crecimiento es privado de nutrientes y oxígeno para sus células en
rápida multiplicación y la lesión degenera.
Los mecanismos por los que las células
cancerosas inducen la formación de nuevos vasos sanguíneos y los
dirigen hacia el tumor han sido ampliamente investigados, y se sabe
que están implicados mecanismos complejos. Las células cancerosas
secretan factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), factor
que dirige el crecimiento de vasos sanguíneos recién formados en la
dirección del gradiente de concentraciones de VEGF hacia la mayor
concentración de VEGF, para finalmente alcanzar el tumor (J.
Folkman, 1.985; J. Folkman et al., 1.989).
En los compuestos de fórmula (I) usados en el
presente invento, R es seleccionado del grupo que consiste en
hidroxilo, alcoxilo C_{1}-C_{10},
NH-alquilo C_{1}-C_{10} y
NH-hidroxialquilo
(C_{1}-C_{10}); R' es seleccionado del grupo
que consiste en hidroxilo y alcoxilo
C_{1}-C_{10}; y R_{1}, R_{2}, R_{3},
R_{4}, R_{5} y R_{6} son independientemente seleccionados del
grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, cloro, bromo, alquilo
C_{1}-C_{10}, alcoxilo
C_{1}-C_{10} y alcoxicarbonilo
C_{1}-C_{10}.
Como se usan aquí, "alquilo
C_{1}-C_{10}", "alcoxilo
C_{1}-C_{10}" y "alcoxicarbonilo
C_{1}-C_{10}" se refieren a radicales
lineales o ramificados que tienen de 1 a 10 átomos de carbono. Son
ejemplos de tales radicales alquilo, pero sin limitación, metilo,
etilo, propilo, isopropilo, butilo, hexilo y octilo. Son ejemplos
de tales radicales alcoxilo, pero sin limitación, metoxilo, etoxilo,
propiloxilo, isopropiloxilo, butoxilo, hexiloxilo y octiloxilo. Son
ejemplos de tales radicales alcoxicarbonilo, pero sin limitación,
metoxicarbonilo, etoxicarbonilo y propiloxicarbonilo. En una
realización preferida, R, R' y de R_{1} a R_{6} son metilo,
pero cadenas alifáticas más largas previstas en esas posiciones en
lugar del grupo metilo pueden tener ventajas tales como la
prolongación de la actividad biológica a causa de una mejor
retención por las células, y el requerimiento de una administración
menos frecuente.
Los compuestos preferidos utilizados en el
invento son heliantrona y derivados de la misma de fórmula (I) en
que los dos R de las posiciones 1 y 6 son hidroxilo, metoxilo,
butilamino o hidroxietilamino, los dos R' de las posiciones 3 y 4
son hidroxilo o metoxicarbonilo, R_{2} y R_{5} de las posiciones
14 y 9 son hidrógeno, y R_{3} y R_{6} de las posiciones 2 y 5
son hidrógeno o bromo. Son ejemplos de dichos compuestos preferidos:
1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona,
1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona,
10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona,
10,13-di(metoxicarbonil)-1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona,
1,6-di-N-butilamino-3,4-dimetoxiheliantrona,
1,6-di-N-butilamino-3,4-dimetoxi-10,13-dimetilheliantrona,
1,6-di-(N-hidroxietilamino)-3,4-dimetoxiheliantrona,
2,5-dibromo-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona,
2,5-dibromo-10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona
y, muy preferiblemente,
10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona.
Los compuestos de fórmula (I) de acuerdo con el
invento en que cada uno de R_{2} y R_{4} es alquilo inferior
pueden ser preparados mediante el método descrito en la Patente de
EE.UU. nº 5.120.412 al utilizar, como material de partida, una
1,3-dihidroxi-6-(alquilo
inferior)-antraquinona de fórmula (II):
en la que R' es alquilo inferior.
El compuesto II es reducido hasta la correspondiente antrona de
fórmula
(III)
en la que R' es como se definió
anteriormente, y el compuesto III es condensado para obtener
compuestos deseados de fórmula (I) en que R es alcoxilo
inferior.
\global\parskip0.990000\baselineskip
Otros compuestos de fórmula (I) pueden ser
preparados de modo análogo usando
1,3-dihidroxi-antraquinonas
apropiadamente sustituidas.
Los compuestos de fórmula (I) de acuerdo con el
invento en que cada uno de R_{2} y R_{4} es alcoxicarbonilo
inferior pueden ser preparados a partir de los derivados
diacetilados del compuesto de la fórmula (II) anterior en que R' es
metilo, por oxidación con CrO_{3} para formar el compuesto de
fórmula (IV):
el cual es luego dimerizado
mediante el método de Spitzner [Angew. Chem. Int. Ed.,
16, 46 (1.977)] para formar un compuesto de fórmula (I) en
que R es carboxilo, el cual es luego esterificado con un alcanol
inferior para obtener el deseado producto de fórmula (I) en que
R_{2} y R_{4} son alcoxicarbonilo
inferior.
Los compuestos de fórmula (I) en que cada R de
las posiciones 1 y 6 es alquilamino o hidroxialquilamino pueden ser
obtenidos por aminación del correspondiente compuesto de fórmula I
en que cada R es alcoxilo, con una alquilamina tal como butilamina
o con una hidroxialquilamina tal como etanolamina.
De acuerdo con el presente invento, se
proporcionan compuestos que inhiben la proliferación celular a
través del ciclo mitótico. Resultó sorprendente descubrir que estos
compuestos, y particularmente la
10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona
(aquí denominada "dimetil-TMH"), son muy
potentes en cuanto a desregular varios controles relacionados con
el ciclo celular que coordinan el paso ordenado de las células a
través de las diferentes fases del ciclo mitótico. En este ciclo,
las células en fase G0 de reposo pasan a la fase G1 de acumulación
de proteína y RNA. Las células entran luego en la fase S, en la que
se duplica el DNA genómico. Una vez completada la duplicación del
DNA, las células están en la fase G2 con el doble de cantidad de
DNA, listas para la división, y avanzan a la fase M de división
celular (mitosis), en la cual la célula se divide en dos células
hijas. De esta manera, se halló que la dimetil-TMH
posee una actividad inhibidora básica de la transducción de señales
de proliferación celular y detiene células malignas, incluyendo
células de glioblastoma y neuroblastoma, en las fases medias S y G2
del ciclo de replicación celular. En ratones que portaban tumores de
carcinoma de células escamosas, la dimetil-TMH
inhibía completamente la propagación del tumor en focos múltiples, y
los tumores se endurecían, se volvían necróticos y decaían después
de un tratamiento prolongado.
En líneas celulares de glioblastoma maligno
humano, el bloqueo del progreso ordenado de las células a través de
las diferentes fases del ciclo culminaba con la muerte celular
(Figura 1), identificándose a la dimetil-TMH como
más potente que la hipericina a la hora de matar las células
tumorales en cultivo en oscuridad completa. La muerte celular por
dimetil-TMH se producía con dosis con las que la
hipericina no ejercía efecto alguno sobre los cultivos.
Sorprendentemente, la dimetil-TMH era igualmente más
potente que la hipericina en la inducción fotodinámica de la muerte
celular cuando los tratamientos fueron llevados a cabo junto con
luz. Los mecanismos que actúan en la oscuridad eran muy diferentes
de los que median en la fotosensibilización inducida por luz. En la
oscuridad, la muerte celular tiene lugar aproximadamente cuatro días
después de que se administra el compuesto mientras que, con luz,
las células morían en 2-3 horas.
La dimetil-TMH no ejercía efecto
alguno sobre la viabilidad de células mononucleares normales de
sangre periférica humana. Además, la administración intraperitoneal
diaria del compuesto a ratones BALB/c durante una semana no tenía
efecto negativo alguno sobre los animales. En ratones BALB/c que
portaban tumores de carcinoma anaplásico de células escamosas, los
tratamientos con 200 \mug/ratón un día sí y otro no daban lugar a
una inhibición significativa del crecimiento tumoral en comparación
con ratones testigo no tratados que portaban el tumor.
Las composiciones farmacéuticas preparadas de
acuerdo con el invento se administrarán al paciente mediante
procedimientos estándares. La cantidad de compuesto que hay que
administrar y la vía de administración serán determinadas de
acuerdo con la clase de tumor, la fase de la enfermedad, y la edad y
el estado de salud del paciente. Las vías preferibles de
administración son la inyección intravenosa o la inyección directa,
en el tumor sólido, de la disolución acuosa del compuesto activo
que comprende vehículos y aditivos farmacéuticamente aceptables
convencionales, y el tratamiento tópico de los tumores cutáneos con
composiciones tópicas adecuadas. En tumores diseminados con
metástasis o en cánceres sistémicos tales como leucemias y linfomas,
las vías preferentes son las vías sistémicas, prefiriéndose la vía
intravenosa o la oral.
Los compuestos de heliantrona útiles en el
presente invento pueden ser utilizados para tratar diversos tipos
de cánceres y sus metástasis, incluyendo, pero sin limitarse a,
carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales,
melanoma, sarcoma de Kaposi, carcinoma de mama, carcinoma de
próstata, hemangioma, meningioma, astrocitoma, neuroblastoma,
carcinoma del páncreas, carcinoma gástrico, carcinoma colorrectal,
carcinoma de colon, carcinoma de células de transición de la vejiga
y carcinoma de la laringe, leucemia mieloide crónica, leucemia
linfocítica aguda, leucemia promielocítica aguda, mieloma múltiple,
linfoma de células T y linfomas de células B.
El compuesto de heliantrona útil en el invento
puede ser formulado mediante cualquier método necesario para
obtener composiciones farmacéuticas adecuadas para administración a
un paciente.
Además del ingrediente activo, las composiciones
farmacéuticas contienen vehículos, agentes diluyentes y similares
farmacéuticamente aceptables convencionales. Las composiciones
sólidas para administración oral, tales como tabletas, píldoras,
cápsulas y similares, pueden ser preparadas mezclando el ingrediente
activo con ingredientes farmacéuticamente aceptables
convencionales, tales como almidón de maíz, lactosa, sacarosa,
sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato magnésico, fosfato
dicálcico y gomas, y con agentes diluyentes farmacéuticamente
aceptables. Las tabletas o las píldoras pueden ser revestidas o, de
lo contrario, compuestas con materiales farmacéuticamente
aceptables conocidos en la técnica para obtener una forma de
dosificación que proporcione una acción prolongada o una liberación
continua. Otras composiciones sólidas pueden ser preparadas en forma
de microcápsulas para administración parenteral. Pueden prepararse
formas líquidas para administración oral o para inyección,
expresión que incluye las vías subcutánea, intramuscular e
intravenosa y otras vías parenterales de administración. Las
composiciones líquidas incluyen disoluciones acuosas, con o sin
codisolventes orgánicos, suspensiones acuosas u oleosas, emulsiones
con aceites comestibles, así como vehículos farmacéuticos similares.
Además, las composiciones farmacéuticas pueden ser formadas como
glóbulos encapsulados o como otros depósitos para distribución
continua.
La dosis activa para seres humanos está
generalmente en el intervalo de 0,1 microgramos a aproximadamente 1
mg por kg de peso corporal, en un régimen de una o más veces al día.
Sin embargo, para compuestos o formulaciones que tienen una acción
prolongada, puede ser también posible una administración en
intervalos más largos.
En general, el intervalo preferido de
dosificación es de 1 a 200 microgramos por kg de peso corporal. Para
un experto en la técnica, es evidente que la forma y el régimen de
dosificación serán determinados por el médico que atiende al
paciente de acuerdo con la enfermedad que se trata, el método de
administración y el estado general del paciente. Se apreciará que
la administración más apropiada de las composiciones farmacéuticas
del presente invento dependerá ante todo del estado clínico que se
trata. El tratamiento profiláctico de un individuo sano que
presenta alto riesgo de angiogénesis patológica necesitará un
régimen de dosificación para mantenimiento continuo, suficiente
para inhibir la angiogénesis. Este tipo de tratamiento podría ser
aplicado a individuos que presentan riesgo de retinopatía
diabética, retinopatía de carácter prematuro, degeneración macular
y otros estados de los que se sabe que afectan a grupos particulares
de pacientes. Por contraste, el tratamiento de una enfermedad
existente podría requerir dosis mayores en intervalos más
frecuentes. Se prevé además que el tratamiento de ciertos estados
en los que se sabe que está implicada una proliferación anormal de
células de músculo liso vascular, incluyendo la reestenosis, será
llevado provechosamente a cabo con composiciones farmacéuticas en
una cantidad suficiente para inhibir la proliferación de células de
músculo liso vascular.
El técnico experto apreciará que, en algunos
casos, los tratamientos pueden incluir provechosamente la
administración de las composiciones junto con un depósito o
dispositivo médico. De esta manera, a modo de ejemplo, el
tratamiento de la angiogénesis en el ojo puede necesitar un
implante intraocular. Similarmente, el tratamiento de la reestenosis
asociada con proliferación de células endoteliales puede necesitar
la aplicación de la composición junto con una angioplastia, por
ejemplo, como un revestimiento sobre un "stent" o un
dispositivo similar.
El invento será ahora ilustrado mediante los
siguientes ejemplos no restrictivos.
Todos los compuestos utilizados en el presente
invento son compuestos conocidos, y los métodos para su preparación
se describen en la bibliografía y, con detalle, en la Publicación
PCT 99/06347 de los presentes solicitantes.
Se cultivaron células leucémicas
HL-60 humanas en medio RPMI-1640
complementado con suero de ternera fetal al 15%, glutamina 100 mM y
100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina. Se
cultivaron células de eritroleucemia K-562 humana
(obtenidas de un paciente con leucemia mieloide crónica) en el mismo
medio complementado con suero de ternera fetal al 10%. Estas
células y las células de glioblastoma U251 humano, glioblastoma
U87MG y neuroblastoma LAN5 usadas en los experimentos son
asequibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC; del
inglés, American Type Culture
Collection). Todas las líneas celulares fueron cultivadas en
una atmósfera humidificada de aire al 95%/CO_{2} al 5%, a
37ºC.
La viabilidad celular fue determinada mediante
el ensayo del MTT, con el que se mide la reducción del bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
hasta formazán por mitocondrias de células viables, como describe
T. Mossman, J. Immunogen., 21, 235-248
(1.983). Las células son incubadas con MTT durante cuatro horas a
37ºC y son analizadas en un aparato lector de placas para ELISA, a
560 nm. La densidad óptica (DO) del formazán degenerado por
cultivos de células no tratadas (DO_{testigo}) es definida como
una unidad de MTT. El número de unidades de MTT de las muestras de
cultivo que han experimentado tratamientos es calculado mediante la
relación (DO_{muestra} - DO_{blanco})/(DO_{testigo}).
La tensión fotodinámica (PD; del inglés,
photodynamic) es el nivel de la fototoxicidad
infligida a células diana por compuestos fotodinámicos y exposición
a luz. La irradiación lumínica fue llevada a cabo mediante una
fuente fluorescente de dos tubos paralelos de 40 vatios situados a
una distancia fija de 16 cm, fuente de la que se había medido una
emisión de incidencia de 4 mW/cm^{2}. Las intensidades lumínicas
fueron cuantificadas utilizando el Radiómetro/Fotómetro IL 1350 de
International Light Inc., EE.UU.
El porcentaje de células apoptóticas fue
determinado mediante microscopía lumínica sobre preparaciones
celulares en centrífuga Cytospin, teñidas con
May-Grunwald-Giemsa. Un total de 400
células fueron contadas independientemente por dos individuos, y
los datos se presentan como la media de las cuentas. Las células
apoptóticas fueron reconocidas por su menor tamaño y por núcleos
que estaban fragmentados en cuerpos de cromatina condensada.
Células recolectadas 5 horas después de la
aplicación de la tensión fotodinámica fueron enjuagadas con
disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés,
phosphate buffered saline) y fueron fijadas con
etanol acuoso al 70%. Las células fueron luego resuspendidas en un
tampón de fosfato-citrato (PC; del inglés,
phosphate-citrate) que tenía un pH de 7,8 (192 partes
de Na_{2}HPO_{4} 0,2 M y 8 partes de ácido cítrico 0,1 M) a
temperatura ambiental durante 30 minutos y fueron teñidas con
yoduro de propidio en tampón de PC que contenía 10 \mug/ml de
RNasa A. Las células fueron luego analizadas en un citómetro de
flujo Coulter EPICS XL-MCL con el campo entero
seleccionado para incluir los diversos cambios que afectaban a las
células.
La fragmentación de DNA en células que
experimentan apoptosis fue analizada del modo previamente descrito
[J. Lotem y L. Sachs, Cell Growth and Differ., 6,
647-653 (1.995)]. 2 x 10^{6} células recogidas
como sedimento de centrifugación en tubos Eppendorf fueron lisadas
en 0,5 ml de tampón de lisis que contenía Tris-HCl
10 mM, pH de 7,5, SDS al 0,6%, EDTA 10 mM y 15 \mug/ml de mezcla
de RNA (Ambion Corp., Austin, Texas, EE.UU.). Después de una
incubación a 37ºC durante 10 minutos, se añadió NaCl hasta 1 M y se
mantuvo la mezcla a 4ºC durante la noche. La preparación fue
centrifugada a 14.000 g durante 30 minutos a 4ºC, el sobrenadante
fue recogido y sometido a extracción con fenol, y el DNA fue hecho
precipitar durante la noche a -20ºC mediante la adición de 1 ml de
etanol. El sedimento de DNA fue dejado secar al aire, dejado
disolver en 20 \mul de tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 10 mM, pH de
7,5) a 4ºC durante 24 horas, sometido a electroforesis durante 4
horas a 2 V/cm en un gel de agarosa al 1,5% que contenía 0,5
\mug/ml de bromuro de etidio, y fotografiado bajo luz UV.
Se evaluaron tres líneas celulares malignas
humanas en cuanto a su sensibilidad a dimetil-TMH
in vitro. Se sembraron células de glioblastoma U251 humano,
glioblastoma U87MG y neuroblastoma LAN5 (2 x 10^{5} células por
pocillo) en placas de microcultivo de 96 pocillos de fondo plano, y
se trataron con dimetil-TMH (acorde con el invento)
e hipericina (no acorde con el invento) en dosis que variaban de 0
(testigo) a 0,1-20 \muM en oscuridad completa
durante un periodo de 72 horas. Se aspiró el medio, se lavó la
monocapa adherente con disolución salina tamponada con fosfato y se
determinó la viabilidad celular mediante el ensayo del MTT.
Las Figuras 1, 2 y 3 muestran los resultados
para las células de glioblastoma U251, neuroblastoma LAN5 y
glioblastoma U87MG, respectivamente, mostrándose en las Figuras 1 y
3 una comparación de la actividad citotóxica con hipericina. La
viabilidad celular se perdió en los tres casos después de una
exposición a dimetil-TMH durante al menos 72 horas,
según se midió en los ensayos de viabilidad con MTT. La pérdida de
la viabilidad celular después del tratamiento de las células de los
dos glioblastomas con dimetil-TMH en la oscuridad
fue más eficaz que el tratamiento con hipericina.
Luego se repitió el experimento con células de
glioblastoma U251 tratadas con dimetil-TMH o
tetrametoxi-heliantrona (TMH) en dosis que variaban
de 0,1 a 12 \muM en oscuridad completa. Se determinó la viabilidad
celular mediante el ensayo del MTT. Los resultados, expuestos en la
Figura 4, muestran que tanto la dimetil-TMH como la
TMH presentaban actividades citotóxicas comparables sobre células
U251.
Los linfocitos de sangre periférica (PBL)
humanos son células no proliferativas en ausencia de estímulos
mitogénicos. Se examinaron los efectos de diferentes dosis de
dimetil-TMH sobre PBL en presencia (no acorde con el
invento) o ausencia (acorde con el invento) de irradiación con luz
blanca policromática. Se sembraron (2 x 10^{5} células/pocillo)
PBL (posmitóticos) en dos diferentes placas de 96 pocillos de fondo
redondo (por triplicado). Se añadió dimetil-TMH a
los cultivos. Una placa fue mantenida en la oscuridad y la otra fue
expuesta a luz blanca policromática con un índice de fluencia de 8
mW/cm^{2} durante 30 minutos (un total de 14,4 J/cm^{2}). Luego
se cultivaron ambas placas a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 72 horas
y se analizó la viabilidad celular mediante el ensayo del MTT. Los
resultados, expuestos en la Figura 5, muestran que la
dimetil-TMH no ejercía efecto alguno sobre la
viabilidad de los PBL en ausencia de irradiación lumínica; sin
embargo, la fotosensibilización con luz causaba la muerte celular
con una dosis letal mediana (LD_{50}; del inglés, lethal
dose 50) de aproximadamente 0,65 \muM de
dimetil-TMH, lo que indica que la
dimetil-TMH es un potente reactivo fotodinámico pero
no actúa sobre células no proliferativas en ausencia de irradiación
lumínica.
Se llevaron a cabo análisis del ciclo celular y
del contenido de DNA en células de glioblastoma U251 humano después
de un tratamiento con 5 \mug/ml (10 \muM) de
dimetil-TMH durante 24, 48 y 72 horas, y en células
de neuroblastoma LAN5 después de 48 horas. Las células fueron luego
teñidas con yoduro de propidio, lavadas con PBS y analizadas en un
separador celular activado por fluorescencia (FACS; del inglés,
fluorescence activated cell sorter). Un
programa informático disponía la fluorescencia relacionada con DNA
del modo siguiente: se considera que la cantidad mínima de
fluorescencia es un conjunto entero de DNA celular relacionado con
la fase G_{1} de reposo. Se considera que una cantidad doble de
fluorescencia es la fase G_{2}, en la que el genoma entero está
duplicado después de la síntesis completa de DNA, y se considera que
las cantidades intermedias son la fase S sintética de DNA, en la que
la síntesis total de DNA aún no se ha completado.
Los resultados, mostrados en las Figuras
6-7, revelan que la administración de
dimetil-TMH 10 \muM a células de glioblastoma
humano U251 producía una detención de la proliferación celular en la
fase S media (6B). La proporción de células halladas en la fase S
aumentaba continuamente con la duración de la exposición a
dimetil-TMH (Figuras 6A, 6B y 6C). Cuando se
aumentó la dosis de dimetil-TMH de 10 \muM a 20
\muM (Figuras 7B y 7C), se produjo una detención exclusiva en la
fase S. Estudios de hibridación in situ con fluorescencia
(FISH; del inglés, fluorescence in situ hybridization)
confirmaron este desequilibrio en la replicación de DNA a nivel
génico. Esta detención del ciclo celular causa los efectos tóxicos
que provocan la muerte celular.
La eficaz actividad citocida de la
dimetil-TMH in vitro fomentó la evaluación de
su perfil de seguridad y de eficacia antitumoral en ratones
portadores de tumores. Los experimentos se llevaron a cabo en
ratones que portaban tumores derivados de la línea SQ2 de carcinoma
de células escamosas (SCC; del inglés, squamous cell
carcinoma) anaplásico y muy metastásico. Este tumor se
desarrolla como centros multifocales que se propagan por las
inmediaciones del tumor primario, y se desarrollan metástasis
aproximadamente dos meses después de la inoculación de células.
Cuando el diámetro de los tumores alcanzó 5-7 mm, se
iniciaron tratamientos con dimetil-TMH
300-600 \muM/ratón, administrados dos veces o tres
veces a la semana.
En la Tabla 1 se muestran los resultados de uno
de los experimentos, en el que se inocularon intradérmicamente 5 x
10^{5} células de la línea SQ2 de carcinoma anaplásico de células
escamosas en los lomos afeitados de ratones BALB/c (8 ratones por
grupo). Cuando los tumores primarios alcanzaron un diámetro de 5 mm,
se inició la terapia con dimetil-TMH 300
\muM/ratón, administrados intraperitonealmente dos veces por
semana. Tres semanas después del inicio de la terapia, se registró
el número de focos tumorales que se habían desarrollado en el sitio
del tumor primario. El número de focos que se habían desarrollado 21
días después del inicio de la terapia resultó considerablemente
reducido por la dimetil-TMH, administrada en dosis
terapéuticas que eran atóxicas para los animales. Además de
evitarse la propagación multifocal de este tumor, los tumores
primarios se endurecían y decaían en 5 de los ratones tratados, lo
que indica que se puede conseguir la curación completa de este
tumor una vez que se hayan optimizado los regímenes de
tratamiento.
En otro experimento, se inocularon
intradérmicamente 5 x 10^{5} células de la línea SQ2 de carcinoma
anaplásico y muy metastásico de células escamosas en los lomos
afeitados de ratones BALB/c. Cuando los tumores primarios
alcanzaron un diámetro de 3-4 mm, se inició la
administración intraperitoneal de 200 \mug de
dimetil-TMH/ratón (400 \muM/ratón) el día 7
después de la inoculación de células tumorales y luego se continuó
la administración a los ratones portadores de tumores dos veces a
la semana durante seis semanas (12 dosis en total). Luego se siguió
la supervivencia de los animales. Los resultados de la Figura 8
muestran que la supervivencia de los animales se prolongó
aproximadamente un 40,3% en comparación con la supervivencia de los
testigos no tratados. Hay que advertir que los tumores primarios
continuaron creciendo durante el tratamiento y que, no obstante, se
prolongó la supervivencia de los animales. Esto parece ser el
resultado de un crecimiento metastásico reducido, como resulta
evidente de la Tabla 1 del Ejemplo 4 anterior.
Los efectos antineoplásicos de la
dimetil-TMH in vivo pueden ser examinados en
diversos tumores experimentales murinos. Estos incluyen el linfoma
murino ESb, el sarcoma MCA-105 y el melanoma B16,
que son evaluados en ratones C57BL/6J. Células de carcinoma de mama
murino DA3^{hi}, una variante muy metastásica de DA3 que genera
adenocarcinoma metastásico de mama en ratones BALB/c, y células
A431, que generan tumores epidermoides en ratones NIH Swiss, son
evaluadas en cuanto a sensibilidades al tratamiento con
dimetil-TMH o con TMH. Los tumores son propagados
en ratones, 8-10 animales por grupo, mediante
inoculaciones intradérmicas de células generadoras de tumores. Se
examinan subidas de dosis de dimetil-TMH que varían
entre 20 y 1.000 \muM (10-500 \mug/ratón). Las
frecuencias de las administraciones varían de administraciones
diarias a 3 veces por semana a 1 vez por semana, variando los
periodos de administración de 2 a 12 semanas. Se comprueban las
diferencias en el tamaño del tumor primario de los animales, en
comparación con el de los ratones testigo portadores de tumor no
tratados. Para analizar la propagación de metástasis, todos los
ratones son sacrificados cuando muere el primer ratón del grupo
testigo o en momentos designados para la terminación del
experimento. Se aplican los puntos finales usados en ejemplos
previos. Los pesos del bazo, el hígado y el pulmón son parámetros
que aquí se usan para la determinación de la carga metastásica. El
número total de focos metastásicos en cada uno de estos órganos es
un segundo parámetro determinado después de una fijación en
disolución Bouins. La supervivencia de los animales es otro punto
final que se examina. Se determinan los tiempos de supervivencia
medio y mediano después de la inoculación de células tumorales. La
significación de la prolongación de la supervivencia es calculada
por comparación con testigos correspondientes a animales portadores
de tumor no tratados sin exposición a la luz (efectos de oscuridad
del compuesto), en la prueba t de Student apareada.
En un experimento, la actividad antitumoral de
la dimetil-TMH sobre tumores humanos en un modelo
in vivo es evaluada en la cepa de ratón
C.B-17 SCID (Fox Chase). Se inducen tumores
epidermoides y de glioblastoma humanos en la piel de estos ratones
por inoculación de las correspondientes líneas celulares humanas.
Luego se someten los animales a diversos protocolos de tratamiento
con dimetil-TMH, administrándose
intraperitonealmente el compuesto. Se controlan los animales en
cuanto al tamaño tumoral y a la supervivencia.
El tamaño del tumor primario con el que se
producen metástasis de tumores de adenocarcinoma de mama derivados
de DA-3^{HI} fue inicialmente calibrado en ratones
BALB/c a los que se habían inoculado intradérmicamente 5 x 10^{5}
células tumorales DA-3^{HI}. Se halló que, si la
extirpación quirúrgica de los tumores primarios era llevada a cabo
cuando los tumores habían alcanzado un diámetro de 5 mm o menos, la
resección del tumor primario curaba a los ratones. Si la resección
era llevada a cabo sobre tumores con diámetros mayores, los ratones
morían de metástasis. Parece que un diámetro de aproximadamente 5 mm
es el punto de corte en que comienzan a propagarse las
metástasis.
Se indujeron tumores DA-3^{HI}
en hembras de ratón BALB/c de 12 semanas de edad, como se describió
anteriormente. Una vez que los tumores hubieron alcanzado diámetros
de 8-10 mm, se dividieron los ratones en cuatro
grupos. Un grupo de 19 ratones fue dejado sin tratar y, en los
otros tres grupos, los tumores fueron quirúrgicamente extirpados.
Uno de los grupos sometidos a resección recibió dos inyecciones
intraperitoneales (i.p.) de 200 \mug de hipericina (HY) cada una,
separadas por 5 días, comenzando dos días antes de la cirugía (16
ratones). Otro grupo sometido a resección recibió cinco inyecciones
i.p. de 200 \mug de hipericina cada una, separadas por 5 días,
comenzando dos días antes de la cirugía (17 ratones). Un grupo
sometido a resección no fue tratado con hipericina (16 ratones).
Luego se siguió la supervivencia de los ratones. En la Figura 9A se
muestra que no sobrevivió ninguno de los ratones portadores de
tumor no tratados y que, además, el 20% de los ratones sometidos a
cirugía sobrevivían el dia 89. Sin embargo, la administración de 2
inyecciones i.p. de hipericina aumentó el índice de supervivencia a
35% y la administración de 5 dosis de hipericina aumentó el índice
de supervivencia a 60%.
En la Figura 9B se muestra la supervivencia
acumulativa de los ratones que recibieron 2 y 5 dosis de hipericina
(cada una de 200 \mug/ratón), a lo largo de 100 días después de la
cirugía (estos valores persistieron durante 164 días después de la
inoculación del tumor). Dichos valores sugieren una prevención
completa de metástasis en los grupos de ratones supervivientes,
particularmente en el grupo que recibió cinco dosis de hipericina.
Estos resultados indican que la hipericina protege a los ratones del
desarrollo de metástasis y, de esta manera, evita la muerte del
animal como consecuencia de la diseminación sistémica de células
desde el tumor primario.
En otro conjunto de experimentos, se generaron
tumores de carcinoma de células escamosas en ratones BALB/c
inoculando 5 x 10^{5} células SQ2 por ratón. Una vez que los
tumores hubieron alcanzado un diámetro de 1,0-1,2
cm, fueron extirpados por cirugía (resecados). Un grupo de 5 ratones
también recibió tres inyecciones i.p. de 100 \mug de
hipericina/ratón antes de la cirugía y dos regímenes de 50
\mug/ratón después de la cirugía a intervalos de 5 días entre
cada administración. Otro grupo de 8 ratones recibió seis
inyecciones i.p. de 100 \mug de hipericina/ratón antes de la
cirugía y cinco regímenes de 50 \mug/ratón después de la cirugía
a intervalos separados por 5 días. Un grupo testigo de 17 ratones
sólo fue sometido a cirugía, sin tratamientos con hipericina, y
otro grupo testigo quedó sin tratar (22 ratones), Luego se siguió la
supervivencia de los animales. Se halló entonces que el 60% de los
ratones que habían recibido tres inyecciones de hipericina
permanecían vivos tras más de 240 días después de la inoculación de
las células tumorales; de los ratones que habían recibido 6
inyecciones de hipericina, el 40% permanecían vivos, mientras que,
de los ratones que sólo habían sido sometidos a cirugía, el 20%
permanecían vivos. Estos resultados también muestran índices de
protección de 20-40% debidos a la administración de
hipericina.
En un esfuerzo por entender cómo la hipericina
evita el crecimiento de metástasis, se repitió el experimento y
luego se siguió la morfología de las lesiones metastásicas. Se
indujeron tumores DA-3^{HI} primarios en ratones
BALB/c. Se llevó a cabo una cirugía sobre los tumores cuando sus
diámetros alcanzaron 8-10 mm. Estos ratones (17
animales) fueron divididos en dos grupos: uno fue tratado con 5
dosis de 200 \mug de hipericina/ratón a intervalos de 5 días como
se describió previamente (9 animales) y otro grupo sirvió como
testigo no tratado (8 ratones). Los animales fueron criados durante
más de dos meses. Luego se sacrificaron los ratones y se examinaron
los órganos internos en cuanto a lesiones metastásicas. El examen
físico reveló numerosas lesiones metastásicas bien desarrolladas en
los ratones no tratados, que estaban provistas de grandes vasos
sanguíneos visibles. Las pocas lesiones que se desarrollaron en
algunos de los ratones tratados con hipericina eran mucho más
pequeñas, algo más necróticas y desprovistas de dicha vasculatura
(vasos sanguíneos de alimentación). Esto sólo era evidente cuando
las inyecciones de hipericina se iniciaron muy pronto, antes de la
resección del tumor primario. Estas observaciones indican que la
hipericina inhibe la angiogénesis (desarrollo de nueva
vasculatura). Es probable que esta falta de suministro sanguíneo, y
no los efectos anticancerosos directos, evitara el desarrollo de
metástasis. Puesto que la angiogénesis es principalmente mediada por
el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), la
hipericina puede interferir en la formación o secreción de VEGF por
las células tumorales o en su presentación a receptores inductores
del crecimiento presentes en células del endotelio vascular. Sin
pretender la vinculación a ningún mecanismo propuesto, se ha
mostrado que la hipericina inhibe la proteína quinasa C, y ésta es
esencial en la producción de VEGF. Una interferencia en la vía de
transducción de señales que culmina en la producción de VEGF podría
ser el mecanismo para la inhibición del efecto de VEGF, mediada por
hipericina o por un derivado de heliantrona, que da lugar a la
inhibición del desarrollo de lesiones metastásicas.
Independientemente del mecanismo de acción propuesto, se demuestra
ahora que estas composiciones son inhibidores muy potentes de la
angiogénesis.
Se administraron tres inyecciones
intraperitoneales de hipericina (750 \mug por dosis en 5 ml de
agua que contenía etanol al 3,5%) a cuatro ratas (de 250 g cada una)
a intervalos de cuatro días. Al día siguiente, se anestesiaron los
animales con xilazina-ketamina y se indujo una
angiogénesis (formación de nuevos vasos sanguíneos) inoculando 2
\mul de heparanasa (30 \mug/ml) en el compartimento frontal del
ojo, en la córnea de uno de los dos ojos de cada rata. Al día
siguiente, se aplicó una cuarta inyección intraperitoneal de 750
\mug de hipericina. Dos animales testigo positivos sólo recibieron
2 \mul de heparanasa (30 \mug/ml) en el compartimento frontal
del ojo. Luego se dejó que se desarrollara la angiogénesis durante 5
días, momento en que los animales fueron anestesiados con
xilazina-ketamina y fueron examinados y
fotografiados bajo un microscopio binocular en cuanto al desarrollo
de vasos sanguíneos en la cámara anterior del ojo. La fotografía de
la Figura 10A muestra los vasos sanguíneos en un ojo testigo de una
rata después de la angiogénesis inducida con heparanasa y sin
tratamiento con hipericina, mientras que la fotografía de la Figura
10B muestra la ausencia de vasos sanguíneos en el ojo de una rata
tratada con hipericina. Se obtuvo una protección similar (datos no
mostrados) cuando se indujo la angiogénesis en ojos de rata con
factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF; del inglés,
basic fibroblast growth factor).
Se corta aorta de rata en anillos que son
embebidos en geles de fibrina y cultivados en medio MCDB 131. Las
células endoteliales que se separan de los anillos de aorta generan
microvasos de ramificación de acuerdo con un método previamente
descrito (R. F. Nicosia y A. Ottinetti, "Growth of microvessels in
serum-free matrix culture of rat aorta".
Laboratory Investigation 63: 115, 1.990). La adición de hipericina
(no acorde con el invento) en un intervalo de dosis de entre 0,1 y
10 \mug/ml (0,2-20 \muM) o de
dimetil-tetrahidroxiheliantrona (acorde con el
invento) en un intervalo de dosis de entre 0,1 y 10 \mug/ml
(0,2-20 \muM) da lugar a la inhibición de la
formación de los microvasos organizados.
La descripción precedente de las realizaciones
específicas revelará así totalmente la naturaleza general del
invento que otros, aplicando el conocimiento actual, pueden
modificar y/o adaptar fácilmente para diversas aplicaciones, tales
como realizaciones específicas, sin una experimentación excesiva y
sin apartarse del concepto genérico, y, por lo tanto, dichas
adaptaciones y modificaciones deberían ser y son consideradas
comprendidas dentro del significado y el alcance de equivalentes de
las realizaciones descritas. Ha de entenderse que la fraseología o
la terminología aquí empleadas tiene el fin de descripción y no de
limitación. Los medios, los materiales y las operaciones para llevar
a cabo las diferentes funciones descritas pueden tomar una
diversidad de formas alternativas sin apartarse del invento.
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and RNA viruses. Antiviral Res. 13: 313-326,
1.990.
Claims (6)
1. Uso de un compuesto de heliantrona o de un
derivado del mismo para la preparación de una composición
farmacéutica para el tratamiento de trastornos oftalmológicos
asociados con la angiogénesis y para la prevención o inhibición de
la reestenosis, compuesto que tiene la fórmula general (I):
en la que R es seleccionado del
grupo que consiste en hidroxilo, alcoxilo
C_{1}-C_{10}, NH-alquilo
C_{1}-C_{10} y
NH-hidroxialquilo
(C_{1}-C_{10}); R' es seleccionado del grupo que
consiste en hidroxilo y alcoxilo C_{1}-C_{10};
y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} son
independientemente seleccionados del grupo que consiste en
hidrógeno, hidroxilo, cloro, bromo, alquilo
C_{1}-C_{10}, alcoxilo
C_{1}-C_{10} y alcoxicarbonilo
C_{1}-C_{10}.
2. El uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en
el que dicho trastorno oftalmológico asociado con la angiogénesis
es retinopatía diabética, degeneración macular o infección
ocular.
3. Uso de un compuesto de heliantrona para la
preparación de una composición farmacéutica para inhibir la
proliferación de células endoteliales o musculares lisas vasculares
asociada con la reestenosis, compuesto de heliantrona que tiene la
fórmula general (I):
en la que R es seleccionado del
grupo que consiste en hidroxilo, alcoxilo
C_{1}-C_{10}, NH-alquilo
C_{1}-C_{10} y
NH-hidroxialquilo
(C_{1}-C_{10}); R' es seleccionado del grupo que
consiste en hidroxilo y alcoxilo C_{1}-C_{10};
y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} son
independientemente seleccionados del grupo que consiste en
hidrógeno, hidroxilo, cloro, bromo, alquilo
C_{1}-C_{10}, alcoxilo
C_{1}-C_{10} y alcoxicarbonilo
C_{1}-C_{10}.
\newpage
4. Uso de un compuesto de heliantrona para la
preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de
tumores en ausencia de irradiación lumínica, compuesto de
heliantrona que tiene la fórmula general (I):
en la que R es seleccionado del
grupo que consiste en hidroxilo, alcoxilo
C_{1}-C_{10}, NH-alquilo
C_{1}-C_{10} y
NH-hidroxialquilo
(C_{1}-C_{10}); R' es seleccionado del grupo que
consiste en hidroxilo y alcoxilo C_{1}-C_{10};
y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} son
independientemente seleccionados del grupo que consiste en
hidrógeno, hidroxilo, cloro, bromo, alquilo
C_{1}-C_{10}, alcoxilo
C_{1}-C_{10} y alcoxicarbonilo
C_{1}-C_{10}.
5. El uso de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho compuesto de heliantrona de
fórmula (I) es
10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona
o
10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona.
6. El uso de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho compuesto de fórmula (I) es
seleccionado del grupo que consiste en:
1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona;
1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona;
10,13-di(metoxicarbonil)-1,3,4,6-tetrametoxiheliantrona;
1,6-di-N-butilamino-3,4-dimetoxi-heliantrona;
1,6-di-N-butilamino-3,4-dimetoxi-10,13-dimetil-heliantrona;
1,6-di-(N-hidroxietilamino)-3,4-dimetoxi-heliantrona;
2,5-dibromo-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona;
y
2,5-dibromo-10,13-dimetil-1,3,4,6-tetrahidroxiheliantrona.
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