JP2016530326A

JP2016530326A - ロクベンシモツケソウ抽出物及びその用途

Info

Publication number: JP2016530326A
Application number: JP2016542422A
Authority: JP
Inventors: メルカティ、ヴァレンティーノ; マイデッキ、アンナ
Original assignee: アボカエッセ．ピ．ア．ソシエタアグリコラ
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2014-09-11
Publication date: 2016-09-29
Also published as: ITRM20130502A1; PT3043809T; US20160213729A1; ES2666422T3; CA2923894A1; AU2014319951A1; EA201690334A1; EP3043809B1; AU2014319951B2; EP3043809A1; WO2015036949A1; MX2016003014A; CN105517558A

Abstract

本発明は、ロクベンシモツケソウの抽出物、ＳＴＡＴ３転写因子の構成的活性化を特徴とする病理学的状態を予防及び／又は処置するための前記抽出物を含む組成物及びキットに関する。

Description

本発明は、メンヒ（Ｍｏｅｎｃｈ）に準ずるロクベンシモツケソウ（Ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）（別称：ヨウシュシモツケソウ（ＦｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｈｅｘａｐｅｔａｌａＧｉｌｉｂ．））の抽出物、ＳＴＡＴ３転写因子の構成的活性化を特徴とする病理学的状態を予防及び／又は処置するための前記抽出物を含む組成物及びキットに関する。

ここ数十年、多くの文献中の証拠において、多種多様な病状、例えば、腫瘍を促進する炎症性の病状、及び腫瘍そのものにおけるＳＴＡＴファミリーに属する転写因子の基本的な役割が開示されている。ＳＴＡＴタンパク質は細胞質転写因子であって、（ＪＡＫ又はヤヌスキナーゼタンパク質のファミリー作用による特定残基セリン及び／又はチロシンでの）リン酸化／活性化が２種のＳＴＡＴモノマーの二量体化、核内での二量体の移行、ＳＴＡＴ特異的標的遺伝子のＤＮＡエレメントへの結合、及び遺伝子転写の誘導を決定する因子である。ＳＴＡＴ因子のファミリーは、７種のメンバー（遺伝子ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ及びＳＴＡＴ６によってコードされている）から構成されており、分化、増殖、成長、アポトーシス及び細胞の炎症における役割をはじめとする様々な生物学的機能を備えている。これらの遺伝子によってコードされているタンパク質の１つの特徴は、二系統の役割、より詳しくは、細胞質におけるシグナル伝達の役割と核における転写因子の役割を有するということである。特に、ＳＴＡＴ３の構造的活性化と、またそれほどではないがＳＴＡＴ５の構造的活性化は、様々な腫瘍形成において、いくつかの細胞内経路、例えば、腫瘍の生存、及び腫瘍細胞の増殖に関与する経路、また、血管新生及び腫瘍自体の転移のプロセスに関与する経路などの制御解除と関連している。

ＹｕＨ．らは、２００９年のＮａｔｕｒｅで公表した概説（ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＣａｎｃｅｒ９、７９８〜８０９：２００９）において、ＳＴＡＴ３の持続的活性化が癌を促進する炎症を誘導し、炎症及び腫瘍の微小環境にとって重要な遺伝子を制御することを報告した。ＳＴＡＴ３によって活性化される遺伝子は、前述の研究の表１及び表２で明らかにされている。また、天然物質のうち、いくつかのＳＴＡＴ３活性化阻害剤、例えば、ククルビタシン（ｃｕｒｃｕｂｉｔａｃｉｎ）、レスベラトロール、ガリエララクトン及びインジルビンなども記載されている。しかし、これらの物質が作用する作用機序は解明されていないと記載されている。

いずれの場合にも、その研究では、ＳＴＡＴ３のモジュレーションが癌処置の新たな、より効果的で非常に有利な方法であると述べられており、様々な腫瘍モデルにおけるＳＴＡＴ３遺伝子の除去が腫瘍増殖を抑制することが報告されている。

ＳＴＡＴ３の構造的活性化は、多数の腫瘍、例えば、乳癌、前立腺癌、頭頚部扁平上皮癌、多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病、脳腫瘍、結腸癌、ユーイング肉腫、胃癌、食道癌、卵巣癌、上咽頭癌及び膵癌などにおいて報告されている（下記表１）。多くのタイプの癌において、高レベルの活性化ＳＴＡＴ３が予後不良と結び付いていた。ＳＴＡＴ３の活性化は、アポトーシスを阻止し、細胞増殖及び細胞生存を増加させ、血管新生及び転移が促進され、抗腫瘍免疫応答が阻害される。ＳＴＡＴ３が構造的に活性化される腫瘍細胞系は、ＳＴＡＴ３の連続的活性化、「発癌遺伝子依存」として定義されている表現型を必要とする（ＪｏｈｎｓｔｏｎＰＡａｎｄＧｒａｎｄｉｓＲＧ、Ｍｏｌｌｎｔｅｒｖ；１１（１）；１８〜２６：２０１１）。

悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）は、胸腔中皮細胞由来の侵襲性の高い腫瘍である。化学療法（多くの場合、ペメトレキセドが使用される）によって手術不可能なＭＰＭ罹患患者の生存期間が改善されるが、その平均の全体生存期間はわずか１２か月である。近年、ＭＰＭに対する可能性のある分子治療標的が、ＭＰＭ罹患患者の胸膜液中に存在する高レベルＩＬ−６によって活性化されるインターロイキン−６シグナル経路（ＩＬ−６）／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３であると報告された。ＩＬ−６のその受容体への結合は、ＪＡＫ活性化を開始する受容体中の構造変化を引き起こし、次いでそれがＳＴＡＴ３転写因子の二量体化を開始し、ＳＴＡＴ３二量体は核内へ移行し、それによって、様々な標的遺伝子の転写活性化の開始が決定される。

この経路は、造血の発生、免疫応答の発生、及び腫瘍形成の発生にとって重要である。さらに、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３系の機能障害が癌の発症に関係していることも実証された。

さらに、腫瘍の発症及び進行においてＳＴＡＴ３が果たす役割に関する概要は、これまでの文献に記載されている。ＳＴＡＴ３の構造的活性化は、血液腫瘍（多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫）と固形腫瘍（メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌及び腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌並びに脳腫瘍）の両方において観察されている。より詳細については、ＴｕｒｋｓｏｎＪａｎｄＪｏｖｅＲ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ；１９（５６）；６６１３〜２６：２０００から取得した下記の表３に、ＳＴＡＴ３の異常活性化に直接関係している多数の腫瘍を示す。特に、この異常活性化は、チロシンキナーゼ、例えば、ｖ−Ｓｒｃ、ｖ−Ｒｏｓ、ｖ−Ｆｐｓ、Ｅｔｋ／ＢＭＸ及びＬｃｋなどを変換する作用によって、或いはサイトカインのオートクリン又はパラクリン放出によって誘導される異常シグナルによって引き起こされると考えられる。ＳＴＡＴ３の構造的活性化は、アポトーシス阻害因子（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−１）、細胞周期の制御因子（例えば、サイクリンＤ１／Ｄ２、ｃＭｙｃ）、及び血管新生の誘導因子（例えば、ＶＥＧＦ：血管内皮細胞増殖因子）をコードしている遺伝子の過剰発現をもたらす。最後に、最近、腫瘍形成における重要な役割を有していることとは別に、この転写因子の構造的活性化が化学療法剤により誘導される死滅に対する耐性を付与していることが明らかにされている（ＡｇｇａｒｗａｌＢ．Ｂ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９１；１５１〜６９：２００６）。

様々な臨床研究からは、インビボにおいて、固形腫瘍は、腫瘍そのものを細胞死のシグナルに対して非感受性にし、しかも放射線療法及び化学療法処置に対して耐性をもたせる、Ｏ_２が低レベルの環境において増殖及び発症すること；一方、低酸素は血管新生、増殖及び転移能力を促進することが明らかになっている。この文脈において、腫瘍の悪性度とは、低酸素及びＳＴＡＴ３の過剰活性化の両方による、ＨＩＦ−１α因子の活性化及び安定化に関連していると思われる。

この理由のため、ＳＴＡＴ３因子の標的化に基づいた抗癌治療が非常に好ましい（ＮｉｕＧ．ら、ＭｏｌＣａｎｃｅｒＲｅｓ、６（７）；１０９９〜１０５：２００８）。

下記に示す表１は、ＡｇｇａｒｗａｌＢ．Ｂ．ら、２００６の研究から取得したものであり、構造的に活性のあるＳＴＡＴ３を発現する腫瘍、ＳＴＡＴ３の活性化因子、ＳＴＡＴ３によって制御される遺伝子及びＳＴＡＴ３の阻害因子のリストを示す。

表２は、ＪｏｈｎｓｔｏｎＰＡａｎｄＧｒａｎｄｉｓＲＧ２０１１から取得したものであり、ＳＴＡＴ３を多数の腫瘍と関連付け、ＳＴＡＴ３が抗癌治療における効果的な標的対象であるという事実を確認している。

ＴｕｒｋｓｏｎＪａｎｄＪｏｖｅＲ２０００から取得した表３は、ＳＴＡＴ３の異常活性化に直接関連している多数の腫瘍を示している。

特に、ＳＴＡＴ３に関して、以下のことが多数の刊行物で実証されている：
１）ＳＴＡＴ３は、多くの場合、多数のヒト癌細胞、例えば、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、肺癌、前立腺癌、頭頚部扁平上皮癌及び他の腫瘍タイプなどで構造的に活性化（リン酸化）される。
２）ＳＴＡＴ３は、増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２３、ＩＬ−２１、ＩＬ−１１、ＨＧＦ）、発癌性キナーゼ（例えば、Ｓｒｃ）によって活性化される。
３）ＳＴＡＴ３は、増殖遺伝子（例えば、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１）、アポトーシス抑制遺伝子（例えば、Ｂｃｌ−ＸＬ及びスルビビン）、サイトカインコード遺伝子、並びに、血管新生を促進する遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ）の発現、活性化された場合の細胞増殖及び血管新生の増加並びにアポトーシスの抑制を媒介する。
４）ＳＴＡＴ３の活性化はまた、化学耐性及び放射線耐性の現象とも関係している。
５）ＳＴＡＴ３の持続的活性化は、様々なヒトの癌において、増殖、生存、血管新生及び転移を増加させ、抗腫瘍免疫を阻害する。

また、特定の臓器又は特定の部位の慢性炎症は悪性転換を促すこと、並びに、ＳＴＡＴ３が癌につながる炎症の外因性及び内因性経路にとって重要であることも公知であり、実際、ＳＴＡＴ３は、慢性炎症に関連した悪性の特性を誘導することが知られている。

腫瘍形成におけるＳＴＡＴ３の重要な役割により、ＳＴＡＴ３の阻害剤は、癌の予防及び処置において多大なる可能性を有している。おそらく、ＳＴＡＴ３の活性化で最もよく知られている阻害剤の１つは、ＪＡＫ２の活性化を阻害する、ＡＧ４９０である。他のＳＴＡＴ３の阻害剤としては、小ペプチド、オリゴヌクレオチド及び小分子が挙げられる。一部の著者は、ＤＮＡへの結合、及び遺伝子制御の活性、並びに細胞形質転換を媒介する機序である、ＳＴＡＴ３のリン酸化／活性化を遮断するペプチドを同定している。ＳＴＡＴ３を遮断する様々な小分子としては、ＰＧＪ２、白金複合体、エタノール、サリチル酸ナトリウム、レチン酸、アチプリモド、ＰＳ−３４１及びスタチンが挙げられる。多くのポリフェノール植物において、ＳＴＡＴ３の活性化を抑制するそれらの能力が同定された。これらには、クルクミン、レスベラトロール、ククルビタシン、ピセアタンノール、パルテノライド、フラボピリドール（ｆｌａｚｏｐｉｒｉｄｏｌ）、マグノロール及びエピガロカテキン−３−ガレートが含まれる。ＳＴＡＴ３活性化の抑制にこれらの分子が効を奏する方法は完全に明らかではない。例えば、クルクミンは、ＳＴＡＴ３活性化に全面的に関与している、ＪＡＫ２、Ｓｒｃ、Ｅｒｂ２及びＥＧＦＲの阻害効果と、発現がＳＴＡＴ３によって制御されている、Ｂｃｌ−ｘＬ、サイクリンＤ１、ＶＥＧＦ及びＴＮＦの発現の下方制御の効果が明らかになっている（ＡｇｇａｒｗａｌＢ．Ｂ．ら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９１；１５１〜６９：２００６）。

ＳＴＡＴ３のシグナル伝達カスケードへの干渉：ＳＴＡＴ３のリン酸化／活性化の阻害、ＳＴＡＴ３が関与する分子間相互作用の阻害、ＳＴＡＴ３の核内取り込み／排出の阻害、ＳＴＡＴ３によって媒介される転写の阻害を可能にする、様々な方策及び様々なメカニズムがある。化学療法剤とは別に、ＳＴＡＴ３を阻害することが既に述べられており、さらに他のものも記載されている（セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブなど）。これらについては様々な影響：緩やかな有効性、耐性の発生、骨髄抑制、胃腸レベルでの毒性、及び心臓血管系毒性をはじめとする様々な有害反応が報告されている（表４を参照）。

下記の表４は、ＪｏｈｎｓｔｏｎＰＡａｎｄＧｒａｎｄｉｓＲＧ２０１１から取得したものであり、ＳＴＡＴ３のシグナルの治療的介入に関する方法及び結果を報告している。

腫瘍進行に直接関与している細胞の亜集団において、より特異的な方法で特定の標的分子を阻害する化合物による標的化治療法である治療法は、癌処置において新たな展望を示す。細胞増殖及び死滅をコントロールする分子、例えば、増殖因子に対する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）などは、このタイプの治療的アプローチの最良の対象の一つである。標的療法の時代は、転移性乳癌を処置するためのトラスツズマブ（ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体）と、慢性骨髄性白血病におけるイマチニブ（ｉｍａｔｉｂｉｎ）（ＢＣＲ−ＡＢＬの阻害因子）の承認で始まった。これらの処置効果に対する当初の熱意にもかかわらず、医師は、すぐに再発の問題に直面しなければならなかった。その理由は、癌に罹患している者には、多くの場合、代替経路が活性化することにより薬剤に対する耐性が出現したからである。腫瘍は、一般的に無秩序化された、多くの機序及び多くの遺伝子標的によって特徴づけられるので、併用療法を採用することは有利であり、応答及び許容性を増加させ、且つ耐性を低下させる合理的な方法となることから、癌処置における標準である。現在、低薬剤用量を使用することにより全身毒性を最小限にして、効果を最大化することを目的とした抗腫瘍薬剤の併用に対して関心が高まっている。

したがって、Ｓｒｃ及びＪＡＫを含む上流分子の薬理学的遮断によるＳＴＡＴ３リン酸化の阻害が腫瘍形成を低減させ、化学療法薬の必要用量の低下の可能性につながることがより多くの試験で結論付けられていることを考慮すると、ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は誘導的活性化を遮断することができる天然由来分子などの薬理学的に安全で有効な治療薬は、癌処置において潜在的有効性を有している。

さらに、ＳＴＡＴ３の活性化は化学療法及び放射線療法に対する耐性にも関連するため、こうした活性化の阻害剤は、そのような耐性を制限し、化学療法及び放射線療法の効果を最適化するための大きな関心事でもある。

本発明の発明者らは、シモツケソウ（ロクベンシモツケソウ（Ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ））の抽出物がタンパク質ＳＴＡＴ３のリン酸化を選択的にモジュレートし、本質的には阻害し、その結果、転写因子としての細胞内のその後の作用を阻害できることを実証した。本出願の実験部分で明らかなように、本発明の発明者らは、多数の実験において、また様々な細胞系に対して、本明細書に記載の抽出物がＳＴＡＴ３の活性化（リン酸化）の有効な阻害剤であり、結果として、
− 腫瘍細胞系に対する有効な細胞障害作用を示し、
− 腫瘍細胞の再生を阻害することができ、したがって細胞増殖抑制剤として作用し、
− 腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、
− 多くの化学療法剤との相加効果及び相乗効果を有し、それによって、化学療法剤単独による処置又は抽出物単独による処置と比べて腫瘍細胞の生存能力が低下する、
ことを実証した。

ＳＴＡＴ３因子に対するこうした抽出物の影響の見地から、本発明の発明者らは、本明細書に記載のロクベンシモツケソウの抽出物がＳＴＡＴ３へのＤＮＡへの結合を阻止し、それにより、通常、リン酸化ＳＴＡＴ３によって活性化される遺伝子発現の変化を阻止できることを実験によってさらに実証した。

言い換えれば、前記抽出物がリン酸化形態のタンパク質ＳＴＡＴ３をモジュレートし、本質的には阻害し、転写因子としての細胞内における前記タンパク質の連続的作用を阻止できることを証明した。特に、本開示の発明者らは、ロクベンシモツケソウの抽出物がＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を阻害できること、またＭＰＭ腫瘍細胞の培養におけるアポトーシスの再活性化を誘導できることを実証した。さらに、本発明の発明者らは、腫瘍細胞の培養に関する実験において、ロクベンシモツケソウの抽出物は創傷治癒を抑制し、実際、腫瘍細胞の浸潤を阻止することも実証した。さらに、本発明の発明者らは、マウスの腫瘍細胞移植実験により、本発明の抽出物がインビボにおいて抗腫瘍効果を発揮することも実証した。

したがって、本発明の第１の主題は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するためのロクベンシモツケソウの抽出物である。

本発明の第２の主題は、１種以上の化学療法剤と併用して、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するためのロクベンシモツケソウの抽出物である。本開示の第３の主題は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、ロクベンシモツケソウの抽出物と担体及び／又は希釈剤及び／又は添加剤を含む組成物である。

一実施形態において、本組成物はまた、抗アポトーシス活性を有する１種以上の成分を含む。

本発明の第４の主題は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、抗腫瘍活性及び／又は抗炎症活性を有する１種以上の成分と併用してロクベンシモツケソウの抽出物並びに担体及び／又は希釈剤及び／又は添加剤を含む組成物である。

本発明の第５の主題は、１種以上の化学療法剤と併用して、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、ロクベンシモツケソウの抽出物又はロクベンシモツケソウの抽出物を含む組成物の１つ以上のアリコートと、化学療法剤を含む１種以上の組成物の１つ以上の個別のアリコートを含む、ロクベンシモツケソウの抽出物及び１種以上の化学療法剤の同時投与又は連続投与用のキットである。

本発明の第６の主題は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態を予防及び／又は処置するための治療方法であって、それを必要とする個体に、任意選択で抗腫瘍及び／又は抗腫瘍活性を有する１種以上の成分と併用してロクベンシモツケソウの抽出物の、ロクベンシモツケソウの抽出物を含む医薬組成物の治療上有効な量を投与するステップを含む、前記治療方法である。

注：本図面において、使用されているロクベンシモツケソウの抽出物は、多くの場合、ＡＢＯ−２の略語で示されている。

ＳＴＡＴ３、ｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）のリン酸化の阻害を示す図である。図１Ａは、２４時間、１００μｇ／ｍｌのロクベンシモツケソウ抽出物で処理したＭＳＴＯ２１１Ｈから得た細胞溶解産物のウェスタンブロット解析である。定量は、対照のアクチンと比較して実施した。図１Ｂは、ＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞でのウェスタンブロットで得られたデータの棒グラフである。ｐ−ＳＴＡＴ３（リン酸化ＳＴＡＴ３）は黒色で示し、ＳＴＡＴ３は灰色で示す。この図は、対照と比べ、抽出物がｐ−ＳＴＡＴ３の形成を阻害することを示している。様々な用量のロクベンシモツケソウ抽出物を用いたヒト中皮腫細胞系でのクローン原性アッセイを示す図である（条件については実験の項目を参照のこと）。図２ａは、ヒト中皮腫細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈで実施したアッセイを示す図である。図２ｂは、ヒト中皮腫細胞系ＭＰＰ８９で実施したアッセイを示す図である。本発明の抽出物は、３種の異なる炎症腫瘍系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＤＵ１４５Ｅ、ＨＣＴ１１６）が用量依存的に、それらのアイソタイプとは無関係にコロニーを形成する能力に影響を及ぼす。図３ａは、乳房腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１で実施したアッセイを示す図である。図３ｂは、前立腺腫瘍細胞系ＤＵ１４５で実施したアッセイを示す図である。図３ｃは、結腸腫瘍細胞系ＨＣＴ１１６で実施したアッセイを示す図である。中皮腫細胞系（ＭＳＴＯ２１１Ｈ、ＭＰＰ−８９、ＮＣＩ−Ｈ２８）でのＡＴＰｌｉｔｅアッセイを使用する細胞生存能力アッセイを示す図である（条件については実験の項目を参照のこと）。このアッセイは、細胞生存能力が様々な中皮腫細胞系において用量依存的に本発明のロクベンシモツケソウ抽出物によって阻害されることを示す。正常中皮細胞（ＨＭＣ）をロクベンシモツケソウの抽出物で処理して得られた増殖曲線と比較した図４の３種の生存能力曲線の比較を示す図である（図５ａＭＳＴＯ２１１Ｈ、図５ｂＭＭＰ−８９、図５ｃＮＣＩ−Ｈ２８）。悪性中皮腫細胞系（ＭＰＭ）は、明らかに、ＨＭＣと比べ、ロクベンシモツケソウ抽出物の抗増殖作用を示す。中皮腫細胞系ＭＰＭＭＳＴＯ２１１Ｈでのペメトレキセド（ＰＭＴＸ）と併用してロクベンシモツケソウ抽出物で処理した後の細胞生存能力アッセイ（ＡＴＰｌｉｔｅアッセイ）を示す図である。図６ａは、細胞における様々な濃度のロクベンシモツケソウ抽出物の効果を報告している。図６ｂは、細胞における様々な濃度のペメトレキセドの効果を報告している。図６ｃは、漸増用量のペメトレキセドと最小用量６μｇ／ｍｌのロクベンシモツケソウ抽出物の間の関連性を報告している。ＰＭＴＸによる処理はＭＰＭ細胞には細胞障害性であり、且つ非腫瘍細胞には毒性が高い。本発明の抽出物＋ＰＭＴＸによる細胞の併用処置は、ＭＰＭ細胞系における細胞生存能力に有意な効果があった。中皮腫細胞系ＭＰＭＮＣＩ−Ｈ２０５２でのペメトレキセド（ＰＭＴＸ）と併用してロクベンシモツケソウ抽出物で処理した後の細胞生存能力アッセイ（ＡＴＰｌｉｔｅアッセイ）を示す図である。図７ａは、細胞における様々な濃度のロクベンシモツケソウ抽出物の効果を報告している。図７ｂは、細胞における様々な濃度のペメトレキセドの効果を報告している。図７ｃは、漸増用量のペメトレキセドと最小用量６μｇ／ｍｌのロクベンシモツケソウ抽出物の間の関連性を報告している。ＰＭＴＸによる処理はＭＰＭ細胞には細胞障害性であり、且つ非腫瘍細胞には毒性が高い。本発明の抽出物＋ＰＭＴＸによる細胞の併用処置は、ＭＰＭ細胞系における細胞生存能力に有意な効果があった。中皮細胞（ＨＭＣ）でのペメトレキセド（ＰＭＴＸ）と併用してロクベンシモツケソウ抽出物で処理した後の細胞生存能力アッセイ（ＡＴＰｌｉｔｅアッセイ）を示す図である。前述の図６及び図７で明らかであるように、ＰＭＴＸによる処理はＭＰＭ細胞には細胞障害性であり、且つ非腫瘍細胞には毒性が高い。図８ａは、細胞における様々な濃度のロクベンシモツケソウ抽出物の効果を報告している。図８ｂは、細胞における様々な濃度のペメトレキセドの効果を報告している。図８ｃは、漸増用量のペメトレキセドと最小用量６μｇ／ｍｌのロクベンシモツケソウ抽出物の間の関連性を報告している。本発明の抽出物＋ＰＭＴＸによる細胞の併用処置は、ＭＰＭ細胞系における細胞生存能力に有意な効果があり、一方、非形質転換細胞（ＨＣＭ）ではペメトレキセドによって誘発される死滅率を低減した。結果として、本発明のロクベンシモツケソウ抽出物は、腫瘍細胞のみをペメトレキセド感受性にすることが明らかである。ヒト中皮腫細胞系ＭＳＴＯ２２１Ｈにおける創傷治癒アッセイを示す図である（条件については実験の項目を参照のこと）。この図は、示した時間、本発明の抽出物で、また担体で処置した創傷を閉じる効果に関する棒グラフを示す（担体に比べて移行した細胞数の定量を％で示す）。この図は、ロクベンシモツケソウ抽出物の存在下において、移行細胞の数が著しく減少したことを示す。アポトーシスの誘導を評価するアッセイを示す図である（ウェスタン法）。本発明の抽出物は、用量１００μｇ／ｍｌで、細胞系ＭＳＴＯ２１１ＨのＰＡＲＰ形態、並びにカスパーゼ３及び７切断形態などのいくつかのアポトーシスマーカーのレベル上昇によって明らかなように、アポトーシスを誘導する。アネキシンＶのレベル測定によるアポトーシス誘導を評価するアッセイを示す図である。本発明の抽出物は、時間依存的及び用量依存的に、アネキシンＶの呈色で判定したとおり、細胞系ＭＭＰ８９においてアポトーシスを誘導する。アネキシンＶのレベル測定によるアポトーシス誘導を評価するアッセイを示す図である。本発明の抽出物は、時間依存的及び用量依存的に、アネキシンＶの呈色で判定したとおり、細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈにおいてアポトーシスを誘導する。ヒト中皮腫細胞系ＭＰＰ８９における４８時間及び７２時間ＡＢＯ２で処置した後の細胞周期の分析を示す図である（図１３ａ及び図１３ｂ）。グラフは、本発明の抽出物が時間依存的にサブＧ１期の細胞を阻害し、アッセイした中皮腫細胞の細胞複製の進行を実際に妨げることを示している。処置の７２時間後、図１３ｂでは、ほとんどの細胞が有糸分裂前のＧ２期に到達していない。中皮腫細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈにおける４８時間及び７２時間ＡＢＯ２で処置した後の細胞周期の分析を示す図である（図１４ａ及び図１４ｂ）。グラフは、本発明の抽出物が時間依存的にサブＧ１期の細胞を阻害し、アッセイした中皮腫細胞の細胞複製の進行を実際に妨げることを示している。処置の７２時間後、図１４ｂでは、ほとんどの細胞が有糸分裂前のＧ２期に到達していない。ＭＰＭ細胞系移植に対するロクベンシモツケソウ抽出物の効果を示す図である。ＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞は、２４時間ロクベンシモツケソウで前処置を行った。次いで、それらをＣＤ１ヌードマウスに接種した。ロクベンシモツケソウ抽出物による前処置は腫瘍移植に影響を及ぼし、腫瘍体積の統計学的な有意差（ｐ＝０．００２４）を誘導した。ロクベンシモツケソウ（図１６ａ）抽出物及びセイヨウナツユキソウ（Ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｕｌｍａｒｉａ）（シモツケ属の草本）抽出物で処置した中皮腫細胞系ＭＳＴＯ２１１ＨでのＡＴＰｌｉｔｅアッセイを使用する細胞生存能力アッセイを示す図である（条件については実験の項目を参照のこと）。このアッセイは、細胞生存能力が様々な中皮腫細胞系において用量依存的に本発明のロクベンシモツケソウ抽出物によって阻害されることを示す。中皮腫細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈをロクベンシモツケソウ抽出物で処置して得られた２種の生存能力曲線を、セイヨウナツユキソウ（シモツケ属の草本）抽出物で同一細胞系を処置して得られた増殖曲線に対して比較したことを示す図である。図から明らかなように、悪性中皮腫細胞系（ＭＰＭ）は、セイヨウナツユキソウ抽出物と比較した場合、ロクベンシモツケソウ抽出物の抗増殖効果によって著しく影響を受けている。マウスにおいてインビボでペメトレキセドと併用して投与したロクベンシモツケソウ抽出物の効果を示す図である。各群は、例１３の表５で報告したように体系化した。コメットアッセイによって示したように、ＡＢＯ２による処置は、非形質転換正常中皮細胞（ＨＭＣ）においてＤＮＡ損傷を誘導しなかったことを示す図である。それとは異なり、ＡＢＯ２は、ＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞においてＤＮＡ損傷を誘導した。ＣＤＤＰ（ｃｉｓ−ジアンミンジクロロ白金）による処置は、両細胞系においてＤＮＡ断片化を誘導する。ＡＢＯ２による処置は正常細胞をＣＣＤＰ誘導性ＤＮＡ断片化から保護するが、ＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞においては、ＤＮＡ断片化の誘導の際にＣＤＤＰとの相乗効果を示す。

したがって、本出願は、ＳＴＡＴ３因子の構造的活性化又は異常活性化が存在する病状の予防及び／又は処置におけるロクベンシモツケソウの抽出物の使用に関する。前述のように、異常活性化又は構造的活性化は、血液中及び組織中の炎症性及び／又は腫瘍原性作用の原因となるこの因子の異常リン酸化又は構造的リン酸化に関わっていると思われる。

以下の記載、特許請求の範囲及び図面において、「ＳＴＡＴ３」という用語は、ＳＴＡＴ３転写のシグナル及び活性化の形質導入因子を意味する（シグナル伝達兼転写活性化因子３）。慣例的には、遺伝子について言及する場合、イタリック体の大文字が使用されるが、タンパク質は非イタリック体の大文字によって表示される。

炎症及び腫瘍は、発癌経路及び環境経路と密接に関連しており、ＳＴＡＴ３因子（シグナル伝達兼転写活性化因子３）のリン酸化は、それらの活性化と核への置換をもたらし、そこでは、それは、多数のサイトカイン、ケモカイン、及び炎症に関連する他の伝達物質の転写の活性化因子として作用し、それにより癌を促進することは、文献において既知である。

したがって、ＳＴＡＴ３の活性化阻害因子は、ＳＴＡＴ３因子の構造的活性化が存在するそれらのすべての病状に対して予防効果及び／又は治療効果を有する因子である。本発明は、初めて、ロクベンシモツケソウの抽出物のＳＴＡＴ３特異的阻害作用を開示している。

ロクベンシモツケソウ（Ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）はまた、ロクベンシモツケソウ（Ｓｐｉｒａｅａｖｕｌｇａｒｉｓ）、ロクベンシモツケソウ（Ｓｐｉｒａｅａｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａ）又はヨウシュシモツケソウ（Ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｈｅｘａｐｅｔａｌａ）としても知られている。本発明の目的においては、特段の指示のない限り、用語ロクベンシモツケソウは、ロクベンシモツケソウ（Ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）又は上記で定義したその別称のみを意味し、セイヨウナツユキソウ（Ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｕｌｍａｒｉａ）（シモツケ属の草本）は意味しない。

ロクベンシモツケソウは多年生草本植物であり、植物丈は７０ｃｍ以下、直立性で、筋の入った、毛がほとんどなく、分枝がほぼない茎を有しており、その葉は、羽状−隔壁であるか又は両側に粗い鋸歯状切り込み形成を有する托葉を有し、雌雄両性花はクリームホワイト色又はピンク色で、一般に花弁は６枚であり、散房花序の頂芽頂部でまとまっている。

この植物は、一般に、その抗リウマチ特性、浄化特性、利尿特性及び収斂特性が知られている。

本発明の実施の目的において、本抽出物は、ロクベンシモツケソウの花頂（葉つき花序）の抽出物であってよく、「花頂」とは、幹、葉及び花（葉つき花序、花序）によって特徴づけられる、地上から高さ１０〜１５ｃｍで回収される植物の空中部分を意味する。収穫期は、季節の気候パターンに応じて、５月から１０月までである。本抽出物は、新鮮な植物及び乾燥植物の両方から調製することができる。この後者の例においては、乾燥は、約３５〜４５℃の温度で、換気型の炉で実施される。

本発明による抽出物は、液体抽出物、軟エキス、又は既知の乾燥技術によって凍結乾燥若しくは乾燥された抽出物であってよい。抽出物は、以下の溶媒：水、エタノール、メタノール、アセトン又はイソプロパノールによる抽出によって、それぞれの場合、純粋な形態又は相互の混合物で取得することができる。アルコールはメタノール、エタノール、イソプロパノールであってよく、好ましくはエタノールである。エタノールは、純粋な形態で、又は以下のパーセンテージの水との混合物で使用することができる：９６％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％。本発明の限定されない実施形態において、抽出で使用される溶媒は、５０：５０の割合のエチルアルコールと水によって形成される混合物であってもよい。液体抽出物は、１：２〜１：１００の薬剤／溶媒比率で、好ましくは１：１０の比率でロクベンシモツケソウの上記で示した部分を浸出／温浸するヒドロアルコール抽出によって調製することができる。抽出時間は当業者によって一般に使用されている時間であり、例えば、最低４時間から約８時間までであってよい。抽出温度は通常コントロールされ、好ましくは、例えば約５０℃の温度であってよい。水性アルコール抽出物からのアルコール蒸発とその後の水性濃縮物の乾燥は、凍結乾燥又は乾燥によって実施し、凍結乾燥抽出物又は乾燥抽出物を得ることができる。

こうした抽出物の調製は、一般に当業者には公知であり、本開示において特に詳細に記述する必要はない。本発明の実施目的において、従来の技術に従って調製される、上記に示したうちのすべての抽出物を使用することができる。

特に、本発明の目的において、抽出物は本明細書に記載の抽出物の画分であってもよい。

この場合、標準方法は、アルコール度５０のアルコール抽出物中に存在するアルコールの蒸発、４０００ｒｐｍで１〜５分間の遠心分離によるアルコール中の不溶性物質の除去、吸着樹脂含有クロマトカラムで行う水溶液（水性濃縮物）の導入を含む。

前述の水性濃縮物は、同様に、乾燥又は凍結乾燥したロクベンシモツケソウ抽出物を１：１０ｗ／ｗの比で水に懸濁させることによって得ることができる。

樹脂の供給流体はＢｉｘ０．２から１°の間に直接的に含まれる懸濁固体を含んでいなければならず、供給速度は１〜４ＢＶ／時間であり、好ましくは２ＢＶ／時間である。対応する水性溶出液を回収し、凍結乾燥又は乾燥による脱水に供し、樹脂に吸着されている物質は９６％エチルアルコール又はメタノール又はアセトン、好ましくは９６％エチルアルコールを使用して溶出する。この最後の事例において、アルコール溶出液は、アルコール溶出液と１：１ｖ／ｖの比で水をこの最後の事例で加えた後に乾燥又は凍結乾燥に供し、エチルアルコールを蒸発させる。

本発明によれば、上記で定義したロクベンシモツケソウの抽出物は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする病状の予防及び／又は処置で使用することができる。

こうした疾患は、例えば、また文献に記載されているように、炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍のタイプの疾患であり得る。

本発明の目的において、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする病理学的状態は、（文献に記載されているように）ウイルス感染、例えば、（Ｙｕら、２００９において報告されている）ヘリコバクター・ピロリによる感染、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）による感染、エプスタイン−バールウイルスによる感染などによって引き起こされ得る。

既に記載のように、「ＳＴＡＴ３」という用語はこのように、ヒトにおいてＳＴＡＴ３遺伝子によってコードされている、ヒト転写因子「シグナル伝達兼転写活性化因子３」を示す。

本発明は、この遺伝子があらゆる場合において構造的又は異常的に活性化される、（例えば下記の）本明細書に詳細に定義されているヒトにおける病理学的状態に関する。

ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化が存在する前腫瘍病理学的状態は、文献で報告されているように、腫瘍切除後の病理学的状態、したがって腫瘍が改善され得るという意味での前腫瘍であるか、又は細胞の一部に炎症から悪性の特性の発症までの変化がある病理学的状態であり得る。

本発明によれば、腫瘍病理学的状態は、従来技術において報告されているＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とするすべての腫瘍、例えば、前立腺癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、メラノーマ、卵巣癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、脳腫瘍、赤白血病、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、中皮腫であり得る。

より詳しくは、前記脳腫瘍は、例えば、神経膠腫、脳髄膜腫、髄芽細胞腫であってよく、前記リンパ腫は、セザリー症候群、ＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、ＳａｉｍｉｒｉＨＳＶ依存性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞関連リンパ腫であってもよい；前記白血病は、ＨＴＬＶ−１−依存性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、巨核球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）であってもよい。

本発明の限定されない例によれば、上記で定義したロクベンシモツケソウの抽出物は、上記表１に挙げたＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とするいずれか１つの病理学的状態の予防及び／又は処置で使用することができる。

本発明に記載の「構造的活性化」又は「異常活性化」という用語は、通常、正常細胞においては存在していない、（例えば、参考文献に記載されているような）ＳＴＡＴ３に関する文献内のこうした用語に起因する意味、又は、この因子の持続的な活性化の認識内で理解されたい。

本発明の抽出物によって示されるＳＴＡＴ３に活性化及び活性の阻害における特異性を考慮すると、本発明の抽出物は、ＳＴＡＴ３を阻害しない化学療法剤による処置に対して耐性のある腫瘍病変の処置において使用することができる。ＳＴＡＴ３を阻害しない化学療法剤の限定されない例は、構造的に活性化されたｐＳＴＡＴ３と化学療法に対し高耐性を有する腫瘍である中皮腫で使用される化学療法薬が挙げられる。一般に使用される薬剤の例としては、チミジル酸シンターゼの阻害剤であるペメトレキセド；ジヒドロ葉酸還元酵素の競合的及び可逆的阻害剤であるメトトレキサート；ピリミジンヌクレオチドの生合成経路における偽基質としてＤＮＡの合成を阻害するゲムシタビン；微小管の形成を阻害する、チューブリンのモノマーに結合する抗有糸分裂薬であるビノレルビン；ＤＮＡにおけるインターフィラメントとイントラフィラメントの架橋形成によってＤＮＡへの細胞周期結合のすべての段階に干渉することができる薬剤であるシスプラチンが挙げられる。

また、ＳＴＡＴ３の構造的活性化が知られている腫瘍細胞系で得られた下記及び図面で示した実験データは、本発明に記載のロクベンシモツケソウの抽出物を１種以上の抗腫瘍薬と有利に関連付けることができ、それによって、薬剤自体の抗腫瘍効果も相乗的に増加させることができることを示す。

したがって、本発明の実施形態に従い、本明細書に記載したロクベンシモツケソウの抽出物は、抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物及び／又は抗炎症作用を有する１種以上の化合物と併用して、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性、前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置で使用することができる。

実施形態に従い、抗腫瘍活性を有する化合物は化学療法剤であってもよく、シスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択することができる。

したがって、本発明は、ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする腫瘍又は前腫瘍病理学的状態を予防及び／又は処置するための１種以上の化学療法剤と併用する本明細書で定義したロクベンシモツケソウの抽出物の使用を含む。

１種以上の化学療法剤との併用は同時併用若しくは連続併用であってよく、又は、抽出物と化学療法剤は、（単回投与若しくは個別投与において）同時に、又は数分の一定時間にわたって投与することができるか、或いは、治療的処置の日又は期間にわたって、連続して、又はそれぞれを数分以上離して異なる時間に投与することができる。

投与計画は、患者の性別、年齢、疾患の状態、体重及び病歴に基づき、処置を行う医師によって決定される。

上述のような単独及び併用の両方において、処置は、例えば、上記に示した腫瘍原性作用を有し得るような既知の感染症の場合、又は前記腫瘍が変性するのを予防するような腫瘍の切除の場合に予防することができる。

本発明に記載の抽出物は、上記のような同一目的に使用することができる組成物で製剤化することができる。

したがって、本発明は、さらに、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、活性成分としてロクベンシモツケソウの抽出物と担体及び／又は希釈剤及び／又は添加剤を含む組成物に関する。

上述のように、本発明の目的におけるロクベンシモツケソウの抽出物は、上述の事例及び定義に従って、ロクベンシモツケソウに属する植物抽出物であり得る。

本組成物は、活性成分として、凍結乾燥抽出物、乾燥抽出物及び／又は液体抽出物の形態の上記で定義した抽出物を含むことができる。既に記載のように、抽出物は、新鮮な、又は乾燥させた、ロクベンシモツケソウの花頂（葉つき花序）の抽出によって得ることができる。抽出は、温度を５０℃にコントロールしながら浸出−温浸によって実施することができ、抽出の溶媒としては、例えば、水、９６％エタノール、メタノール、アセトン、イソプロパノールのそのもの又は混合物が挙げられる。次いで、得られた液体抽出物に対し蒸発を行うことができ、その後、凍結乾燥又は乾燥を行うことにより凍結乾燥抽出物又は乾燥抽出物を得ることができる。本発明によれば、上記で定義した組成物は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする病状の予防及び／又は処置で使用することができる。

このような疾患は、例えば、また文献に記載されているように、炎症性疾患及び／又は前腫瘍疾患及び／又は腫瘍疾患であり得る。本発明の組成物で使用することができる様々な病理学的状態の定義は、本発明の抽出物の治療的使用に関して上記で規定したものと同じである。

本発明の目的において、本組成物は、既に上記で定義したＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする病理学的状態、ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする、既に上記で定義した腫瘍病理学的状態、及び本明細書の範囲内において既に前述で説明したようなＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化が存在する前腫瘍病理学的状態を処置することができる。

本発明の限定されない例によれば、本明細書で定義した組成物は、上記表１に挙げたＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とするいずれか１つの病理学的状態の予防及び／又は処置に使用することができる。

さらに、さらなる実施形態によれば、本明細書に記載した本発明の組成物は、活性成分として、１種以上の抗腫瘍薬剤及び／又は１種以上の抗炎症薬をさらに含んでいてもよい。

したがって、本発明はさらに、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、活性成分として、ロクベンシモツケソウの抽出物と、抗腫瘍活性及び／又は抗炎症活性を有する１種以上の化合物とを含む組成物に関する。

実施形態によれば、抗腫瘍活性を有するこうした化合物は、例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される化学療法剤であってよい。

本発明の組成物は、単位投与用量で、又は各患者のそれぞれのニーズに適合した治療法をさらに可能にする目的で処置を行う医師によって投薬可能な方法で製剤化することができる。

したがって、本発明は、ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置における、任意選択で、抗腫瘍活性を有する１種以上のさらなる活性成分及び／又は抗炎症作用を有する１種以上のさらなる活性成分と併用する、本明細書で定義したロクベンシモツケソウの抽出物を含む組成物の使用を包含する。

こうしたさらなる活性成分は、例えば、化学療法化合物であってもよく、また、病理学的状態は、前腫瘍又は腫瘍の病理学的状態であってもよい。

上述の１種以上の活性成分を含む組成物（任意選択で１種以上の抗腫瘍薬及び／又は１種以上の抗炎症薬と併用するロクベンシモツケソウの抽出物）は、通常の製薬業若しくは化粧品業で、又は食品産業で技術的に使用されている１種以上の添加剤又はアジュバントをもちろん含んでいてもよい。使用される添加剤は、希釈剤、可溶化剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、スリップ剤及び抗接着剤のカテゴリーに属するものであってよい。

必要に応じて、本組成物は、製薬、化粧品及び食品産業において一般に使用されている着香料、着色剤及び保存剤を含有していてもよい。

本発明に記載の組成物は、当業者に公知の技術に従い、上記で定義したロクベンシモツケソウの抽出物と、任意選択で１種以上の抗腫瘍薬剤、及び前述のカテゴリーに属する１種以上の添加剤とを使用して製造することができる。

本組成物は、経口投与（例えば、粉末、顆粒、カプセル剤、ハード又はソフトゼラチンのカプセル、錠剤、シロップ剤、ドロップ、溶液及び経口エマルジョン）、吸入（例えば、エアロゾル、液体及び粉末噴霧剤）、局所投与（ゲル剤、軟膏剤、エマルジョン、泥膏、フォーム剤、局所使用の無水固形剤型、及び貼付剤）、並びに当業者によって現在使用され既知である技術による非経口投与（例えば、皮下使用、筋肉内使用、静注使用又は皮内使用）向けの製剤を調製する当業者によって適切であると考えられるすべての製剤であってよい。すべての製剤において、技術上の添加剤又はアジュバントの使用は、製薬実務において一般に使用されているものに基づいて使用する物質を選択することにより決定される。

抗腫瘍活性を有する薬剤を併用する、又は併用しないロクベンシモツケソウの抽出物をベースとした製剤の調製において、当業者は、治療法での使用に適し得る安定製剤を得るために、従来技術により有用であると考えられるいずれかの添加剤を使用することができる。例えば、希釈剤のカテゴリーにおいて、固形剤において希釈剤を使用することが可能であり、例えば、糖、多価アルコール（例えばラクトース、マニトール、ソルビトール）、セルロース、無機酸の塩類（例えば第二リン酸カルシウム）、ナトリウム、カリウム及びカルシウムの塩類の形態のクエン酸塩、炭酸塩及び重炭酸塩をはじめとする有機酸の塩類、或いは液体の形態の希釈剤、例えば水、経口用途の食用油（ヒマワリ油、オリーブ油、トウモロコシ油、スイートアーモンド油、落花生油）又は局所製剤で使用される油（ホホバ油、短鎖、中鎖又は長鎖トリグリセリド）、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール）がある。

崩壊剤のカテゴリーにおいて、例えば、天然又は加工デンプン（トウモロコシデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン）、クロスカルメロースナトリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン、クロスポビドン；ゴム系の天然産物を含む使用可能な結合剤（グアーガム、キサンタンガム、アラビアゴム）、スクロース及び合成品、例えば、ポリビニルピロリドン及びセルロースの半合成誘導体を使用することができる。

ステアリン酸及びそれらの塩、例えばマグネシウムの塩、エチレングリコールのポリマー、トリグリセリド及び滑沢剤としての天然又は合成ワックスが有効であることが判明している。

界面活性剤は、水でより溶解し得るか、洗浄可能である本発明の基剤を形成する製剤に含まれる１種以上の活性成分を調製するために使用され、これらの活性成分は、単独で作用するか、１種以上の希釈剤によって担持される。例えば、ソルビタンエステル、ソルビタンポリオキシエチレンエステル、スクロースエステル及びラウリル硫酸ナトリウムを挙げることができる。

スリップ剤は、例えば、コロイダルシリカ、沈降性シリカから選択することができ、一方、使用可能な付着防止剤としては、例えば、タルク又はデンプンが挙げられる。

注射用製剤の調製において、活性物質（単数又は複数）を有効に可溶化又は分散させることができる添加剤を選択することができる。例えば、注射よる投与に適したｐＨ及び浸透圧を得るために、水とともに、他の水溶性担体、例えば、多価アルコール及び有機酸又は無機酸の塩を使用することができる。

特定の事例において、非水溶性担体、例えば油、又は注射での使用について承認されている合成物質を使用することができる。

当業者は、公知の通常の調製スキーマを使用して、すべての製剤を調製することができる。

単なる例ではあるが、カプセル剤の製剤は、ロクベンシモツケソウの抽出物を事前に粉砕し、通常のミキサーで得られた粉末と、１種以上の抗腫瘍薬及び製剤の調製に選択した添加剤、例えば、上述のもの又は市販の経口使用が承認されているものから選択される希釈剤、崩壊剤、滑沢剤及びスリップ剤とを一緒に混合することによって簡易に製造することができる。

錠剤の場合には、従来技術による造粒方法のアジュバントとして水を使用し、混合物の一部又は全部を、事前に水に溶解させておいた結合剤、又は混合物に入れておいた結合剤とともに造粒することが必要である。

顆粒剤は、乾燥させ、篩にかけ、さらに、当業者に公知のものに従い、錠剤を得るのに好適な混合物を得るための他の粉末と混合することができる。

非経口使用の場合には、組成物はまた、特定の操作要件に従って簡単に混和できる個別の容器中の活性成分とともに提供することができる。

本明細書に記載の組成物の使用を容易にするために、これらは、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする特定の病理学的状態の予防的及び／又は治療的使用に有効な本明細書に記載の活性成分（ロクベンシモツケソウの抽出物と任意選択で１種以上の抗腫瘍薬及び／又は１種以上の抗炎症薬）の１つを含有する単位投与用量の形態で提供することができる。

本発明はさらに、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、ロクベンシモツケソウの抽出物と抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物及び／又は抗炎症作用を有する１種以上の化合物の同時投与又は連続投与用のキットであって、前記キットが本明細書に定義したロクベンシモツケソウの抽出物の１つ以上のアリコートと、抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコート及び／又は抗炎症作用を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコートを含む、キットに関する。

或いは、本キットは、活性成分として、本明細書で定義したロクベンシモツケソウの抽出物と、腫瘍活性を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコート及び／又は抗炎症性活性を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコートを含有する組成物の１つ以上のアリコートを含んでいてもよい。

上述のように、こうした化合物は、例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される化学療法剤であってよい。

キットを使用し、本発明の組成物を使用して処置又は予防することができる病状は、上記で既に示したものであり、例えば、（文献に記載されているような）ウイルス感染、例えば、ヘリコバクター・ピロリによる感染、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）による感染、（Ｙｕら、２００９に報告されているような）エプスタイン−バールウイルスによる感染によって引き起こされ得る、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする病理学的状態、或いは従来技術において報告されているＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化を特徴とするすべての腫瘍によって示され得る腫瘍病理学的状態である。

こうした腫瘍の限定されない例は、前立腺癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、メラノーマ、卵巣癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、脳腫瘍、赤白血病、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、中皮腫を含む。

より詳しくは、前記脳腫瘍は、例えば、神経膠腫、脳髄膜腫、髄芽細胞腫であってよく、前記リンパ腫は、セザリー症候群、ＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、ＳａｉｍｉｒｉＨＳＶ依存性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞関連リンパ腫であってよい；前記白血病は、ＨＴＬＶ−１−依存性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、巨核球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）であってもよい。

ＳＴＡＴ３の構造的活性化又は異常活性化が存在する前腫瘍病理学的状態は、文献において報告されているような、腫瘍の切除後の病理学的状態、したがって、腫瘍が変性し得るという意味での前腫瘍であり得るか、又は細胞の一部に炎症から悪性の特性の発症までの変化がある病理学的状態であり得る。

最後に、本明細書はまた、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態を予防及び／又は処置する治療方法であって、それを必要とする個体にロクベンシモツケソウの抽出物又はロクベンシモツケソウの抽出物を含む医薬組成物の治療上有効な量の抽出物を、任意選択で、１種以上の抗腫瘍及び／又は抗炎症化合物と併用して、投与するステップを含む、前記治療方法に関する。

本発明の基礎を形成する方法は、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態を示す対象に、本明細書で定義した抽出物の治療有効量を、任意選択で、１種以上の抗腫瘍薬又は抗炎症薬と併用して投与することにより；或いは、任意選択で、１種以上の抗腫瘍薬及び／又は抗炎症薬をさらに含む、本明細書で定義した組成物の治療有効量を投与することにより、或いは、本明細書で定義したキットを使用して、本抽出物と１種以上の抗腫瘍及び／又は抗炎症薬を投与することにより実施することができる。

上述の投与は、医師によって選択される投与計画に従って、同時に又は連続して実施することができる。

本発明に記載の抽出物の効果を証明する多くの実験データを報告した。

使用した細胞系
− Ｌ４２８ヒトリンパ腫細胞系。ＤＳＭＺＡＣＣ１９７から入手可能。
− 構造的に活性化されたＳＴＡＴ３を有するＫＡＲＰＡＳヒトリンパ腫細胞系。ＣｅｌｌＢａｎｋＡｕｓｔｒａｌｉａ＃６０７２６０４から入手可能。
１９８６年に非ホジキンＴ細胞リンパ腫細胞を用いて２５歳のヒト末梢血から樹立され、現在、リンパ芽球性リンパ腫細胞系として分類されている、ヒトＴ細胞性リンパ腫細胞系。Ｋａｒｐａｓ２９９は、チロシン７０５及びセリン７２７でリン酸化されたＳｔａｔ３を発現する。
− 構造的に活性化されたＳＴＡＴ３を有するＭＳＴＯ２１１Ｈヒト肺二相性中皮腫細胞系。ＡＴＣＣ＃ＣＬＲ−２０８１から入手可能。
過去にいかなる治療も受けていなかった中皮腫（二相性悪性腫瘍）のある６２歳のヒト胸膜流出から樹立された、ヒト中皮腫細胞系。細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈは高レベルのｐＳｔａｔ３を発現する（Ｔｓａｏら、悪性胸膜中皮腫組織におけるｃ−Ｓｒｃ発現及び活性化の阻害は、アポトーシス、細胞周期停止、遊走及び浸潤の低下を導く（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｃ−Ｓｒｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎｍａｌｉｇｎａｎｔｐｌｅｕｒａｌｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａｔｉｓｓｕｅｓｌｅａｄｓｔｏａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｃｅｌｌｃｙｃｌｅａｒｒｅｓｔ，ａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎ．）、ＭｏｌＣａｎｃｅｒＴｈｅｒ２００７；６：１９６２〜１９７２）。
− ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−８１から入手可能なＤＵ−１４５ヒト癌細胞系。
細胞系ＤＵ１４５は、転移性の可能性の高いＰＣ３細胞と比べ、転移性の可能性が中程度のヒト前立腺癌細胞系である。ＤＵ１４５細胞は、ホルモン非感受性で、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）を発現しない。細胞系ＤＵ１４５は、構成的にｐＳｔａｔ３を発現する。
− ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞系。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２４７から入手可能。
− ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房腺癌細胞系。ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２６から入手可能。
− ＮＣＩ−ｈ２８ヒトステージ−４中皮腫細胞系。ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−５８２０から入手可能。
− ＭＰＰ−８９ヒト中皮腫細胞系。ＣＡＢＲＩから入手可能、アクセス番号ＩＣＬＣＨＴＬ０００１２。

１．ウェスタンブロットによるＳＴＡＴ３のリン酸化の分析。結果は図１〜図３に報告した。
１．１．細胞溶融及びウェスタンブロッティング。
細胞を氷中で３０分間、プロテアーゼ及びホスファターゼの阻害剤（５ｍＭＰＭＳＦ、３ｍＭＮａＦ、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＮａＶＯ４）を補充した溶融バッファーＮＰ４０（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶融させた。タンパク質の全抽出物の等量（３０μｇ）を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で変性させることによって分解させ、２時間ニトロセルロース膜に移した。１時間、０．０５％のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０に溶解させた５％のミルク溶液で膜をブロックし、特異的一次抗体とインキュベートした。一次抗体は以下のものを使用した：抗ベータアクチン（Ａ−２２２８、ＳＩＧＭＡ）、抗ｐＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ−７０５）（ｓｃ８０５９、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）及び抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ７１７９、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）。二次抗体をペルオキシダーゼ結合されており（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、化学発光にはＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用した。

１．２．ＭＰＭの細胞系、及び一般的に市販されている中皮細胞（ＨＭＣ）のロクベンシモツケソウ抽出物による処置
ＭＰＭの細胞系（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＮＣＩ−Ｈ２８、ＮＣＩ−Ｈ２０５２、ＭＰＰ８９）はＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から取得し、一方、ＨＭＣ（ヒト中皮細胞）はＴｅｂｕ−Ｂｉｏ（Ｆｒａｎｃｅ）から取得した。すべての細胞系は、特定の培地中、３７℃及び５％ＣＯ２で単層において増殖させた。ロクベンシモツケソウ抽出物は、３０ｍｇ／ｍｌの初期濃度で、比率１：１の注射用溶液用の水及びエタノールの溶液中に都合よく溶解させた。次いで、抗腫瘍特性を試験するため、図面に示したように、生成物を様々な細胞系の培地に、様々な濃度及び様々な回数で直接添加した。

１．３．結果
図１〜３に示した結果は、抽出物で処置されていない対照と比べた場合に、アッセイした抽出物がどのようにＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害するかを示している。

図１及び図２は、本明細書によるロクベンシモツケソウの抽出物で処置したＭＳＴＯ２１１Ｈの細胞に対して得られたデータを示す。

図１は、担体単独で処置した対照と、ロクベンシモツケソウの抽出物（２４時間培養した培地１００μｇ／ｍｌ）で処置した対照（対照アクチン）のデータを示す。

２．悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）の細胞に対するクローン原性アッセイ
ＭＰＭ細胞（ＭＳＴＯ２１１Ｈ及びＭＰＰ−８９）を１ウェル当たり２００個の細胞で接種し、本明細書による様々な増殖濃度のロクベンシモツケソウ抽出物（対照担体単独；１２．５μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌ；５０μｇ／ｍｌ；１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ）で処置した。各ポイントは、６ウェルのマルチウォールに二連でプレーティングした。形成されたコロニーは、１５〜２１日後にクリスタルバイオレットを用いて染色した。クローン原性アッセイとして知られているコロニー形成アッセイは、腫瘍細胞が単一細胞からコロニーを形成する能力の観点から抗腫瘍化合物の効果を評価する際に使用されている技術である。コロニーは、単一細胞に由来する５０個以上の細胞（クローン）の群であると考えられる。

図２ａ及び図２ｂに示した実験結果は、本発明の抽出物が試験したすべてのＭＰＭ細胞系におけるコロニー形成を用量依存的に阻害する、用量依存的能力を示す。

さらに、同様のアッセイをＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞、ＤＵ１４５前立腺癌細胞及びＨＣＴ１１６結腸癌細胞に対しても実施した。この場合もまた、図３ａ、ｂ及びｃで示したデータからは、本発明の抽出物がコロニー形成を用量依存的に阻害する効果を有することが明らかである。

４．細胞生存能力ＡＴＰｌｉｔｅ（商標）アッセイ
様々な濃度の本発明の抽出物に暴露した後の各種細胞系の活性を、ＡＴＰｌｉｔｅ（商標）アッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を製造者の説明書に従って使用し、評価した。表示されている場合、「担体」という用語は、処置で用いる同一容量で使用される濃度１：１の注射溶液用の水とエタノールの溶液を意味する。

ＡＴＰＬｉｔｅ（商標）は、ホタル（フォチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓ））ルシフェラーゼの活性に基づいたアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレベルをモニタリングする系である。この発光アッセイは、培地中に含まれている可能性物質で処置した培養哺乳動物細胞の増殖を定量的に評価するための比色定量試験、蛍光定量試験及び放射性同位体試験に代わるものである。ＡＴＰのモニタリングは、実際、広範囲の薬剤、生物学的応答調節物質及び生物学的化合物の細胞増殖抑制効果及び抗増殖効果を評価するために使用されている。ＡＴＰＬｉｔｅ（商標）試験の系は、ＡＴＰルシフェラーゼ及びＤ−ルシフェリンを添加する反応によって生じる光の生成に基づいている。放出された光は、ある一定範囲内でＡＴＰ濃度に比例する。細胞内のＡＴＰ量は、細胞の生存能力と相関する。

ＭＰＭ細胞系（ＭＳＴＯ２１１Ｈ、ＭＰＰ８９、ＮＣＩ−Ｈ２８）及びＨＭＣ細胞（ドナーの好意によって提供された非形質転換中皮細胞）の様々なタイプの細胞生存能力は、様々な濃度の本発明に記載の抽出物（対照担体単独；１２．５μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌ；５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ）を使用した処置後にアッセイした。

アッセイの結果を示す図４のグラフは、本抽出物が細胞生存能力を用量依存的に有意に低下させることができることを示す。

これに対し、細胞生存能力に対する効果を非形質転換中皮細胞（ＨＭＣ）においても試験したところ、本発明の基礎を形成する抽出物は、腫瘍細胞系と比べた場合、細胞毒性が低いことが示された（図５Ａ〜図５Ｃ）。

７．化学療法剤との同時処置における細胞生存能力アッセイ
細胞系ＭＳＴＯ２１１Ｈ及びＮＣＩ−Ｈ２０５２を使用し、ロクベンシモツケソウ抽出物＋抗腫瘍薬の併用効果を評価した。

図１０に示したアッセイは、製造者の説明書に従ってＡＴＰＩｉｔｅ（商標）アッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用し実施した。

濃度１：１の注射溶液用の水とエタノールの溶液は、処置で使用した同一容量で用いた。

試薬：
ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ、Ｌｉｌｌｙ）は、製造者の説明書に従い希釈した。

７．１ロクベンシモツケソウの抽出物とペメトレキセドの併用に関するＡＴＰＩｉｔｅ（商標）アッセイ
図９は、ペメトレキセド、及びロクベンシモツケソウの抽出物を併用したペメトレキセドで処置した７２時間後のＭＳＴＯ２１１Ｈに関する生存能力曲線を示す。図Ａは、ＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞に対する非細胞障害用量（６μｇ／ｍｌ）の抽出物及びペメトレキセドを用いた処置を示し、図Ｂは、ＮＣＩ−Ｈ２０５２細胞に対する非細胞障害性用量（６μｇ／ｍｌ）の抽出物による処置及び（様々な濃度の）ペメトレキセドを用いた処置を示し、図Ｃは、非形質転換ＨＭＣ細胞に対する非細胞障害性用量（６μｇ／ｍｌ）の抽出物による処置及び（様々な濃度の）ペメトレキセドによる処置を示す。アッセイした化合物の濃度を横座標上にプロットし、パーセンテージで表した細胞生存能力を縦座標上にプロットしている。

図７及び図８は、抽出物による処置は、ペメトレキセドによる処置に対し腫瘍系をどのように感受性にするかを示す。二重処置の曲線において、ちょうど１０μΜのペメトレキセド濃度が被試験系の細胞生存能力を低下させるのに十分であることが明らかである。非腫瘍細胞系（図８参照）において、本抽出物がペメトレキセドに対する保護作用を有することを示していることは興味深い。

８．創傷治癒アッセイ
創傷治癒アッセイ（図９）は、インビトロでの細胞指向性遊走を研究するために開発された、簡単で、安価な、最初の方法の１つである。この方法は、インビボにおける創傷治癒の間の細胞遊走を模倣する。基本的なステップは、細胞単層に「創傷」を生じさせ、次いで、「創傷」を閉じるのに必要な細胞遊走の間、開始時及び一定の間隔で画像を取り込むことにより「創傷」の特定領域をモニタリングすることを含む。９５％の密集度により培養されたＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞を６ウェルのテキスタイルプレートに接種し、１０マイクロリットルの滅菌ピペットによって穴を開けることによって「創傷」（又は切り込み）を調製し、細胞を取り除いた。創傷後の示した時間にデジタル顕微鏡写真を得た。最後の棒グラフは、示した時間に担体又はＡＢＯ１で処置した切り込みを閉じる効果（定量した細胞の数を％で表示）を示す。

９．アポトーシス誘導の評価アッセイ
図１０を参照されたい。
９．１ウェスタンブロッティング
１．１の項目で述べたものと同じ技術を使用し、以下の一次抗体を使用した：抗ベータアクチン（Ａ−２２２８、ＳＩＧＭＡ）、抗カスパーゼ−３（３１Ａ１０６７、Ａｌｅｘｉｓ）、抗カスパーゼ−７（＃９４９２、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇ）及び抗ＰＡＲＰ（＃９５４２Ｓ、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇ）。

９．２ＦＡＣＳ分析、ＰＩ染色及びＰＩ／アネキシンＶ染色分析
細胞周期に対する本発明抽出物の効果を判定するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。

ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による染色については、１０^４細胞／ｍｌの密度で細胞を６ウェルプレートに接種した。２４時間後、様々な時間間隔で腫瘍細胞を提示濃度の本発明抽出物を用いて処置した。懸濁液中の細胞を収集し、付着細胞をＰＢＳで洗浄し、凍結エタノール（７０％ｖ／ｖ）で固定し、−２０℃で保存した。分析については、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ１Ｚ、ＰＩ（２５ｍｇ／ｍｌ）及びＲＮａｓｅＡ（２００ｍｇ／ｍｌ）の溶液に懸濁した。

ＰＩ／アネキシンＶ二重染色法については、処置細胞を収集し、結合バッファー（ＨＥＰＥＳｐＨ７．４、ＣａＣｌ２２．５ｍＭ、ＮａＣｌ１４０ｍＭ）に再懸濁した。細胞のアリコートをアネキシンＶＦＩＴＣ及びＰＩ（５ｍｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに１５分間インキュベートした。

すべてのＦＡＣＳ分析の間、１０^５の事象を各々のサンプルについて分析した。フローサイトメトリー分析は、ＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｅ８ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フローサイトメーターで実施した。

図１１から明らかなように、本発明の抽出物は、アネキシンＶ染色法で判定したとおり、時間依存的及び用量依存的にＭＳＴＯ２１１Ｈの細胞でアポトーシスを誘導する。

１２．本発明の抽出物による処置又は未処置腫瘍細胞の移植
第１移植実験の説明。
ＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞を２４時間、５０μｇ／ｍｌ濃度のロクベンシモツケソウで処置した。ＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に２×１０^６細胞の懸濁液を収集し、４週齢の雌ヌードマウスの右臀部に接種した。腫瘍の体積は、週に２回、２１日目までモニターした。マウスを屠殺し、塊を除去した。

１３．マウスにおける腫瘍細胞の移植とロクベンシモツケソウ及びペメトレキセドによる処置
第２移植実験の説明。
細胞を移植までに増殖させ、それらの活性及び混成の観点から評価した。すなわち、細胞を計数し、２０×１０^６／ｍｌの濃度でＰＢＳに再懸濁した。Ｍａｔｒｉｇｅｌを懸濁液に加え、ＰＢＳＭａｔｒｉｇｅｌ１／１の最終濃度１０×１０^６細胞／ｍｌを得た。ＭＳＴＯ細胞を４８匹のマウスの皮下に接種した。

腫瘍が６０ｍｍ^３の平均体積に達した時、異なる処置を受ける一群当たり６匹の動物によって形成される８群にマウスを分けた。

２群は、３週間の間、週７日間、飲用水中のロクベンシモツケソウを摂取した；他の群は、３週間の間、週５日、ペメトレキセドを腹腔内投与した。

これらの群を下記の表５に概説した：

腫瘍の進行が出現したならば（すなわち、腫瘍が６０ｍｍ^３に達した時）、処置は、以下のように投与するＡＢＯ２及びペメトレキセドで開始した：連続５日間、マウス１匹あたり８８ｍｌで用量１００ｍｇ／ｋｇのペメトレキセドを腹腔内投与、濃度が２５、５０及び７５マイクログラム／ｍｌの飲用水中ロクベンシモツケソウ抽出物を投与。３週間の間、隔日で測定した。

マウスに対し、あらゆる徴候を評価するため、毎日モニターした；体重は週に２回モニターした。

実験の終了時に（接種４２日後）、腫瘍塊を回収し、１０％ホルマリンに固定した（２４時間後に７０％エタノールに移した）。

腫瘍直径は週２回、Ｍｉｔｕｔｏｙｏキャリパーを使用して測定した。

１４．ロクベンシモツケソウ抽出物の調製
事前に正確な粒状サイズにカットしたロクベンシモツケソウの葉つき花序を、５０％エタノールを使用するヒドロアルコール抽出に供した。

抽出は５０℃で８時間実施した。抽出の最後に、使用済みの葉つき花序は、得られたヒドロアルコール溶液から濾過を行って除去した。この溶液は、エタノールが完全に除去されるまで、薄膜蒸発によって濃縮させた。こうして得た濃縮水溶液は、固体ケーキが得られるまで、凍結乾燥装置で乾燥させた。

最後に、ハンマーミルを使用して凍結乾燥ケーキを粉砕、混合し、均質な粉末凍結乾燥抽出物を得た。

１５．細胞系及び培養条件
細胞系ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＮＣＩ−Ｈ２８、ＮＣＩ−Ｈ２０５２ＭＰＰ８９は、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から取得した。ＨＭＣ（ヒト中皮細胞）系は、Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ（Ｆｒａｎｃｅ）から取得した。すべての細胞系は、３７℃及び５％ＣＯ_２の加湿型インキュベータ中で維持した。この細胞を、１０％非加熱不活化ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、５ｍｇｒ／ｍＬインスリン（ＳＩＧＭＡ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンＧナトリウム、及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＧＬＵＴＡＭＡＸ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）において単層として培養した。

１６．細胞試薬
ペメトレキセド（ＡＬＩＭＴＡ、Ｌｉｌｌｙ）及びシスプラチン（Ｐｆｉｚｅｒ）は、製造業者の説明書に従って溶解した。

１７．コメットアッセイ
処理後、細胞にはトリプシン処理を行い、ＰＢＳ中の１％低溶解アガロース（Ｓｉｇｍａ）に浸漬し、１％アガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で予め被覆した顕微鏡用スライド上に広げた。細胞は、室温で１時間、溶解溶液（２．５ＭＮａＣｌ、１００ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ塩基、８ｇ／ｌＮａＯＨ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％ＤＭＳＯ）中で溶解させ、次いで、３０分間、２５Ｖ及び２５０ｍＡで、泳動溶液（３００ｍＭＮａＯＨ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ１３．０）に流し込んだ。ＤＮＡは０．４ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０で平衡化し、スライドはメタノールで乾燥させた。ヨウ化プロピジウム−ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）及び図面画像は、４０×倍率のＡｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ型顕微鏡とＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎ（Ｚｅｉｓｓ）画像取り込み用ソフトウェアを使用することによって取得した。各スライド当たり少なくとも３００個の細胞を記録した。

１８．ＦＡＣＳ分析、並びにＰＩ染色及びＰＩ／アネキシンＶ染色分析
細胞周期に対する本発明抽出物の効果を判定するために、ＦＡＣＳ分析を実施した。

ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による染色については、１０^４細胞／ｍｌの密度で細胞を６ウェルプレートに接種した。２４時間の付着後、様々な時間間隔で腫瘍細胞を提示濃度の本発明抽出物を用いて処置した。懸濁液中の細胞を収集し、付着細胞をＰＢＳで洗浄し、凍結エタノール（７０％ｖ／ｖ）で固定し、−２０℃で保存した。分析については、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ、ＰＩ（２５ｍｇ／ｍｌ）及びＲＮａｓｅＡ（２００ｍｇ／ｍｌ）に懸濁した。

１９．統計分析
スチューデントｔ検定を用いてインビトロにおけるデータの有意性を評価し、一方、カプラン−マイヤー分析及びログランク検定を用いてマウスにおける生存データの有意性を評価した。ｐ≦０．０５値は、統計的に有意であるとみなした。

異種移植片の移植
ＰＢＳ１×／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に１×１０^６個のＭＳＴＯ２１１Ｈ細胞懸濁液を、５週齢の雄ＣＤ１マウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ、Ｍｉｌａｎ）に皮下注射した。マウスの体重と臨床的症状を３日ごとに判定した。腫瘍体積は、次式を使用して計算した：Ｖ＝１／２×長さ×幅２（長さと幅は手動式キャリパーを用いて測定した）。腫瘍が５０ｍｍ^３に達した時、マウスにペメトレキセド（１００ｍｇ／ｋｇ／３日）を腹腔内投与するか、ロクベンシモツケソウ抽出物（２５／５０／１００μｇ／ｍｌ／７日）を経口投与して処置した。すべての腫瘍形成アッセイは、内部倫理委員会ガイドラインに従って実施した。

ウェスタンブロッティング
細胞を氷中で３０分間、プロテアーゼ及びホスファターゼの阻害剤（５ｍＭＰＭＳＦ、３ｍＭＮａＦ、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＮａＶＯ４）を補充した溶融バッファーＮＰ４０（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＥＤＴＡ）に溶融させた。

タンパク質の全抽出物の等量（３０μｇ）を８％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で変性させることによって分解させ、２時間純ニトロセルロース膜に移した。１時間、５％ミルク−ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で膜をブロックし、特異的一次抗体と一晩インキュベートした。以下の一次抗体を使用した：抗ベータアクチン（Ａ−２２２８、ＳＩＧＭＡ）、抗カスパーゼ−３（３１Ａ１０６７、Ａｌｅｘｉｓ）；抗カスパーゼ−７（＃９４９２、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）；抗ＰＡＲＰ（＃９５４２Ｓ、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）。化学発光検出に使用する二次抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）であり、化学発光にはＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用した。

（参考文献）
− ＡｇｇａｒｗａｌＢ．Ｂ．ｅｔａｌ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０９１；１５１−６９：２００６
− ＪｏｈｎｓｔｏｎＰＡａｎｄＧｒａｎｄｉｓＲＧ，ＭｏｌＩｎｔｅｒｖ；１１（１）；１８−２６：２０１１
− ＮｉｕＧ．ｅｔａｌ．ＭｏｌＣａｎｃｅｒＲｅｓ，６（７）；１０９９−１０５：２００８
− ＴｕｒｋｓｏｎＪ．ＪｏｖｅＲ．「ＳＴＡＴタンパク質：制癌剤を発見するための新規分子標的」（ＳＴＡＴｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｎｏｖｅｌｍｏｌｅｃｕｌａｒｔａｒｇｅｔｓｆｏｒｃａｎｃｅｒｄｒｕｇｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０００Ｄｅｃ２７；１９（５６）：６６１３−２６
− Ｙｕ．Ｈ．ｅｔａｌ「癌炎症及び免疫におけるＳＴＡＴ：ＳＴＡＴ３に関する主要な役割」（ＳＴＡＴｓｉｎｃａｎｃｅｒｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙ：ａｌｅａｄｉｎｇｒｏｌｅｆｏｒＳＴＡＴ３）ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＣａｎｃｅｒ９，７９８−８０９（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ２００９）

Claims

ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するためのロクベンシモツケソウ（ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）抽出物。
前記抽出物がロクベンシモツケソウ（ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）の葉つき花序の乾燥又は凍結乾燥又は液体抽出物である、請求項１に記載のロクベンシモツケソウ（ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）抽出物。
１種以上の抗腫瘍及び／又は抗炎症化合物と併用して、ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、請求項１又は２に記載のロクベンシモツケソウ（ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）抽出物。
前記併用が、前記抽出物を前記１種以上の抗腫瘍及び／又は抗炎症化合物と同時投与又は連続投与することによって実施される、請求項３に記載のロクベンシモツケソウ（ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）抽出物。
前記１種以上の抗腫瘍化合物がシスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される、請求項３又は４に記載のロクベンシモツケソウ（ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）抽出物。
前記病理学的状態が前立腺癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、メラノーマ、卵巣癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、脳腫瘍、赤白血病、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、中皮腫を含む群から選択される腫瘍病理学的状態である、請求項１から５までのいずれか一項に記載のロクベンシモツケソウ（ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）抽出物。
前記脳腫瘍が神経膠腫、脳髄膜腫、髄芽細胞腫であり、前記リンパ腫がセザリー症候群、ＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、ＳａｉｍｉｒｉＨＳＶ依存性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞関連リンパ腫であり；前記白血病がＨＴＬＶ−Ｉ−依存性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、巨核球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）である、請求項６に記載のロクベンシモツケソウ（ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）抽出物。
前記病理学的状態がＳＴＡＴ３を阻害しない化学療法剤による処置に耐性の腫瘍である、請求項１から７までのいずれか一項に記載のロクベンシモツケソウ（ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）抽出物。
前記炎症性疾患がヘリコバクター・ピロリ（ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）による感染、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）による感染、エプスタイン−バールウイルス感染などのウイルス感染によって引き起こされる炎症である、請求項１から４までのいずれか一項に記載のロクベンシモツケソウ（ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）抽出物。
ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、活性成分として、請求項１又は２で定義したロクベンシモツケソウ（ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）抽出物並びに担体及び／又は希釈剤及び／又は添加剤を含む組成物。
活性成分として、１種以上の抗腫瘍及び／又は抗炎症化合物をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
前記１種以上の抗腫瘍化合物がシスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される、請求項１０又は１１に記載の組成物。
前記病理学的状態が前立腺癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、メラノーマ、卵巣癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、脳腫瘍、赤白血病、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、中皮腫を含む群から選択される腫瘍病理学的状態である、請求項１０から１２までのいずれか一項に記載の組成物。
前記脳腫瘍が神経膠腫、脳髄膜腫、髄芽細胞腫であり、前記リンパ腫がセザリー症候群、ＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、ＳａｉｍｉｒｉＨＳＶ依存性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞関連リンパ腫であり；前記白血病がＨＴＬＶ−１−依存性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、巨核球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）である、請求項１３に記載の組成物。
前記病理学的状態がＳＴＡＴ３を阻害しない化学療法剤による処置に耐性の腫瘍である、請求項１０から１４までのいずれか一項に記載の組成物。
前記炎症性状態及び／又は前腫瘍状態がヘリコバクター・ピロリ（ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）による感染、Ｂ型肝炎ウイルスの感染、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）による感染、エプスタイン−バールウイルス感染などのウイルス感染によって引き起こされる炎症である、請求項１０又は１１に記載の組成物。
ＳＴＡＴ３転写因子の構造的活性化又は異常活性化を特徴とする炎症性及び／又は前腫瘍及び／又は腫瘍の病理学的状態の予防及び／又は処置において使用するための、ロクベンシモツケソウ（ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）抽出物並びに抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物及び／又は抗炎症作用を有する１種以上の化合物の同時投与又は連続投与用のキットであって、請求項１又は２で定義したロクベンシモツケソウ（ｆｉｌｉｐｅｎｄｕｌａｖｕｌｇａｒｉｓ）抽出物の１つ以上のアリコート、並びに抗腫瘍活性を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコート及び／又は抗炎症作用を有する１種以上の化合物の１つ以上のアリコートを含む、上記キット。
前記１種以上の抗腫瘍化合物がシスプラチン、ドキソルビシン、ペメトレキセド、メトトレキサート、ビノレルビン、ゲムシタビン及びタキソールを含む群から選択される、請求項１７に記載のキット。
前記病理学的状態が前立腺癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、メラノーマ、卵巣癌、腎細胞癌、膵臓腺癌、肺癌、脳腫瘍、赤白血病、頭頚部扁平上皮癌、結腸癌、中皮腫を含む群から選択される腫瘍病理学的状態である、請求項１７又は１８に記載のキット。
前記脳腫瘍が神経膠腫、脳髄膜腫、髄芽細胞腫であり、前記リンパ腫がセザリー症候群、ＥＢＶ関連バーキットリンパ腫、ＳａｉｍｉｒｉＨＳＶ依存性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞関連リンパ腫であり；前記白血病がＨＴＬＶ−Ｉ−依存性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、巨核球性白血病、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）である、請求項１９に記載のキット。
前記病理学的状態がＳＴＡＴ３を阻害しない化学療法剤による処置に耐性の腫瘍である、請求項１７から２０までのいずれか一項に記載のキット。
前記炎症性状態及び／又は前腫瘍状態がヘリコバクター・ピロリ（ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）による感染、Ｂ型肝炎ウイルスの感染、ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）による感染、エプスタイン−バールウイルス感染などのウイルス感染によって引き起こされる炎症であり得る、請求項１７又は１８に記載のキット。