ES2666422T3

ES2666422T3 - Extracto de Filipendula vulgaris y usos del mismo

Info

Publication number: ES2666422T3
Application number: ES14786320.3T
Authority: ES
Inventors: Valentino Mercati; Anna MAIDECCHI
Original assignee: Aboca SpA Societa Agricola
Current assignee: Aboca SpA Societa Agricola
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2014-09-11
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2034-09-11
Also published as: ITRM20130502A1; PT3043809T; US20160213729A1; CA2923894A1; AU2014319951A1; EA201690334A1; EP3043809B1; AU2014319951B2; JP2016530326A; EP3043809A1; WO2015036949A1; MX2016003014A; CN105517558A

Abstract

Un extracto de Filipendula vulgaris para su uso en la prevención y/o en el tratamiento de una afección patológica inflamatoria y/o pretumoral y/o tumoral caracterizada por una activación constitutiva o anómala del factor de transcripción STAT3.

Description

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numerosos tumores asociados directamente con la activación anómala de STAT3. En particular, esta activación anómala parece estar causada por la acción de tirosina quinasas transformantes, tales como v-Src, v-Ros, v-Fps, Etk/BMX y Lck, o por una señal anómala inducida por la liberación autocrina o paracrina de citocinas. La activación constitutiva de STAT3 conduce a una mayor expresión de genes que codifican inhibidores de la apoptosis (por 5 ejemplo Bcl-xL, Mcl-1), reguladores del ciclo celular (por ejemplo ciclina D1/D2, c Myc) e inductores de la angiogénesis (por ejemplo VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular). Por último, se ha demostrado recientemente que además de tener un papel clave en la tumorigénesis, la activación constitutiva de este factor de transcripción confiere resistencia a la muerte inducida por agentes quimioterapéuticos (Aggarwal B. B. et al. Ann.

N.Y. Acad. Sci. 1091; 151-69: 2006).

10 Una diversidad de investigaciones clínicas ha demostrado que, in vivo, los tumores sólidos crecen y se desarrollan en un ambiente con bajos niveles de O2 que hacen al tumor en sí mismo insensible a las señales de muerte celular y resistente a tratamientos por radioterapia y quimioterapia; por otro lado, la hipoxia promueve la angiogénesis, la proliferación y la capacidad metastásica. La agresividad del tumor en este contexto parece estar asociada con la

15 activación y estabilización del factor de HIF-1 α tanto por la hipoxia como por la hiperactivación de STAT3.

Por este motivo, es altamente deseable una terapia antineoplásica basada en la dirección al factor STAT3 (Niu G. et al. Mol Cancer Res, 6 (7); 1099-105: 2008).

20 La Tabla 1, mostrada a continuación, se toma del trabajo de Aggarwal B. B. et al. 2006 y muestra una lista de tumores que expresan STAT3 activo de forma constitutiva, activadores de STAT3, genes regulados por STAT3 e inhibidores de STAT3.

Tabla 1

STAT3 constitutivo: Activadores Genes Quinasas Inhibidores

Tumores hematopoyéticos -Mieloma múltiple -Dependiente de HTLV-1 leucemia -LLC -LMC -LMA -Granulares grandes linfocitos leucemia -Eritroleucemia -Policitemia vera -Relacionado con VEB/de Burkitt -Micosis fungoide -Cutáneo de linfocitos T linfoma -Dependiente de VHS saimiri (linfocitos T) -Enfermedad de Hodgkin -Linfoma anaplásico Tumores sólidos -Cáncer de mama -Cáncer de cerebro -Carcinoma de colon -Sarcoma de Ewing -Carcinoma gástrico -Cáncer de pulmón -Cáncer nasofaríngeo: EGF IL-6 IL-5 IL-9 IL-10 IL-12 IL-22 TNF-α MCP-1 GCSF GMCSF LCR LIF OSM IFN-γ MIP-1α RANTES SLF UVB Choque osmótico Progestina LPS Tabaco VHC Antiapoptosis Bcl-XL Bcl-2 Mcl-1 clAP-2 Survivina Progresión del ciclo celular Ciclina D1 c-Myc c-Fos p21 Invasión tumoral y metástasis MMP-2 MMP-9 β-catenina VEGF hTERT IRF-1NLK MyD88 RANKL TNF β-macroglobulina Tirosina quinasas no receptoras JAK JAK2 JAK3 TYK2 Src Tirosina receptoras quinasas EGFR ErbB-2 Gp130 Grb2 Serina quinasas JNK P38MAPK ERK Tirosina fosfatasa Sintéticos AG490 Salicilato sódico Atiprimod BMS-354825 Etanol Nelfinavir PS-341 R115777 WP-1034 Compuestos de platino 15-Desoxi-delta 12,14-PGJ2 UCN-01 Estatina Péptidos SOCS3 PIAS GRIM-19 Adiponectina Duplin SSI-1 α-Trombina Lipoxina A4 DIF-1 PTPε C STAT3-DN Péptido señuelo

STAT3 constitutivo: Activadores Genes Quinasas Inhibidores

-Carcinoma de ovario -Adenocarcinoma pancreático -Carcinoma de próstata -Carcinoma de células renales -Cáncer SCCHN: SOCS Angiotensina Antiquimotripsina Naturales Flavopiridol Indirubina Magnolol Resveratrol Piceatanol Partenólido EGCG Curcumina Cucurbitacina Otros Rituximab GQ-ODN Ácido retinoico STA-21 EKB569

Clave: STAT, transductor de señal y activador de la transcripción; LLC, leucemia linfocítica crónica; LMC, leucemia mieloide crónica; LMA, leucemia mielógena aguda; SCCHN, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, HTLV, virus linfotrópico de linfocitos T humano; VEB, virus de Epstein-Barr; Nelfinavir, inhibidor de proteasa del VIH-1; R115777, inhibidor de farnesil transferasa; AG490 y piceatanol, inhibidores de tirosina quinasa; PIAS, inhibidor proteico de STAT3 activado; GQ-ODN, oligonucleótidos de cuarteto G; SOCS, supresor de señalización de citocinas; GRIM, gen asociado con inmortalidad inducida por retinoide-IFN; EGCG, epigalocatequina-3-galato; SSI, inhibidor de STAT inducido por STAT; PTPε C, proteína tirosina fosfatasa ε C; DN, dominante negativo; EKb569, inhibidor de EGF-R; DIF-1, factor inductor de diferenciación 1; JAB, proteína que contiene dominio SH2; IL, interleucina; TNF, factor de necrosis tumoral; MDA, antígeno de diferenciación de melanoma; MCP, proteína quimioatrayente de monocitos; GCSF, factor estimulante de colonias de granulocitos; LIF, factor inhibidor de leucemia; OSM, oncostatina M; IFN, interferón; MIP, proteína inflamatoria de macrófagos; RANTES, regulada tras la activación, expresada y secretada por linfocitos T normales; EGF, factor de crecimiento epidérmico; LPS, lipopolisacárido; VEGF, factor de crecimiento endotelial vascular; MMP, metaloproteinasa de matriz; hTERT, telomerasa inversa humana; SLF, factor de acero, VHC, virus de la hepatitis C

La Tabla 2 se toma de Johnston PA y Grandis RG 2011 y correlaciona STAT3 con numerosos tumores, lo que confirma el hecho de que STAT3 es de hecho una diana de interés para terapias antineoplásicas.

Tabla 2

Caracterización de tumores con STAT3 y actividad: El pronóstico desfavorable correlacionó STAT3 con altos niveles de anomalía cadena arriba y cadena abajo de la señal de STAT3 Modelos de xenotrasplante sensible a la inhibición de STAT3

-Leucemia -Linfoma -Mieloma múltiple -Cáncer de mama -Carcinoma de próstata -Cáncer de pulmón -Cáncer de pulmón (no microcítico) -Carcinoma de las células renales -Carcinoma hepatocelular -Colangiocarcinoma -Carcinoma de ovario -Adenocarcinoma pancreático -Melanoma -Carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello: -Carcinoma de las células renales -Cáncer colorrectal -Carcinoma de ovario -Carcinoma gástrico -Tipo intestinal adenocarcinoma gástrico -de células escamosas carcinoma del cuello uterino -Osteosarcoma -Carcinoma epitelial del ovario -Expresión elevada de EGFR -Activado de forma constitutiva EGFR-RTK -Sobreexpresión de SFK -JAK hiperactivada -Niveles elevados de TNF-α/IL-6 -Carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello -Glioblastoma -Neoplasias mieloproliferativas -Carcinoma de las células renales -Cáncer de mama -Adenocarcinoma de pulmón -Leucemia linfoblástica aguda

La Tabla 3, tomada de TurksonJ y JoveR 2000, indica numerosos tumores asociados directamente con la activación anómala de STAT3.

Tabla 3

Tipo de tumor: STAT activados Referencias

Tumores de mama Tumores: STAT 1, 3 (Garcia et al., 2000; Watson y Miller, 1995) (J Bromberg y JE Darnell, resultados no publicados; P Chaturvedi y EP Reddy, resultados no publicados; R Garcia, C Muro-Cacho, S Minton, C Cox, N Ku, R Falcone, T Bowman y R Jove, resultados no publicados)

células: STAT 3 (Garcia et al., 1997; Sartor et al., 1997)

Tumores de cabeza y cuello Líneas celulares y tumores: STAT 1, 3 (Grandis et al., 1998, 2000a)

Melanomas malignos Líneas celulares y tumores: STAT 1, 3 (Florenes et al., 1999; Kirkwood et al., 1999; Pansky et al., 2000)

Tumores de la hipófisis Líneas celulares: STAT 1 (Ray et al., 1998)

Tumores cerebrales (tumores primarios)

Gliomas: STAT 1, 3 (Cattaneo et al., 1998)

Meduloblastomas: STAT 3 (Cattaneo et al., 1998)

Meningiomas cerebrales: STAT 1,3,5 (Magrassi et al., 1999; Schrell et al., 1998)

Mielomas múltiples Líneas celulares y tumores: STAT 1, (Catlett-Falcone et al., 1999b)

Linfomas (líneas celulares y tumores)

Linfoma anaplásico de linfocitos T grandes: STAT 3, 5 (Zhang et al., 1996c)

Tipo de tumor: STAT activados Referencias

Síndrome de Sezary: STAT 3, 5 (Zhang et al., 1996c)

Linfoma relacionado con VEB/de VHS de Burkitt: STAT 3 (Weber-Nordt et al., 1996)

VHS dependiente de Saimiri (linfocitos T): STAT 3 (Lund et al., 1997b, 1999)

Linfoma cutáneo de linfocitos T: STAT 3 (Sun et al., 1998)

Linfoma de linfocitos T LSTRA (ratón): STAT 5 (Yu et al., 1997)

Micosis fungoide: STAT 3 (Nielsen et al., 1997)

Leucemia (tumores y líneas celulares)

Dependientes de HTLV-I: STAT 3, 5 (Migone et al., 1995; Takemoto et al., 1997)

Leucemia linfocítica crónica (LLC): STAT 1, 3 (Frank et al., 1997)

Leucemia mieloide aguda (LMA): STAT 1, 3, 5 (Chai et al., 1997; Gouilleux-Gruart et al., 1996; Weber-Nordt et al., 1996)

Leucemia megacariocítica: STAT 1, 3, 5 (Liu et al., 1999)

Leucemia linfocítica granular grande (LGG): STAT 3 (Epling-Bumette et al., 2000)

OTROS TUMORES (tumores y líneas celulares): L Mora, R Garcia, J Seigne, T Bowman, M Huang, G Niu, J Pow-Sang, J Diaz, C Muro-Cacho, D Coppola, T Yeatman, J Cheng, S Nicosia, S Shivers, T Landowski, D Reintgen, W Dalton, H Yu y R Jove, resultados no publicados

Próstata: STAT 3

Carcinoma de células renales: STAT 3

Carcinoma de ovario: STAT 3

Melanoma: STAT 3

5 En particular, en relación con STAT3, lo siguiente se ha demostrado en numerosas publicaciones:

1) STAT3 está con frecuencia constitutivamente activo (fosforilado) en muchas células cancerosas, tales como mieloma múltiple, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas de 10 cabeza y cuello y otros tipos tumorales.

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Las células MSTO211H se pretrataron con Filipendula vulgaris durante 24 horas. A continuación, se inocularon en ratones CD1 desnudos. El pretratamiento con el extracto de Filipendula vulgaris influyó en el injerto del tumor e indujo una diferencia estadísticamente significativa (p=0,0024) en el volumen del tumor. Figura 16: Ensayo de vitalidad celular con ensayo ATPlite (véase sección experimental para las condiciones) en líneas celulares de mesotelioma MSTO211H tratadas con un extracto de Filipendula vulgaris (Figura 16a) y un extracto de Filipendula ulmaria (ulmaria). El ensayo muestra que la vitalidad celular es inhibida por el extracto de Filipendula vulgaris de la invención, de una manera dependiente de dosis en diversas líneas celulares de mesotelioma. Figura 17: comparación de las dos curvas de vitalidad obtenidas tratando líneas celulares de mesotelioma MSTO211H con extracto de Filipendula vulgaris con respecto a la curva de proliferación obtenida tratando las mismas líneas celulares con extracto de Filipendula ulmaria (ulmaria). Las líneas celulares de mesotelioma maligno (MPM) son afectadas en mayor medida por el efecto antiproliferativo del extracto de Filipendula vulgaris en comparación con el extracto de Filipendula ulmaria, como resulta evidente a partir de la figura. Figura 18: Efecto del extracto de Filipendula vulgaris administrado junto con Pemetrexed in vivo en ratones. Los grupos se esquematizan como se indica en la Tabla 5 del Ejemplo 13. Figura 19: Como se muestra por el ensayo de cometas, el tratamiento con ABO2 no indujo daño de ADN en células mesoteliales normales no transformadas (HMC).

Por el contrario, ABO2 indujo daño de ADN en células MSTO211H.

El tratamiento con CDDP (cis-diaminodicloroplatino) induce fragmentación de ADN en ambas líneas celulares.

El tratamiento con ABO2 protege células normales de fragmentación de ADN inducida por CCDP, mientras que en células MSTO211H muestra un efecto sinérgico con CDDP en la inducción de fragmentación de ADN.

Descripción detallada de la invención

La presente solicitud se refiere por lo tanto a un uso del extracto de Filipendula vulgaris en la prevención y/o en el tratamiento de patologías en las que está presente una activación constitutiva o anómala del factor STAT3. Como se ha indicado anteriormente, la activación anómala o constitutiva parecería consistir en una fosforilación anómala o constitutiva de este factor con efectos inflamatorios y/o tumorigénicos resultantes tanto en la sangre como en tejidos.

En la siguiente descripción, en las reivindicaciones y en los dibujos, el término «STAT3» indica el factor de transducción de la señal y activación de la transcripción de STAT3 (transductor de señal y activador de la transcripción 3). Convencionalmente, cuando se hace referencia al gen, se usan letras mayúsculas en cursiva, mientras que la proteína se indica por letras mayúsculas no en cursiva.

Ya se conoce en la bibliografía que la inflamación y los tumores están estrechamente ligados por rutas oncogénicas y ambientales, y la fosforilación del factor STAT3 (transductor de señal y activador de la transcripción 3) provoca activación del mismo y el desplazamiento al núcleo donde actúa como un activador de la transcripción de numerosas citocinas, quimiocinas y otros mediadores asociados con inflamación, promoviendo de este modo cáncer.

Los inhibidores de la activación de STAT3 son por lo tanto factores que tienen un efecto preventivo y/o curativo para todas las patologías en las que esté presente activación constitutiva del factor STAT3. La presente invención desvela por primera vez la acción inhibidora específica para STAT3 de extractos de Filipendula vulgaris.

Filipendula vulgaris también se conoce como Spiraea vulgaris, Spiraea filipendula o Filipendula hexapetala. Para los fines de la presente invención, excepto cuando se indique de forma específica, la expresión Filipendula vulgaris significa solamente Filipendula vulgaris o un sinónimo de la misma como se ha definido anteriormente y no Filipendula ulmaria (ulmaria).

Filipendula vulgaris es una planta perenne herbácea, de hasta 70 cm de altura, con tallos erguidos, estriados, lisos y poco ramificados, cuyas hojas tienen estípulas que son pinadas-tabicadas o con una crenación rugosa doble, y las flores hermafroditas son de color blanco crema o rosa, generalmente tienen 6 pétalos y se reúnen en extremos apicales en corimbo.

Esta planta se conoce habitualmente por sus propiedades antirreumáticas, depurativas, diuréticas y astringentes.

Para los fines de la implementación de la presente invención, el extracto puede ser un extracto de parte superior de floración de Filipendula vulgaris (inflorescencia foliar), entendiéndose por «parte superior de floración» la parte aérea de la planta recogida a una altura de 10-15 cm desde el suelo, caracterizada por tallo, hojas y flores (inflorescencia foliar, inflorescencia). El tiempo de recolección es de mayo a octubre, dependiendo de los patrones climáticos estacionales. El extracto puede realizarse tanto de la planta nueva como de la seca. En este último caso, el secado se lleva a cabo en un horno ventilado, a una temperatura de aproximadamente 35-45 ºC.

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El extracto según la invención podría ser un extracto fluido, un extracto blando o un extracto liofilizado o secado por medio de técnicas de secado conocidas. El extracto puede obtenerse por medio de extracción con los siguientes disolventes: agua, etanol, metanol, acetona o isopropanol, en cada caso en forma pura o en una mezcla entre sí. El alcohol podría ser metanol, etanol, isopropanol y es preferentemente etanol. El etanol puede usarse en forma pura o en mezcla con agua a los siguientes porcentajes: 96 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 1 %. En una realización no limitante de la invención, el disolvente usado para la extracción podría ser una mezcla formada por alcohol etílico y agua en una proporción de

50:50. El extracto de fluido podría prepararse por medio de extracción hidroalcohólica por percolación/digestión de las partes anteriormente indicadas de Filipendula vulgaris en relación con fármaco/disolvente de 1:2 a 1:100 y preferentemente en una relación de 1:10. La duración de la extracción es una duración habitualmente usada por un experto en la materia y podría ser, por ejemplo, de un mínimo de 4 horas a aproximadamente 8 horas. La temperatura de extracción se controla normalmente y podría ser preferentemente, por ejemplo, una temperatura de aproximadamente 50 °C. La evaporación del alcohol del extracto hidroalcohólico y el posterior secado del concentrado acuoso podría realizarse por medio de liofilización o desecación para proporcionar el extracto liofilizado

o extracto seco.

La preparación de dichos extractos es habitualmente conocida por un experto en la materia y no es necesario describirla en detalle particular en la presente divulgación. Para los fines de implementación de la presente invención, es posible usar cualquier extracto entre los indicados anteriormente, preparado de acuerdo con técnicas convencionales.

En particular, para los fines de la presente invención, el extracto podría ser también una fracción de los extractos como se describe aquí.

En este caso, un procedimiento convencional comprende la evaporación del alcohol presente en el extracto alcohólico a 50 grados alcohólicos, la retirada de las sustancias insolubles en alcohol por medio de centrifugación a 4000 rpm durante 1-5 minutos, la introducción de la solución acuosa (concentrado acuoso), dando como resultado una columna cromatográfica que contiene la resina de adsorción.

El concentrado acuoso anteriormente puede obtenerse a su vez suspendiendo el extracto de Filipendula vulgaris secado o liofilizado en agua a una relación de 1:10 p/p.

El fluido de suministro de la resina debe tener sólidos suspendidos comprendidos de forma indicativa entre 0,2 a 1° Bix, el intervalo de suministro está entre 1 y 4 BV/hora y preferentemente 2 BV/hora. El eluato acuoso correspondiente se recoge y se somete a secado por medio de liofilización o desecación, eluyéndose las sustancias adsorbidas en la resina usando alcohol etílico 96 % o metanol o acetona, preferentemente alcohol etílico 96 %. En este último caso, el eluato de alcohol se somete a desecación o a liofilización después de haber añadido en este último caso agua a una relación 1:1 v/v con eluato de alcohol y evaporado de alcohol etílico.

De acuerdo con la presente invención, el extracto de Filipendula vulgaris como se ha definido anteriormente podría usarse para la prevención y/o el tratamiento de patologías caracterizadas por una activación constitutiva o anómala del factor de transcripción STAT3.

Dichas enfermedades pueden ser, por ejemplo y como se indica en la bibliografía, enfermedades del tipo inflamatorio y/o pretumoral y/o tumoral.

Para los fines de la presente invención, los estados patológicos caracterizados por una activación constitutiva o anómala del factor de transcripción STAT3 pueden estar provocados por infecciones víricas (como se indica en la bibliografía), incluyendo infecciones por H. pylori, infecciones por el virus de la hepatitis B, infecciones por VPH (virus del papiloma humano), infecciones por el virus de Epstein-Barr (como se indica en Yu et al 2009).

Como ya se ha mencionado, el término «STAT3» indica por lo tanto el factor de transcripción humano «transductor de señal y activador de la transcripción 3», codificado en seres humanos por el gen de STAT3.

La invención se refiere a estados patológicos en seres humanos definidos en detalle en la presente descripción (por ejemplo posteriormente) en los que este gen está activado de forma constitutiva o de forma anómala en cualquier caso.

Los estados patológicos pretumorales en los que una activación constitutiva o anómala de STAT3 está presente pueden ser estados patológicos después de la ablación de un tumor, y por lo tanto pretumorales en el sentido de que el tumor podría volver a formarse, o estados patológicos en los que hay una transferencia de inflamación a la adquisición de características malignas por parte de la célula, como se indica en la bibliografía.

De acuerdo con la presente invención, los estados patológicos tumorales pueden ser cualquier tumor caracterizado por una activación constitutiva o anómala de STAT3 indicada en la técnica anterior, tales como:

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1.2. Tratamiento de las líneas celulares de MPM y de células mesoteliales comerciales normales (HMC) con extracto de Filipendula vulgaris.

Las líneas celulares de MPM (MSTO-211H, NCI-H28, NCI-H2052, MPP89) se adquirieron de ATCC (Rockville, MD) mientras que las HMC (células mesoteliales humanas) se adquirieron de Tebu-Bio (Francia). Todas las líneas se cultivaron en monocapas a 37 °C y a 5 % de CO2 en medio de cultivo específico. El extracto de Filipendula vulgaris se disolvió convenientemente en una solución de agua para soluciones inyectables y etanol en una relación de 1:1 a una concentración inicial de 30 mg/ml. Para ensayar la propiedad antitumoral, el producto se añadió después directamente en el medio de las diversas líneas celulares usando diversas concentraciones y diversos tiempos, como se muestra en los dibujos.

1.3. Resultados

Los resultados, mostrados en las Figuras 1 a 3, muestran cómo el extracto ensayado inhibe la fosforilación de STAT3 en comparación con los controles no tratados con el extracto.

Las Figuras 1 y 2 muestran los datos obtenidos en células MSTO211H tratadas con extracto de Filipendula vulgaris de acuerdo con la descripción.

La Figura 1 muestra los datos con el control tratado solamente con el vehículo y extracto de Filipendula vulgaris, 100 µg/ml de medio de cultivo durante 24 horas (control de actina).

2. Ensayo de clonogenicidad en células de mesotelioma pleural maligno (MPM)

Se sembraron células MPM (MSTO211H y MPP-89) a 200 células por pocillo y se trataron con diversas concentraciones crecientes (control solo con vehículo; 12,5 µg/ml; 25 µg/ml; 50 µg/ml; 100 µg/ml; 200 µg/ml) de extracto de Filipendula vulgaris de acuerdo con la presente descripción. Cada punto se sembró por duplicado en placas multipocillo de 6 pocillos. Las colonias formadas se tiñeron con violeta cristal 15-21 días después. El ensayo de formación de colonias, también conocido como ensayo clonogénico, es una técnica usada para evaluar la eficacia de compuestos antitumorales con respecto a la capacidad de las células tumorales para formar colonias a partir de una única célula. Se considera que una colonia es un grupo de 50 o más células (clones) que se originan de una única célula.

Los resultados del experimento, mostrados en las Figuras 2a y 2b, muestran la capacidad dependiente de la dosis del extracto de la invención para inhibir, de una manera dependiente de dosis, la formación de colonias en todas las líneas celulares MPM ensayadas.

El mismo ensayo también se realizó en células de cáncer de mama MDA-MB-231, células de cáncer de próstata DU145 y células de cáncer de colon HCT116. También en este caso, los datos mostrados en las Figuras 3a, b y c muestran la eficacia de la inhibición, de una manera dependiente de dosis, de la formación de colonias del extracto de la invención.

4. Ensayo de vitalidad celular ATPlite™

La vitalidad de diversas líneas celulares después de exposición al extracto de la invención a diversas concentraciones se evaluó usando el ensayo ATPlite™ (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones del productor. Cuando se indica, el término «vehículo» se refiere a una solución de agua para soluciones inyectables y etanol a una concentración de 1:1 usada en los mismos volúmenes usados para los tratamientos.

ATPLite™ es un sistema para supervisar los niveles de adenosín trifosfato (ATP) basándose en la actividad de luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis). Este ensayo de luminiscencia es una alternativa a ensayos colorimétricos, fluorométricos y radioisotópicos para la evaluación cuantitativa de la proliferación de células de mamífero cultivadas sometidas a tratamiento con posibles sustancias contenidas en el medio de cultivo. La supervisión de ATP se usa de hecho para evaluar los efectos citostáticos y antiproliferativos de una amplia serie de fármacos, modificadores de la respuesta biológica y compuestos biológicos. El sistema de ensayo ATPLite™ se basa en la producción de luz provocada por la reacción con adición de ATP luciferasas y D-luciferina. La luz emitida es proporcional a la concentración de ATP dentro de ciertos límites. La cantidad de ATP en células se correlaciona con la vitalidad celular.

La vitalidad celular de diversos tipos de líneas celulares MPM (MSTO211H, MPP89, NCI-H28) y de células HMC (células mesoteliales no transformadas proporcionadas por donantes voluntarios) se ensayó después del tratamiento con diversas concentraciones de extracto según la invención (control solo con vehículo; 12,5 µg/ml; 25 µg/ml; 50 µg/ml; 100 µg/ml; 200 µg/ml).

La gráfica en la Figura 4, que muestra los resultados del ensayo, muestra que el extracto es capaz de reducir significativamente la vitalidad celular de una manera dependiente de dosis.

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Con la aparición de progresión del tumor (es decir cuando el tumor alcanzó 60 mm3), el tratamiento se inició con ABO2 y se administró Pemetrexed de la siguiente manera: pemetrexed a una dosis de 100 mg/Kg en 88 ml/ratón durante 5 días consecutivos por vía intraperitoneal) extracto de Filipendula vulgaris en agua potable a concentraciones de 25, 50 y 75 microgramos/ml y se midió en días alternos durante un periodo de 3 semanas.

Los ratones se supervisaron diariamente para evaluar cualquier señal; el peso corporal se supervisó dos veces a la semana.

Al final del experimento (42 días después de la inoculación), las masas tumorales se recogieron y se fijaron en formalina 10 % (transferida después de 24 horas a etanol 70 %).

Los diámetros tumorales se midieron dos veces por semana usando un calibrador Mitutoyo.

14. Preparación de extracto de Filipendula vulgaris

Inflorescencias foliares de Filipendula vulgaris, previamente cortadas hasta un tamaño de grano correcto, se sometieron a extracción hidroalcohólica con etanol 50 %.

La extracción se realizó a 50 °C durante 8 horas. Al final de la reacción, se retiraron las inflorescencias foliares agotadas de la solución hidroalcohólica obtenida por filtración. La solución se concentró por evaporación en película fina hasta la retirada completa del etanol. La solución acuosa concentrada obtenida de este modo se secó en un liofilizador hasta obtener una pastilla sólida.

Por último, la pastilla liofilizada se pulverizó usando un molino de martillo y se mezcló para obtener un extracto liofilizado en polvo homogéneo.

15.: Líneas celulares y condiciones de cultivo.

Las líneas celulares MSTO-211H, NCI-H28, NCI-H2052 MPP89 se obtuvieron de ATCC (Rockville, MD). Las líneas HMC (células mesoteliales humanas) se obtuvieron de Tebu-Bio (France). Todas las líneas celulares se mantuvieron en una incubadora humidificada a 37 ºC en CO2 5 %. Las células se cultivaron como monocapa en DMEM/F12 + GLUTAMAX (INVITROGEN) complementado con FBS no termoinactivado 10 % (GIBCO), insulina 5 mg/ml (SIGMA), penicilina G sódica 100 UI/ml y sulfato de estreptomicina 100 mg/ml.

16.: Reactivos celulares

Pemetrexed (ALIMTA, Lilly) y cisplatino (Pfizer) se disolvieron de acuerdo con las instrucciones del productor.

17 Ensayo de cometas

Después del tratamiento, las células se tripsinizaron y se sumergieron en agarosa de bajo punto de fusión 1 % (Sigma) en PBS y se propagaron a portaobjetos de microscopio recubiertos de antemano con agarosa 1 % (Bio-Rad). Las células se lisaron en la solución de lisis (NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, base Tris 10 mM, NaOH 8 g/l, Triton X-100 1 %, DMSO 10 %) durante 1 hora a temperatura ambiente y después se procesaron en la solución de ejecución (NaOH 300 mM, EDTA 1 mM, pH 13,0) durante 30 minutos, a 25 V y 250 mA. El ADN se equilibró con Tris 0,4 M, pH 8,0, y los portaobjetos se secaron con metanol. Se tomaron imágenes de yoduro de propidio-ADN (Sigma) y las figuras usando un microscopio Axiovert 200M con aumento 40X y un software de adquisición de imágenes Axiovision (Zeiss). Se registraron al menos 300 células por cada portaobjetos.

18. Análisis de FACS y tinción de PI y análisis de tinción de PI/Anexina V

Para el fin de determinar el efecto del extracto de la invención en el ciclo celular, se realizó un análisis de FACS.

Para tinción con yoduro de propidio (PI), las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 104 células/ml. Tras 24 h de adhesión, las células tumorales se trataron con concentraciones indicadas del extracto de la invención durante diversos intervalos temporales. Las células se recogieron en suspensión y las células adheridas se lavaron en PBS, se fijaron con etanol congelado (70 % v/v) y se almacenaron a -20 °C. Para los análisis, las células se lavaron en PBS y se suspendieron en PBS, PI (25 mg/ml) y RNasa A (200 mg/ml).

Para la doble tinción de PI/anexina V, las células tratadas se recogieron y se resuspendieron en tampón de unión (HEPES pH 7,4, CaCl2 2,5 mM, NaCl 140 mM). Se incubaron alícuotas de células durante 15 min con anexina V FITC y PI (5 mg/ml) (Invitrogen).

Durante todos los análisis de FACS, se analizaron 105 acontecimientos para cada muestra. Los análisis de citometría de flujo se realizaron en un citómetro de flujo GuavaEasyCyte 8HT (Millipore).

19. Análisis estadístico

Se usó ensayo de t de Student para evaluar la significación de datos in vitro, mientras que la significación de datos de supervivencia en ratones se evaluó usando análisis de Kaplan-Meier y ensayos de rangos logarítmicos. Valores p 5 ≤ 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Trasplante de xenoinjerto

Se inyectaron por vía subcutánea suspensiones de 1 x 106 células MSTO211H en PBS 1x/ Matrigel (BD

10 Biosciences) en ratones CD1 macho de 5 semanas (Charles River, Milán). El peso corporal y las señales clínicas de ratones se determinaron cada 3 días. Se calcularon volúmenes tumorales usando la fórmula: V = 1/2 x longitud x anchura 2 (la longitud y la anchura se midieron con un calibrador manual). Cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de 50 mm3, los ratones se trataron por vía intraperitoneal con pemetrexed (100 mg/kg/3 días) o por vía oral con extracto de Filipendula vulgaris (25/50/100 µg/ml/7 d). Todos los ensayos de tumorigenicidad se

15 realizaron siguiendo las directrices del comité de ética interno.

Transferencia de Western

Las células se lisaron en hielo durante 30 min en tampón de lisis NP40 (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, NP

20 40 1 %, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM) complementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa (PMSF 5 mM, NaF 3 mM, DTT 1 mM, NaVO4 1 mM).

Se degradaron cantidades iguales de extractos totales de proteína (30 µg) por medio de electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) en gel de poliacrilamida 8 % y se transfirieron durante 2 horas en membrana de 25 nitrocelulosa pura. Las membranas se bloquearon con leche al 5 %-Tween 20 0,05 % durante 1 hora y se incubaron durante una noche con los anticuerpos primarios específicos. Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: antibeta actina (A-2228, SIGMA), anti-caspasa-3 (31A1067, Alexis); anti-caspasa-7 (n.º 9492, Cell Signaling); anti-PARP (n.º 9542S, Cell Signaling). Los anticuerpos secundarios usados para detección de quimioluminiscencia fueron conjugados con peroxidasa de rábano (Santa Cruz) y se usaron reactivos ECL (Amersham, GE Healthcare,

30 Piscataway, NJ, Estados Unidos) para la quimioluminiscencia.

BIBLIOGRAFÍA

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-Yu.H. et al "STATs in cancer inflammation and immunity: a leading role for STAT3" Nature Reviews Cancer 9, 40 798-809 (noviembre de 2009)

Claims

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