KR20130064162A - 암의 증식, 재발 또는 전이 억제용 의약 조성물 - Google Patents

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KR20130064162A
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문애리
고민수
민창희
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한올바이오파마주식회사
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Abstract

본 발명은 암의 증식, 재발 또는 전이 억제용 의약 조성물에 관한 것으로, 세포사멸(apoptosis)을 통한 암세포의 감소 및 matrix metalloproteinase2(MMP2)의 발현 억제에 기인한 암세포의 침윤성 억제를 통해 보다 효과적으로 암세포의 증식, 재발 또는 전이를 억제할 수 있다.

Description

암의 증식, 재발 또는 전이 억제용 의약 조성물{Pharmaceutical composition for inhibiting cancer growth, recurrent or metastasis}
본 발명은 세포사멸(apoptosis)을 통한 암세포의 감소 및 matrix metalloproteinase2(MMP2)의 발현 억제에 기인한 암세포의 침윤성 억제를 통해 보다 효과적으로 암세포의 증식, 재발 또는 전이를 억제할 수 있는 암의 증식, 재발 또는 전이 억제용 의약 조성물에 관한 것이다.
AMPK(AMP-activated protein kinase)는 세포 내 AMP의 농도가 증가함에 따라 활성화되는 효소로서 세포의 대사과정을 조절하는 중요한 단백질이다. 활성화된 AMPK는 에너지를 만들어내는 해당과정(glycolysis) 및 지방산 산화(fat acid oxidation) 등의 이화작용(catabolism)은 활성화하고, 에너지 소비를 필요로 하는 당생성(gluconeogenesis), 단백질 합성 및 지방산 합성 등의 동화작용(anabolism)은 억제함으로써 세포 내 에너지 균형을 유지하기 때문에 2형 당뇨 또는 비만 등의 대사성질환 치료제의 표적으로 연구되어오고 있다. 그러나 세포 내 에너지 대사의 이상은 대사성질환 이외에, 암의 발생에도 영향을 주는 요인이기 때문에 AMPK를 표적으로 항암제 개발이 진행되고 있다.
종양 억제 단백질들인 LKB1(liver kinase B1) 유전자가 돌연변이 된 세포와 PTEN 또는 TSC1 /2(tuberous sclerosis complex 1/2) 유전자가 돌연변이 된 세포에서는 mTOR(mammalian target of rapamuycin)의 과활성화가 일어나 세포의 성장 및 증식이 촉진되고, 이로 인하여 종양 생성 및 암 발생을 일으킨다. LKB1은 AMPK의 상위 키나아제이며, 활성화된 AMPK는 TSC2및 mTOR 결합 단백질인 Raptor를 인산화 시킴으로써 mTOR를 불활성화 시킨다. 따라서 활성화된 AMPK는 LKB1/AMPK/mTOR 신호 전달체계를 억제함으로써 암세포가 필요로 하는 단백질 합성과 세포 성장 및 증식을 저해한다.
전 세계적으로 유방암은 여성에게 있어 발병률이 2위인 암으로서 계속 증가하는 추세이며 국내의 경우 지난 20년간 유방암으로 인한 사망률이 2.2배나 증가하였으며 특히 젊은 여성환자의 사망률이 급증하고 있다. 유방암 전이는 유방암의 완치를 어렵게 하며 유방암으로 인한 사망의 주된 원인이 되는데, 암세포가 전이하기 위해서는 다른 조직 및 장기로 침투할 수 있는 침윤능이 필수적이며, 이때 세포외 기질을 분해할 수 있는 matrix metalloproteinase(MMP)와 같은 효소의 작용이 수반되어 나타난다.
유방암은 임상적으로나 병리학적으로 매우 복잡한 양상을 보이는 암으로써 유전자 발현 양상에 따라 유방암을 다섯 개의 군으로 분류한다. 에스트로겐 수용체가 양성인 군으로 내강형 A(ER+, PR+, HER2-)와 내강형 B(ER+, PR+, HER2+)가 있으며, 에스트로겐 수용체가 음성인 군으로 HER2/neu 과발현군(ER-, PR-, HER2+), 정상형군(normal like) 그리고 기저형군(ER-, PR-, HER2-)이 있다. 특히, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, HER2/neu가 음성인 삼중복 음성 유방암은 기저형 유방암에 속하며 이 유방암은 호르몬 치료 및 표적 치료를 할 수 없기 때문에 다른 군의 유방암과 비교하여 예후가 좋지 못하고, 조기에 재발되는 경우가 많다.
현재까지 개발된 대부분의 항암제는 암을 일으키는 분자를 표적으로 하는 약물이거나 세포 독성을 표적으로 하는 약물들이었다. 그러나 세포 독성을 표적으로 하는 약물들은 정상세포에도 독성을 일으키기 때문에 이 약물들을 투여받은 암환자에게서 치명적인 부작용을 일으켰으며, 분자를 표적으로 하는 약물들은 그 분자의 발현이 적은 환자나, 돌연변이가 생긴 환자에게는 약효가 없거나 내성이 생기기 때문에 항암제 개발에 있어서 문제시되고 있다.
1. 대한민국 공개특허 제2009-0023245호, 2009.03.04 2. 대한민국 공개특허 제2011-0007984호, 2011.01.25
본 발명의 목적은 암의 증식, 재발 또는 전이를 효과적으로 억제하면서도 부작용을 줄일 수 있는 1,3,5-트리아진-2,4,6-트리아민 화합물의 약제학적 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
하기 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및
약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암의 증식, 재발 또는 전이 억제용 의약 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00001
본 발명의 1,3,5-트리아진-2,4,6-트리아민 화합물은 AMPK 활성화를 통하여 mTOR의 활성을 억제함으로써 항암 효과를 나타내었으며, 세포사멸(apoptosis)이 유도되어 암세포의 증식을 억제할 수 있다.
또한, 기저막의 주요 성분인 콜라겐 타입 4(Type 4 collagen)를 분해하는 MMP2 효소의 발현 및 활성을 억제하고, 암세포의 침윤을 현저히 억제함으로써 암의 전이를 효과적으로 억제할 수 있으며, 특히 호르몬 치료나 표적 치료에 어려움이 있었던 삼중복 음성 유방암에 월등한 효과를 보인다.
또한, 적은 용량의 투여로도 우수한 약리학적 활성을 나타내어 약물 과용에 따른 부작용의 발생 확률을 줄이고, 치료 효과는 현저히 증가시킬 수 있다.
더불어, 예후가 좋지 못한 암이나, 전이가 잘 일어나는 암을 비롯하여 항암제의 내성으로 치료가 불량했던 암에 대한 새로운 항암제로도 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명 1,3,5-트리아진-2,4,6-트리아민 화합물에 의한 유방암 세포의 증식 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명 1,3,5-트리아진-2,4,6-트리아민 화합물에 의한 AMPK(A) 및 mTOR(B) 활성화의 변화를 나타낸 웨스턴 블랏 결과 및 그 발현량에 대한 그래프이다.
도 3은 본 발명 1,3,5-트리아진-2,4,6-트리아민 화합물에 의한 세포사멸이 일어난 세포 분포도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명 1,3,5-트리아진-2,4,6-트리아민 화합물에 의한 pro-MMP2(상단) 및 MMP2 효소(하단)의 발현 및 활성을 나타낸 웨스턴 블랏 및 젤라틴 자이모그램의 결과와 그에 따른 발현 및 활성 그래프이다.
도 5는 본 발명 1,3,5-트리아진-2,4,6-트리아민 화합물에 의한 암세포의 침윤율을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명 1,3,5-트리아진-2,4,6-트리아민 화합물에 의한 종양 억제 효과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은
하기 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및
약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암의 증식, 재발 또는 전이 억제용 의약 조성물에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure pat00002

상기 화학식 1의 화합물의 화합물명은 N2,N2-디메틸-N4-(2-프로필페닐)-1,3,5-트리아진-2,4,6-트리아민이며, 이에 특별히 제한하는 것은 아니나, 하기 반응식 1과 같이 제조할 수 있다.
NR3R4이 페닐알킬기(프로필페닐기 포함)인 경우, 디메틸 시아노카르보노디티오이미데이트(화학식 2의 화합물) 와 NR3R4 유도체를 용매(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸 아세테이트, 테트라히드로퓨란, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드)중에서 반응시켜 시아노카바이미도티오에이트 유도체(화학식 3의 화합물)를 제조한다. 사용되는 NR3R4 양은 화학식 2의 화합물에 대해 약 1 내지 2 몰 당량이며, 반응온도는 일반적으로 실온에서 용매의 환류 온도범위이다.
이어서 화학식 3의 화합물은 구아니딘 유도체(화학식 4의 화합물)와 용매(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸 아세테이트, 테트라히드로퓨란, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 물 및 이들의 혼합용매) 중 염기의 존재 하에 반응시켜 목적하는 화학식 1의 화합물을 제조한다. 상기 염기(예를 들어, 피페리딘, 피리딘, 트리에틸아민, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 포타슘카보네이트 등) 및 구아니딘 유도체는 화학식 3의 화합물의 1몰 당 약 1 내지 2 몰 당량 사용하며 반응온도는 상온에서 용매의 환류 온도범위이다.
[반응식 1]
Figure pat00003

본 발명의 일 구체예에 따르면, 디메틸 시아노카르보노디티오이미데이트와 피페로닐 아민을 메틸알콜에 용해시킨 후 30분 동안 교반한다. 반응이 끝나면 생성된 고체를 여과한 다음 물과 메틸알콜로 세척하여 화학식 3의 화합물을 얻는다. 화학식 3의 화합물을 디메틸설폭사이드와 40% 포타슘카보네이트 수용액에 디메틸 구아니딘설페이트를 녹인 혼합용액에 더한다. 반응용액을 120?에서 5시간 환류시킨 후 냉각시킨다. 에틸아세테이트를 이용하여 생성물을 추출한 후 농축한 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 (메틸렌클로라이드:메틸알콜 = 95:5) 정제하여 화학식 1의 화합물을 얻는다.
상기 화학식 1의 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염은 유기산 또는 무기산을 이용하여 형성된 산 부가염일 수 있으며, 상기 유기산은, 예를 들면 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 부티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신산 모노아미드, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 시트르산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 디클로로아세트산, 아미노옥시 아세트산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 및 메탄술폰산계 염을 포함하며 무기산은 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산, 탄산 및 붕산계 염을 포함한다.　바람직하게는 염산염 또는 아세트산염 형태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 염산염 형태일 수 있다.
상기 언급된 산 부가염은 a) 상기 화학식 1의 화합물 및 산을 직접 혼합하거나, b) 이들 중 한 가지를 용매 또는 함수 용매 중에 용해시키고 혼합시키거나, 또는 c) 화학식 1의 화합물을 용매 또는 수하 용매 중의 산에 위치시키고 이들을 혼합하는 일반적인 염 제조방법으로 제조된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 화학식 1의 화합물을 메틸렌클로라이드와 메탄올 혼합 용매에 녹인 후 2M HCl(수용액, 디에틸에테르, 다이옥세인등의 용액)을 첨가한 뒤 1시간 교반한 뒤 감압 농축하고 건조시켜 화학식 1의 화합물의 염산염을 얻는다.
위와는 별도로 추가적으로 염이 가능한 형태는 가바염, 가바펜틴염, 프레가발린염, 니코틴산염, 아디페이트염, 헤미말론산염, 시스테인염, 아세틸시스테인염, 메티오닌염, 아르기닌염, 라이신염, 오르니틴염, 아스파르트산염 등이 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 암 증식, 재발 및 암 전이 억제 효과를 확인하는 지표로서 유방암 세포를 이용하여 AMPK 활성화 및 mTOR 억제를 통하여 암세포의 증식이 감소되고, 암세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도하여 항암 효과를 나타낸다. 또한, 전이와 관계 깊은 MMP2(matrix metalloproteinase 2) 효소의 발현 및 활성이 감소함은 물론이고, 침윤성이 현저히 감소되며, 최종적으로 유방암세포가 주입된 누드마우스에서 종양 증식이 억제되는 효과를 나타낸다. 아울러, 재발가능성이 높은 유방암 세포주, 예컨대, 삼중복 음성 유방암 세포주로 알려진 인간의 Hs578T, MDA-MB-231 세포주에 대해 항암 효과를 나타내어 암의 재발을 억제하는 효과를 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 의약 조성물이 적용될 수 있는 구체적인 질환으로는 예를 들어, 유방암, 자궁암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 폐암, 피부암, 난소암, 신장암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 갑상선암 또는 간암 등과 같은 각종 암을 들 수 있으며, 바람직하게는 자궁암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 폐암, 피부암, 혈액암 및 간암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 보다 바람직하게는 유방암 또는 대장암 일 수 있다.
특히, 유방암의 경우, 임상적으로나 병리학적으로 매우 복잡한 양상을 보이는데, 이중 스테로이드성 수용기나, 유방암에서 과발현되는 것으로 알려진 Her2 단백질이 발현되지 않는 암세포를 삼중복 음성 유방암이라고 하며, 이 유방암은 다른 유방암에 비해 더욱 치명적이고, 예후도 좋지 않으며, 재발가능성이 크고, 암 초기에도 다른 장기로의 전이가 활발히 일어난다.
세포 내 대사 조절에 관여하는 효소인 AMPK는 암세포의 대사과정에도 관여하며 활성화된 AMPK는 mTORC1, p53, 지방산합성효소 등을 인산화시켜, 세포주기(cell cycle), 세포극성(cell polarity), 자가소화작용(autophagy), 세포사멸(apoptosis) 등을 조절하여 항암 활성을 나타낸다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유방암 세포에 처리하면 AMPK를 활성화하여 TSC2를 인산화 시킴으로써 mTOR의 활성화를 억제하고 따라서 암 세포의 성장 및 증식을 억제한다. 이는 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 의해 활성화된 AMPK가 AMPK/mTOR 신호 전달체계를 억제함으로써 암세포가 필요로 하는 단백질 합성 및 세포 성장이 억제되기 때문이다.
활성화된 AMPK는 mTORC1의 활성을 낮추고 이렇게 활성이 감소된 mTORC1은 암세포의 자가소화작용(autophage)을 유도하여 종양 억제 효과를 나타낸다. 또한 활성화된 AMPK는 cyclin-dependent kinase inhibitor, p21cip1 또는 cyclinD를 조절하여 세포주기를 제어함으로써 세포 증식을 억제하거나, 세포사멸을 일으킨다. 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 암세포의 세포사멸을 유도하여 암세포의 증식을 억제한다.
아울러, 재발가능성이 큰 삼중복 음성 유방암 세포주로 알려진 인간의 Hs578T, MDA-MB-231 세포주 등에서 암세포의 세포사멸을 유도하여 암세포의 증식을 억제하므로 암의 재발을 억제하는 특징이 있다.
또한, 상피세포는 기저막에 의해 조직의 기질과 격리되어 있고, 암세포가 전이하기 위해서는 주변의 기질로 침입하여 혈관을 통하여 이동하여야 한다. 따라서 암세포의 전이가 일어나기 위해서는 먼저 기저막을 파괴하여야 한다. 기저막은 주로 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin), 헤파란 황산(heparan sulphate), 프로테오글리칸(proteoglycan) 및 콜라겐 타입4(type IV collagen) 등으로 구성되는데, 전이를 위한 기저막의 파괴를 위해서는 기저막의 주성분을 이루는 콜라겐 타입4(type IV collagen)의 분해가 필수적이다. Matrix metaloproteinase (MMP)에 속하는 효소는 단백분해효소로서 여러 가지 기질특이성이 있으며, 관절염, 종양의 침윤 등 여러 질환에 관여되어 있다. 이 MMP 효소군 중 MMP2 와 MMP9는 기저막의 콜라겐 타입4(type IV collagen)의 분해를 일으키는 주요한 효소이며, 이런 MMP2 및 MMP9의 발현 및 활성의 억제를 통하여 암세포의 전이를 억제할 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 MMP2의 발현을 감소시키며, MMP2의 활성을 감소시킨다. 따라서, 암의 전이 과정에서 필수적인 기저막의 파괴를 억제함으로써 암세포가 기질로 전이되는 것을 효과적으로 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 암 증식 및 종양의 성장을 억제하는 동시에 암의 전이를 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 외에 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 약제학적 조성물을 제형화 할 경우에 유용하고, 사용 조건하에 비독성 및 비민감성인 약제학적 첨가제를 의미하며, 이러한 담체의 구체적인 함량비는 활성 성분의 용해도와 화학적 특성, 선택된 투여 경로뿐만 아니라, 표준 약제학적 관행에 의해 결정될 수 있다.
상기 약제학적으로 허용 가능한 담체로서 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 방향제 등과 같은 약제학적 첨가제들을 사용하여 원하는 투여 방법에 적합한 형태로 제제화될 수 있다. 또한 투여 단위당 필요한 담체의 양은 피험자의 순응도가 높아질 수 있는 크기 및 투여 형태 제공에 충분한 양이 될 수 있다.
제제화는 경구제 또는 비경구제의 형태로 이루어질 수 있으며, 예를 들어, 펠렛, 정제, 미립자, 액체 또는 분말을 함유한 캡슐제, 환제, 과립제, 산제, 트로키제(Troches)(액체 충전된 것 포함), 츄제(chewable tablet), 멀티- 및 나노-미립제, 겔제, 고용제(solid solution), 리포솜, 필름제(점막-점착성 포함), 난형제(ovule), 분무제(spray), 액제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
액제는 예를 들어 현탁액제, 용액제, 시럽제 및 엘릭서(elixir)제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
경구 제형 중 일반적인 정제의 형태로 제제화 할 경우, 활성 성분 이외에 붕해제를 더 포함할 수 있다. 붕해제로는 예를 들어, 전분글리콘산나트륨, 옥수수 전분, 감자 전분 또는 전젤라틴화 전분 등의 전분 또는 변성전분과, 벤토나이트, 몬모릴로나이트, 비검(veegum) 등의 클레이와, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스류와, 알긴산 등의 알긴류와, 크로스카멜로스(croscarmellose) 나트륨 등의 가교 셀룰로오스류와, 크로스포비돈(crospovidone) 등의 가교 중합체와, 중탄산 나트륨, 시트르산 등의 비등성 제제 등을 혼합 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 붕해제는 바람직하게는 투여 형태의 약 0.5 중량% 내지 약 30 중량%, 더욱 바람직하게는 투여 형태의 약 1 중량% 내지 약 20 중량%로 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한 정제는 점착성 부여를 위해 결합제를 더 포함할 수 있다. 결합제로는 예를 들어, 젤라틴, 당(sugar), 당알코올, 천연 및 합성 검류(gum), 폴리비닐피롤리돈(포비돈), 폴리비닐알코올, 코포비돈, 전분류, 히드록시프로필 셀룰로오스 및 히프로멜로오스 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 결합제는 바람직하게는 투여 형태의 약 0.1 중량% 내지 약 40 중량%, 더욱 바람직하게는 투여 형태의 약 0.5중량% 내지 약 25 중량%를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 정제는 희석제를 더 포함할 수 있다. 희석제로는 예를 들어, 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포도당, 만니톨, 알기네이트, 알칼리토류금속염, 폴리에틸렌글리콜 및 디칼슘포스페이트 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 희석제는 바람직하게는 투여 형태의 약 0.5 중량% 내지 약 90 중량%, 더욱 바람직하게는 투여 형태의 약 1 중량% 내지 약 75 중량%를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 정제는 활택제를 더 포함할 수 있다. 활택제로는 예를 들어, 탈크, 스테아르산, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 아연, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 수소화 식물성 오일, 폴리에칠렌글리콜 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 활택제는 바람직하게는 투여 형태의 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.2 중량% 내지 약 10 중량%를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
그 밖에도 정제는 예를 들어, 라우릴황산나트륨, 폴리솔베이트 80과 같은 계면활성제 및 콜로이드성이산화규소, 함수이산화규소, 활석과 같은 유동화제(glidant)를 선택적으로 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 계면활성제는 투여 형태의 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%를 포함할 수 있으며, 상기 유동화제는 투여 형태의 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한 포함 가능한 성분으로는 산화방지제, 착색제, 향미제, 보존제 및 맛-차단제 등이 있다.
상기 정제는 상술한 바와 같이 정제에 포함되는 성분들을 직접적으로 압착하거나 롤러로 압착하여 형성할 수 있다. 또는 상술한 바와 같은 정제에 포함되는 성분들을 정제화 이전에 습식-, 건식-, 용융-과립화(melt-granulated)하거나 용융 응고(melt-congealed), 또는 압출할 수 있다. 최종 제제의 형태는 하나 이상의 층을 포함할 수 있고, 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있으며 또는 캡슐화될 수도 있다.
또한 약물 방출의 시기에 따라, 즉시(immediate) 방출형 및/또는 변형(modified) 방출형으로 제제화될 수 있으며, 상기 변형 방출형 제제는 지연(delayed)-, 지속(sustained)-, 맥동형(pulsed)-, 제어(controlled)-, 표적(targeted) 및 프로그램(programmed) 방출형을 포함한다.
변형 방출형 정제로 제제화하기 위한 매트릭스 기제로는 특별히 제한되지 않으나 장용 중합체, 소수성 물질 및 친수성 고분자 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 성분을 사용할 수 있다.
장용 중합체로는 예를 들어, 폴리비닐아세테이트프탈레이트, 폴리(메타크릴산, 메틸 메타크릴레이트)공중합체 및 폴리(메타크릴산, 에틸 아크릴레이트)공중합체와 같은 폴리메타크릴레이트 공중합체, 히프로멜로오스프탈레이트, 히프로멜로오스아세테이트숙신네이트, 쉘락, 셀룰로오스아세테이트프탈레이트, 셀룰로오스프로피오네이트프탈레이트등이 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
소수성 물질로는 약제학적으로 허용 가능한 것으로서 예를 들어, 폴리아크릴레이트, 암모니오 메타크릴레이트 공중합체, 폴리비닐 아세테이트, 에틸셀룰로오스 및 셀룰로오스아세테이트, 지방산 및 지방산 에스테르류, 지방산 알코올류 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
보다 상세하게는 폴리아크릴레이트는 폴리(에틸 아크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트) 공중합체, 암모니오 메타크릴레이트 공중합체로는 폴리(에틸아크릴레이트, 메틸메타크릴레이트, 트리메틸암모니오에틸 메타크릴레이트) 공중합체 등을 사용할 수 있다.
지방산 및 지방산 에스테르류로서 글리세릴 팔미토스테아레이트, 글리세릴 스테아레이트, 글리세릴 비헤네이트, 세틸 팔미테이트, 글리세릴 모노 올레이트 및 스테아르산 등을 사용할 수 있으며, 지방산 알코올류로는 세토스테아릴 알코올, 세틸알코올 및 스테아릴알코올 등을 사용할 수 있다.
친수성 고분자로는 예를 들어, 당류, 셀룰로오스 유도체, 검류, 단백질류, 폴리비닐 유도체, 폴리에틸렌 유도체 및 카르복시비닐중합체 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
보다 상세하게는 당류로서 덱스트린, 폴리덱스트린, 덱스트란, 펙틴 및 펙틴 유도체, 알긴산염, 폴리갈락투론산, 자일란, 아라비노자일란, 아라비노갈락탄, 전분, 히드록시프로필스타치, 아밀로오스, 아밀로펙틴 등을 사용할 수 있고, 셀룰로오스 유도체로서 히프로멜로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 히드록시에틸메틸셀룰로오스 등을 사용할 수 있다. 검류로는 구아검, 로커스트 콩 검, 트라가칸타, 카라기난, 아카시아검, 아라비아검, 젤란검, 잔탄검 등을 사용할 수 있고, 단백질류로는 젤라틴, 카제인, 및 제인 등을 선택 사용할 수 있고, 폴리비닐 유도체로서 폴리비닐알코올, 폴리비닐 피롤리돈등을 사용할 수 있다. 폴리에틸렌 유도체로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 옥사이드 등을 사용할 수 있으며, 카르복시비닐중합체로는 카보머 등을 사용할 수 있다.
이 밖에도 본 발명의 의약 조성물의 제형 및 약제학적으로 허용 가능한 담체는 특별히 제한되지 않으며, 당업계의 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 예를 들어, 경구, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 안구내 또는 피내 경로를 통해 대상체에 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명에 있어서, '대상체'는 특정 질병, 장애 또는 질환에 걸린 포유동물과 같은 온혈 동물을 의미하며, 예를 들어, 인간, 오랑우탄, 침팬지, 마우스, 랫트, 개, 소, 닭, 돼지, 염소, 양 등을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한 '치료'는 증상을 경감시키거나, 증상의 원인을 일시적 또는 영구적으로 제거하거나 증상의 출현 및 상기한 질병, 장애 또는 질환의 진행을 예방 또는 둔화시키는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 치료를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 예컨대, 성인의 경우, 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 1일 1회 내지 수회 투여시, 총 10 내지 3000 mg의 용량으로 투여할 수 있다. 보다 구체적으로는 20 내지 1000 mg의 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 단독으로 또는 항암제와 병용 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과 항암제를 함께 포함하는 단일 단위 투여 형태뿐만 아니라, 각각 하나씩의 활성성분을 포함하는 두 개의 단위 투여 형태를 포함할 수 있다. 즉, 이들 두 개의 단위 투여 형태가 동시 또는 일정 시간 이하의 간격을 두고 투여되어 이들 단위 투여 형태 각각에 포함된 두 가지 활성성분이 체내에서 함께 존재함으로써 상승 작용을 일으켜서 예를 들어, 증상의 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장 기타 다른 이로운 치료 결과 등의 다양한 측면에서 치료 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.
상기 항암제는 공지의 항암제라면 어떠한 것이든 가능하다. 예를 들어, 알킬화제, 대사길항제, 천연제제, 호르몬 및 길항제 등의 공지의 화학요법제 및 면역요법제, 유전자치료제 등의 생물학적 제제 등이 포함된다.
예컨대, 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 로무스틴 및 카르무스틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 약물일 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> N2,N2-디메틸-N4-(2-프로필페닐)-1,3,5-트리아진-2,4,6-트리아민의 약학적 활성 조사
N2,N2-디메틸-N4-(2-프로필페닐)-1,3,5-트리아진-2,4,6-트리아민은 특허출원 제2008-84723호에 공지된 방법으로 염산염 형태(화학식 5: 이하 HL010183 라 함)로 제조하고, 유방암 세포주에서 이의 항암 효과와 암 전이 억제 효과를 조사하였다:
[화학식 5]
Figure pat00004

< 실험예 1> 유방암 세포의 증식 억제 효과
HL010183을 인간의 유방암 세포에 처리하여 암세포 증식 억제 효능을 측정하였다. 이를 위해, 삼중복 음성 유방암 세포주로 알려져 있는(Cancer Cell. 2006. 10(6). 515-527) 인간의 Hs578T 세포(한국세포주 은행에서 구입)를 사용하여, MTT(3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-ditetrazoliumbromide) 분석법으로, 세포의 생존율(%)을 측정하여 HL010183의 암세포 증식 억제 효과를 확인하였다.
Hs578T 세포를 10 % (v/v) 송아지 혈청이 포함된 DMEM 배지 (Lonza, Basel, Switzerland)에서 세포수가 약 5×103 개가 되도록 96-웰 플레이트에 넣어 37 ℃, 5%의 CO2에서 24 시간 배양하였다. 이 후 세포생존율을 보기 위해서 HL010183을 혈청이 배제된 DMEM 배지 (Lonza, Basel, Switzerland)에서 각각 0, 0.1, 0.2, 0.3 mM으로 상기 세포가 배양된 웰 플레이트에 교체하여 24시간 동안 처리하였다. 또한, 각각의 처리 농도에서 구해진 세포생존율(%)을 이용하여 GIC50을 구하였다. 대조군으로 메트포르민 염산염(Metformin HCl) 을 0, 10, 20, 30 mM로 처리한 후 위와 동일한 방법으로 세포 생존율(%) 및 GIC50을 구하였다.
HL010183 처리 후 살아있는 세포를 확인하기 위하여 각각의 웰에 5 ㎎/mL의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide, Sigma, MO, USA) 용액 20 ㎕를 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 항온기에서 4시간 동안 반응시켰고, 배지를 제거한 후, 100 ㎕ DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma, MO, USA)를 첨가하여 골고루 혼합하였다. ELISA 플레이트 판독기(EL800, Bio-TEK Instruments, USA)로 570 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
HL010183을 처리하지 않은 웰 플레이트에서 측정한 흡광도 값을 세포 생존율(%) 100%로 하여 HL010183을 농도별로 처리했을 때의 세포 생존율(%)을 구하여 그 결과를 표 1 및 도1에 각각 나타내었다. 또한, 세포 생존율 곡선을 이용하여 성장이 50%로 억제되는 농도(GIC50) 값을 계산하여 암세포 증식 억제 효과를 확인하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 또한 메트포르민 염산염에 대한 세포생존율(%) 및 GIC50값을 구하고 그 결과를 표 1, 표 2 및 도 1에 각각 나타내었다.
Figure pat00005
Figure pat00006
표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이, Hs578T세포에서 HL010183을 0.2 mM 처리했을 때의 세포 생존율은 메트포르민 염산염을 10 mM로 처리했을 때와 비슷한 76.6%의 세포 생존율을 보여 HL010183이 메트포르민 염산염 보다 50배 이상 낮은 농도에서도 유방암 세포의 생존을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.
또한, 표 2에 나타난 바와 같이, HL010183이 0.28 mM 사용하는 경우 Hs578T 세포의 생장을 50% 억제할 수 있었던 반면, 메트포르민 염산염은 동일 세포에서 26.8 mM을 처리하여야 세포의 생장을 50% 정도 억제할 수 있음을 알 수 있다. 이로부터 HL010183이 항암 효과가 있는 바이구아나이드 계열 약물인 메트포르민 염산염보다 적은 양을 사용하여도 유방암에서 유래한 암세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실험예 2> AMPK 활성화 및 mTOR 억제를 통한 항암 신호 분자 변화 확인
HL010183에 의한 항암 작용의 신호 분자인 AMPK 및 AMPK의 하위 신호 단백질인 mTOR의 인산화 여부를 확인하고자 웨스턴 블랏 실험을 수행하였고, 간략한 실험 방법은 아래와 같다.
Hs578T 세포를 (한국세포주 은행에서 구입) 10 % (v/v) 송아지 혈청이 포함된 DMEM 배지 (Lonza, Basel, Switzerland)에서 세포수가 약 2×105 개가 되도록 6-웰 플레이트에 넣어 37 ℃, 5%의 CO2에서 24 시간 배양하였다. 이후 HL010183을 혈청이 배제된 DMEM 배지 (Lonza, Basel, Switzerland)에서 0, 0.05, 0.1 및 0.2 mM의 농도로 상기 세포가 배양된 웰 플레이트에 교체하여 24시간 동안 처리하였다.
대조군으로 메트포르민 염산염을 0, 5, 10 및 20 mM의 농도로 처리한 후 동일한 방법으로 실험하여 비교하였다. 배지를 제거한 세포에 0.15 mL의 용해 버퍼(50 mM Tris.Cl pH 6.8, 2% SDS, 1 mM EDTA, 100 mM DTT, 프로테아제 억제제)를 넣어 세포를 용해시켰고, Bradford 방법을 이용하여 단백질을 정량하였다.　 동량의 단백질을 5분 동안 95℃ 이상으로 가열한 후 5분 동안 얼음에 넣어 냉각시켰고, 10% SDS-PAGE 겔에 90 V로 전기영동 하였다. 이후, 분리된 단백질을 PVDF 막으로 옮겨서 5% 탈지유로 블로킹하였다.　항-인산화된(phosphorylated) AMPK, 항-인산화된 mTOR, 항-AMPK 항체(Cell signaling, Danvers, MA, USA) 및 항-액틴(Santa cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 항체를 부착시켜 4℃에서 17시간 반응시킨 후, PBST로 세척하였다.　 2차 항체를 결합시킨 후, ECL(enhanced chemiluminescence) 검출 시스템(Armersham-Pharmacia Buckinghamshire, UK)을 이용하여 1분 동안 반응시켰고, X-선 필름에 노출시켜 단백질의 발현 정도를 도 2에 나타내었으며, 도 2A는 AMPK의 인산화 정도를 통하여 AMPK의 활성화를 확인할 수 있으며, 도 2B는 mTOR의 인산화를 통하여 mTOR의 활성이 억제됨을 확인할 수 있다.
도 2에 나타난 바와 같이, HL010183을 처리한 결과 농도 의존적으로 AMPK 활성화 및 mTOR 억제 효과를 나타내었으며, 이는 AMPK 활성화를 통하여 TSC2가 활성화 되고, mTOR의 인산화가 억제됨으로써 그 활성이 감소되어 단백질 합성을 저해하는 기전으로 항암 효과를 나타내는 것임을 확인할 수 있었다.
또한 대조군으로 사용한 메트포르민 염산염과 비교하였을 때 100 배 낮은 농도에서도 AMPK 활성 및 mTOR 억제 효과를 보임으로써 HL010183이 적은 농도에서 월등히 좋은 항암 효과를 보일 것으로 예상된다.
< 실험예 3> 세포사멸을 통한 항암 효과 확인
암세포의 세포 생존율 감소 효과에 있어서 HL010183이 세포사멸에 의한 것인지를 확인하기 위하여 삼중복 음성 유방암 세포주로 알려져 있는(Cancer Cell. 2006. 10(6). 515-527) 인간의 MDA-MB-231 세포에 처리한 후 유세포(FACS) 분석을 통하여 세포의 분포도를 확인하였다.
이를 위해, MDA-MB-231 세포(한국세포주 은행 구입)를 10 % (v/v) 송아지 혈청이 포함된 DMEM 배지 (Lonza, Basel, Switzerland)를 사용하여 6-웰 플레이트에 2×105 cells/웰이 되도록 세포를 분주하여 CO2 항온기에서 37℃에서 배양하였다. 24시간 뒤에 0.1 mM의 HL010183을 혈청이 배제된 DMEM 배지 (Lonza, Basel, Switzerland)에 넣어 상기 세포가 배양된 웰 플레이트에 교체하여 24시간 동안 처리하였다. 대조군으로 메트포르민 염산염 10 mM을 동일한 방법으로 처리하여 실험하였다. 트립신/EDTA를 처리하여 세포를 수확한 후, 차가운 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하였고, 1×아넥신 V 결합 버퍼(BD bioscience, San Jose, CA, USA)에 세포를 재부유 시켰다.　 100 ㎕의 부유액 (1×105 cells)에 5 ㎕의 아넥신 V-FITC와 5 ㎕의 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide) (BD bioscience, San Jose, CA, USA)를 첨가하였다.　 세포를 잘 혼합하여 어두운 실온에서 15분 동안 방치한 후, 1×아넥신 V 결합 버퍼(BD bioscience, San Jose, CA, USA) 400 ㎕를 첨가하여, 한 시간 이내에 유세포 분석기(Beckman Coulter, High Wycombe, UK)를 이용하여 실험을 수행하였다.
유세포 분석 결과는 표 3에, 세포의 분포도에 대한 그림은 도 3에 나타내었다.
Figure pat00007
표 3에 나타난 바와 같이, HL010183은 0.1 mM의 농도에서 17.0%의 세포 사멸을 유도하는 것을 확인하였으며, 이를 통하여 HL010183이 세포사멸을 유도함으로써 유방암 세포의 증식을 억제하는 것을 알 수 있었다. 10 mM의 메트포르민 염산염을 처리했을 때 세포사멸을 6.4 % 에서 15.3 %로 증가시켰으며, HL010183은 이보다 100 배 낮은 농도에서 세포사멸을 9.7 % 에서 17.0% 로 증가시킴을 확인하였다. 따라서 HL010183은 낮은 농도에서 세포사멸을 통하여 우수한 항암 효과를 나타내는 것임을 알 수 있다.
< 실험예 4> MMP2 ( matrix metalloprotease 2)의 발현 및 활성 효과 확인
MMP2(matrix metalloprotease 2)는 세포의 기질을 분해하는 효소로서 특히, MMP2는 암세포의 침윤성 획득에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 따라서 암세포의 전이 억제 효과에 있어서 HL010183이 MMP2의 발현 및 그 활성에 미치는 영향을 확인하고자 웨스턴 블랏 및 젤라틴 자이모그램(gelatin zymogram)을 이용하여 실험하였다.
이를 위해, 인간의 유방암 세포주인 Hs578T 세포(한국세포주 은행 구입)를 10 % (v/v) 송아지 혈청이 포함된 DMEM 배지 (Lonza, Basel, Switzerland)를 사용하여 6-웰 플레이트에 2×105 cells/웰이 되도록 세포를 분주하여 CO2 항온기에서 37℃에서 배양하였다. 24시간 뒤에 0, 0.05, 0.1, 0.2 mM 의 HL010183을 혈청이 배제된 DMEM 배지 (Lonza, Basel, Switzerland)에 넣어 상기 세포가 배양된 웰 플레이트에 교체하여 24시간 동안 처리하였다. 대조군으로 메트포르민 염산염을 0, 5, 10, 20 mM로 처리하여 동일한 실험 방법으로 실험하였다. 상층액을 취해 12,000rpm으로 5분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상층액만 취하여 BCA 시약(Pierce, Rockford, IL, USA)을 이용하여 단백질을 정량하였다. 자이모그램은 동량의 단백질에 4×램나이(laemmmli) 샘플 버퍼(100 mM Tris-HCl, pH 6.8, 8%(w/v) SDS, 30% 글리세롤(w/v), 8%(v/v) β-메르캅토에탄올, 0.04%(w/v) 브로모페놀 블루)를 넣고 15분간 실온에서 반응시킨 후, 1 ㎎/mL의 젤라틴을 함유한 10% SDS-PAGE 겔에 90V로 약 1시간 30분 정도 전기영동하였다. 겔을 꺼내어 2.5% Triton X-100으로 30분간 3회 세척하고, 다시 5mM Tris-HCl로 15분간 세척한 후, 상기 버퍼로 37?에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날 0.5% 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250으로 염색하고, 10% 아세트산으로 탈색하였다. 이 때 전체적인 바탕은 푸른색을 나타내며, 흰색 부분은 젤라티나제(gelatinase)로 작용한 MMP 효소를 나타낸다. 웨스턴 블랏은 항-MMP2 항체(R&D system, USA)을 이용하여 실험예 2의 실험방법과 동일하게 수행하였다. MMP2의 발현 및 활성 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, HL010183의 처리 농도 의존적으로 MMP2의 발현이 감소되었다. 또한 대조군으로 사용한 메트포르민 염산염과 비교하였을 때, HL010183이 100배 낮은 농도, 특히 0.1 mM의 HL010183과 10 mM의 메트포르민 염산염을 비교한 경우 HL010183에 의해 pro-MMP2의 발현 정도가 확연히 감소되었다. 젤라틴 자이모그램을 이용한 MMP2의 활성을 비교한 경우도 100배 낮은 농도, 특히 0.2mM의 HL010183과 20 mM의 메트포르민 염산염을 비교하였을 때, 비슷한 정도의 MMP2 활성을 억제하는 효과를 보였다.
따라서 HL010183은 MMP2의 발현 및 그 활성을 억제함으로써 암세포의 전이를 효과적으로 저해하며, 메트포르민 염산염 보다 낮은 농도에서 월등히 우수한 효과를 보일 것으로 예상된다.
< 실험예 5> 암세포 침윤성 억제 효과 확인
HL010183을 암세포에 처리하여 암세포의 전이와 관련되어 있는 암세포 침윤의 억제 효능을 트렌스웰을 이용하여 측정하였다 (Kim et al , Cancer Res 63, 5454-5461, 2003).
이를 위해, 인간의 유방암에서 유래한 Hs587T 세포주 (한국세포주 은행에서 구입)를 10 % (v/v) 송아지 혈청이 포함된 DMEM 배지 (Lonza, Basel, Switzerland)로 배양하여 침윤성 억제 효과 확인을 위하여 사용하였다. 세포의 침윤성은 6.5 ㎜ 직경에 세공의 크기가 8.0 ㎛인 폴리카보네이트 필터(Corning Costar, Cambridge, MA)가 있는 24-웰 트렌스웰를 이용하여 측정하였다. 필터의 안쪽 부분을 0.5 ㎎/mL 농도의 타입 I 콜라겐 (BD Bioscience, MA, USA)으로 덮고 건조시킨 후, 바깥 부분은 0.5 ㎎/mL 농도의 재구성된 기저막 물질(Matrigel; Collabrative Reserch, Lexington, KY)로 코팅하였고, 세포를 넣기 전에 공기 중에 건조시켰다. 0.1 ㎎/㎖ 농도의 BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA) 가 함유된 600 ㎕의 혈청이 배제된 DMEM 배지(Lonza, Basel, Switzerland) 를 웰의 아랫부분에 넣고, 5×104 세포가 분산된 100 ㎕의 혈청이 배제된 DMEM 배지(Lonza, Basel, Switzerland)를 트렌스웰의 윗부분에 넣었다. HL010183은 바깥쪽 및 안쪽 트렌스웰 모두에 각각 0, 0.2, 0.5 mM 농도로 처리하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 17시간 동안 배양시켰다. 대조군으로 메트포르민 염산염을 0, 5, 10 mM 농도로 처리하여 동일한 방법으로 실험하였다. 배양 후 세포를 메탄올로 고정시킨 후, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 세포막을 염색하고, 에오신(eosin)으로 세포핵을 염색하였으며, 필터 아랫부분으로 이동한 세포수를 400 배율의 현미경으로 측정하였다. 각각의 분석을 위해 13개의 필드(field)를 사용하였으며, 각각의 샘플에 대해 실험을 3회 반복 수행하여 침윤성 억제 효과를 확인하였고, 그 결과를 하기 표 4와 도 5에 나타내었다.
Figure pat00008
표 4에 나타난 바와 같이, Hs578T세포에 HL010183을 0.2 mM로 처리하였을 때 36.6%의 암세포 침윤성 억제 효과가 나타났으며, 0.5 mM로 처리한 경우는 전혀 암세포의 침윤을 일으키지 않았다. 이는 메트포르민 염산염을 10 mM로 처리하였을 때 유의한 침윤성 억제 효과를 나타내지 않는 것과 비교하여 월등히 우수한 암세포 침윤 억제 효과를 나타낸다. 따라서 HL010183은 메트포르민 염산염보다 암세포 특히, 유방암 세포의 침윤성을 억제하는 효과를 보이며, 암세포 전이 억제에 탁월한 효과를 가짐을 알 수 있다.
< 실험예 6> 종양 성장 억제 효과 확인
유방암세포를 누드 마우스에 주입하여 만들어진 항암 동물 모델을 이용하여 HL010183에 의한 종양의 성장 억제 효과를 알아보았다.
이를 위해, 인간의 유방암에서 유래한 MDA-MB-231(한국세포주 은행 구입) 세포주를 5×106 cell/0.1mL 로 만들어 Balb/c 유래의 흉선이 없는 누드(nude) 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하로 주입하였다. 주입된 세포주에 의해서 종양이 130 mm3까지 성장하면, 모든 군의 종양의 크기가 일정하도록 군당 6마리씩 군 분리하였고, 시험물질을 35일 동안 1일 1회 경구투여 하였다. 시험물질로는, 부형제(1군)로서 5% DMSO와 20% PEG400을 사용하였고, HL010183 25 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg(각각 2군, 3군, 4군)과 메트포르민 염산염 500 mg/kg(5군)을 투여하여 종양 억제 능력을 비교 평가하였다. 투여기간 동안 2-3일에 한번씩 캘리퍼(caliper)를 이용하여 종양의 크기를 하기 수학식으로 측정하였다.
종양 크기(Tumor volume) = (너비2×길이)/2
기간별로 측정한 실제 종양크기 및 이에 따른 각 군간의 종양 성장 억제율(%)(Tumor growth inhibition, TGI(%))은 부형제군과 비교하여 표 5 및 도 6에 나타내었다.
Figure pat00009
표 5에 나타난 바와 같이, 투여종료 후 실제 종양 크기는 부형제가 투여된 1군이 2005.7±246.7 mm3 이였고, HL010183이 투여된 2군(25 mg/kg)이 1881.2±271.7 mm3 , 3군(50 mg/kg)이 1656.5±161.0 mm3 그리고, 4군이(100 mg/kg)이 1445.4±106.1 mm3이었으며, 메트포르민 염산염이 투여된 5군(500 mg/kg)은 1444.1±313.2 mm3으로 종양 억제 능력을 보였다. 이를 종양 성장 억제율(TGI)로 나타내면 HL010183 25 mg/kg을 투여한 군(2군)은 6.2%, 50 mg/kg을 투여한 군(3군)은 17.4%, 100 mg/kg을 투여한 군(4군)은 27.9%로 종양의 크기가 감소되었다. 또한 대조군인 메트포르민 염산염 500 mg/kg를 투여한 군(5군)은 28.0%로 종양의 크기가 감소되어, 이는 HL010183을 100 mg/kg로 투여한 결과와 비슷한 효과를 보였다. 따라서 HL010183이 메트포르민 염산염 보다 낮은 용량으로도 종양의 성장을 효과적으로 억제함을 확인하였으며, 따라서 암의 치료, 특히 유방암 치료에 우수한 효과를 보일 것으로 예측된다.
< 제조실시예 1> HL010183 함유 정제의 제조
HL010183 100g과 미세결정성 셀룰로오스 830g을 각각 24호 체로 체과한 후 더블콘 혼합기(Doubel cone mixer, Erweka, Germany)에서 30분간 혼합하였다. 이와 별도로 히드록시프로필 셀룰로오스 30g, 크로스카멜로오스 나트륨 30g, 콜로이드성 이산화규소 5g을 35호 체에 체과하여 상기 혼합물에 가하고 30분간 혼합하였다. 최종적으로 스테아르산 15g을 35호 체로 체과하여 상기 혼합물에 가하여 3분간 혼합하였다. 이어서 상기 최종혼합분을 타정하여 HL010183 10mg을 함유한 정제를 제조하였으며, 하이코터(SFC-30N, 세종 기계, 한국)로서 오파드라이 OY-C-7000A 50g을 코팅 기제로 하여 필름 코팅 층을 형성하여 1정 중 HL010183 10mg이 함유된 필름코팅정을 제조하였다.
< 제조실시예 2> HL010183 함유 캡슐제의 제조
HL010183 1,000g과 미세결정성 셀룰로오스 960g을 각각 24호 체로 체과한 후 더블콘 혼합기(Doubel cone mixer, Erweka, Germany)에서 30분간 혼합하였다. 이와 별도로 히드록시프로필 셀룰로오스 20g, 콜로이드성 이산화규소 10g을 35호 체에 체과하여 상기 혼합물에 가하고 30분간 혼합하였다. 최종적으로 스테아르산 10g을 35호 체로 체과하여 상기 혼합물에 가하여 3분간 혼합하였다. 이어서 상기 최종혼합분을 캡슐충전기를 이용하여 2호 캡슐에 충진하여 HL010183 25mg을 함유한 캡슐을 제조하였다.
< 제조실시예 3> HL010183 함유 정제의 제조
HL010183 1,250g과 미세결정성 셀룰로오스 1,060g을 각각 24호 체로 체과한 후 고속혼합기(Doubel cone mixer, Erweka, Germany)에서 3분간 혼합하였다. 이와 별도로 히드록시프로필 셀룰로오스 75g을 80% 에탄올용액 750g에 용해하여 결합액을 제조하였다. 제조한 결합액을 고속혼합기에 투입하여 3분간 연합한 후 연합물은 60℃에서 건조감량이 2% 이하가 될 때까지 건조하였다. 건조물은 24호 체로 체과하여 더블콘 믹서(Double cone mixer, Erweka, Germany)에 투입하였다. 이와 별도로 전분글리콘산 나트륨 75g, 콜로이드성 이산화규소 25g을 35호 체에 체과하여 상기 더블콘믹서에 가하고 30분간 혼합하였다. 최종적으로 스테아르산 15g을 35호 체로 체과하여 상기 더블콘믹서의 혼합물에 가하여 3분간 혼합하였다. 이어서 상기 최종혼합분을 타정하여 HL010183 250mg을 함유한 정제를 제조하였으며, 하이코터(SFC-30N, 세종 기계, 한국)로서 오파드라이 OY-C-7000A 75g을 코팅 기제로 하여 필름 코팅 층을 형성하여 1정 중 HL010183 250mg이 함유된 필름코팅정을 제조하였다.
< 제조실시예 4> HL010183 함유 서방정제의 제조
HL010183 1,000g, 미세결정성 셀룰로오스 70g, 히프로멜로오스(점도 100,000 cps) 840g 및 히드록시프로필 셀룰로오스 60g을 각각 24호 체로 체과한 후 더블콘 혼합기 (Doubel cone mixer, Erweka, Germany)에서 30분간 혼합하였다. 이와 별도로 콜로이드성 이산화규소 20g을 35호 체에 체과하여 상기 혼합물에 가하고 30분간 혼합하였다. 최종적으로 스테아르산 10g을 35호 체로 체과하여 상기 혼합물에 가하여 3분간 혼합하였다. 이어서 상기 최종혼합분을 타정하여 HL010183 500mg을 함유한 서방정제를 제조하였으며, 하이코터(SFC-30N, 세종 기계, 한국)로서 오파드라이 OY-C-7000A 60g을 코팅 기제로 하여 필름 코팅 층을 형성하여 1정 중 HL010183 500mg이 함유된 필름코팅 서방정을 제조하였다.
< 제조실시예 5> HL010183 함유 정제의 제조
HL010183 2,250g과 미세결정성 셀룰로오스 165g을 각각 24호 체로 체과한 후 고속혼합기(Doubel cone mixer, Erweka, Germany)에서 3분간 혼합하였다. 이와 별도로 히드록시프로필 셀룰로오스 60g을 80% 에탄올용액 600g에 용해하여 결합액을 제조하였다. 제조한 결합액을 고속혼합기에 투입하여 3분간 연합한 후 연합물은 60℃에서 건조감량이 2% 이하가 될 때까지 건조하였다. 건조물은 24호 체로 체과하여 더블콘 믹서 (Double cone mixer, Erweka, Germany)에 투입하였다. 이와 별도로 가교결합된 포비돈 45g, 콜로이드성 이산화규소 15g을 35호 체에 체과하여 상기 더블콘믹서에 가하고 30분간 혼합하였다. 최종적으로 스테아르산 15g을 35호 체로 체과하여 상기 더블콘믹서의 혼합물에 가하여 3분간 혼합하였다. 이어서 상기 최종혼합분을 타정하여 HL010183 750mg을 함유한 정제를 제조하였으며, 하이코터(SFC-30N, 세종 기계, 한국)로서 오파드라이 OY-C-7000A 60g을 코팅 기제로 하여 필름 코팅 층을 형성하여 1정 중 HL010183 750mg이 함유된 필름코팅정을 제조하였다.
< 제조실시예 6> HL010183 함유 정제의 제조
HL010183 2,000g을 24호 체로 체과한 후 고속혼합기(Doubel cone mixer, Erweka, Germany)에 투입하였다. 이와 별도로 히드록시프로필 셀룰로오스 60g을 80% 에탄올용액 600g에 용해하여 결합액을 제조하였다. 제조한 결합액을 고속혼합기에 투입하여 3분간 연합한 후 연합물은 60℃에서 건조감량이 2% 이하가 될 때까지 건조하였다. 건조물은 24호 체로 체과하여 더블콘 믹서(Double cone mixer, Erweka, Germany)에 투입하였다. 이와 별도로 콜로이드성 이산화규소 10g을 35호 체에 체과하여 상기 더블콘믹서에 가하고 30분간 혼합하였다. 최종적으로 스테아르산 10g을 35호 체로 체과하여 상기 더블콘믹서의 혼합물에 가하여 3분간 혼합하였다. 이어서 상기 최종혼합분을 타정하여 HL010183 1,000mg을 함유한 정제를 제조하였으며, 하이코터(SFC-30N, 세종 기계, 한국)로서 오파드라이 OY-C-7000A 60g을 코팅 기제로 하여 필름 코팅층을 형성하여 1정 중 HL010183 1,000mg이 함유된 필름코팅정을 제조하였다.

Claims (4)

  1. 하기 화학식 1로 표현되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및
    약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암의 증식, 재발 또는 전이 억제용 의약 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00010

  2. 제1항에 있어서,
    암은 유방암, 자궁암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 폐암, 피부암, 혈액암 및 간암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 암의 증식, 재발 또는 전이 억제용 의약 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 항암제와 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것인 암의 증식, 재발 또는 전이 억제용 의약 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 암의 증식, 재발 또는 전이 억제용 의약 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101579763B1 (ko) * 2014-07-22 2015-12-23 한국 한의학 연구원 펠리온나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품
CN108042796A (zh) * 2018-01-04 2018-05-18 江西华文科创文化发展有限公司 一种清除自由基的组合物及其制备方法与应用
CN110022879A (zh) * 2016-08-27 2019-07-16 中国医药大学 依西美坦用于治疗胃癌的用途

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