KR20160067103A - 신경 장애를 치료하기 위한 토라세미드 및 바클로펜을 포함하는 조성물 - Google Patents

신경 장애를 치료하기 위한 토라세미드 및 바클로펜을 포함하는 조성물 Download PDF

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KR20160067103A
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다니엘 코엔
일리야 슈마코브
세르게이 나비혹킨
미까엘 그디쥬
엠마누엘 비알
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파넥스트
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Abstract

본 발명은 글루타메이트 흥분 독성 및 아밀로이드 β 독성과 관련된 신경 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 다발성 경화증, 알츠하이머병, 알츠하이머병 관련 장애, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 헌팅턴병, 신경병증성 통증, 알코올성 신경병증, 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상의 신규의 조합적 요법에 관한 것이다.

Description

신경 장애를 치료하기 위한 토라세미드 및 바클로펜을 포함하는 조성물{COMPOSITION COMPRISING TORASEMIDE AND BACLOFEN FOR TREATING NEUROLOGICAL DISORDERS}
본 발명은 신경 질환 및 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 알츠하이머병 및 관련 질환, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 신경병증, 알코올 중독, 알코올 금단증, 헌팅턴병 및 척수 손상을 포함한 상기 질환의 신규 조합적 치료에 관한 것이다.
알츠하이머병(AD)은 실어증(대화 및 대화의 이해에 대한 장애를 가지는 언어장애), 통합운동장애(운동 또는 감각 장애의 부재 하에서 조직화 및 특정 목적성 움직임 및 제스처의 수행 장애) 및 피질 관련 영역의 관여에서 기인한 인지불능(사물, 사람, 소리, 형태 또는 냄새를 인지하는 능력)을 동반하는 기억력 결함에 의해 특징화되는 원형성 피질성 치매이다(1-4).
AD는 현재 가장 흔한 치매의 원인이다. 이는 임상적으로 느리게 진행되고, 말기 환자에게서는 침대에 묶여서 실금의, 간호에 의존하도록 하는 인지 기능의 전체적 감퇴에 의해 특징화된다. 사망은 평균 진단 후 9년 내 발생된다(5).
AD의 발병률은 나이와 함께 급격하게 증가 된다. 유엔 인구 추계(population projection)에 따르면, 80세 이상의 인구 수가 2050년에는 3억 7천만 명에 접근할 것으로 추정된다. 현재, 85세 이상 중 50%가 AD로 고통받는 것으로 추정된다. 따라서, 전 세계 1억 만 명 이상이 50년 내에 치매로 고통받을 것이다. 지속적인 케어 및 기타 서비스를 필요로하는 방대한 수의 사람들은 심각하게 의료 자원, 금전적 자원 및 인력 자원에 영향을 미치게 될 것이다(6). 기억력 결함은 질환의 초기적 특징으로 일화 기억(하루 동안-오늘의 사건에 대한 기억)과 관련된다. 의미 기억(언어적 및 시각적 의미에 대한 기억)은 후에 본 질환과 관련된다. AD의 병리적 특징은 베타-아밀로이드(Abeta)를 함유하는 아밀로이드 반(아밀로이드 플라크), Tau를 함유하는 신경섬유 매듭(NFT) 및 뉴런성 및 시냅스성 기능 장애 및 결실을 포함한다(7-9). 최근 10년간, AD를 유발에 관한 두 개의 주요 가설이 제안되었다: “아밀로이드 케스케이드 가설”에 따르면, 신경퇴행성 과정은 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 비정상적인 처리에 의해 유발되는 일련의 과정이라 언급되고(10), “뉴런의 세포골격적 퇴화 가설”(11)에 따르면, 세포골격의 변화가 촉발 과정(triggering event)임을 제안한다. AD 진행을 설명하는 가장 보편적으로 받아들여지는 가설은 아밀로이드 케스케이드 가설(12-14)로, AD 연구자들은 주로 Abeta 단백질과 관련된 독성에 기초하는 메카니즘을 규명하는데 집중해 왔다. 미세혈관의 투과 및 변형, 비정상적 혈관형성 및 혈관 뇌 관문(blood 뇌 장벽)의 파괴가 아밀로이드 케스케이드 하 APP 독성에 기여하는 핵심 사건으로 규정되어 졌다(15). 반면에, Tau 단백질은 아밀로이드에 비해 의약품 업계에서 덜 주목되어져 왔는데, 이는 근본적이고 실질적인 염려 때문이다. 더욱이, 스냅스성 밀도 변화는 다른 두개의 성분들에 비해서 인지 장애와 가장 상호작용을 하는 병리적 병변이다.
연구에 따르면, 아밀로이드 병리학은 신경 전달 물질-특이적인 방법에 있어서 진전이 있었는데, 여기에서는 콜린성 종말(terminal)이 가장 취약하였고, 이어서 글루타메이트성 종말 및 끝으로 GABA성 종말 순서였다(9). 글루타메이트는 표유류 신경계에서 가장 풍부한 흥분성 신경 전달 물질이다. 병리 조건하에서, 이의 시냅스 간극 내 비정상적인 축적은 글루타메이트 수용체의 과활성화를 유발한다(16). 시냅스 간극 내 글루타메이트의 비정상적 축적은 글루타메이트 수용체의 과활성화를 유발하여 병리적 진행 및 종국적으로 뉴런 세포의 사멸을 유발한다. 이러한 진행, 소위 흥분 독성은 급성 및 만성의 신경 장애 중 뉴런 조직 내에서 흔히 관찰된다.
증거로, 흥분 독성은 다발성 경화증, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 및 헌팅턴과 같은 신경퇴행성 질환뿐만 아니라 척수 손상, 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 청력 상실, 알코올 중독 및 알코올 금단증, 알코올성 신경병증, 또는 신경병증성 통증과 같은 다양한 병인의 다발성 장애의 발병과 관련된다(17-19). 치료법의 부재 및 이들 질환의 발병률 때문에 상기의 질환들에 대한 효율적 치료법의 개발은 주요 공중 보건 문제로서 남아있다.
상기 수용체의 다양한 사이트를 표적화하는 NMDAR 길항제가 흥분 독성에 대응하기 위하여 실험되어져 왔다. 비경쟁적 NMDAR 길항제는 이온 채널 포어를 표적화하여 따라서 시냅스후 뉴런 내로의 칼슘 흡수를 감소시킨다. 이들 중 몇몇은 허가 단계에 진입해 있다. 예컨대, 메만틴(Memantine)은 중등도 중증 알츠하이머병에 현재 허가받았다. 이는 알코올 의존증(2상), 근위축성 측삭 경화증(3상), 파킨슨 관련 치매(2상), 간질, 헌팅턴병(4상), 다발성 경화증(4상), 파킨슨병(4상) 및 외상성 뇌 손상(4상)과 같은 흥분독성의 성분를 포함하는 다른 적응증으로 임상 시험 되었다. 상기 분자는 대부분의 알츠하이머병 환자들에게 제한적인 장점만을 가지는데, 이는 상기 분자가 단지 완화된 증상적인 효과만을 가지고 있기 때문이다. 흥분 독성을 제한하기 위한 또 다른 접근으로, 글루타메이트의 시냅스전 방출을 억제하는 것이 존재한다. 릴루졸(Riluzole)은 근위축성 측삭 경화증에 대해 현재 허가받은 것으로서, 허열성 및 외상성 뇌 손상 모델에서 고무적인 결과를 보여준다(20-23). 이는 현재 척수 손상 뿐 아니라 초기 다발성 경화증, 파킨슨병(이는 위약에 비해 향상된 효과를 나타내지 않음)에 대해 임상 2상이 현재 진행 중이다. 1995년, 상기 의약은 근위축성 측삭 경화증의 치료에 대해 희귀의약품 단계에 도달하였고, 1996년에는 헌팅턴병의 치료에 대해 희귀의약품 단계에 진입하였다
WO2009/133128, WO2009/133141, WO2009/133142, 및 WO2011/054759, 은 신경 장애를 치료하기 위한 조성물에 사용될 수 있는 분자를 개시한다.
본 영역에 대한 활발한 연구에도, 신경 장애, 및 특히 글루타메이트 및/또는 아밀로이드 베타 독성과 관련된 신경 장애를 위한 대안 혹은 향상된 효율적인 치료에 대한 필요는 여전히 존재한다. 본 발명은 중추 신경계(CNS) 및 말초 신경계(PNS)의 이러한 신경 질환을 위한 신규의 치료법을 제시한다.
본 발명의 목적은 신경 장애의 치료를 위한 신규의 치료적 접근을 제공하는 것이다.
본 발명은, 특히, 토라세미드, 트리메타지딘, 메실레틴, 브로모크립틴, 이펜프로딜 및 목시플록사신이 단독 또는 조합으로 신경 장애의 치료를 위한 신규하고 효율적인 치료법을 나타낸다는 본 발명자들의 예측하지 못한 발견으로부터 유래된다.
본 발명은 따라서 신경 장애, 특히 AD 및 관련 장애, 다발성 경화증(MS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 파킨슨병(PD), 신경병증(예를 들어 신경병증성 통증 또는 알코올성 신경병증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 말초 신경계 손상, 헌팅턴병(HD) 및 척수 손상을 치료하기 위한 신규의 조성물 및 방법을 제공한다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 적어도 토라세미드, 트리메타지딘, 메실레틴, 이펜프로딜, 목시플록사신 또는 브로모크립틴, 또는 이들의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 서방성 제형을 포함하는 신경 장애 치료용 조성물과 관련된다.
본 발명의 추가의 목적은, 동시적, 개별적 또는 연속적인 투여를 위해, 설피속사졸, 메티마졸, 프릴로카인, 디필린, 퀴나크린, 카르베녹솔론, 아캄프로세이트, 아미노카프로익 산, 바클로펜, 카베르골린, 디에틸카바마진, 시나칼셋, 신나리진, 에플레레논, 페놀도팜, 레플루노마이드, 레보시멘단, 설로덱사이드, 테르비나핀, 조니사마이드, 에토미데이트, 펜포르민, 트리메타지딘, 메실레틴, 브로모크립틴, 이펜프로딜, 토라세미드, 및 목시플록사신 이들의 임의의 화학적 순도의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 서방성 제형으로부터 선택되고 제1 화합물과는 상이한 적어도 하나의 제2 화합물과 조합하여, 토라세미드, 트리메타지딘, 메실레틴, 이펜프로딜, 목시플록사신, 및 브로모크립틴, 또는 이들의 임의의 화학적 순도의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 서방성 제형로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제1 화합물을 포함하는 조성물과 관련된다.
본 발명의 추가의 목적은, 토라세미드, 트리메타지딘, 메실레틴, 이펜프로딜, 목시플록사신, 및 브로모크립틴, 이들의 임의의 화학적 순도의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 서방성 제형로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제1 화합물을, 상기 제1 화합물과는 상이하고, 설피속사졸, 메티마졸, 프릴로카인, 디필린, 퀴나크린, 카르베녹솔론, 아캄프로세이트, 아미노카프로익 산, 바클로펜, 카베르골린, 디에틸카바마진, 시나칼셋, 신나리진, 에플레레논, 페놀도팜, 레플루노마이드, 레보시멘단, 설로덱사이드, 테르비나핀, 조니사마이드, 에토미데이트, 펜포르민, 트리메타지딘, 메실레틴, 브로모크립틴, 이펜프로딜, 토라세미드, 및 목시플록사신, 이들의 임의의 화학적 순도의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 서방성 제형으로부터 선택되는 적어도 하나의 제2 화합물과 조합하여 포함하는, 동시적, 개별적 또는 연속적인 투여를 위한 신경 장애의 치료에의 사용을 위한 조성물과 관련된다.
본 발명은 또한 동시적, 개별적 또는 연속적인 투여를 위한 설피속사졸, 메티마졸, 프릴로카인, 디필린, 퀴나크린, 카르베녹솔론, 아캄프로세이트, 아미노카프로익 산, 바클로펜, 카베르골린, 디에틸카바마진, 시나칼셋, 신나리진, 에플레레논, 페놀도팜, 레플루노마이드, 레보시멘단, 설로덱사이드, 테르비나핀, 조니사마이드, 에토미데이트, 펜포르민, 트리메타지딘, 메실레틴, 브로모크립틴, 이펜프로딜, 토라세미드, 및 목시플록사신 이들의 임의의 화학적 순도의 염(들), 프로드럭(들), 유도체(들), 또는 서방성 제형(들)으로부터 선택되고 제1 화합물과는 상이한 적어도 하나의 제2 화합물과 조합된, 토라세미드, 트리메타지딘, 메실레틴, 이펜프로딜, 목시플록사신, 및 브로모크립틴, 이들의 임의의 화학적 순도의 염(들), 프로드럭(들), 유도체(들), 또는 서방성 제형(들)로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제1 화합물 및 약학적으로 허용가능 한 첨가제를 포함하는 조성물과 관련된다.
가장 바람직한 의약 조성물은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 상이한 약물들을 포함하고, 심지어 더욱 바람직하게는 2, 3 또는 4개의 약물을 포함한다. 또한, 상기 약물 조성물은 신경 장애를 앓는 개체에 유익한 하나 또는 복수의 추가적 약물 또는 치료와 추가로 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 신경 장애를 치료하는 방법과 관련되고, 상기 방법은 전술한 약물 또는 조성물을 이를 필요로하는 개체 내로 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 목적은 신경 장애를 치료하는 방법과 관련되고, 상기 방법은, 전술한 약물 조합을 이를 필요로하는 개체 내로, 동시적, 개별적 또는 연속적으로 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 목적은 토라세미드, 트리메타지딘, 메실레틴, 이펜프로딜, 브로모크립틴 및 목시플록사신, 또는 이들의 임의의 화학적 순도의 염(들), 프로드럭(들), 유도체(들), 또는 서방성 제형(들)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물의 신경 장애 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 용도와 관련된다.
본 발명의 추가의 목적은 전술한 약물 조합의 신경 장애의 치료를 위한 의약을 제조하기 위한 용도와 관련된다.
본 발명은 임의의 포유류 개체, 특히 인간 개체에서 임의의 질병 단계에서 사용될 수 있다.
도 1 내지 27에서, *: p<0.05: 대조군(중독 없음)과 유의적으로 상이함 ; "ns": 유의적인 효과 없음(ANOVA + Dunnett의 Post-Hoc 테스트)을 의미함.
도 1: HBMEC 내 Aβ1 - 42 손상에 대한 선택 약물 전-처리 효과. A) 약물 스크리닝에 사용되는 실험 모델의 밸리데이션: 1시간의 10nM으로의 VEGF 전-처리는 아밀로이드 손상으로부터 모세혈관망을 유의적으로 보호하였음(아밀로이드 중독과 비교해서 모세혈관망의 +70%). 토라세미드(B) 및 브로모크립틴(C) 각각은 400nM 및 3.2nM 정도로 낮은 용량에 의해 중독을 유의적으로 억제하였고, 반면 더 높거나 더 낮은 용량에서는 약한 효과 혹은 효과가 나타나지 않았음¹: p<0.05: 아밀로이드 중독과 유의적으로 상이함.
도 2: 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 에세이에서 LDH 방출에 대한 선택 약물 전-처리의 효꽈. A) 약물 스크리닝에 사용되는 실험 모델의 밸리데이션: 1시간의 에스트라디올(150ng/ml) 전-처리는 뉴런을 아밀로이드 손상으로부터 유의적으로 보호하였는데(-70%), 이는 신경보호에 대한 양성 대조군으로서 간주 됨. 모든 실험에 있어서, Aβ1 -42는 비히클-처리된 뉴런에 비해 유의적인 중독을 생성하였다. 중독은 브로모크립틴 (40nM, -29%) (B), 트리메타지딘 (40nM, -94%) (C), 이펜프로딜 (600nM, -94%) (D), 메실레틴 (3.2nM, -73%) (E), 목시플록사신 (20nM, -63%) (F)에 의해 유의적으로 억제된다. 다른 약물 농도에서는, 더 높거나 더 낮은 용량에서 더 약한 효과 혹은 효과가 나타나지 않았음. ◈: p<0.05: Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 3: 베타-아밀로이드 중독된 HBMEC 배양 내 모세혈관망의 총 길이에 대한 바클로펜 및 토라세미드 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42 2.5μM)는 비히클-처리된 세포와 비교하여, 40% 이상의, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 바클로펜 및 토라세미드(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 바클로펜(B) 및 토라세미드(C) 단독은 중독에 대한 유의적인 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 4: 베타-아밀로이드 중독된 HBMEC 배양 내 모세혈관망의 총 길이에 대한 설피속사졸 및 토라세미드 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1 -42 2.5μM)는 비히클-처리된 세포와 비교하여, 40%이상의, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 설피속사졸 및 토라세미드(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 설피속사졸(B) 및 토라세미드(C) 단독은 중독에 대해 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 5: 베타-아밀로이드 중독된 HBMEC 배양 내 모세혈관망의 총 길이에 대한 에플레레논 및 토라세미드 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42 2.5μM)는 비히클-처리된 세포와 비교하여, 40% 이상의, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 에플레레논 및 토라세미드(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 토라세미드(B) 및 에플레레논(C) 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 6 : 베타-아밀로이드 중독된 HBMEC 배양 내 모세혈관망의 총 길이에 대한 브로모크립틴 및 설피속사졸 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42 2.5μM)는 비히클-처리된 세포와 비교하여, 40% 이상의, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 브로모크립틴 및 설피속사졸(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 브로모크립틴(B) 및 설피속사졸(C) 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.◈: p<0.05, Aβ1-42 중독과 유의적으로 상이함.
도 7 : 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 내 LDH 방출에 대한 아캄프로세이트 및 이펜프로딜 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42 10μM)는 비히클-처리된 뉴런과 비교하여, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 아캄프로세이트 및 이펜프로딜(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 아캄프로세이트(B) 및 이펜프로딜(C) 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 8 : 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 내 LDH 방출에 대한 바클로펜 및 메실레틴 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1 -42 10μM)는 비히클-처리된 뉴런과 비교하여, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 바클로펜 및 메실레틴(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 바클로펜(B) 및 메실레틴(C) 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p=0.051, Aβ1 -42 중독과 상이함.
도 9: 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 내 LDH 방출에 대한 바클로펜 및 트리메타지 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1 -42 10μM)는 비히클-처리된 뉴런과 비교하여, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 바클로펜 및 트리메타지딘(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 바클로펜(B) 및 트리메타지딘(C) 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 10: 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 내 LDH 방출에 대한 시나칼셋 및 메실레틴 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1 -42 10μM)는 비히클-처리된 뉴런과 비교하여, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 시나칼셋 및 메실레틴(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 시나칼셋(B) 및 메실레틴(C) 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 11 : 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 내 LDH 방출에 대한 신나리진 및 트리메타지 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1 -42 10μM)는 비히클-처리된 뉴런과 비교하여, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 신나리진 및 트리메타지딘(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 신나리진(B) 및 트리메타지딘(C) 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 12 : 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 내 LDH 방출에 대한 트리메타지딘 및 조니사마이드 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42 10μM)는 비히클-처리된 뉴런과 비교하여, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 트리메타지딘 및 조니사마이드(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 트리메타지딘(B) 및 조니사마이드(C) 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다.◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 13: 베타-아밀로이드 중독된 HBMEC 배양 내 모세혈관망의 총 길이에 대한 테르비나핀 및 토라세미드 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42 2.5μM)는 비히클-처리된 세포와 비교하여, 40% 이상의, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 테르비나핀 및 토라세미드(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 테르비나핀(B) 및 토라세미드(C) 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다.◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 14: 베타-아밀로이드 중독된 HBMEC 배양 내 모세혈관망의 총 길이에 대한 시나칼셋 및 메실레틴 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1 -42 2.5μM)는 비히클-처리된 세포와 비교하여, 40% 이상의, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 시나칼셋 및 메실레틴(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서,시나칼셋(B) 및 메실레틴(C) 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 15: 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 내 LDH 방출에 대한 바클로펜 및 토라세미드 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1 -42 10μM)는 비히클-처리된 뉴런과 비교하여, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 바클로펜 및 토라세미드의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 바클로펜 및 토라세미드 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 16: 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 내 LDH 방출에 대한 토라세미드 및 설피속사졸 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1 -42 10μM)는 비히클-처리된 뉴런과 비교하여, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 설피속사졸 및 토라세미드(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 토라세미드(B) 및 설피속사졸(C) 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 17: 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 내 LDH 방출에 대한 목시플록사신 및 트리메타지딘 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1 -42 10μM)는 비히클-처리된 뉴런과 비교하여, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 목시플록사신 및 트리메타지딘(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제된다. 목시플록사신의 첨가는 트리메타지딘(C) 단독에서 관찰되는 효과의 100%의 증가를 허용한 반면, 동일한 농도에서, 목시플록사신(B) 단독은 중독에 대한 유의적인 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 18: 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 내 LDH 방출에 대한 목시플록사신 및 바클로펜 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1 -42 10μM)는 비히클-처리된 뉴런과 비교하여, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 목시플록사신 및 바클로펜(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 목시플록사신(B) 및 바클로펜(C) 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 19: 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 내 LDH 방출에 대한 목시플록사신 및 시나칼셋 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1 -42 10μM)는 비히클-처리된 뉴런과 비교하여, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 목시플록사신 및 시나칼셋(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 목시플록사신(B) 및 시나칼셋(C) 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 20: 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 내 LDH 방출에 대한 목시플록사신 및 조니사마이드 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1 -42 10μM)는 비히클-처리된 뉴런과 비교하여, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 목시플록사신 및 조니사마이드(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제된다. 목시플록사신의 첨가는 조니사마이드(C) 단독에서 관찰되는 효과의 81%의 증가를 허용한 반면에, 동일한 농도에서, 목시플록사신(B) 단독은 중독에 대해 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 21: 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 내 LDH 방출에 대한 목시플록사신 및 설피속사졸 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42 10μM)는 비히클-처리된 뉴런과 비교하여, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 목시플록사신 및 설피속사졸(A)의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 목시플록사신(B) 및 설피속사졸(C) 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 22: 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 내 LDH 방출에 대한 메실레틴(MEX) 및 이펜프로딜(IFN) 조합 요법의 효과. 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1 -42 10μM)는 비히클-처리된 뉴런과 비교하여, 유의한 중독을 생성한다. 이러한 중독은 메실레틴 25.6 pM 및 이펜프로딜 24 nM의 조합에 의해 유의적으로 억제되는 반면, 상기의 농도에서, 메실레틴 및 이펜프로딜 단독은 중독에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.0572, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 23: 베타-아밀로이드 중독된 피질 뉴런 내 신경돌기망(neurites network) 총 길이에 대한 바클로펜(BCL) 및 토라세미드(TOR) 조합 요법의 효과. 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1 -42 2.5μM)는 비히클-처리된 세포와 비교하여, 15% 이상의, 유의한 중독을 생산한다. 이러한 중독은 토라세미드 및 바클로펜의 조합에 의해 유의적으로 억제된다; 그뿐만 아니라, 이러한 조합은 신경돌기 성장을 향상시킨다. :◈ p<0.05, Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 24: 뉴런 피질 세포 상 글루타메이트 독성에 대한 시나칼셋 및 메실레틴 조합 요법의 효과. 글루타메이트 중독이 시나칼셋(64pM) 및 메실레틴(25.6pM)의 조합에 의해 유의적으로 억제된 반면, 상기의 농도에서, 시나칼셋 및 메실레틴 단독은 중독에 대해 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈: p<0.001, 글루타메이트 중독과 유의적으로 상이함;(ANOVA + Dunnett Post-Hoc 테스트).
도 25 : 뉴런 피질 세포 상 글루타메이트 독성에 대한 설피속사졸 및 토라세미드 조합 요법의 효과. 글루타메이트 중독이 설피속사졸(6.8nM) 및 토라세미드(400nM)의 조합에 의해 유의적으로 억제된 반면, 상기의 농도에서, 설피속사졸 및 토라세미드 단독은 중독에 대해 유의적 효과를 가지지 않는다. ◈ : p<0.001, 글루타메이트 중독과 유의적으로 상이함;(ANOVA + Dunnett Post-Hoc 테스트).
도 26 : 래트 일차 피질 세포 상 인간 Aβ1 -42 독성 에세이 내 LDH 방출에 대한 토라세미드(TOR) 전-처리의 영향. Aβ1 -42는 비히클 처리된 뉴런과 비교하여 유의한 중독을 생성한다. 상기 중독은 토라세미드(200nM, -90%)에 의해 유의하게 억제된다. ◇: p<0.0001: Aβ1-42 중독과 유의적으로 상이함.
도 27 : 래트 일차 피질 세포 상 Aβ1 -42 독성 에세이 내 LDH 방출에 대한 아캄프로세이트 및 이의 유도 호모타우린 전-처리의 비교. Aβ1 -42는 비히클-처리된 뉴런과 비교하여 유의한 중독을 생성한다. 중독은 호모타우린 및 아캄프로세이트(99%, 8nM)에 의해서 동일하게 유의적으로 억제된다. ◇: p<0.0001: Aβ1 -42 중독과 유의적으로 상이함.
도 28: 독성의 부재하에서 배양된 피질 뉴런의 신경돌기망의 총길이에 대한 바클로펜(BCL) 및 토라세미드(TOR) 조합의 영향. 바클로펜(400nM) 및 토라세미드(80nM)의 조합이 배양 배지 내 첨가되는 경우 신경돌기망의 길이의 증가가 관찰되었다; 뿐만 아니라, 상기의 조합은 신경돌기 성장을 향상시키는 반면, 상기의 농도에서 바클로펜 및 토라세미드 단독은 신경돌기망 길이에 대한 유의적 효과를 가지지 않는다(ns). * p<0.005, 대조군과 유의적으로 상이함.
도 29 : 신경 압착 후 신경재생을 촉진시키는데의 바클로펜(BCL) 및 토라세미드(TOR)의 조합의 영향. A-바클로펜-토라세미드의 조합으로 치료받은 신경 손상(신경 압착)을 경험한 동물은, 샴 처리된 동물(하얀색 bar) 또는 비히클 처리된 동물과 비교하여 신경 압착으로부터 7일차 및 30일차에 손상된 좌골 신경의 자극에 대한 CMAP 의 유의적으로 더 낮은 잠재성을 보였다. B-좌골 신경 자극에 대한 근육성 유발 전위(muscular evoked potential) 신호의 진폭은, 신경 압착으로부터의 7일차 및 30일차 모두에서 샴 처리된 동물과 비교하여 신경 손상을 경험한 동물에서 유의적으로 더 낮았다. CMAP 진폭의 유의한 증가가 바클로펜(3 mg/kg)-토라세미드(400μg/kg)(용량 3)으로 1일 2회(bid) 치료받은 동물에 대하여 신경 압착으로부터 30일차에서 관찰되었다. *p<0.05; **p<0.001; ***p<0.0001, 비히클 치료된 동물과 비교하여 유의적으로 상이함(검정 bar).
본 발명은 신경 장애를 치료하는 새로운 조성물을 제공한다. 본 발명은 상기 질환의 효과적인 교정을 허용하고 환자의 치료에 사용될 수 있는 약물의 신규의 용도 또는 신규의 약물 조합을 개시한다.
본 발명은 중추 또는 말초의, 특히 아밀로이드 또는 글루타메이트 흥분 독성이 관여되는, 임의의 신경 장애를 치료하는데 적합하다. 이러한 장애의 특정의 예에는 알츠하이머병 및 관련 장애, 다발성 경화증(MS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 파킨슨병(PD), 헌팅턴병(HD), 또는 다른 신경 장애, 예컨대 신경병증(예를 들어 알코올성 신경병증 또는 신경병증성 통증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증 및 척수 손상과 같은 신경퇴행성 질환이 포함된다. “신경병증”은 말초 신경계의 신경이 손상된 상태를 의미하고, 여기에는 유전적 성분, 염증성 질환, 약물(빈크리스틴, 옥살리플라틴, 에틸 알코올)을 포함하는 화학적 물질, 신경으로의 직접의 물리적 절연에 의해 유발되는 말초 신경계의 손상이 포함된다. 신경병증의 치료에는 또한 신경병증성 통증의 치료가 포함된다.
말초신경계의 손상은 뉴런의 절연 단계에 따라 등급화될 수 있다. 발명은 신경단열증(neurotmesis)(축색돌기 및 둘러싸는 조직 모두가 훼손된 손상) 뿐 아니라 신경무동작증(신경의 신호화 능력만이 손상된 상태), 축삭절단증(주위의 신경의 결합조직의 손상 없는, 축색 돌기의 훼손을 의미하는 손상)으로부터 등급화되는 신경 손상을 치료하는데 적합하다.
축색돌기 또는 (미엘린과 같은) 둘러싸는 조직의 변경은 유전적 기원에 의할 수 있다. 유전성 신경병증의 예로 소위 Charcot Marie Tooth 과의 질환을 들 수 있다. Charcot Marie Tooth 병은 말초 신경에 영향을 미치는 점진적인 장애로서, 변형된 특정 유전자(들)에 의해 구별된다. 변이는 신경 자극을 전달하는 축색 돌기의 장애를 야기하고, 및/또는 신경 자극의 전달 속도와 관련되는 Shwann 세포에 의한 미엘린초(myelin sheath)의 생성에 영향을 미친다. 여기에는 몇몇 타입 (임상적 특징에 의해 카테고리화 됨) 및 CMT의 서브타임(유전적 분류에 대응됨)이 존재한다. CMT 타입은 CMT1, CMT2, CMT3, CMT4, CMT5, CMT6, CMTDI, CMTRI, CMTX이 있다. 관련 말초 신경병증으로, 예컨대, HNPP(압박 마비 유전 신경병증: hereditary neuropathy with liability to pressure palsies), 고도 탈수성(demyelinating) 신경병증 DSS(Dejerine-Sottas syndrome), CHN(선천성 저수초성 신경병증)이 있다. MT1(탈수성 타입) 및 CMT2(축색 돌기성)은 CMT 환자의 약 70%를 차지한다.
본 발명은 특히 AD 및 관련 장애를 치료하는데 적합하다. 본 발명의 문맥에서, 용어 “AD 관련 장애”는 AD 타입 노인성 치매(SDAT), 루이소체 치매, 혈관성 치매, 저등도 인지 장애(MCI) 및 노화-관련 기억력 결함(AAMI)을 포함한다.
본원에서 사용되는, “치료”에는 상기 질환 또는 장애에 의해 유발되는 또는 원인이 되는 증상들의 치료, 억제, 예방, 지연 또는 감소가 포함된다. 치료라는 용어는 특히 질환의 진행 및 관련 증상들의 조절을 포함한다. 치료라는 용어는 특히 치료받은 개체 내의 i) 아밀로이드 베타에 의해 유발되는 독성으로부터의 보호, 또는 상기 독성의 감소 또는 지연, 및/또는 ii) 글루타메이트 흥분 독성으로부터의 보호 또는 상기 독성의 감소 또는 지연을 포함한다. 치료라는 용어는 또한 인지적 증상의 향상 또는 뉴런 세포의 보호를 의미한다. 신경 병증과 관련해서, 치료라는 용어는 또한 수초 재형성, 새로운 뉴런, 교질, 축색 돌기, 미엘린 또는 시냅스의 생성을 포함하는 신경 재생을 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 특정의 화합물은 특정의 명명된 분자뿐 아니라 임의의 순도의, 이들의 임의의 약학적으로 허용 가능한 염, 수화물, 유도체(예컨대, 에스테르, 에테르), 이성질체, 라세미체, 콘쥬게이트, 또는 프로드럭을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "프로드럭"은 본 발명의 화합물의 임의의 기능성 유도체(또는 전구체)를 의미하는 것으로, 이들이 생물학적 시스템에 투여되는 경우 예컨대, 자발적인 화학 반응(들), 효소 촉매 화학 반응(들), 및/또는 대사성 화학 반응(들)의 결과로서 상기 화합물이 생성된다. 프로드럭은 결과 약물에 대하여 보통 불활성이거나 약한 활성을 가지고, 예컨대 약물의 물리화학적 특성을 향상시키고, 특정 조직으로 약물을 표적화 시키며, 약물의 약동학적 및 약리학적 특징을 향상시키고, 원치않는 부작용을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 프로드럭은 일반적으로 X-약물의 구조를 가지는데, 여기에서 X는 불활성 캐리어 모이어티(inert carrier moiety)이고, 약물은 체내(in-vivo)에서 캐리어로부터 방출된다. 프로드럭 디자인으로 변경가능 한 몇몇 일반적인 작용기로서 카로복시기, 히드록시기, 아민기, 포스페이트/포스포네이트기 및 카르보닐 기가 비제한적으로 포함된다. 프로드럭은 일반적으로 에스테르, 카보네이트, 카바메이트, 아마이드 및 포스페이트를 비제한적으로 포함하는 이러한 기(group)의 변경에 의해 생성된다. 적합한 프로드럭의 선택을 위한 특정 기술의 안내는 일반의 공지된 지식에 속한다(24-28). 그뿐 아니라, 프로드럭의 제조는 당업계에 공지된 통상의 방법을 통해 수행될 수 있다. 다른 프로드럭을 합성하는데 사용될 수 있는 방법은 이 주제에 관한 수많은 리뷰들에 기술되어 있다(25; 29-35). 예컨대, 알바클로펜 플라카르빌이 ChemID plus 어드벤스 데이타베이스(http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/)에 리스트 되어있고, 알바클로펜 플라카르빌은 바클로펜의 프로드럭으로 공지되어 있다(36; 43).
화합물의 “유도체”라는 용어는 상기 화합물과 기능적으로 및/또는 구조적으로 임의의 분자, 예를 들어 상기 화합물의 산, 아마이드, 에스테르, 에테르, 아세틸화된 변이체(variant), 히드록시화된 변이체 또는 알킬화된(C1-C6) 변이체와 관련된다. 유도체라는 용어는 또한 전술한 하나 이상의 치환체를 가지는 구조적으로 관련된 화합물을 포함한다. 예컨대, 호모타우린은 아캄프로세이트의 탈아세틸화 유도체이다. 화합물의 바람직한 유도체는 공지된 방법에 의해 측정했을 경우, 상기 화합물과 실질적 정도의 유사성을 가지는 분자이다. 모 분자와의 유사성에 대한 인덱스에 따라 유사한 화합물은 예를 들어 PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/) 또는 DrugBank(http://www.drugbank.ca/)와 같은 수많은 데이타베이스에서 찾을 수 있다. 더욱 바람직한 구현예에서, 유도체는 모 약물(parent drug)과 0.4 초과, 바람직하게는 0.5 초과, 더욱 바람직하게는 0.6 초과, 심지어 더욱 바람직하게는 0.7 초과의 Tanimoto 유사성 인덱스를 가져야 한다. Tanimoto 유사성 인덱스는 두 분자 간 구조적 유사성의 정도를 측정하는데 널리 사용된다. Tanimoto 유사성 인덱스는 예를 들어 온라인(http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/SMSD/)상에서 이용가능한 Small Molecule Subgraph Detector(37-38)와 같은 소프트웨어에 의해 산출될 수 있다. 바람직한 유도체는 구조적으로 및 기능적으로 모 화합물과 관련되어 있어야 하고, 즉, 모 분자의 활성의 적어도 일부를 또한 유지해야 하며, 더욱 바람직하게는 그들은 Aβ 또는 글루타메이트 독성에 대한 보호적 활성을 가지고 있어야 한다.
유도체라는 용어는 또한 약물의 대사체, 예컨대 보통 전문화된 효소 시스템을 통한, 유기체로의 투여 후 상기 약물의(생화학적) 변형(들) 또는 처리로부터 기인되고 및 약물의 생물학적 활성을 보여주거나 또는 보존하는 분자를 포함한다. 대사체는 모 약물의 수많은 치료 작용을 수행하는 것으로 개시되어 왔다. 특정의 구현예에서, 본원에서 사용되는“대사체”는 모 약물의 활성의 적어도 일부를 보유하는, 바람직하게는 Aβ 독성 또는 글루타메이트 독성에 대응한 보호적 활성을 가지는, 변형된 또는 가공된 약물을 지칭한다. 대사체의 예에는, 약물의 간 대사에서 기인되는 토라세미드의 히드록시화된 형태가 포함된다(Drug bank database(39)).
용어 "염"은 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용가능 하고 상대적으로 무-독성인, 무기 또는 유기 산부가 염을 의미한다. 약학적 염 형성은 산성, 염기성 또는 양성이온성 약물 분자를 반대 이온과 페어링 하여 약물의 염을 형성하는 것으로 구성된다. 다양한 화학적 종이 중화 반응에 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적으로 허용가능 한 염은 염기로 작용하는 주 화합물을 무기산 또는 유기산과 반응시켜 염, 예컨데 아세트산, 질산, 타트르산, 염산, 황산, 인산, 메탄설폰 산, 캄파 설폰산, 옥살산, 말레익 산, 수시닉 산 또는 시트릭 산의 염을 형상하는 것에 의해 획득되는 것들을 따라서 포함한다. 본 발명의 약학적으로 허용가능 한 염은 또한 산성으로 작용하는 주 화합물이 적절한 염기와 결합하여 예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄 또는 콜린 염을 형성하는 것들을 또한 포함한다. 비록 주어진 유효 성분의 대부분의 염은 생물학적으로 동등하지만, 그 중에서도, 몇몇은 향상된 용해도 또는 생물학적 이용 가능적 특성을 가질 수 있다. 염의 선택은 현재, H. Stahl 및 C.G Wermuth이 그들의 핸드북에서 언급하고 있는 바와 같이 의약 개발 과정에서 일반적인 표준 작업에 해당된다(40).
용어 “조합” 또는 “조합적 치료/요법”은 생물학적 효과를 유발하기 위해 적어도 둘 이상의 약물이 개체로 공동-투여되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 조합 요법은, 적어도 두 개의 약물이 함께 또는 별도로, 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 또한, 적어도 두 개의 약물이 상이한 루트 및 프로토콜을 통해 투여될 수 있다. 결과적으로, 비록 함께 제형화될 수 있더라도, 약물의 조합은 또한 별도로 제형 화될 수 있다.
실시예에 기술된 바와 같이, 토라세미드, 트리메타지딘, 메실레틴, 이펜프로딜, 브로모크립틴 및 목시플록사신은 신경 장애와 관련된 생물학적 과정에 대해 예측하지 못한 강력한 효과를 나타낸다. 또한, 이들 화합물은 이러한 질환의 증상을 교정하는 매우 효율적인 능력을 체내(in vivo)에서 또한 보여준다. 이들 분자는, 단독 또는 조합요법에서, 따라서 신경 장애, 예컨대 알츠하이머병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 헌팅턴병, 신경병증(예를 들어 신경병증성 통증 또는 알코올성 신경병증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 및 척수 손상과 같은 신경 장애를 치료하는 신규한 접근을 보여준다. 이들 약물의 다른 선택된 화합물과의 조합(표 2 참조)은 특히 유리한데 왜냐하면 이들은 놀라운 예상 밖의 시너지 효과를 약물 단독으로는 본질적으로 효과를 보이지 않는 용량에서 생성하기 때문이다. 또한, 그들의 약효 때문에, 본원에서 언급된 약물의 조합은 낮은 용량에서 사용될 수 있고, 이는 추가의 매우 실질적인 장점이 된다.
이와 관련하여, 특히 구현예에서, 본 발명은 적어도 토라세미드, 트리메타지딘, 메실레틴, 이펜프로딜, 브로모크립틴, 또는 목시플록사신, 또는 이들의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 서방성 제형를 포함하는 AD, AD 관련 장애, MS, PD, ALS, HD, 신경병증(예를 들어 신경병증성 통증 또는 알코올성 신경병증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상을 치료하는데 사용되는 조성물과 관련된다.
상기 화합물 각각에 대한 특정한 CAS 번호가 하기 표 1에 제공된다. 표 1에서는 또한 비 제한적으로, 본 발명의 조성물에서 사용되는 이들 화합물의 통상의 염, 라세미체, 프로드럭, 대사체 또는 유도체가 기재된다.
[표 1]
Figure pct00001
상기 분자들은 가장 효율적인 임상적 이점을 제공하기 위하여 단독으로 혹은 바람직하게는 조합 요법으로 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 설피속사졸, 메티마졸, 프릴로카인, 디필린, 퀴나크린, 카르베녹솔론, 아캄프로세이트, 아미노카프로익 산, 바클로펜, 카베르골린, 디에틸카바마진, 시나칼셋, 신나리진, 에플레레논, 페놀도팜, 레플루노마이드, 레보시멘단, 설로덱사이드, 테르비나핀, 조니사마이드, 에토미데이트, 펜포르민, 트리메타지딘, 메실레틴, 이펜프로딜, 목시플록사신, 브로모크립틴 또는 토라세미드, 또는 이들의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 서방성 제형에서 선택되는 적어도 하나의 별개의 화합물과 조합된, 상기의 화합물 중 어느 하나를 포함하는, 신경 장애, 바람직하게는 AD, AD 관련 장애, MS, PD, ALS, HD, 신경병증(예를 들어 신경병증성 통증 또는 알코올성 신경병증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상을 치료하는데 사용되기 위한 조성물에 관한 것이다.
표 1의 화합물과는 구별되는 이들 추가의 별개의 화합물 각각의 특정 CAS 번호가 하기 표 2에서 제공된다:
[표 2]
Figure pct00002
바클로펜의 프로드럭의 특정의 예가 Hanafi et al, 2011(41)에서 제공되고, 특히 바클로펜 에스테르 및 바클로펜 에스테르 카르바메이트가 CNS 표적화를 위한 특정의 관심의 약물로 주어진다. 따라서 이러한 프로드럭은 특히 본 발명의 조성물에 적합하다. 전술한 알바클로펜 플라카르빌은 공지된 프로드럭으로, 본 발명의 조성물에서 바클로펜을 대신하여 사용될 수 있다. 바클로펜의 다른 프로드럭을 하기의 출원에서 찾을 수 있다: WO2010102071, US2009197958, WO2009096985, WO2009061934, WO2008086492, US2009216037, WO2005066122, US2011021571, WO2003077902, WO2010120370.
아캄프로세이트의 유용한 프로드럭, 예를 들어 아캄프로세이트의 판토익산 에스테르 네오펜틸 설포닐 에스테르, 네오펜틸 설포닐 에스테르 프로드럭 또는 마스크된 카복시화된 네오펜틸 설포닐 에스테르 프로드럭이 특히 WO2009033069, WO2009033061, WO2009033054 WO2009052191, WO2009033079, US 2009/0099253, US 2009/0069419, US 2009/0082464, US 2009/0082440, 및 US 2009/0076147에 리스트 된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 이를 필요로하는 개체 내 신경 장애 치료용 조성물에 관한 것이다:
- 토라세미드, 트리메타지딘, 메실레틴, 이펜프로딜, 브로모크립틴 및 목시플록사신 임의의 화학적 순도의 이들의 염(들), 프로드럭(들), 유도체(들), 또는 서방성 제형(들)에서 선택되는 적어도 하나의 제1 화합물,
- 상기 제1 화합물과 구별되고, 설피속사졸, 메티마졸, 프릴로카인, 디필린, 퀴나크린, 카르베녹솔론, 아캄프로세이트, 아미노카프로익 산, 바클로펜, 카베르골린, 디에틸카바마진, 시나칼셋, 신나리진, 에플레레논, 페놀도팜, 레플루노마이드, 레보시멘단, 설로덱사이드, 테르비나핀, 조니사마이드, 에토미데이트, 펜포르민, 트리메타지딘, 메실레틴, 브로모크립틴, 이펜프로딜, 토라세미드 및 목시플록사신, 임의의 화학적 순도의 이들의 염(들), 프로드럭(들), 유도체(들), 또는 서방성 제형((들)으로부터 선택되는 적어도 하나의 제2 화합물의 조합.
특정 구현예에서, 본 발명은 이러한 약물 또는 조성물의 이를 필요로하는 개체 내 AD 또는 관련 장애 치료용 용도와 관련된다.
특정의 구현예에서, 본 발명은 이들 약물 또는 조성물의 이를 필요로하는 개체 내 MS, PD, ALS, HD, 신경병증(예를 들어 신경병증성 통증 또는 알코올성 신경병증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상를 치료하는 용도와 관련된다.
실시예에 언급되는 바와 같이, 전술한 하나 이상의 약물을 사용한 조성물 치료는 알츠하이머병 및 다른 신경 질환의 효율적인 교정을 이끌어낸다. 실험 섹션에서 보여지는 바와 같이, 적어도 토라세미드, 트리메타지딘, 메실레틴, 이펜프로딜, 브로모크립틴, 및 목시플록사신을 포함하는 조성물은 인간 세포에 대한 아밀로이드(Aβ) 단백질 또는 펩타이드의 독성 효과를 억제하는 실질적인 치료적 및 생물학적 효과를 제공한다. 더욱이, 체내(in vivo), 이들 조성물은 글루타메이트 흥분 독성 내 Aβ 중독에서 유발되는 분자적 경로의 억제뿐 아니라 인지 증상의 개선을 유도한다. 따라서 그들은 이러한 질환의 치료에 대한 신규하고 잠재적인 방법을 제공한다.
실험 섹션은 추가로 전술한 조성물이 또한 i) 글루타메이트 독성으로부터 체외(in vitor) 뉴런 세포를 시너지 작용에 의해 보호하고, 및 ii) 글루타메이트 흥분 독성과 관련된 질환에 대한 체내 모델에 대한 임상적 이점을 부여하는데 효과적인 점을 보여준다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 의약 조성물은 치료를 필요로 하는 개체 내 알츠하이머병(AD), AD 관련 장애, MS, PD, ALS, HD, 신경병증(예를 들어 신경병증성 통증 또는 알코올성 신경병증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상의 조합적 치료를 위하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 상이한 약물을, 심지어 더욱 바람직하게는 2, 3 또는 4개의 상이한 약물을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 약물은, 가장 효율적인 효과를 제공하기 위해, 조합되어, 개별적으로 또는 연속적으로 투여되기 위한 조합으로서 사용될 수 있다.
특정의 구현예에서, 조성물은 (i) 토라세미드 및 (ii) 브로모크립틴, 바클로펜, 설피속사졸, 에플레레논 또는 테르비나핀에서 선택되는 화합물, 또는 상기 화합물 (i) 및 (ii)의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 서방성 제형를 포함한다.
또 다른 특정의 구현예에서, 조성물은 (i) 트리메타지딘 및 (ii) 바클로펜, 신나리진, 조니사마이드, 또는 목시플록사신에서 선택되는 화합물, 또는 상기 화합물 (i) 및 (ii)의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 서방성 제형를 포함한다.
추가의 특정 구현예에 따르면, 조성물은 (i) 목시플록사신 및 (ii) 바클로펜, 시나칼셋, 조니사마이드, 설피속사졸, 또는 트리메타지딘에서 선택되는 화합물, 또는 상기 화합물 (i) 및 (ii)의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 서방성 제형를 포함한다.
또 다른 추가의 특정 구현예에서, 조성물은 (i) 메실레틴 및 (ii) 바클로펜, 시나칼셋, 이펜프로딜, 또는 레보시멘단에서 선택되는 화합물 또는 상기 화합물 (i) 및 (ii)의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 서방성 제형를 포함한다.
특정의 구현예는 또한 (i) 이펜프로딜 및 (ii) 아캄프로세이트, 레보시멘단, 또는 메실레틴에서 선택되는 화합물 또는 상기 화합물 (i) 및 (ii)의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 서방성 제형를 포함하는 조성물과 관련된다.
알츠하이머병(AD), AD 관련 장애, MS, PD, ALS, HD, 신경병증(예를 들어 신경병증성 통증 또는 알코올성 신경병증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상과 같은 신경 장애를 치료하는데 사용되는 본 발명의 바람직한 조성물은 하기의 약물 조합 중 하나를, 조합적, 개별적 또는 연속적 투여를 위해 포함한다:
- 바클로펜 및 토라세미드,
- 에플레레논 및 토라세미드,
- 아캄프로세이트 및 이펜프로딜,
- 바클로펜 및 메실레틴,
- 바클로펜 및 트리메타지딘,
- 브로모크립틴 및 설피속사졸,
- 시나칼셋 및 메실레틴,
- 신나리진 및 트리메타지딘,
- 설피속사졸 및 토라세미드,
- 트리메타지딘 및 조니사마이드,
- 레보시멘단 및 메실레틴,
- 레보시멘단 및 이펜프로딜,
- 레보시멘단 및 트리메타지딘,
- 레보시멘단 및 목시플록사신,
- 테르비나핀 및 토라세미드,
- 목시플록사신 및 트리메타지딘,
- 목시플록사신 및 바클로펜,
- 목시플록사신 및 시나칼셋,
- 목시플록사신 및 조니사마이드,
- 목시플록사신 및 설피속사졸, 또는
- 메실레틴 및 이펜프로딜.
조합적, 개별적 또는 연속적인 투여를 위한 적어도 세 개의 화합물의 조합을 포함하는, 본 발명에 따른 바람직한 조성물의 예가 하기에 제공된다:
- 바클로펜 및 트리메타지딘 및 토라세미드,
- 바클로펜 및 시나칼셋 및 토라세미드,
- 바클로펜 및 아캄프로세이트 및 토라세미드,
- 레보시멘단 및 바클로펜 및 트리메타지딘,
- 레보시멘단 및 아미노카프로익 산 및 트리메타지딘,
- 레보시멘단 및 테르비나핀 및 트리메타지딘, 또는
- 레보시멘단 및 설피속사졸 및 트리메타지딘.
조합적, 개별적 또는 연속적인 투여를 위한, 적어도 4개의 화합물의 조합을 포함하는 본 발명에 따른 바람직한 조성물의 예가 하기에 제공된다:
- 설피속사졸 및 트리메타지딘 및 토라세미드 및 조니사마이드,
- 설피속사졸 및 메실레틴 및 토라세미드 및 시나칼셋,
- 바클로펜 및 아캄프로세이트 및 토라세미드 및 디에틸카바마진, 또는
- 바클로펜 및 아캄프로세이트 및 토라세미드 및 이펜프로딜.
실험 섹션에서 개시되는 바와 같이, 본 방법의 상기 조합 요법은 Aβ 독성에 대한 강력한 신경보호 효과를 유도하고, 행동 수행 및 생체 내 생화학적 에세이에서 긍적적인 결과를 제공한다. 결과에 따르면 본 발명의 조성물은 i) Aβ 응집에 의한 체내 유발된 분자적 경로를 효율적으로 교정하고 및 ii) 뉴런 생존 또는 시냅스 온전화와 같이 병든 동물에서 관찰되는 신경생리학적 장애의 개선을 유발한다.
더욱이, 결과에 따르면 또한, 상기 조합 치료는 AD, MS, PD, ALS, HD, 신경병증(예를 들어 신경병증성 통증 또는 알코올성 신경병증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상과 같은 다양한 신경 질환에 연루된 경로인 글루타메이트 흥분 독성에 대해 중요한 시너지적 신경보호효과를 가지는 것이 확인된다(도 24 및 25, 표 8). 이러한 치료는 이들 질환의 체내 또는 체외 모델에서 긍적적인 결과를 제공한다.
더욱이, 체내 결과에 따르면 본 발명의 조성물은 혈액 뇌 관문(Brain Blood Barrier)을 온전하게 효율적으로 회복시키는 것이 확인된다.
본 발명의 목적은 또한 알츠하이머병(AD), AD 관련 장애, MS, PD, ALS, HD, 신경병증(예를 들어 알코올성 신경병증 또는 신경병증성 통증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상과 같은 신경 장애를 치료하기 위한 상기 정의된 조성물에 존재한다.
본 발명의 추가의 목적은 신경 장애 예를 들어 알츠하이머병(AD), AD 관련 장애, MS, PD, ALS, HD, 신경병증(예를 들어 신경병증성 통증 또는 알코올성 신경병증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상 치료용 의약의 제조를 위한, 전술된 조성물의 용도에 존재한다.
본 발명은 추가로 전술한 조성물의 유효 용량을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병(AD), AD 관련 장애, MS, PD, ALS, HD, 신경병증(예를 들어 신경병증성 통증 또는 알코올성 신경병증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상과 같은 신경 장애를 치료하기 위한 방법을 제공한다.
전술한 바와 같이, 조합적 치료 내 화합물 또는 본 발명의 조성물은 함께 또는 개별적으로 제형화 될 수 있고, 함께, 개별적으로 또는 연속적으로 및/또는 반복적으로 투여될 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명의 특정의 목적은 전술한 조성물의 유효 용량을 이러한 치료를 필요로하는 개체에 동시적, 개별적 또는 연속적으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내 AD, AD 관련 장애, MS, PD, ALS, HD, 신경병증(예를 들어 신경병증성 통증 또는 알코올성 신경병증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상을 피료하는 방법에 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 유효 용량의 토라세미드, 트리메타지딘, 메실레틴, 이펜프로딜, 브로모크립틴 또는 목시플록사신, 또는 이들의 염(들) 또는 프로드럭(들) 또는 유도체(들) 또는 서방성 제형(들)을, 바람직하게는 전술한 조합으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로하는 개체 내 알츠하이머병(AD), AD 관련 장애, MS, PD, ALS, HD, 신경병증(예를 들어 신경병증성 통증 또는 알코올성 신경병증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상을 치료하는 방법과 관련된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 토라세미드, 트리메타지딘, 메실레틴, 이펜프로딜, 브로모크립틴 및 목시플록사신 이들의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 임의의 제형으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 제1 화합물을, 상기 제1 화합물과는 구별되고 설피속사졸, 메티마졸, 프릴로카인, 디필린, 퀴나크린, 카르베녹솔론, 아캄프로세이트, 아미노카프로익 산, 바클로펜, 카베르골린, 디에틸카바마진, 시나칼셋, 신나리진, 에플레레논, 페놀도팜, 레플루노마이드, 레보시멘단, 설로덱사이드, 테르비나핀, 조니사마이드, 에토미데이트, 펜포르민, 트리메타지딘, 메실레틴, 브로모크립틴, 이펜프로딜, 토라세미드, 및 목시플록사신 이들의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 임의의 제형에서 선택되는 적어도 하나의 제2 화합물과 조합하여, 동시적, 개별적 또는 연속적으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로하는 개체 내에서, 알츠하이머병(AD), AD 관련 장애, MS, PD, ALS, HD, 신경병증(예를 들어 신경병증성 통증 또는 알코올성 신경병증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상을 치료하는 방법을 제공한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 토라세미드, 트리메타지딘, 메실레틴, 이펜프로딜, 브로모크립틴 및 목시플록사신 이들의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 임의의 제형으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제1 화합물을, 상기 제1 화합물과 구별되고, 설피속사졸, 메티마졸, 프릴로카인, 디필린, 퀴나크린, 카르베녹솔론, 아캄프로세이트, 아미노카프로익 산, 바클로펜, 카베르골린, 디에틸카바마진, 시나칼셋, 신나리진, 에플레레논, 페놀도팜, 레플루노마이드, 레보시멘단, 설로덱사이드, 테르비나핀, 조니사마이드, 에토미데이트, 펜포르민, 트리메타지딘, 메실레틴, 브로모크립틴, 이펜프로딜, 토라세미드, 및 목시플록사신 이들의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 임의의 제형에서 선택되는 적어도 하나의 제2 화합물과 조합하여, 이를 필요로하는 개체 내로 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병(AD), AD 관련 장애, MS, PD, ALS, HD, 신경병증(예를 들어 신경병증성 통증 또는 알코올성 신경병증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상을 치료하는 방법과 관련된다.
실시예에 개시된 바와 같이, 글루타메이트 독성으로부터 뉴런을 보호하는데 효율적인 것 외에, 바클로펜-토라세미드 요법은 또한 뉴런 세포의 성장, 심지어 독성 제제 또는 조건의 임의의 노출의 부재 하에서도 뉴런 세포의 성장을 촉진하는데 특히 효율적이다. 더욱이, 체내에서, 이러한 조합 요법은 신경 손상 뒤 신경 신호의 전달의 상실의 개선을 유발한다. 따라서 바클로펜-토라세미드 조합은 전술한 신경병증, 신경 손상 및 척수 손상을 치료하는 신규하고 잠재적인 요법을 나타낸다.
그에 따라, 특정의 구현예에서, 본 발명은 바클로펜 및 토라세미드 염, 프로드럭, 유도체, 또는 이들의 임의의 제형을 포함하는 조성물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경병증, 예컨대, 말초 신경 손상 또는 척수 손상을 필요로하는 방법과 관련된다.
또 다른 특정의 구현예에서, 본 발명은 바클로펜 및 토라세미드, 또는 이들의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 임의의 제형을 포함하는, 신경병증, 예컨대 CMT 질환과 같은 유전성 신경병증을 치료하는 방법과 관련된다.
더욱 특정의 구현예에서, 본 발명은 바클로펜 및 토라세미드, 또는 이들의 염, 프로드럭, 유도체, 또는 임의의 제형을 포함하는 조성물을 이를필요로하는 개체 내에 투여하는 단계를 포함하는, CMT1 또는 CMT2 질환을 치료하는 방법과 관련된다.
본 발명의 특정의 목적은 또한 전술한 바클로펜 및 토라세미드의 유효 용량을 이러한 치료를 필요로 하는 개체에 동시적, 개별적 또는 연속적으로 및/또는 반복적으로 투여하는 단계를 포함하는, 신경병증, 예컨대, 말초 신경 손상 또는 척수 손상을 치료하는 방법이다.
비록 체외 및 체내에서 매우 효율적이지만, 개체 또는 특정의 조건에 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 개체 내 치료되는 신경 조건에 유리한 추가의 약물 또는 치료와 추가로 결합되어 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 특정의 구현예에서, 본 발명에 따른 약물(들) 또는 조성물은 추가로 은행나무 추출물과 조합될 수 있다. 적당한 추출물로, 비제한적으로, 은행나무 추출물, 개선된 은행나무 추출물(예컨대 활성 성분이 풍부한 또는 오염이 완화된) 또는 은행나무 추출물을 함유하는 임의의 약물이 포함된다.
은행나무 추출물은 적어도 토라세미드, 트리메타지딘, 메실레틴, 브로모크립틴, 이펜프로딜 및 목시플록사신을 포함하는 조성물 내에서 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 은행나무 추출물은 하기의 약물 조합 중 어느 하나와 조합되어 사용될 수 있다:
- 아캄프로세이트 및 이펜프로딜,
- 바클로펜 및 메실레틴,
- 바클로펜 및 토라세미드,
- 바클로펜 및 트리메타지딘,
- 브로모크립틴 및 설피속사졸,
- 시나칼셋 및 메실레틴,
- 신나리진 및 트리메타지딘,
- 에플레레논 및 토라세미드,
- 설피속사졸 및 토라세미드,
- 트리메타지딘 및 조니사마이드,
- 레보시멘단 및 메실레틴,
- 레보시멘단 및 이펜프로딜,
- 레보시멘단 및 트리메타지딘,
- 레보시멘단 및 목시플록사신,
- 테르비나핀 및 토라세미드,
- 목시플록사신 및 바클로펜,
- 목시플록사신 및 시나칼셋,
- 목시플록사신 및 조니사마이드,
- 목시플록사신 및 설피속사졸,
- 메실레틴 및 이펜프로딜,
- 바클로펜 및 트리메타지딘 및 토라세미드,
- 바클로펜 및 시나칼셋 및 토라세미드,
- 바클로펜 및 아캄프로세이트 및 토라세미드,
- 설피속사졸 및 트리메타지딘 및 토라세미드 및 조니사마이드,
- 설피속사졸 및 메실레틴 및 토라세미드 및 시나칼셋,
- 바클로펜 및 아캄프로세이트 및 토라세미드 및 디에틸카바마진,
- 바클로펜 및 아캄프로세이트 및 토라세미드 및 이펜프로딜,
- 레보시멘단 및 바클로펜 및 트리메타지딘,
- 레보시멘단 및 아미노카프로익 산 및 트리메타지딘,
- 레보시멘단 및 테르비나핀 및 트리메타지딘, 또는
- 레보시멘단 및 설피속사졸 및 트리메타지딘.
본 발명에 따른 약물(들) 또는 약물(들) 조합(들)과 결합되어 사용될 수 있는 다른 치료는 알츠하이머병, AD 관련 장애, MS, PD, ALS, HD, 신경병증(예를 들어 신경병증성 통증 또는 알코올성 신경병증), 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상을 개선하는 약물(들), 또는 이들 장애의 경감적 치료에 사용될 수 있는 약물(들)을 하나 이상 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 조합은 도네페질(CAS: 120014-06-4), 가바펜틴(CAS: 478296-72-9; 60142-96-3), 갈란타민(357-70-0), 리바스티그민(123441-03-2) 또는 메만틴(CAS: 19982-08-2)과 결합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 목적은 이를 필요로하는 개체에의 조합된, 분리된 또는 연속된 투여에 의해, 앞서 리스트된 장애의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 전술한 화합물 또는 화합물의 조합의 용도와 관련된다.
본 발명의 추가의 목적은 적절한 첨가제 또는 캐리어 내 상기 화합물을 혼합하는 단계를 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 방법이다.
요법의 기간은 치료되는 질환 또는 장애의 단계, 사용되는 조합, 나이 및 환자의 상태 및 치료에 대한 환자의 반응 정도에 의존된다.
조합의 각 성분의 투여량, 투여빈도 및 투여방식은 독립적으로 조절될 수 있다. 예컨대, 하나의 약물은 경구로 투여되는 반면, 제2 약물은 근육 내로 투여될 수 있다. 조합 요법은 환자의 신체가 아직 예측하지 못한 임의의 부작용들로부터 회복할 기회를 가지도록 휴식기를 포함하는 단속적(on-and-off) 사이클로 주어질 수 있다. 약물은 또한 한번의 투여에 의해 모든 약물들이 전달되도록 함께 제형화될 수 있다.
조합의 각 약물의 투여는 다른 성분과 조합되어 환자의 상태를 개선시키거나 또는 질환 또는 장애를 효율적으로 치료할 수 있는 약물의 농축을 유발하는 임의의 적절한 수단에 의한 것일 수 있다.
조합의 활성 성분이 순수 화학물질로 투여될 수 있다면, 그들이 약학적 조성물(본원에서는 약학 제형이라고도 지칭됨)로 존재함이 바람직하다. 가능한 조성물에는 경구, 직장, 국부(경피, 구강 및 설하를 포함), 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내를 포함) 투여에 적합한 것이 포함된다.
더 일반적으로는, 상기 약학 제형은 다수의 투여 단위들을 함유한 "환자 팩(patient pack)"으로 환자에게 처방되거나, 또는 단일 패키지로 별개 처리 기간 동안 사용하기 위한 정량 단위 투여량으로 투여하기 위한 다른 수단, 일반적으로 블리스터 팩으로 처방된다. 약사가 대량 공급물로부터 약학적으로 환자의 공급량을 나누는 전통적인 처방에 대해, 환자 팩은 환자가 환자 팩에 함유되어 있는 패키지 삽입물에 항상 접근할 수 있다는 점(일반적으로 전통적인 처방에서 아쉬운 점임)에서 이점을 가진다. 패키지 삽입물의 포함은 환자가 의사의 지시를 따르도록 개선시켜주는 것으로 보여졌다. 따라서, 본 발명은 전술한 약학 제형과 상기 제형에 적합한 패키징 물질의 조합을 또한 포함한다. 이러한 환자 팩에서, 조합 치료를 위한 제형의 의도된 사용은 치료에 가장 적합한 제형을 사용하도록 도와주는 지시서(instructions), 설비(facilities), 규정(provisions), 적응(adaptations) 및/또는 다른 수단들에 의해 추론될 수 있다. 상기 측정에 의해 본 발명의 조합에 의한 치료에 사용하는데 특이적으로 적합하고 적용된 환자 팩이 만들어진다.
약물은 임의의 적합한 캐리어 물질(예컨대, 첨가제, 비히클, 지지체)에 임의의 적합한 양으로 함유될 수 있고, 조성물 총 중량의 1 - 99 중량%의 양으로 존재할 수 있다. 조성물은 경구, 비경구(예컨대, 정맥내, 근육내), 직장, 피부, 코, 질, 흡입제, 피부(패치), 또는 안구 투여 경로에 적합한 투여 형태로 제공될 수 있다. 따라서, 조성물은 예컨대 정제, 캡슐, 알약, 분말, 과립, 현탁액, 에멀젼, 용액, 히드로겔을 포함하는 겔, 페이스트, 연고, 크림, 플라스터(plaster), 드렌치(drench), 삼투 전달 도구, 좌제, 관장제, 주사제, 임플란트, 스프레이 또는 에어로졸의 형태일 수 있다.
약학 조성물은 통상의 약학적 실무에 따라 제형화될 수 있다(예컨대, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York 참조).
본 발명에 따른 약학 조성물은 활성 약물을 투여시에 즉시 실질적으로 방출하거나, 임의의 미리 예정된 시기에 방출하거나, 또는 투여하고 임의의 시간 후에 방출하도록 제형화될 수 있다.
제어 방출 제형에는, (i) 연장된 시간에 걸쳐 체내에서 약물의 실질적으로 일정한 농도가 만들어지는 제형; (ii) 연장된 시간에 걸쳐 체내에서 약물의 실질적으로 일정한 농도가 미리 예정된 지연 시간 이후에 만들어지는 제형; (iii) 활성 약물 물질의 혈장 수준의 변동과 연관되는 원하지 않는 부작용의 수반되는 최소화와 함께, 체내에서 상대적이고 일정하고 효과적인 약물 수준을 유지함으로써, 미리 예정된 시간 동안 약물 작용을 지속시키는 제형; (iv) 예컨대 환부 조직 또는 기관에 근접하거나 환부 조직 또는 기관 내에 제어 방출 조성물의 공간적 위치에 의해, 약물 작용을 편재화시키는 제형; 및 (v) 약물을 특정 타입의 표적 세포에 전달하기 위해 캐리어 또는 화학적 유도체를 사용하여 약물 작용을 표적화시키는 제형이 포함된다.
제어 방출 제형의 형태로 약물을 투여하는 것은, 약물이, 단독 또는 조합으로, (i) 좁은 치료 인덱스(즉, 해로운 부작용 또는 독성 반응을 유발하는 혈장 농도와 치료 효과를 유발하는 혈장 농도 사이의 차이가 작음; 일반적으로, 치료 인덱스(TI)는 중간치사량(LD50) 대 중간유효량(ED50)의 비로서 정의됨)를 갖는 경우; (ii) 위장관에서 좁은 흡수 창을 갖는 경우; 또는 (iii) 치료적 수준에서 혈장 수준을 유지하기 위해 하루 동안 잦은 투여가 요구되는, 생물학적으로 매우 짧은 반감기를 갖는 경우에, 특히 바람직하다.
다수의 임의 전략들이 방출 속도가 문제되는 약물의 물질대사 속도보다 더 큰 제어 방출을 얻기 위해 추구될 수 있다. 제어 방출은 예컨대 다양한 유형들의 제어 방출 조성물 및 코팅을 포함하는 다양한 제형 파라미터들과 성분들을 적절하게 선택함으로써 얻어질 수 있다. 따라서, 약물은 투여시에 제어된 방식으로 약물을 방출시키도록 약학 조성물 내에 적합한 첨가제와 함께 제형화된다(단일 또는 다중 단위 정제 또는 캡슐 조성물, 유제, 현탁액, 에멀젼, 마이크로캡슐, 마이크로스피어, 나노입자, 패치 및 리포좀).
경구용 고체 투여 형태
경구용 제형에는 무-독성의 약학적으로 허용가능한 첨가제와의 혼합물로 활성 성분(들)을 함유하는 정제가 포함된다. 이러한 첨가제는 예컨대 불활성 희석제 또는 충진제(예컨대, 수크로스, 미정질 셀룰로스, 감자 전분을 포함하는 전분, 칼슘 카보네이트, 소듐 클로라이드, 칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 또는 소듐 포스페이트); 과립제 및 붕해제(예컨대, 미정질 셀룰로스를 포함하는 셀룰로스 유도체, 감자 전분을 포함하는 전분, 크로스카멜로스 소듐, 알기네이트 또는 알긴산); 결합제(예컨대, 아카시아, 알긴산, 소듐 알기네이트, 젤라틴, 전분, 전-젤라틴화 전분, 미정질 셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스 소듐, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 또는 폴리에틸렌 글리콜); 및 윤활제, 활택제, 및 항부착제(예컨대, 스테아르산, 실리카, 또는 탈크)일 수 있다. 다른 약학적으로 허용가능 한 첨가제들은 착색제, 향미제, 가소제, 습윤제, 완충제 등일 수 있다.
정제는 미코팅된 것일 수도 있고, 공지된 기법에 의해 (선택적으로는, 위장관에서 붕해 및 흡수를 지연시킴에 따라 더 긴 시간에 걸쳐 지속되는 작용을 제공하도록) 코팅된 것일 수도 있다. 코팅은 미리 예정된 패턴(예컨대, 제어 방출 제형을 획득하기 위함)으로 활성 약물 물질을 방출하도록 개조될 수 있거나, 또는 위를 통과한 후까지 활성 약물 물질을 방출시키지 않도록 개조될 수도 있다(장용성 코팅). 코팅은 당류 코팅, 필름 코팅(예컨대, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 메틸 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 아크릴레이트 코폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 폴리비닐피롤리돈에 기초함), 또는 장용성 코팅(예컨대, 메타크릴산 코폴리머, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 아세테이트 숙시네이트, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 셸락, 및/또는 에틸셀룰로스에 기초함)일 수 있다. 시간 지연 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 이용될 수 있다.
고체 정제 조성물에는 원하지 않는 화학적 변화(예컨대, 활성 약물 물질의 방출 이전에 화학적 분해)로부터 조성물을 보호하기 위해 개조된 코팅이 포함될 수 있다. 코팅은 [Encyclopedia of Pharmaceutical Technology]에 기재된 것과 유사한 방식으로 고체 투여 형태에 대해 적용될 수 있다.
여러 약물들이 정제 내에 함께 혼합될 수도 있고, 분할되어 있을 수도 있다. 예를 들어, 제1 약물은 정제의 내부에 함유되어 있고, 제2 약물은 정제의 외부에 함유되어 있어서, 제2 약물의 실질적인 부분이 제1 약물의 방출에 앞서 방출된다.
경구용 제형은 또한 씹을 수 있는 정제로서 제조되거나, 또는 활성성분이 불활성 고체 희석제(예컨대, 감자 전분, 미정질 셀룰로스, 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트 또는 카올린)와 혼합된 경질 젤라틴 캡슐로서 제조되거나, 또는 활성성분이 물 또는 오일 매질, 예를 들어 액체 파라핀, 또는 올리브 오일과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 제조될 수 있다. 분말 및 과립은 통상의 방식으로 정제 및 캡슐에 대해 전술한 성분들을 사용하여 제조될 수 있다.
경구용 제어 방출 조성물은 예컨대 활성 약물 물질의 용해 및/또는 확산을 제어함으로써 활성 약물을 방출하도록 구축될 수 있다.
용해 또는 확산 제어 방출은 약물의 정제, 캡슐, 펠릿 또는 과립 제형을 적절하게 코팅함으로써 달성되거나, 또는 약물을 적절한 매질 내에 혼입시킴으로써 달성될 수 있다. 제어 방출 코팅은 하나 이상의 전술한 코팅 물질 및/또는, 예컨대 셸락, 비즈왁스, 글리코왁스, 카스토르 왁스, 카르나우바 왁스, 스테아릴 알코올, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 디스테아레이트, 글리세롤 팔미토스테아레이트, 에틸셀룰로스, 아크릴성 수지, dl-폴리락트산, 셀룰로스 아세테이트 부티레이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 아세테이트, 비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌, 폴리메타크릴레이트, 메틸메타크릴레이트, 2-히드록시메타크릴레이트, 메타크릴레이트 히드로겔, 1,3 부틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 메타크릴레이트, 및/또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 방출 제어 매질(matrix) 제형에서, 매질 물질에는 예컨대 수화된 메틸셀룰로스, 카르나우바 왁스 및 스테아릴 알코올, 카르보폴 934, 실리콘, 글리세릴 트리스테아레이트, 메틸 아크릴레이트-메틸 메타크릴레이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 및/또는 할로겐화 플루오로탄소가 또한 포함될 수 있다.
청구된 조합의 약물을 하나 이상 포함하는 제어 방출 조성물은 부력 정제 또는 캡슐(즉, 경구 투여시에 특정 시간 동안 위 내용물의 상부에 떠다니는 정제 또는 캡슐)의 형태일 수도 있다. 약물(들)의 부력 정제 제형은 약물(들)과 첨가제 및 20-75% w/w의 하이드로콜로이드, 예컨대 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스 또는 히드록시프로필메틸셀룰로스의 혼합물을 과립화시킴으로써 제조될 수 있다. 획득된 과립은 이어서 정제로 압착될 수 있다. 위액과 접촉하게 되면, 정제는 그 표면 주위로 실질적으로 물이 침투할 수 없는 겔 장벽을 형성한다. 이러한 겔 장벽은 1 미만의 밀도를 유지하는데 관여하며, 이에 따라 정제가 위액에 떠있는 상태로 남아있게 해준다.
경구 투여용 액체
물을 첨가하여 수성 현탁액을 제조하는데 적합한 분말, 분산성 분말, 또는 과립은 경구 투여를 위한 편리한 투여 형태이다. 현탁액으로서 제형은 분산제 또는 습윤제, 현탁제, 및 하나 이상의 보존제와 혼합된 활성성분을 제공한다. 적합한 현탁제는 예를 들어 소듐 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 소듐 알기네이트 등이다.
비경구 조성물
약학 조성물은 또한 투여 형태, 제형의 주사, 수액 또는 이식(정맥내, 근육내, 피하 등)에 의해, 또는 통상적인 무-독성의 약학적으로 허용가능 한 캐리어 및 아쥬반트를 함유하는 적합한 전달 도구 또는 임플란트를 통해, 비경구적으로 투여될 수도 있다. 이러한 조성물의 제형 및 제조는 약학 제형 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다.
비경구용 조성물은 단위 투여 형태(예컨대, 단회 투여량 앰플)로 제공되거나, 수회 투여량을 함유하는 바이알로 제공될 수 있으며, 적절한 보존제가 첨가될 수 있다(하기 참조). 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 수액 기기, 또는 이식용 전달 기기의 형태일 수 있으며, 또는 조성물은 건조 분말로서 제공됨에 따라 사용하기 전에 물 또는 다른 적절한 담체에 의해 재구성될 수 있다. 활성 약물(들)과 별도로, 조성물은 비경구적으로 허용가능한 적합한 캐리어 및/또는 첨가제를 포함할 수 있다. 활성 약물(들)은 제어 방출을 위해 마이크로스피어, 마이크로캡슐, 나노입자, 리포좀 등에 혼입될 수 있다. 조성물은 현탁제, 가용화제, 안정화제, pH-조정제, 및/또는 분산제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 멸균주사에 적합한 형태일 수 있다. 이러한 조성물을 제조하기 위하여, 적합한 활성 약물(들)은 비경구적으로 허용가능 한 액체 담체 내에 용해되거나 현탁된다. 이용될 수 있는 허용가능 한 담체 및 용매 중에는 물, 적절한 양의 염산, 수산화나트륨 또는 적절한 완충제의 첨가에 의해 적절한 pH로 조정된 물, 1,3-부탄디올, 링거액, 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 수성 제형은 하나 이상의 보존제(예컨대, 메틸, 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트)를 함유할 수 있다. 약물들 중 하나가 물에 약간만 또는 조금만 녹는 경우에, 용해 증강제 또는 가용화제가 첨가될 수 있거나, 또는 용매는 10-60% w/w의 프로필렌 글리콜 등을 포함할 수 있다.
제어 방출 비경구 조성물은 수성 현탁액, 마이크로스피어, 마이크로캡슐, 자성 마이크로스피어, 유제, 유현탁액 또는 에멀젼의 형태일 수 있다. 대안적으로, 활성 약물(들)은 생적합성 캐리어, 리포좀, 나노입자, 임플란트 또는 수액 기기에 혼입될 수 있다. 마이크로스피어 및/또는 마이크로캡슐을 제조하는데 사용되는 물질들은 예컨대 생분해성/생침식성 폴리머, 예컨대 폴리갈락틴, 폴리-(이소부틸 시아노아크릴레이트), 폴리(2-히드록시에틸-L-글루타민)이다. 제어 방출 비경구 제형을 제형화시킬 때 사용될 수 있는 생적합성 캐리어는 탄수화물(예컨대, 덱스트란), 단백질(예컨대, 알부민), 지질단백질 또는 항체이다. 임플람트에 사용하기 위한 물질은 비-생분해성(예컨대, 폴리디메틸실록산) 또는 생분해성(예컨대, 폴리(카프로락톤), 폴리(글리콜산) 또는 폴리(오르소 에스테르))일 수 있다.
대체 경로
비록 덜 바람직하고 덜 편리할지라도, 다른 투여 경로 및 이에 따른 다른 제형들이 고려될 수 있다. 이와 관련하여, 직장에 적용하기 위해, 조성물에 대해 적합한 투여 형태는 좌제(에멀젼 또는 현탁액 타입), 및 직장 젤라틴 캡슐(용액 또는 현탁액)일 수 있다. 전형적인 좌제 제형에서, 활성 약물(들)은 적합한 약학적으로 허용가능 한 좌제 기재, 예컨대 코코아 버터, 에스테르화 지방산, 글리세린화 젤라틴, 및 다양한 수용성 또는 수분산성 염기, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜과 조합된다. 다양한 첨가제, 증강제 또는 계면활성제들이 혼입될 수 있다.
약학적 조성물은 또한 통상적인 무-독성의 약학적으로 허용가능 한 캐리어 및 첨가제, 예컨대 마이크로스피어 및 리포좀을 함유하는 투여 형태 또는 제형의 경피 흡수를 위해 피부에 대해 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 제형에는 크림, 연고, 로션, 도포제, 겔, 히드로겔, 용액, 현탁액, 스틱, 스프레이, 페이스트, 플라스터, 및 다른 종류의 경피 약물 전달 시스템들이 포함된다. 약학적으로 허용가능 한 캐리어 또는 첨가제에는 에멀젼화제, 항산화제, 완충제, 보존제, 습윤제, 침투 촉진제, 킬레이트제, 겔-형성제, 연고 기재, 향수, 및 피부 보호제가 포함될 수 있다.
보존제, 습윤제, 침투 촉진제는 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트, 및 벤즈알코늄 클로라이드, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 우레아 등일 수 있다.
피부에 대해 국부 투여하기 위한 전술한 약학 조성물은 또한 치료하려는 신체의 부위상에 또는 신체의 부위에 가까이 국부 투여하는 것과 연관되어 사용될 수 있다. 조성물은 직접 적용하거나, 또는 특정 약물 전달 도구, 예컨대 드레싱 또는 대안적으로는 플라스터, 패드, 스폰지, 스트립, 또는 적절한 가요성 물질의 다른 형태들을 이용하여 적용하기 위해 개조될 수 있다.
치료의 투여량 및 기간
조합의 약물은 같거나 상이한 약학 제형으로 수반되어 투여되거나 연속적으로 투여될 수 있다는 것이 인식될 수 있다. 연속적인 투여의 경우, 제2(또는 추가의) 활성성분의 지연이 활성성분의 조합의 유효한 효과의 이점을 상실하도록 해서는 안 된다. 본 기재에 따른 조합에 대한 최소 요구조건은, 조합은 활성 성분의 조합의 유효한 효과에 기인한 조합된 사용을 위해 의도된 것이어야 한다는 것이다. 조합의 목적하는 사용은 본 발명에 따른 조합을 사용하도록 도와주는 설비(facilities), 규정(provisions), 적응(adaptations) 및/또는 다른 수단들에 의해 추론될 수 있다.
비록 본 발명의 활성 약물이 분할된 투여량으로, 예컨대 매일 2회 또는 3회로 투여되는 경우라도, 조합 내 각 약물의 단일 일일 투여량이 바람직하고, 단일 약학적 조성물 내 모든 약물들의 단일 일일 투여량(단위 투여 형태)이 가장 바람직하다.
용어 “단위 투여 형태(unit dosage form)”는 인간 개체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위(예컨대, 캡슐, 정제 또는 로드된 시린지 실린더)를 나타내며, 각각의 단위는 원하는 치료 효과를 생산하기 위해 계산된 예정된 양의 활성 물질 또는 물질들을 필요한 약학적 케리어와 결부하여 함유한다.
투여는 일반적으로 반복된다. 이는 수 일에서 수년 동안 일일 1회 내지 수 회일 수 있고, 심지어 환자의 수명 동안일 수 있다. 만성적인 또는 적어도 주기적으로 반복되는 장기간 투여가 대부분의 경우에서 지시된다.
부가적으로, 특정 환자에 대한 게놈약학적(치료제의 약동학적, 약력학적 또는 치료의 효능 프로파일에 대한 유전자타입의 효과) 정보가 사용되는 투여량에 영향을 줄 수 있다.
더 높은 투여량이 요구되는 특히 악화된 경우에 응답하는 경우를 제외하고는, 조합 내 각 약물의 바람직한 투여량은 장기간 유지 요법에 보통 처방되고, 임상 3상에서 안전하다고 입증된 것들을 넘어서지 않는 투여량의 범위내에서 존재한다.
본 발명의 하나의 놀라운 이점은 각 화합물이 조합 요법에서 낮은 용량을 사용된다는 것으로, 조합되어, 환자에 대한 실질적인 임상적 이점을 제공한다. 조합 요법은 실제로 화합물이 개별적으로는 실질적인 효과를 갖지 않는 용량에서 효율적일 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정의 이점은 각 화합물의 서브-최상의 용량, 즉 보통 처방되는 치료적 용량보다 더 낮은 용량, 바람직하게는 치료적 용량의 1/2, 더욱 바람직하게는 1/3, 1/4, 1/5, 또는 심지어 더욱 바람직하게는 치료적 용량의 1/10을 사용할 수 있도록 하는데 존재한다. 특히 예로, 치료적 용량의 1/20, 1/30, 1/50, 1/100 만큼 낮은, 또는 심지어 그 보다 더 낮은 용량이 사용된다.
상기 서브-최상의 투여량에서, 화합물 단독은 실질적으로 비활성이지만, 본 발명에 따른 조합(들)은 충분히 효과적이다.
바람직한 투여량은 장기간 유지 요법에서 보통 처방되는 것의 1% 내지 50%의 양에 대응된다.
가장 바람직한 투여량은 장기간 유지 요법에서 보통 처방되는 것의 1% 내지 10%의 양에 대응된다.
본 발명에서 사용되는 약물의 투여량의 특정 예는 하기에 제공된다:
- 브로모크립틴: 경구 약 0.01 내지 10 mg/일, 바람직하게는 5 mg/일 미만 , 더욱 바람직하게는 2.5 mg/일 미만, 심지어 더욱 바람직하게는 1 mg/일 미만, 여기서 상기 투여량은 특히 경구 투여에 적합함,
- 이펜프로딜: 경구 약 0.4 내지 6 mg/ 일, 바람직하게는 3 mg/일 미만 더욱 바람직하게는 1.5 mg/일 미만, 심지어 더욱 바람직하게는 0.75 mg/일 미만, 여기서 상기 투여량은 특히 경구 투여에 적합함,
- 메실레틴: 경구 약 6 내지 120 mg/일, 바람직하게는 60 mg/일 미만, 더욱 바람직하게는 30 mg/일 미만, 심지어 더욱 바람직하게는 15 mg/일 미만, 여기서 상기 투여량은 특히 경구 투여에 적합함,
- 목시플록사신: 경구 약 4 내지 40 mg/일, 바람직하게는 20 mg/일 미만, 더욱 바람직하게는 10 mg/일 미만, 심지어 더욱 바람직하게는 5 mg/일 미만, 여기서 상기 투여량은 특히 경구 투여에 적합함,
- 토라세미드: 경구 약 0.05 내지 4 mg/일, 바람직하게는 2 mg/일 미만, 더욱 바람직하게는 1 mg/일 미만, 심지어 더욱 바람직하게는 0.5 mg/일 미만, 여기서 상기 투여량은 특히 경구 투여에 적합함,
- 트리메타지딘: 경구 약 0.4 내지 6 mg/일, 바람직하게는 3 mg/일 미만, 더욱 바람직하게는 1.5 mg/일 미만, 심지어 더욱 바람직하게는 0.75 미만 mg/일, 여기서 상기 투여량은 특히 경구 투여에 적합함,
- 아캄프로세이트: 경구 약 1 내지 400 mg/일,
- 아미노카프로익 산: 경구 약 0.1 g 내지 2.4 g/일,
- 바클로펜: 0.01 내지 150 mg/일, 바람직하게는 100 mg/일 미만, 더욱 바람직하게는 50 mg/일 미만, 가장 바람직하게는 5 내지 40 mg/일, 심지어 더욱 바람직하게는 35 mg/일 미만, 일반적으로 15 mg/일, 12 mg/일, 24 mg/일, 30 mg/일, 여기서 상기 투여량은 특히 경구 투여에 적합함,
- 디에틸카바마진: 경구 약 0.6 내지 600 mg/일,
- 시나칼셋: 경구 약 0.3 내지 36 mg/일,
- 신나리진: 경구 약 0.6 내지 23 mg/일,
- 에플레레논: 경구 약 0.25 내지 10 mg/일,
- 레플루노마이드: 경구 약 0.1 내지 10 mg/일,
- 레보시멘단: 경구 약 0.04 내지 0.8 mg/일,
- 설피속사졸: 경구 약 20 내지 800 mg/일,
- 설로덱사이드: 경구 약 0.05 내지 40 mg/일,
- 테르비나핀: 경구 약 2.5 내지 25 mg/일,
- 조니사마이드: 경구 약 0.5 내지 50 mg/일.
실제로 투여되는 양은 치료하려는 상태 또는 상태들, 투여하려는 정확한 조성물, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 환자 증상의 중증도 및 선택된 투여 경로를 포함한 관련 상황들의 측면에서 의사가 결정할 것이라는 점을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 투여량의 범위는 본원의 개시내용에 대한 일반적인 가이드를 제공하고 본원의 개시내용을 뒷받침하기 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
하기의 실시예들은 설명을 목적으로 제시되고, 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예
실험동물의 취급 및 양육 뿐만 아니라 실험들은 I.A.S.P의 연구 및 윤리적 이슈를 위한 위원회의 가이드라인 [guidelines of the Committee for Research And Ethical Issue of the I.A.S.P., 1983]에 따라 수행되었다.
A) Aβ 독성에 관련되는 질환의 치료
일련의 연구에서, 후보 화합물이 인간 Aβ1 -42의 독성 효과를 예방하거나 감소시키는 능력에 대해 시험되었다. Aβ1 -42 는 AD를 앓는 인간 환자에게서 생검을 통해 발견된 응집물을 구성하는 전장(full length) 펩타이드이다. 약물은 먼저 개별적으로 시험되고, 그 후 이들의 조합 작용에 대한 에세이가 수행되었다. AD의 상이한 생리적 특징을 보이는 생체 외 모델 내 화합물의 활성을 추가로 확인하기 위하여, 효과는 다양한 세포 타입에 대해 측정되었다. 또한, 체내 연구는 AD의 마우스 모델에서 수행되어, 화합물의 i) 동물 인지 능력, 및 ii) AD의 분자적 홀마크(세포 사멸 유도, 산화적 스트레스 유도, 염증 경로 유도)에 대한 효과를 평가함으로써, 보호적 효과를 확인하였다.
I. 화합물은 인간 Aβ 1 -42 의 독성을 방지한다.
I.1. 인간 뇌 미세혈관 내피세포 모델에서 Aβ 1 -42 의 독성으로부터의 보호
Aβ1 -42 독성에 대해 후보 화합물(들)에 의해 제공되는 보호를 연구하기 위해 인간 뇌 미세혈관의 내피세포 배양물이 사용되었다.
인간 뇌 미세혈관의 내피 대뇌 세포(HBMEC, ScienCell 참조: 1000, 제10계대에서 동결)는 +37℃ 항온조에서 빠르게 해동되었다. 상청액은 즉시 송아지태아혈청(FCS; GIBCO 참조 10270-106) 10%를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; Pan Biotech 참조: P04-03600)에 가해졌다. 세포 현탁액은 +4℃에서 10분 동안 180 xg에서 원심분리되었고, 펠렛은 1.6%의 무혈청 RocketFuel(세포 시스템, 참조: SF-4Z0-500-R, Batch 54102), 2%의 페니실린 10.000 U/ml 및 스트렙토마이신 10 mg/ml(PS ; Pan Biotech 참조: P06-07100 batch 133080808)를 가지는 CSC 무-혈청 배지(CSC serum free, 세포 시스템, 참조: SF-4Z0-500-R, Batch 51407-4) 내에 현탁되고, 96 웰-플레이트(matrigel layer biocoat angiogenesis system, BD, 참조 354150, Batch A8662) 에서 웰당 20 000개 세포의 밀도로 최종 볼륨 100μl로 파종되었다. 마트리겔 지지체상에서, 내피 대뇌 세포는 자발적으로 모세혈관망 형태형성 과정을 시작하였다(33).
3개의 분리된 배양이 상태마다 수행되었고, 6개의 웰이 상태마다 수행되었다.
후보 화합물 및 인간 아밀로이드- β 1 -42 의 처리
요약하면, Aβ1 -42 펩타이드(Bachem, 참조: H1368 batch 1010533)는 20μM(모액)에서 한정 배양 배지에서 재구성되었고, 응집을 위해 암실에서 +37℃로 3일간 천천히 진탕되었다. 대조군 배지가 동일한 상태에서 제조되었다.
3일 후에, 이러한 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드는 대조군 배지에서 희석된 2.5μM으로 HBMEC에 대해 사용되었다(최적 인큐베이션 시간). Aβ1 -42 펩타이드는 18시간 인큐베이션 동안 마트리겔상에서 HBMEC를 파종하고 2시간 후에 첨가되었다.
마트리겔 상 HBMEC 파종하고 1시간 후에, 시험 화합물 및 VEGF-165가 배양배지(+ 0.1 % DMSO) 내 용해되고, 이어서, Aβ1 -42 적용 전 1시간 동안 HBMEC와 함께 전-인큐베이션되었다(배양 웰 당 최종 볼륨 100μl). 시험 화합물 또는 VEGF 인큐베이션 1시간 후(마트리겔 상 세포 시딩 2시간 후), 100μl의 Aβ1 -42 펩타이드가 첨가되어, 추가 약물 희석을 방지하기 위해 시험 화합물 또는 VEGF의 존재 하 대조군 배지에서 희석된 2.5μM의 최종 농도에 도달되었다(웰 당 200 μl 총 볼륨).
배양 플레이트의 조직화
VEGF-A의 혈관형성유발(pro-angiogenic) 이소폼으로 알려진 VEGF-165는 참조 화합물로서 본 연구의 모든 실험에 사용되었다. VEGF-165는 혈관형성에 관여하는 가장 풍부한 VEGF 이소폼들 중 하나이다. VEGF는 참조 시험 화합물로서 10nM으로 사용되었다.
하기의 조건들이 평가되었다:
- 음성 대조군: 배지 단독 + 0.1% DMSO
- 중독(intoxication): 18 시간 동안 아밀로이드-β1 -4(2.5μM)
- 앙성 대조군: 18시간 인큐베이션 시간 동안 Aβ1 -42(2.5 μM)의 첨가 1시간 전 VEGF-165(10nM)(1개 참조 화합물/배양)
- 시험 화합물: 18시간 인큐베이션 시간 동안 Aβ1 -42(2.5 μM)의 첨가 1시간 전 시험 화합물
모세혈관망 정량화
웰당, 4x 렌즈로 2개의 사진이 광 투과 InCell AnalyzerTM 1000(GE Healthcare)를 사용하여 촬영되었다. 모든 이미지들은 동일한 상태에서 촬영되었다. 혈관형성 망의 분석은 Developer 소프트웨어(GE Healthcare)를 이용하여 수행되었다. 모세혈관망 총 길이가 평가되었다.
데이터 처리
모든 값들은 3개 배양의 평균 ± 표준오차(s.e.) 평균으로서 나타낸다(n = 조건 당 6). 통계 분석은 상이한 조건들에서 ANOVA를 통해 수행되었으며, 이어서 가능하다면 Dunnett 테스트를 수행하였다(Statview 소프트웨어 버전 5.0). 그래프에 삽입된 값(%)들은 아밀로이드 독성 진행(evolution)을 보여준다. 실제로, 아밀로이드 독성은 100%로서 취급되었으며, 시험 화합물 효과는 이러한 아밀로이드 독성의 a %로서 산출되었다.
결과
결과는 도 1에 도시된다. 결과에 따르면, 시험된 약물 단독은 Aβ 펩타이드 1-42에 의해 유발된 독성에 대한 실질적인 보호 효과를 유도하였다:
- 토라세미드는, 예컨대, 400 nM의 낮은 투여량에서, 강한 보호 효과를 유발한다;
- 브로모크립틴은, 예컨대, 3.2 nM의 낮은 투여량에서, 강한 보호 효과를 유발한다.
이와 같이 획득된 결과는 또한 전술한 약물 농도에 비해 더 높거나 더 낮은 약물 농도가 본 모델 내 Aβ 1-42 독성에 대해 악화될 수 있거나 오히려 더 적은 보호 효과 내지 전혀 보호 효과를 갖지 않을 수 있다는 점을 놀랍게도 보여준다.
I.2 일차 피질 뉴런 세포상에서 Aβ 1 -42 의 독성에 대한 보호
시험 화합물 및 인간 아밀로이드- β1 -42 처리
래트 피질 뉴런이 문헌 [Singer et al.](42)에 기재된 바와 같이 배양되었다. 요약하면, 임신 15일의 임신 암컷 래트가 자궁경부의 전위에 의해 죽여졌고(Rats Wistar), 자궁에서 태아가 제거되었다. 피질이 제거되고, 1%의 소 혈청 알부민(BSA) 및 2%의 페니실린 10.000 U/ml 및 스트렙토마이신 10mg/ml를 함유하는 Leibovitz(L15)의 아이스-콜드 배지에 놓여졌다. 피질이 37℃에서 20분 동안 트립신에 의해 해리되었다(0.05%).상기 반응은 DNase1 grade II 및 10%의 송아지태아 혈청(FCS)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)의 첨가에 의해 중단되었다. 이어서, 세포들은 10 ml 피펫을 통해 3개의 일련 계대에 의해 기계적으로 해리되었으며, +4℃에서 10분 동안 515 x g에서 원심분리되었다. 상청액은 버려졌으며, 세포의 펠릿은 B27(2%), L-글루타민(0.2mM), 2%의 PS 용액 및 10ng/ml의 BDNF가 보충된 Neurobasal로 구성된 한정 배양 배지에 재-현탁되었다. 생존 세포는 트리판 블루 배제 시험을 이용하여 Neubauer 세포계산기에서 카운팅되었다. 세포들은 96 웰-플레이트에서 30 000 세포/웰의 밀도로 파종되었으며(웰은 폴리-L-리신(10μg/ml)으로 사전코팅되었음), 가습공기(95%)/CO2(5%) 대기에서 +37℃에서 배양되었다.
요약하면, Aβ1 -42 펩타이드는 40μM(모액)로 한정 배양 배지에서 재구성되었으며, 응집을 위해 암실에서 3일 동안 +37℃에서 천천히 진탕되었다. 대조군 배지가 동일한 상태에서 제조되었다.
3일 후에, 용액은 하기와 같이 일차 피질 뉴런에 대해 사용되었다:
뉴런 배양 10일 후에, 약물은 배양배지(+ 0.1% DMSO)에 용해되었으며, 이어서 Aβ1 -42를 적용하기 전 1시간 동안 뉴런과 함께 전-인큐베이션되었다(배양 웰 당 최종 부피 100μl). 약물(들) 인큐베이션 1시간 후에, 100μl의 Aβ1 -42 펩타이드가 추가 약물(들) 희석을 피하기 위하여 약물(들)의 존재하에 희석된 최종 농도 10μM에 첨가되었다. 피질 뉴런은 24시간 동안 중독되었다. 3개의 분리된 배양이 조건마다 수행되었으며, 6개의 웰이 조건마다 사용되었다.
BDNF(50ng/ml) 및 에스트라디올-β(150nM)가 각각 양성 대조군 및 참조 화합물로서 사용되었다.
배양 플레이트의 조직화
150nM의 에스트라디올-β가 양성 대조군으로서 사용되었다.
에스트라디올-β는 배양 배지에 용해되었으며, 응집된 아밀로이드-β1 -42를 적용하기 전 1시간 동안 전-인큐베이션되었다.
하기의 조건들이 평가되었다:
- 대조 플라크: 12 웰/조건
* 음성 대조군: 배지 단독 + 0.1% DMSO
* 중독: 24시간 동안 아밀로이드-β1 -42(10 μM)
* 참조 화합물: 에스트라디올(150nM) 1시간.
- 약물 플레이트: 6 웰/조건
* 음성 대조군: 배지 단독 + 0.1% DMSO
* 중독: 24시간 동안 아밀로이드-β1 -42(10 μM)
* 약물: 약물- 1시간, 그 후 아밀로이드-β1 -42(10 μM) 24시간 동안
락트산 탈수소효소( LDH ) 활성 에세이
중독 24시간 후에, 상청액이 제거되고 Cytotoxicity Detection Kit(LDH, Roche Applied Science, 참조: 11644793001, batch: 11800300)로 분석되었다. 세포 독성의 정량화를 위한 상기 비색 분석은 사멸 세포의 사이토졸로부터 상청액으로 방출되는 락트산 탈수소효소(LDH) 활성의 측정에 기초한다.
데이터 처리
모든 값들은 3개 배양의 평균 ± 표준오차(s.e.) 평균으로서 나타낸다(n = 조건 당 6). 통계 분석은 상이한 조건들에서 수행되었다(ANOVA, 이어서 가능하다면 Dunnett 테스트, Statview 소프트웨어 버전 5.0).
결과
일차 피질 뉴런 세포에 대한 독성 에세이에서 개별적으로 선택된 약물에 대해 획득된 결과들이 도 2, 26 및 27에 도시된다. 이는 Aβ 펩타이드 1-42에 의해 야기되는 독성에 대해 시험된 약물들이 단독으로 실질적인 보호 효과를 유도한다는 점을 입증한다:
- 트리메타지딘은, 예컨대 40nM의 낮은 용량에서 강한 보호 효과를 유발한다;
- 멕실레틴은 3.2 nM 정도로 낮은 투여량으로 강한 보호 효과를 유발한다;
- 브로모크립틴은 40 nM 정도로 낮은 투여량으로 강한 보호 효과를 유발한다;
- 이펜프로딜은 600 nM 정도로 낮은 투여량으로 강한 보호 효과를 유발한다;
- 목시플록사신은 20 nM 정도로 낮은 투여량으로 강한 보호 효과를 유발한다;
- 토라세미드는 200 nM의 투여량으로 강한 보호 효과를 유발한다;
- 호모타우린은 8 nM의 투여량으로 강한 보호 효과를 유발한다.
이와 같이 획득된 결과는 또한 전술한 약물 농도에 비해 더 높거나 더 낮은 약물 농도가 신경 세포에 대한 Aβ 1-42 독성에 대해 악화될 수 있거나 오히려 더 적은 보호 효과 내지 전혀 보호 효과를 갖지 않을 수 있다는 점을 놀랍게도 보여준다.
II. 조합 요법은 인간 Aβ 1 -42 의 독성을 방지한다.
II.1 인간 HBMEC 세포에서 인간 Aβ 1 -42 펩타이드의 독성에 대한 조합 치료의 효과
본 발명의 약물 조합의 효능이 인간 세포에 대해 평가된다. 이러한 에세이에서 사용되는 프로토콜은 상기 I.1 부분에 기재된 것과 동일하다.
결과
시험된 약물 조합들 모두는 하기의 표 3에 보여진 바와 같이 그리고 도 3 내지 6과 도 13 및 14에서 예증된 바와 같이 HBMEC 모델에서 인간 Aβ1 -42 펩타이드의 독성에 대해 보호 효과를 나타낸다. 이러한 결과는 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42 2.5μM)에 의한 중독이 본 발명의 조합에 의해 유의적으로 방지되는 반면, 상기 농도에서 약물 단독으로는 상기 기재된 실험 조건에서의 중독에 대해 유의적인 효과를 나타내지 못한다는 점을 명백하게 보여준다.
[표 3]
Figure pct00003
도 3 내지 6, 13 및 14에서 예증된 바와 같이, 하기의 약물 조합은 중독된 HBMEC 세포에서 인간 Aβ1 -42 펩타이드의 독성에 대해 특히 흥미로운 보호 효과를 나타낸다:
- 바클로펜 및 토라세미드,
- 설피속사졸 및 토라세미드,
- 토라세미드 및 에플레레논,
- 설피속사졸 및 브로모크립틴,
- 테르비나핀 및 토라세미드, 또는
- 시나칼셋 및 메실레틴.
II.2 일차 피질 뉴런 세포상에서 인간 Aβ 1 -42 펩타이드의 독성에 대한 조합 치료의 효과
본 발명의 약물 조합의 효능이 일차 피질 뉴런 세포 상에서 평가된다. 이러한 에세이에서 사용되는 프로토콜은 상기 I.2 부분에 기재된 것과 동일하다.
결과
시험된 약물 조합들 모두는 하기의 표 4에서 보여지고 도 7 내지 12 및 16 내지 22에서 예증 된 바와 같이 일차 피질 뉴런 세포에서 인간 Aβ1 -42 펩타이드의 독성에 대해 보호 효과를 나타낸다. 이러한 결과는 응집된 인간 아밀로이드 펩타이드(Aβ1-42 10μM)에 의한 중독이 본 발명의 조합에 의해 유의적으로 방지되는 반면, 상기 농도에서 약물 단독으로는 상기 기재된 실험 조건에서의 중독에 대해 유의적인 효과를 나타내지 못한다는 점을 명백하게 보여준다.
[표 4]
Figure pct00004
Figure pct00005
도 7 내지 12 및 15 내지 22에서 예증 된 바와 같이, 하기의 약물 조합은 중독된 일차 피질 뉴런 세포에서 인간 Aβ1 -42 펩티드의 독성에 대해 특히 흥미로운 보호 효과를 나타낸다:
- 아캄프로세이트 및 이펜프로딜,
- 바클로펜 및 메실레틴,
- 바클로펜 및 토라세미드,
- 바클로펜 및 트리메타지딘,
- 시나칼셋 및 메실레틴,
- 신나리진 및 트리메타지딘,
- 트리메타지딘 및 조니사마이드.
- 메실레틴 및 이펜프로딜,
- 목시플록사신 및 바클로펜,
- 목시플록사신 및 시나칼셋,
- 목시플록사신 및 트리메타지딘,
- 목시플록사신 및 설피속사졸,
- 목시플록사신 및 조니사마이드, 또는
- 토라세미드 및 설피속사졸.
II.4. Aβ 1 -42 독성에 대한 신경돌기 성장의 보호
시험 화합물 및 Aβ1 -42 처리
일차 래트 피질 뉴런이 전술된 바와 같이 배양된다.
배양 10일 후에, 세포들은 약물과 함께 인큐베이션된다. 1시간 후에, 세포는 BDNF이 없는 한정 배지에서 그러나 약물과 함께 2.5μM의 베타-아밀로이드(1-42; Bachem)에 의해 중독된다. 피질 뉴런은 24시간 동안 중독된다. BDNF(10ng/ml)가 양성(신경보호) 대조군으로 사용된다. 3개의 독립 배양이 조건마다 수행되었으며, 조건마다 6개의 웰이 사용되었다.
신경돌기의 길이
중독 24시간 후에, 상청액이 제거되고, 피질 뉴런은 5분 동안 에탄올(95%) 및 아세트산(5%)의 차가운 용액에 의해 고정된다. 0.1%의 사포닌으로 투과성 화(permeabilization)된 후, 세포는 1% 송아지태아 혈청을 함유하는 PBS로 2시간 동안 블로킹된다. 그 후, 세포는 모노클로날 항체 항 미세소관-연관-단백질 2(MAP-2; Sigma)와 함께 인큐베이션된다. 이러한 항체는 Alexa Fluor 488 염소 항-마우스 IgG(Molecular probe)에 의해 나타난다. 뉴런의 핵은 형광 마커에 의해 표지된다(Hoechst 용액, SIGMA).
웰마다 20x 배율로 InCell AnalyzerTM 1000(GE Healthcare)을 사용하여 10개의 사진이 촬영된다. 모든 사진들은 동일한 상태에서 촬영된다. 신경돌기 망의 전체 길이를 평가하기 위하여, 신경돌기 망의 분석은 Developer 소프트웨어(GE Healthcare)를 이용하여 수행된다.
결과
바클로펜 및 토라세미드의 조합은 도 23에서 보여지는 바와 같이 일차 피질 뉴런 세포에서 인간 Aβ1 -42 펩티드의 독성에 대해 유의적인 보호 효과를 유도한다(신경돌기 망의 531% 향상). 이러한 결과는 인간 아밀로이드 펩티드(Aβ1 -42 2.5μM)에 의한 중독이 조합에 의해 유의적으로 방지된다는 점, 또한 대조군에 비해 조합은 신경돌기 망을 증대시킨다는 점을 명백하게 보여준다.
따라서, 상기 조합에 의해 인간 Aβ1 -42 펩티드의 독성에 대해 피질 뉴런 세포의 보호 및 세포 신경망의 보호가 효과적으로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 신경돌기 망의 증대는 척수 손상과 같은 신경 장애에서 상기 약물의 효능을 입증한다.
III. 화합물은 생체내에서 인간 Aβ 25 -35 의 독성을 방지한다.
동물
수컷 스위스 마우스가 본 연구에서 사용된다. 동물은 거동 실험 시간을 제외하고는 실험실 음식물과 물에 자유롭게 접근하면서 플라스틱 케이지에서 거주하고, 12시간 명/암 사이클(오전 8:00시에 불음 켬)로 규제된 환경하에 유지된다. 거동 실험은 방음되고 공기-조절된 실험방에서 수행되며, 여기서 마우스는 각 실험으로부터 적어도 30분 전에 익숙해졌다.
아밀로이드 펩티드 제조 및 주사
Aβ25 -35 펩티드 및 스크램블된 Aβ25 -35 펩티드가 멸균 이증류(bidistilled) 물에 용해되었으며, 사용시까지 -20℃에서 저장되었다. 광학현미경 관찰에 의해, 스크램블된 Aβ25 -35 펩티드가 아니라 Aβ25 -35 펩티드를 인큐베이션한 것은 2개 타입의 불용성 침전물, 복굴절 원섬유-유사 구조 및 비정질 구형 응집물의 존재를 야기하였다는 점이 나타났다. 그 후, β-아밀로이드 펩티드는 i.c.v.(뇌심실내: intracerebroventricularly) 투여된다. 요약하면, 각 마우스는 에테르에 의해 가볍게 마취되고, 게이지 스테인리스강 니들이 눈과 귀 사이에 같은 거리에서 두개골 면에 수직으로 각 눈으로부터 동일한 거리에 정중선 포인트의 우측 1 mm에 일방적으로 삽입된다. 펩티드 또는 비히클은 약 3초 내에 점진적으로 전달된다. 마우스는 주사한 후 1분 내에 정상적인 거동을 나타낸다. 투여 사이트는 예비 실험에서 Indian 잉크를 주사하여 체크된다. 니들의 삽입도, 그리고 담체의 주사도, 생존, 거동 반응 또는 인지 기능에 대해 유의적인 영향을 미치지 않았다.
약물(들) 처리
-1 일째에, 즉 Aβ25 -35 펩티드 주사하기 24시간 전에, 약물, 약물 조합 또는 비히클 용액이 매일 2회(오전 8:00, 및 오후 6:00시에) 위관 영양법에 의해 경구 투여된다.
0 일째에(오전 10:00시에), 마우스는 Aβ25 -35 펩티드 또는 스크램블된 Aβ25 -35 펩티드(대조군)가 최종 부피 3μl(3 mM)로 i.c.v. 주사된다.
0일째와 7일째 사이에, 약물, 약물 조합 또는 담체 용액이 매일 1회 또는 2회(오전 8:00시에, 및 오후 6:00시에) 위관 영양법에 의해 경구 투여된다. 하나의 동물 그룹은 단일 주사로(오전 8:00시에) 위관 영양법에 의해 경구적으로 도네페질(참조 화합물 - 1 mg/kg/day)을 수용한다. 약물은 물에 용해되고, 각각의 위관 영양법 투여 직전에 신선하게 제조된다.
7일째에, 모든 동물들은 Y-maze 테스트(공간적 작업 기억의 인덱스)에서 자발적 선택 능력에 대해 시험된다.
7일째 및 8일째에, 동물의 맥락적 장기 기억은 스텝-다운 타입 수동적 회피 과정을 이용하여 평가된다.
8일째에, 동물은 희생된다. 동물의 뇌가 해부되어, 추가 분석을 위해 -80℃에서 유지된다.
긍정적인 결과가 거동 행동에서 관찰되고, Aβ25 -35 펩티드 icv 주사로부터 7일 후에 생화학적 에세이가 특히 표 5에 기재된 조합에 대해 수행되었다.
[표 5]
Figure pct00006
IV. 화합물은 중독된 동물의 거동 및 인지 능력을 증대시켰다.
동물들은 상기 섹션에서와 같이 중독된다.
자발적 선택 능력-Y Maze 테스트
7일째에, 모든 동물들은 Y-maze(공간적 작업 기억의 인덱스)에서 자발적 선택 능력에 대해 시험 된다. Y-maze는 회색 폴리비닐클로라이드로 구성된다. 각 암(arm)은 40cm 길이, 13cm 높이, 하부에서 3cm 너비, 상부에서 10cm 너비이고, 동일한 각도에서 수렴된다. 각 마우스는 하나의 암의 끝에 위치되고, 8분의 시간 동안 미로를 통해 자유롭게 이동하도록 놓여진다. 동일한 암으로의 가능한 복귀를 포함하는 암 진입의 계열이 시각적으로 체크된다. 선택은 연속적인 경우에 대해 3개의 모든 암으로의 진입으로서 규정된다. 따라서, 최대 선택의 수는 암 진입의 총 수 - 2이고, 선택의 백분율은(실제 선택/ 최대 선택) x 100으로 계산된다. 매개변수에는 선택의 백분율(기억 인덱스) 및 암 진입의 총 수(탐사 인덱스)가 포함된다. 극적인 거동(선택 백분율 < 25% 또는 > 85% 또는 암 진입 수 < 10) 을 보이는 동물들은 버려진다. 통상적으로, 동물들의 0-5%이다. 이 테스트는 부수적으로 Aβ25 -35 주사에 의해 마우스에서 유도되는 기억상실 및 충돌을 거동 수준에서 분석하는 역할을 한다
수동적 회피 테스트
장치는 2-구획(15 x 20 x 15 cm 높이) 박스이고, 이들 중 하나는 흰색 폴리비닐클로라이드 벽으로 조명되고, 다른 하나는 검은색 폴리비닐클로라이드 벽과 그리드 바닥으로 어둡게 되어 있다. 길로틴 문은 각 구획을 분리한다. 상기 장치에서 40cm 위에 위치한 60W 램프는 실험 동안 흰색 구획을 조명한다. 스크램블된 사지충격(3초 동안 0.3mA)은 충격 생성 스크램블러(Lafayette Instruments, Lafayette, USA)를 이용하여 그리드 바닥에 전달될 수 있다. 길로틴 문은 훈련 기간 동안 처음에는 닫혀 있다. 각 마우스는 흰색 구획으로 위치된다. 5초 후에, 문이 올라간다. 마우스가 어두운 구획에 진입하고 그리드 바닥 위에 모든 발을 놓게 되면, 문이 닫히고 사지충격이 3초 동안 전달된다. 스텝-스루 잠재성(step-through latency), 즉 어두운 구획에 진입하는데 소모되는 잠재성, 및 발성의 횟수가 기록된다. 훈련한지 24시간 후에 기억 검사(retention test)가 수행된다. 각 마우스는 흰색 구획으로 다시 놓여진다. 5초 후에 문이 올라가고, 스텝-스루 잠재성 및 탈출 잠재성, 즉 흰색 구획으로 복귀하는데 소모되는 시간이 300초까지 기록된다.
긍정적인 결과가 표 6에 기재된 시험 조합에 대해 각각 관찰된다.
[표 6]
Figure pct00007
V. 본 발명의 화합물은 신경 질환의 신경생리적 관심을 향상시킨다.
조합 치료가 Aβ 중독증의 생체내 모델에서 시험된다. 신경 질환에서 영향을 미치는 여러 매개 변수들에 대한 그 효과가 평가된다:
- 카스파제(caspase) 3 및 9 발현 수준, 이는 세포자멸의 지표로서 고려됨,
- 지질 과산화, 이는 산화적 스트레스 수준에 대한 마커로서 고려됨,
- GFAP 발현 에세이, 이는 뇌 염증 수준의 마커로서 고려됨,
- 혈액 뇌 관문(Brain Blood Barrier) 온전성(integrity),
- 전반적 시냅스 온전성(시냅토파이신 ELISA).
혈액 뇌 관문(Brain Blood Barrier) 온전성
Aβ에 의한 동물 중독에 대한 실험 설계는 상기 III 부분에서와 같다.
혈액 뇌 관문(blood brain barrier: BBB) 온전성에 대한 조합 요법의 잠재적 보호 효과는 올리고머 아밀로이드-β25-35 펩타이드(Aβ25-35) 또는 스크램블된 Aβ25-35 대조 펩티드(Sc.Aβ)를 i.c.v.(뇌심실내) 주사한 마우스에서 주사한지 7일 후에 분석된다.
Aβ25 -35 주사한지 7일 후가 되는 날, 동물들은 EB(Evans Blue) 방법을 이용하여 BBB 온전성을 결정하기 위해 시험된다. EB 염료는 말초 주사 이후에 혈청 알부민에 결합하는 것으로 알려져 있으며, 이는 혈청 알부민에 대한 트레이서(tracer)로서 사용되어왔다.
EB 염료(식염수 중 2%, 4 ml/kg)는 심장관통 관류 3시간 전에 복강내(i.p.) 주사된다. 그 후, 마우스는 200μl의 전-혼합 케타민 80 mg/kg, 크실라진 10 mg/kg으로 i.p. 마취되고, 흉부가 개봉된다. 마우스는 우심방으로부터의 유체가 무색이 될 때까지 약 15분 동안 250 ml의 식염수로 심장을 관통하여 관류된다. 목을 벤 후에, 뇌가 제거되고, 3개의 부위로 해부된다: 대뇌 피질(좌 + 우), 해마(좌 + 우), 간뇌. 그 후, 각각의 뇌 영역은 EB-알부민 유출의 정량적 측정을 위해 칭량된다.
시료는 포스페이트-완충된 식염수에서 균질화되고, 단백질을 침전시키기 위해 60% 트리클로로아세트산의 첨가 이후에 소용돌이에 의해 혼합된다. 시료는 4℃에서 냉각되고, 이어서 10,000 g, 4℃에서 30분 원심분리된다. 상청액은 분광광도계를 이용하여 EB의 흡광도가 610 nm에서 측정된다.
EB는 하기의 2개로서 정량된다:
- EB-알부민의 알려진 농도에 의해 획득된 표준 곡선의 사용에 의해, 뇌 조직 μg/mg,
- 단백질 μg/mg.
표 7에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 조합 요법은 비-처리된 중독 동물과 비교할 때 BBB 온전성을 유지하는데 있어서 효과적이다.
전반적 시냅스 온전성 ( 시냅토파이신 ELISA)
시냅토파이신이 시냅스 온전성의 마커로서 선택되었으며, 이는 시판되는 ELISA 키트(USCN, Ref. E90425Mu)를 통해 분석된다. 시료는 해마 조직으로부터 준비되고, 제조사 및 참조 문헌에서 지시된 바와 같이 특이적인 추출 완충액에서 균질화된다.
조직들은 과량의 혈액을 완전하게 제거하기 위해 아이스-콜드 PBS(0.02 mol/l, pH 7.0-7.2)에서 세척되고, 질소 동결 및 -80℃ 저장 전에 칭량된다. 조직들은 작은 조각들로 절단되고, 유리 균질화기를 이용해 1ml 아이스-콜드 포스페이트 완충 식염수(PBS) 용액에서 균질화된다. 생성된 현탁액은 초음파 세포 분열기로 초음파처리되거나 2회의 동결-해동 사이클이 처리되어 세포막이 더 파괴된다. 그 후, 균질액은 5분 동안 5,000 g에서 원심분리되고, 상청액이 즉시 분석된다.
모든 시료들은 3회 분석된다.
단백질의 정량화는 추출 성능을 평가하고 정규화를 실시하기 위해 Pierce BCA(bicinchoninic acid) 단백질 에세이 키트(Pierce, Ref. #23227)를 이용하여 수행된다.
그 후, 총 단백질 농도는 표준 곡선 희석으로부터 산출되고, ELISA 결과를 정규화하는 역할을 한다.
그 결과(표 7)는 조합 요법이 비-처리된 중독 동물과 비교할 때 처리된 동물의 뇌에서 전반적 시냅토파이신 수준을 유지하는데 효과적이라는 점을 보여준다.
산화적 스트레스 에세이
마우스는 목이 베어지고, 2개의 해마가 신속하게 제거되어 칭량되고 분석될 때까지 액체 질소에서 유지된다. 해동 후에, 해마는 냉각 메탄올(1/10 w/v)에서 균질화되고, 5분 동안 1,000 g에서 원심분리되고, 상청액은 에펜도르프(eppendorf) 튜브에 놓여진다. 각 균질액의 반응 볼륨이 FeSO4 1 mM, H2SO4 0.25 M, 크실레놀 오렌지 1 mM에 첨가되고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션된다. 580nm에서의 흡광도를 판독한 후에(A580 1), 10μl의 큐멘 히드로퍼옥시드 1mM(CHP)이 시료에 첨가되고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션되어, 최대 산화 수준이 측정된다. 흡광도가 580nm에서 측정된다(A580 2). 지질 과산화의 수준은 CHPE = A580 1/A580 2 x [CHP]에 따라 CHP 당량(CHPE)으로서 측정되고, 이는 조직의 중량 당 CHP 당량으로서 나타내고 대조군 데이터의 백분율로서 나타낸다.
그 결과(표 7)는 조합 요법이 비-처리된 중독 동물과 비교할 때 처리된 동물의 뇌에서 Aβ에 의해 유도된 전반적 산화 스트레스를 감소시키는데 효과적이라는 점을 보여준다.
카스파제 경로 유도 에세이 및 GFAP 발현 에세이
마우스는 목이 베어지고, 2개의 해마가 신속하게 제거되고, 과량의 혈액을 완전하게 제거하기 위해 아이스-콜드 PBS(0.02 mol/l, pH 7.0-7.2)에서 세척되고, 칭량되고 분석할 때까지 액체 질소에서 유지된다. 조직들은 작은 조각들로 절단되고, 유리 균질화기를 이용해 1ml 아이스-콜드 PBS에서 균질화된다. 생성된 현탁액은 초음파 세포 분열기로 초음파처리되거나 2회의 동결-해동 사이클이 처리되어 세포막이 더 파괴된다. 그 후, 균질액은 5분 동안 5,000 g에서 원심분리되고, 상청액이 즉시 분석된다.
실험은 시판되는 에세이로서 카스파제-3(USCN - E90626Mu), 카스파제-9(USCN - E90627Mu), GFAP(USCN - E90068)를 이용하여 수행된다.
단백질의 정량화는 추출 성능을 평가하고 정규화를 실시하기 위해 Pierce BCA(bicinchoninic acid) 단백질 에세이 키트(Pierce, Ref. #23227)를 이용하여 수행된다.
그 결과(표 7)는 조합 요법이 비-처리된 중독 동물과 비교할 때 처리된 동물의 뇌에서 세포사멸 및 염증의 마커에 대해 긍정적인 효과를 갖는다는 점을 보여준다.
[표 7]
Figure pct00008
B) 뉴런 세포에 대한 글루타메이트 독성의 방지
이번 추가 실험 세트에서, 후보 화합물은 뉴런 세포 상에서 글루타메이트 독성의 효과를 방지하거나 감소시키는 능력에 대해 시험 되었다. 글루타메이트 독성은 신경 질환 또는 장애, 예컨대 다발성 경화증, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 헌팅턴병, 신경병증, 알코올 중독 또는 알코올 금단증, 또는 척수 손상의 발병에 관여한다. 약물은 먼저 개별적으로 시험되고, 그 후 이들의 조합 작용의 에세이가 수행된다.
방법
본 발명의 약물 조합의 효능은 일차 피질 뉴런 세포에 대해 평가된다. 이러한 에세이에서 사용되는 프로토콜은 상기 A.I.2 부분에 기재된 것과 동일하다.
글루타메이트 독성 에세이
화합물의 신경보호 효과는 글루타메이트성 뉴런을 특이적으로 나타내는 신경돌기 망(신경미세섬유 면역염색(NF))의 정량화에 의해 평가된다.
뉴런 배양 12일 후에, 후보 조합의 약물들이 배양배지(+ 0.1% DMSO)에 용해된다. 이어서, 후보 조합은 글루타메이트 손상되기 전 1시간 동안 뉴런과 함께 전-인큐베이션된다. 함께 인큐베이션되고 1시간 후에, 추가 약물 희석을 피하기 위하여 글루타메이트는 후보 조합의 존재하에 20분 동안 40μM의 최종 농도로 첨가된다. 인큐베이션의 말기에, 배지는 글루타메이트가 없지만 후보 조합을 갖는 배지로 교환된다. 배양물은 글루타메이트 손상 24시간 후에 고정된다. MK801(Dizocilpinehydrogen maleate, 77086-22-7 - 20μM)은 양성 대조군으로서 사용된다.
사포닌(Sigma)으로 투과성화된 후, 세포는 10% 염소 혈청을 함유하는 PBS로 2시간 동안 블로킹되고, 이어서 세포는 신경미세섬유 항체(NF, Sigma)에 대한 마우스 모노클로날 일차 항체와 함께 인큐베이션된다. 이러한 항체는 Alexa Fluor 488 염소 항-마우스 IgG에 의해 나타난다.
세포의 핵은 형광 마커에 의해 표지되고(Hoechst solution, SIGMA), 신경돌기 망이 정량화된다. 조건마다 6개의 웰이 사용되어, 3개의 다른 배양에서 신경 생존이 평가된다.
결과
시험 된 약물 조합들 모두는 피질 뉴런 세포에서 글루타메이트 독성에 대해 보호 효과를 나타낸다. 그 결과는 하기 표 8에 보여 진다.
도 24 및 25에서 예증 된 바와 같이, 본 발명의 조합은 전술한 실험 조건하에서 글루타메이트 독성으로부터 뉴런을 강력하게 보호한다. 약물이 단독으로 사용되면 유의적인 보호 효과가 없거나 더 낮게 나타나는 약물 농도를 이용하여 효과적인 보호가 획득된다는 점에 주목된다.
[표 8]
Figure pct00009
C) 본 발명의 조합을 사용하여 글루타메이트 흥분독성과 연관되는 다른 장애들의 개선
본 발명의 약물 및 약물 조합의 글루타메이트 독성에 대한 전술한 체외(in vitro) 보호 효과는 수개의 AD 모델에서 본원에서 예증 된 보호 효과와 결합 되었으며, 본 발명자들은 MS, ALS 및 신경병성 통증과 같이 글루타메이트 독성이 또한 관여되는 발병에서 다른 질환들의 일부 모델에 있어서 상기 약물 및 조합을 테스트하게 되었다.
I) 다발성 경화증의 생체내 모델에서 조합의 보호 효과
미엘린-올리고덴드로사이트 당단백질-면역화된(MOG-면역화된) 마우스에서 만성 진행 EAE가 진행된 모델이 다발성 경화증 치료에서 본 발명의 조성물의 이로운 효과를 입증하기 위하여 사용된다.
동물 및 화학물질
C57L/6J 암컷 마우스(8주령)가 Janvier(프랑스)에서 구입되고; 2주의 습관화 이후에, 암컷 마우스(10주령)는 MOG(미엘린 올리고덴드로사이트 지질단백질) 펩타이드에 의한 면역화 이후에 만성 마비가 진행된다. 실험적 뇌척수염은 EAE 유도(EK-0110, EK-0115; Hooke laboratories)를 위해 Hooke Kit MOG35 -55/CFA Emulsion PTX(Pertussis toxin)로 유도된다. 대조 키트는 CK-0115(Hooke laboratories)이다.
실험 과정
실험적 뇌척수염은 하기 과정에 의해 유도된다:
0일째에, 각각 0.1 ml의 피하 주사가 2회 수행되고, 여기는 1회는 마우스의 등 상부에 대해, 다른 1회는 마우스의 등의 더 하부에 대해 수행된다. 각각의 주사는 100μg의 MOG35 -55 펩타이드(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK), 200μg의 불활성화된 결핵균 H37Ra를 함유하고, 완전 프로인트 아쥬반트(CFA)(Hooke laboratories)에서 에멀젼화된다. 에멀젼은 MOG-특이적 자가면역 T 세포를 증식 및 분화시키는데 필요한 항원을 제공한다.
PBS 중 500ng의 백일해 독소(Pertussis toxin)의 2개의 복강내 주사(Hooke kit)가 MOG 주사로부터 2시간 후(0일째) 및 24시간 후(1일째)에 수행된다. 백일해 독소는 부가적 아쥬반트를 제공함으로써 EAE 진행을 증대시킨다.
마우스는 면역화로부터 8일 후에 EAE를 진행시키며, 실험 기간 동안 만성적으로 마비된 상태로 놓인다. 면역화 이후에, 마우스는 블라인드 과정에서 임상적 증상이 매일 관찰된다. 동물들은 통상의 무균 설비에서 유지되며, 모든 실험들은 [standing local committee of bioethics]에서 처방되고 승인된 가이드라인에 따라 수행된다.
실험군 및 약물 처리
전술한 암컷 마우스 군은 면역화 이전에 중량 균질화된다.
- 대조군: EAE 마우스의 동일한 조건에서 비히클 주사(제-1일째부터 28일째까지, 위약이 매일 제공됨).
- EAE 군: MOG 주사(0일째) + 백일해 독소 주사(0일째 및 1일째) - 제-1일째부터 28일째까지, 위약이 매일 경구 제공됨.
- EAE + 양성 대조군: MOG 주사(0일째) + 백일해 독소 주사(0일째 및 1일째) - 제-1일째부터 28일째까지, 덱사메타존이 매일 경구 제공됨.
- EAE + 처치군: MOG 주사(0일째) + 백일해 독소 주사(0일째 및 1일째). 치료는 면역화 1일 전에 시작되고 28일째까지 지속된다.
임상 스코어는 0-5-8-9-12-14-16-19-21-23-26-28일째에 측정된다.
통계 소프트웨어(Statsoft Inc.)가 통계 분석을 위해 계속 사용된다. ANOVA 분석 및 Student's t 테스트는 임상 질환 스코어를 분석하기 위해 이용된다. P < 0.05는 유의적인 것으로 고려된다.
발병의 지체, 임상 스코어 및 사망의 지체는 Cox 모델(R 패키지 "survival") 및 Kaplan-Meier 커브를 갖는 참조 "immu" 군에 대한 각각의 군 사이에서 비교되었다. 산출된 p-값은 단일적(unilateral)이고, 참조 "immu" 군에 비해 더 낫다는 가설을 테스트한다.
총 임상 스코어는 하기에 기재된 꼬리 스코어(tail score), 뒷다리 스코어(hind limb score), 앞다리 스코어(fore limb score) 및 방광 스코어(bladder score)로 구성된다:
꼬리 스코어:
Figure pct00010
뒷다리 스코어:
Figure pct00011
앞다리 스코어:
Figure pct00012
방광 스코어:
Figure pct00013
동물 각각에 대한 전체 스코어는 전술한 모든 카테고리를 더하여 결정된다. 살아있는 동물에 대해 최대 스코어는 10이다.
결과 - 조합 요법은 MS 모델에서 효과적이다.
전체 임상 스코어의 유의적인 개선이 "EAE + 처치군" 마우스에서 특히 하기 표 9에 기재된 조합에 대해 관찰된다.
[표 9]
Figure pct00014
II. ALS 모델에서 조합의 보호 효과
본 발명에 따른 조합 요법은 체외 공배양 모델에서 시험되고, 체외 ALS 마우스 모델에서 시험 된다. 프로토콜과 결과는 본 섹션에 기재된다.
II.1 신경-근육 공-배양의 일차 배양에서 글루타메이트 독성에 대한 보호 효 과
신경- 및 근육 세포의 일차 공배양
인간 근육은 건강한 환자의 생검 부분에서 이미 기술된 방법에 따라 준비된다(44). 근육 세포는 분리된 세포들로부터 구축되고(웰 당 10000 세포), 48 웰 플레이트 상에 젤라틴-코팅된 0.1%로 놓여지고, MEM 배지 및 M199 배지의 혼합으로 구성된 증식 배지에서 성장된다.
위성 세포 융합 이후에 즉시, 후근 신경절(DRG)이 부착된 13일령 래트 Wistar 배아 척수의 전체 횡단 슬라이스가 웰 당 근육 단층 1 절편체(explant) 상에 위치된다(중심 부위에). DRG는 신경분포(innervation) 비율을 우수하게 얻기 위해 필요하다. 신경분포 된 배양이 혼합 배지에서 유지된다. 통상의 공배양에서 24시간 후에, 신경염이 척수 절편체가 없어지면서 관찰된다. 이는 근관(myotube)과 접촉하게 되고, 8일 후에 첫 번째 수축을 유도한다. 그 후 신속하게, 척수 절편체에 근접하여 위치한 신경분포 된 근육 섬유는 사실상 계속적으로 수축하고 있다. 신경분포된 섬유는 비-신경분포된 섬유로부터 형태학적으로 그리고 공간적으로 구별되며, 용이하게 구분될 수 있다.
하나의 공배양이 수행된다(조건 당 6개의 웰).
글루타메이트 손상
27일째에, 공-배양물은 20분 동안 글루타메이트 중독(60μM) 1시간 전에 후보 화합물 또는 릴루졸과 함께 인큐베이션된다. 이어서, 공-배양물은 세척되고, 후보 화합물 또는 릴루졸이 추가 48시간 동안 첨가된다. 이러한 인큐베이션 시간 후에, 고정되지 않은 공배양물은 실온에서 15분 동안 500 nmol/L의 농도로 Alexa 488과 결합된 α-분가로독소와 함께 인큐베이션된다. 이어서, 공배양물은 실온에서 20분 동안 PFA에 의해 고정된다. 0.1%의 사포닌으로 투과성화된 후, 공배양물은 항-신경미세섬유 항체(NF)와 함께 인큐베이션된다.
이 항체는 Alexa Fluor 568 염소 항-마우스 IgG(Molecular probe)로 검출된다. 뉴런의 핵은 형광 마커(Hoechst 용액)로 표지된다.
종말점은 (1) 전체 신경돌기 길이, (2) 운동 단위의 수, (3) 전체 운동 단위 면적이며, 이들은 운동뉴런 생존 및 기능의 지표이다.
각 조건에 대해, 20x 배율로 InCell AnalyzerTM 1000(GE Healthcare)을 사용하여 웰마다 2 x 10개의 사진이 촬영된다. 모든 이미지들은 동일한 조건에서 촬영된다.
결과
본 발명의 약물은 공배양 모델에서 운동뉴런 및 운동 단위를 효과적으로 보호한다. 또한, 하기 표 10에 기재된 약물 조합에 대해 약물들이 조합되어 사용될 때 보호가 개선된 점이 주목된다.
[표 10]
Figure pct00015
II.2 - 조합 치료는 ALS 마우스 모델에서 효과적이다.
실험은 수컷 마우스에 대해 수행된다. 형질전환 수컷 마우스 B6SJL-Tg(SOD1)2Gur/J 마우스 및 이의 대조군(각각, SN2726 및 SN2297, 미국의 [Jackson Laboratories, Ben Harbor] 및 프랑스의 [Charles River]에서 판매됨)이 모의(mimic) ALS에 대한 이 실험 세트에서 선택된다.
병든 마우스는 내인성 인간 SOD1 프로모터에 의해 유발된 돌연변이 인간 SOD1 유전자(코돈 93에서 글리신이 알라닌으로 단일 아미노산의 치환)에 의해 설계된 SOD1 - G93A 이식유전자를 발현한다. 대조 마우스는 대조 인간 SOD1 유전자를 발현한다.
약물 투여
마우스는 출생 후 60일째부터 사망시까지 비히클 내 희석된 후보 약물 치료가 투여된다. 약물 후보의 희석된 용액은 투여 시작 직전에 실온에서 물을 이용하여 제조된다.
* 식용수에서:
릴루졸이 5% 시클로덱스트린 중 최종 농도 6mg/ml(각 군의 평균 체중에 조정됨)로 식용수에 첨가된다. 마우스가 약 5 ml/day로 마실 때, 추산되는 투여되는 양은 30mg/kg/day이고, 이는 마우스의 생존을 증가시키는 것으로 나타난 투여량이다.
- 시클로덱스트린은 저장액(시클로덱스트린 20%)으로부터 실온에서 물에 희석된 최종 농도 5%에서 비히클로서 사용된다.
* 경구 투여(구강을 통함):
- 약물 조합은 매일 경구 투여된다.
- 시클로덱스트린은 저장액(시클로덱스트린 20%)으로부터 실온에서 물에 희석된 최종 농도 5%에서 비히클로서 사용된다.
임상적 관찰
각 마우스의 임상적 관찰이 처치 제1일째(60일령)부터 사망시까지(또는 희생될 때까지) 매일 수행된다. 임상적 관찰은 거동 테스트: 마비의 시작, "스플레이(splay)의 상실", "정위반사(righting reflex)의 상실" 및 일반적인 걸음걸이 관찰을 연구하는 것으로 구성된다:
- 마비의 시작: 관찰은 각 다리에 대한 마비 관찰로 구성된다. 마비의 시작은 마비의 첫번째 징후가 나타난 날에 상응한다.
- 스플레이 상실 테스트는 마우스가 꼬리로 매달릴 때 뒷다리의 위치(다리가 늘어뜨려짐 또는 다리를 벌림) 및 떨림 또는 흔들림의 표시로 구성된다.
- 정위반사 상실 테스트는 양측을 공격받는 30초 내에 몸을 바로잡는 마우스의 능력을 평가한다. 마우스가 몸을 바로잡을 수 없는 경우, 정위반사는 상실된다. 정위반사의 상실은 질환의 말기를 결정한다: 몸을 바로잡을 수 없는 마우스는 안락사된다.
결과 - 조합 치료는 ALS 생체내 모델에서 효과적이다.
본 발명의 약물 및 약물 조합으로 처치된 병든 동물에게서 질환의 개선이 관찰된다. 특히, 표 11에 기재된 약물 조합에 의해, 질환의 상이한 단계 동안 상기 동물의 임상 스코어가 효과적으로 개선된다.
[표 11]
Figure pct00016
III) 신경병증성 통증에 대한 생체내 모델로서 옥살리플라틴 유도된 신경병증에서 본 발명의 조합이 나타내는 보호 효과
본 발명의 조합 치료는 말초 신경병증의 적절한 모델, 즉 옥살리플라틴-유도된 신경병증의 급성 모델 및 옥살리플라틴-유도된 신경병증의 만성 모델에서 생체내 테스트된다. 동물, 프로토콜 및 결과는 여기에 기재된다.
동물 양육
옥살리플라틴 처리 실험을 시작 시(D0) 150-175 g으로 칭량된 Sprague-Dawley 래트(CERJ, 프랑스)가 사용된다. 동물들은 12시간-명/암 사이클을 갖고 온도(19.5℃-24.5℃) 및 상대습도(45%-65%)가 조절된 방에서 접근제한된 동물 설비에서 거주하고, 연구 내내 표준 펠릿화된 실험실 음식과 물에 자유롭게 접근한다. 동물들은 케이지당 4 마리 또는 5 마리가 거주하고, 일주일의 적응 기간이 임의의 테스트 이전에 확인된다.
실험 설계
래트의 하기 4개 군이 모든 실험에서 사용된다:
대조군:
제1군: 옥살리플라틴의 비히클(증류수), i.p. / 후보 조합(들)의 비히클(증류수), p.o. 매일.
제2군: 옥살리플라틴(증류수), i.p. / 후보 조합(들)의 비히클(증류수), p.o. 매일.
제3군: 옥살리플라틴 3 mg/kg i.p. / 증류수 중 단일 약물, p.o. 매일 x 9.
시험 조성물 군:
제4군: 옥살리플라틴 3 mg/kg i.p. / 증류수 중 후보 조합(들), p.o. 매일 x 9.
제5군: 옥살리플라틴 3 mg/kg i.p. / 증류수 중 가바펜틴(100 mg/kg), p.o. 시험일(즉, D1 및 D8);
비히클 및 시험 물질은 D-1부터 D7(마지막 시험일 전날)까지 매일 전달되는 반면, 가바펜틴은 시험일에 투여된다(시험 120분 전).
모든 처치는 가능한 때에 코드된 임의의 순서로 투여된다. 투여량은 자유 활성 물질의 측면에서 표현된다.
신경병증 유도
급성 신경병증은 옥살리플라틴(3　mg/kg)의 단일 복강내 주사에 의해 유도된다.
만성 말초 신경병증은 0, 2, 4 및 7일에 옥살리플라틴(3 mg/kg, i.p.)의 반복적인 복강내 주사에 의해 유도된다(CD = 12 mg/kg, i.p.). 인간에게서 만성 신경병증은 역시 누적되고, 래트에서 누적 투여량으로서 ~15 mg/kg에 상응하는 540 mg/m2 이상의 옥살리플라틴의 총 투여량이 제공된 환자에게서 가장 흔하게 나타난다(Cersosimo R.J. 2005).
래트에서 옥살리플라틴-유도된 통증성 신경병증은 옥살리플라틴-처치된 환자에게서 통증 증상을 재현한다:
- 열 통각 과민증은 가장 초기의 증상이다. 이는 아세톤 테스트로 측정되거나, 또는 꼬리-침지 테스트로 측정될 수 있다;
- 기계적 통각 과민증은 더 나중에 나타난다. 이는 Von Frey 테스트로 정량화되거나, 또는 발 압력 테스트로 정량화될 수 있다.
동물 투여 및 테스트
모든 약물 조합들은 옥살리플라틴 3 mg/kg의 첫번째 복강내 주사 전날(D-1)부터 투여되고, D7까지 매일 경구적으로 투여된다. 시험일(즉, D1 및 D7) 동안, 약물 조합들은 시험 이후에 투여된다. 참조-처치된 군(가바펜틴)의 동물은 시험일 동안만 투여된다.
아세톤 테스트
냉각 이질통증(allodynia)은 D1(옥살리플라틴 3 mg/kg의 첫번째 주사로부터 약 24시간 후, 옥살리플라틴의 급성 효과) 및 D8(옥살리플라틴의 만성 효과)에 열적 비-통각(non-nociceptive) 자극에 대한 반응을 측정함으로써 아세톤 테스트를 사용하여 평가된다.
아세톤 테스트에서, 뒷발 철회의 잠재성은 양쪽 뒷발의 발바닥 표면에 아세톤을 적하 적용시킨 후에 측정되고(반응시간), 반응의 세기가 스코어링된다(콜드 스코어). 아세톤의 냉각 효과에 대한 반응시간은 아세톤 적용 후 20초 내에 측정된다(컷오프: cut-off). 아세톤에 대한 반응은 또한 다음과 같은 4-포인트 등급으로 나뉘어진다: 0(무반응); 1(발을 빠르게 철회, 튕김); 2(발을 지속적으로 철회 또는 뚜렷하게 튕김); 3(핥거나 물면서 발을 반복적으로 튕김).
각 실험군에 대해, 결과는 하기와 같이 나타내어진다:
- 반응시간은 발 반응을 이끌어내는데 필요한 시간(sec로 나타냄)으로서 규정됨(각 래트에 대한 6회 측정의 평균 ± SEM).
- 누적 콜드 스코어는 각 래트에 대한 6개의 스코어의 합 ± SEM으로서 규정됨. 최소 스코어는 0이고(6번의 시험 어느 것에도 반응이 없음), 최대 가능한 스코어는 18임(6번의 시험 각각에 대해 발을 반복적으로 튕기고 핥거나 깨물음).
통계학적 분석
Student 테스트, 단독, 타입 3이 수행된다. 유의도 수준은 p< 0.05로 설정되고; 모든 군들은 질환 + 비히클 군(옥살리플라틴 처치 군)과 비교된다. 평균 및 표준오차 평균은 도면에 보여진다.
결과
옥살리플라틴은 시간 과정 동안 아세톤 적용 후에 발을 철회하는 반응시간의 유의적인 감소를 유도하였다(질환 군 + 비히클). 이러한 감소는 비히클 군과 비교할 때 제1일(옥살리플라틴-유도된 신경병증의 급성 모델)부터 제8일(만성 모델)까지 점진적이고 유의적이다.
* 옥살리플라틴-유도된 신경병증의 급성 모델에서 항-이질통증 효과
옥살리플라틴-유도된 신경병증의 급성 모델에서 시험된 약물 조합은 아세톤 테스트에 의해 평가된다. 표 12는 옥살리플라틴-비히클 처치 군(제2군)과 비교시에 반응시간의 유의적인 증가 및 누적 콜드 스코어의 유의적인 감소를 유도하는 약물 조합(제4군)을 나타낸다. 결과적으로, 이러한 약물 조합들은 옥살리플라틴에 의해 유도된 급성 신경병증으로부터 동물을 보호한다.
[표 12]
Figure pct00017
+ = 급성 옥살리플라틴-유도된 모델에서, 누적 콜드 스코어의 분석 및 아세톤 테스트의 반응시간의 분석에 따른, 래트의 제4군에서 획득된 항-이질통증 효과
* 옥살리플라틴-유도된 신경병증의 만성 모델에서 항-이질통증 효과
옥살리플라틴-유도된 신경병증의 만성 모델에서 사용된 약물 조합은 아세톤 테스트에 의해 평가된다.
표 13은 옥살리플라틴-비히클 처치 군(제2군)과 비교시에 제4군(약물 조합 및 옥살리플라틴으로 처치된 동물)에서 측정된 아세톤 테스트의 반응시간 및 콜드 스코어는 신경병증의 만성 모델에서 처치된 이후에 각각 유의적으로 증가되고 감소되는 약물 조합을 나타낸다. 결과적으로, 이러한 약물 조합들은 옥살리플라틴에 의해 유도된 만성 신경병증으로부터 동물을 보호한다.
신경병증의 만성 모델에서 시험된 약물 조합(제4군) 제2군과 비교한 콜드 스코어의 편차 제2군과 비교한 반응시간 항-이질통증 효과
바클로펜-토라세미드 감소 증가 +
바클로펜-아캄프로세이트-토라세미드 감소 증가 +
메실레틴 및 시나칼셋 감소 증가 +
설피속사졸 및 토라세미드 감소 증가 +
+ = 만성 옥살리플라틴-유도된 모델에서, 누적 콜드 스코어의 분석 및 아세톤 테스트의 반응시간의 분석에 따른, 래트의 제4군에서 획득된 항-이질통증 효과
IV) 바클로펜 - 토라세미드 기초 조성물은 비 중독된 세포 내 신경 재생을 촉진한다 .
* 체외(in vitro) 바클로펜 토라세미드 조합의 신경영양적 효과
신경돌기 길이 에세이
래트 피질 세포의 10일간의 배양물 내의 신경돌기 성장에 대한 평가가 세포가 어떠한 독성에도 노출되지 않았다는 점을 제외하고는 섹션 A) II.4에서 전술된 것과 동일하게 MAP-2 항체를 사용하여 수행되었다. 10이리 된 세포 배양물은 에세이 전 하루동안 약물과 함께 인큐베이션 되었다.
결과
도 28은 바클로펜-토라세미드 조합이 유의한 신경 영양적 효과(+11%)를 보여주는 반면에 개개의 약물은, 단독으로 사용되는 경우, 어떠한 실질적인 신경영양적 효과를 가지지 않음을 보여준다. 실제로, 뉴런 망(MAP2-2 표지) 내 총 신경돌기 길이의 유의한 증가가 바클로펜-토라세미드 조합(400 nM 및 80 nM 각각)에 노출된 경우에서 관찰되었다. 주목할만한 것은, 조합이나 약물 단독 모두 뉴런의 수에 대해서는 효과를 보이지 않아, 신경돌기 망의 이러한 증가는 현존하는 신경 돌기의 신장 및 드 노보(de novo) 뉴런 세포 신장의 촉진과 관련되어 있음을 강조한다.
이러한 결과는 바클로펜-토라세미드 조합이 축색 돌기의 신장을 지지하는데 효율적이고, 따라서 척추 손상 및 다른 신경 손상을 치료하는데에 효과적이라는 점을 확인한다. 또한, 이는 축색 돌기성, 탈수화성 또는 축색 돌기성이고 탈수화성인 요소를 포함하는 유전성 신경병증을 치료하는데 효과적이라는 점을 확인한다. 실제로, 탈수화는 축색 돌기의 불안전성을 유발하고 이는 주로 탈수화 형태로 고려되는 신경병증에서도 심지어 관찰되는 축색돌기성 퇴화를 야기한다는 점이 고려되어야 한다.
* 바클로펜 - 토라세미드 기초 조성물은 생체 내 신경 재생을 촉진하는데 효과적이다.
좌골 신경 압착이 말초 신경 손상 및 신경 재생의 측정을 위한 유효 모델로서 널리 받아들여진다. 이 모델에서, 신경 훼손은 손상된 좌골 신경의 자극을 통해서 생성되는 유발근활동전위(CMAPs)의 측정에 의해 증거되는 신경 기능의 빠른 분열을 초래한다.
신경 손상은, CAMP의 생성에 대한 향상된 잠재성과, 감소된 진폭 및 기간을 유발하는 활동 전위의 손상된 강도에 의해서 기인되는 신호의 낮은 신경 전도에 의해 특징화된다.
보통, 신경 기능 재생의 첫 번째 징후는 2주 내에 나타나고, 병변 후 4주 까지 재생된 축색 돌기의 유의한 수초재형성이 조직학에 의해 좌골 신경 내에서 관찰된다(45).
신경 압착
마우스가 이소플루란(공기 내 2.5 내지 3%)를 사용하여 마취된다. 오른 넓적다리가 이후 면도되고 좌골 신경이 중간-넓적 다리 레벨에서 노출되고 몸쪽 5mm에서 좌골 신경의 양갈래 점으로 암착되었다. 신경은 개별 압착 간 90°로테이션으로 마이크로포셉(Holtex, reference P35311)을 사용하여 10초간 2회 압착되었다. 샴 처리된 동물에 대해서는, 좌골 신경은 노출시켰지만 압착시키지는 않았다. 끝으로, 피부 절개가 운드클립에 의해 보호되었다. 압착한 날을 0일차로 한다.
투여 일정
압착한 날, 화합물의 제1 투여가 압착 후 30분에 수행되었다.
이후, 화합물은 압착한 당일부터 42일 동안 일일 2회 투여되었다. 하루 내에서의 약물 투여는 적어도 6시간의 간격을 두고 투여되었다.
시험 당일 (7일차 및 30일차) 마우스는 시험 전 1시간 30분에 투여받았다.
투여 볼륨은 0.25% DMSO/멸균 수 내 10ml/kg이었다.
Figure pct00018
근전도 검사
전기생리적 기록이 Keypoint 근전도검사(E mg)(Medtronic, France)를 사용하여 7일차 및 30일차에 수행되었다. 마우스는 공기 중 2.5-3% 이소플루란에 의해 마취되었다. 피하의 단극성 니들 전극이 자극 및 기록 모두에 사용되었다. 0.2 ms의 기간동안 Supramaximal(12.8 mA) 스퀘어 웨이브 펄스가 좌골신경을 자극하는데 사용되었다. 오른쪽 좌골신경(ipsilateral)은 좌골 절흔에 적용된 단회 펄스로 자극되었다. CMAP가 비장근에 위치된 니들 전극에 의해 기록되었다. 밀리초로 표현된 CMAP 신호의 시작(잠재성)이 신경 전도 속도를 평가하는데 사용되었다. 따라서, 잠재성은 축색 돌기의 수초화의 정도를 반영한다. 활동 전위(μV)의 진폭이 또한 결정되었고, 이는 근육의 신경 제거(denervation) 및 신경재지배(reinervation)의 정도를 반영한다. CMAP의 진폭은 현재 재생된 운동 축색 돌기의 수에 비례하여 주어진다. 유발된 근 전위 기간이 또한 결정된다. 유발된 근 전위의 진폭 및 기간은 근육 신경재지배와 더 관련된다. 잠재성 및 진폭은 신경 재생을 다룰 때 가장 중요한 종결점으로서 더욱 일반적으로 인식된다. 데이터가 양방향, 타입 3, Student t-test을 사용하여 분석되었다; 유의한 레벨은 p<0.05에 고정된다.
결과
바클로펜-토라세미드 조합은 모든 시험 된 투여량에서, 신경 손상된 날로부터 7일차에, 비히클 처리된 동물과 비교하여, 신호의 시간 잠재성이 유의하게 향상시키는데 효율적이다. 보통 자발적인 회복의 시작이 관출되는 경우, 신경 압착 후 30일차에서 유의적인 차이가 관찰된다.
신호의 진폭에 있어서 통계학적으로 유의한 향상이 신경 압착 30일 차에 용량 3에서 또한 관찰된다. 이러한 향상은 또한, 더 작은 정도이긴 하지만, 용량 1 및 2에서도 관찰된다. 유사한 결과가 신호의 기간을 측정하는 경우 관찰된다.
조합하면, 이러한 생체 내 결과는 바클로펜-토라세미드 조합이 재수초화 및 근육 재신경지배를 통한 신경 재생을 촉진하는데 효과적임을 보여준다. 따라서 생체 내 실험 데이터는 체외에서 관찰되는 바클로펜-토라세미드의 신경영양적 효과 및 척추 손상뿐 아니라 이들의 말초 신경계가 훼손(즉 본원에서 정의된 신경 병증)되는 경우 신경 병증을 교정하는데의 그들의 유용함을 확인한다.
참조 문헌
1. Crook R.et al. (1998). A variant of Alzheimer's disease with spastic paraparesis and unusual plaques due to deletion of exon 9 of presenilin 1. Nat Med. 4(4): 452-5.
2. Houlden H., Baker M., et al. (2000). Variant Alzheimer's disease with spastic paraparesis and cotton wool plaques is caused by PS-1 mutations that lead to exceptionally high amyloid-beta concentrations. Ann Neurol. 48(5): 806-8.
3. Kwok J.B., Taddei K., et al. (1997). Two novel presenilin-1 mutations in early-onset Alzheimer's disease pedigrees and preliminary evidence for association of presenilin-1 mutations with a novel phenotype. Neuroreport. 8(6): 1537-42.
4. Verkkoniemi A., Kalimo H., et al. (2001). Variant Alzheimer disease with spastic paraparesis: neuropathological phenotype. J Neuropathol Exp Neurol. 60(5): 483-92.
5. Citron M. (2004). Strategies for disease modification in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci. 5(9): 677-85.
6. Suh Y.H. and Checler F. (2002). Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-synuclein: molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease. Pharmacol Rev. 54(3): 469-525.
7. Glenner G.G., Wong C.W., et al. (1984). The amyloid deposits in Alzheimer's disease: their nature and pathogenesis. Appl Pathol. 2(6): 357-69.
8. Ballatore C., Lee V.M., et al. (2007). Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer's disease and related disorders. Nat Rev Neurosci. 8(9): 663-72.
9. Bell K.F. and Claudio Cuello A. (2006). Altered synaptic function in Alzheimer's disease. Eur J Pharmacol. 545(1): 11-21.
10. Hardy J.A. and Higgins G.A. (1992). Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256(5054): 184-5.
11. Braak H. and Braak E. (1991). Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82(4): 239-59.
12. Golde T.E. (2005). The Abeta hypothesis: leading us to rationally-designed therapeutic strategies for the treatment or prevention of Alzheimer disease. Brain Pathol. 15(1): 84-7.
13. Hardy J. and Selkoe D.J. (2002). The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297(5580): 353-6.
14. Selkoe D.J. (2000). The genetics and molecular pathology of Alzheimer's disease: roles of amyloid and the presenilins. Neurol Clin. 18(4): 903-22.
15. Zlokovic B. V., The Blood Brain Barrier In Health And Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron review. 2008, 57, 178-201.
16. Budd Haeberlein, S.L. and S.A. Lipton, Excitotoxicity in neurodegenerative disease, in Encyclopedia of neuroscience, L.R. Squire, Editor. 2009, Elsevier. p. 77-86.
17. Hughes, J.R., Alcohol withdrawal seizures. Epilepsy Behav, 2009. 15(2): p. 92-7.
18. Kim, A.H., G.A. Kerchner, and C. DW, Blocking Excitotoxicity, in CNS Neuroprotection, F.W. Marcoux and D.W. Choi, Editors. 2002, Springer: New York. p. 3-36.
19. Hama A, Sagen J., Antinociceptive effect of riluzole in rats with neuropathic spinal cord injury pain. J Neurotrauma. 2011 Jan;28(1):127-34.
20. Lees, K.R., et al., Glycine antagonist ( gavestinel ) in neuroprotection (GAIN International) in patients with acute stroke: a randomised controlled trial. GAIN International Investigators. Lancet, 2000. 355(9219): p. 1949-54.
21. Malgouris, C., et al., Riluzole , a novel antiglutamate , prevents memory loss and hippocampal neuronal damage in ischemic gerbils. J Neurosci, 1989. 9(11): p. 3720-7.
22. Wahl, F., et al., Effect of riluzole on focal cerebral ischemia in rats. Eur J Pharmacol, 1993. 230(2): p. 209-14.
23. Wahl, F., et al., Riluzole reduces brain lesions and improves neurological function in rats after a traumatic brain injury. Brain Res, 1997. 756(1-2): p. 247-55.
24. Ettmayer, P., Amidon, G. L., Clement, B. & Testa, B. Lessons learned from marketed and investigational prodrugs. J. Med . Chem. 47, 2393-2404 (2004).
25. Beaumont, K., Webster, R., Gardner, I. & Dack, K. Design of ester prodrugs to enhance oral absorption of poorly permeable compounds: challenges to the discovery scientist. Curr . Drug Metab. 4, 461-485 (2003).
26. Heimbach, T. et al. Enzyme-mediated precipitation of parent drugs from their phosphate prodrugs. Int . J. Pharm. 261, 81-92 (2003).
27. Yang, C. Y., Dantzig, A. H. & Pidgeon, C. Intestinal peptide transport systems and oral drug availability. Pharm . Res. 16, 1331-1343 (1999).
28. Steffansen, B. et al. Intestinal solute carriers: an overview of trends and strategies for improving oral drug absorption. Eur . J. Pharm. Sci. 21, 3-16 (2004).
29. Stella, V. et al. Prodrugs: Challenges and Rewards (AAPS, New York, 2007).
30. Wermuth, CG. The Practice of Medicinal Chemistry. (Hardbound, 2003). Part VI, Chap 33: Designing prodrugs and bioprecursors.
31. Pezron, I. et al. Prodrug strategies in nasal drug delivery. Expert Opin. Ther . Pat., Vol. 12, No. 3 , 331-340 (2002).
32. Stella, V. J. Prodrugs as therapeutics. Expert Opin . Ther . Pat. 14, 277-280 (2004).
33. Stella, V. J. & Nti-Addae, K. W. Prodrug strategies to overcome poor water solubility. Adv . Drug Deliv . Rev. 59, 677-694 (2007).
34. Higuchi, T.; Stella, V. eds. Prodrugs As Novel Drug Delivery Systems. ACS Symposium Series. American Chemical Society: Washington, DC (1975). 31.
35. Roche, E. B. Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrugs and Analogs. American Pharmaceutical Association: Washington, DC (1977).
36. Lal, R., et al., Arbaclofen placarbil, a novel R-baclofen prodrug: improved absorption, distribution, metabolism, and elimination properties compared with R-baclofen. J Pharmacol Exp Ther, 2009. 330(3): p. 911-21.
37. Andrew R. Leach,Valerie J. Gillet. An Introduction to Chemoinformatics. Springer 2007.
38. S. Asad Rahman, M. Bashton, G. L. Holliday, R. Schrader and J. M. Thornton: Small Molecule Subgraph Detector (SMSD) Toolkit, Journal of Cheminformatics 2009, 1:12 doi:10.1186/1758-2946-1-12
39. Wishart DS, Knox C, Guo AC, Cheng D, Shrivastava S, Tzur D, Gautam B, Hassanali M. DrugBank : a knowledgebase for drugs, drug actions and drug targets. Nucleic Acids Res. 36, Issuesuppl 1. D901-D906 (2008).
40. Stahl H., Wermuth C. G. (Eds.) Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use. Wiley-VCH; 2 edition (March 29, 2011).
41. Hanafi R, Mosad S, Abouzid K, Niess R, Spahn-Langguth H. Baclofen ester and carbamate prodrug candidates: a simultaneous chromatographic assay, resolution optimized with DryLab. J Pharm Biomed Anal, 2011. 56(3): p.569-76.
42. Singer C., Figueroa-Masot X., Batchelor R., and Dorsa D. Mitogen -activated protein kinase pathway mediates estrogen neuroprotection after glutamate toxicity in primary cortical neurons. J. Neuroscience, 1999. 19(7):2455-2463.
43. Feng Xu, Ge Peng, Thu Phan, Usha Dilip, Jian Lu Chen, Tania Chernov-Rogan, Xuexiang Zhang, Kent Grindstaff, Thamil Annamalai, Kerry Koller, Mark A. Gallop, David J. Wustrow, Discovery of a novel potent GABAB receptor agonist; Bioorg Med Chem Lett. 2011 Nov 1;21(21):6582-5.)
44. Braun S, Croizatb B, Lagrangec MC, Wartera JM, Poindron P. Neurotrophins increase motoneurons ' ability to innervate skeletal muscle fibers in rat spinal cord-human muscle cocultures.Volume 136, Issues 1-2, March 1996, Pages 17-23.
45. Bordet T, Buisson B, Michaud M, Drouot C, Gal?a P, Delaage P, Akentieva NP, Evers AS, Covey DF, Ostuni MA, Lacap?re JJ, Massaad C, Schumacher M, Steidl EM, Maux D, Delaage M, Henderson CE, Pruss RM. Identification and characterization of cholest -4-en-3-one, oxime (TRO19622), a novel drug candidate for amyotrophic lateral sclerosis. J Pharmacol Exp Ther. 2007 Aug;322(2):709-20.

Claims (19)

  1. 적어도 토라세미드(torasemide) 및 바클로펜(baclofen) 또는 이들의 염, 프로드럭, 유도체 또는 서방성 제형를 포함하는, 신경 또는 뉴런의 재생을 이를 필요로하는 개체 내에서 촉진하는 용도의 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    설피속사졸(sulfisoxazole), 메티마졸(methimazole), 프릴로카인(prilocaine), 디필린(dyphylline), 퀴나크린(quinacrine), 카르베녹솔론(carbenoxolone), 아캄프로세이트(acamprosate), 아미노카프로익 산(aminocaproic acid), 카베르골린(cabergoline), 디에틸카바마진(diethylcarbamazine), 시나칼셋(cinacalcet), 신나리진(cinnarizine), 에플레레논(eplerenone), 페놀도팜(fenoldopam), 레플루노마이드(leflunomide), 레보시멘단(levosimendan), 설로덱사이드(sulodexide), 테르비나핀(terbinafine), 조니사마이드(zonisamide), 에토미데이트(etomidate), 펜포르민(phenformin), 트리메타지딘(trimetazidine), 메실레틴(mexiletine), 이펜프로딜(ifenprodil), 목시플록사신(moxifloxacin), 또는 브로모크립틴(bromocriptine), 또는 이들의 염, 프로드럭, 유도체 또는 서방성 제형으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 추가로 포함하는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    적어도 하나의 하기의 화합물의 조합을 포함하는, 조성물:
    - 바클로펜 및 트리메타지딘 및 토라세미드,
    - 바클로펜 및 시나칼셋 및 토라세미드,
    - 바클로펜 및 아캄프로세이트 및 토라세미드,
    - 바클로펜 및 아캄프로세이트 및 토라세미드 및 디에틸카바마진, 또는
    - 바클로펜 및 아캄프로세이트 및 토라세미드 및 이펜프로딜.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로 약학적으로 허용가능 한 캐리어 또는 첨가제를 포함하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물 내 화합물이 개별로 또는 연속적으로 함께 투여되도록 제형화되는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물은 개체에 반복적으로 투여되는 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체가 유전적 기원의 신경 손상을 앓고 있는 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    개체는 Charcot-Marie-Tooth 병을 앓고 있는 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    4 mg 미만의 토라세미드를 포함하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    150 mg 미만의, 바람직하게는 50 mg 미만의 바클로펜을 포함하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    신경무동작증(neurapraxia), 축삭절단증(axonometsis) 또는 신경단열증(neurotmesis)을 치료하기 위한 용도인 조성물.
  12. 신경 또는 뉴런 재생을 이를 필요로하는 개체 내에서 촉진하는 방법으로서, 상기 개체에 토라세미드 및 바클로펜, 또는 이들의 염, 프로드럭, 유도체 또는 서방성 제형를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    약학적으로 허용가능 한 캐리어 또는 첨가제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    동시적, 개별적 또는 연속적으로 토라세미드 및 바클로펜을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제12항에 있어서,
    개체는 유전적 기원의 신경 손상을 앓고 있는 방법.
  16. 제12항에 있어서,
    개체는 Charcot-Marie-Tooth 병을 앓고 있는 방법.
  17. 제12항에 있어서,
    개체는 신경무동작증(neurapraxia), 축삭절단증(axonometsis) 또는 신경단열증(neurotmesis)을 앓고 있는 방법.
  18. 제12항에 있어서,
    4 mg 미만의 토라세미드를 포함하는 것을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  19. 제12항에 있어서,
    150 mg 미만의, 바람직하게는 50 mg 미만의 바클로펜을 포함하는 것을 투여하는 것을 포함하는 방법.
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9241933B2 (en) 2011-03-01 2016-01-26 Pharnext Compositions for treating amyotrophic lateral sclerosis
EP2560631B1 (en) 2011-03-01 2014-01-15 Pharnext Baclofen and acamprosate based therapy of neurogical disorders
US9248111B2 (en) 2011-03-01 2016-02-02 Pharnext Therapeutic approaches for treating parkinson's disease
US10010515B2 (en) 2011-03-01 2018-07-03 Pharnext Therapeutic approaches for treating Parkinson's disease
US9867837B2 (en) 2011-03-01 2018-01-16 Pharnext Compositions for treating neurological disorders
US9931326B2 (en) 2011-03-29 2018-04-03 Pharnext Composition comprising torasemide and baclofen for treating neurological disorders
US9012640B2 (en) * 2012-06-22 2015-04-21 Map Pharmaceuticals, Inc. Cabergoline derivatives
WO2014020608A1 (en) * 2012-07-31 2014-02-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of diagnosing and treating motor neuron diseases
WO2015121218A1 (en) 2014-02-11 2015-08-20 Pharnext Combination of baclofen, acamprosate and medium chain triglycerides for the treatment of neurological disorders
FR3018688A1 (fr) * 2014-03-19 2015-09-25 Virbac Utilisation de torasemide a faible dose dans une composition veterinaire
KR102560182B1 (ko) * 2014-10-15 2023-07-28 오리온 코포레이션 운동 뉴런 질환(예를 들면 근위축성 측삭경화증)의 치료에 사용되는 레보시멘단
KR102364840B1 (ko) 2014-11-05 2022-02-18 삼성전자주식회사 신경세포의 탈수초화와 연관된 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물 및 그를 이용하는 방법
KR101680464B1 (ko) 2015-04-17 2016-11-28 가톨릭대학교 산학협력단 시나칼셋을 유효성분으로 함유하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 및 치료용 약학적 조성물
US10039772B2 (en) 2015-11-13 2018-08-07 Pietro Paolo Sanna Methods and compositions for treating alcohol use disorders
KR101910153B1 (ko) * 2016-11-04 2018-10-19 한국과학기술연구원 타우 관련 질환의 예방 또는 치료용 레보시멘단 화합물
JP7065880B2 (ja) 2017-04-24 2022-05-12 ファーネクスト アルツハイマー病のイダロピルジン系組合せ療法
EP3638283A1 (en) * 2017-06-14 2020-04-22 Netzer, Rainer Antagonists of cav2.3 r-type calcium channels for the treatment of neurodegenerative diseases
AU2018292939B2 (en) * 2017-06-28 2022-11-24 Kyoto University Agent for preventing and/or treating Alzheimer's disease
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
TWI804518B (zh) 2017-10-16 2023-06-11 美商航海家醫療公司 肌萎縮性脊髓側索硬化症(als)之治療
WO2019145523A1 (en) * 2018-01-29 2019-08-01 Pharnext Baclofen and acamprosate based therapy of alzheimer's disease in patients having lost responsiveness to acetylcholinesterase inhibitor therapy
EP3755329A4 (en) * 2018-02-19 2021-10-27 Martin Pharmaceuticals, Inc. STABLE LIQUID FORMULATION OF TRIMETAZIDINE FOR ORAL USE
CN112567035A (zh) 2018-07-02 2021-03-26 沃雅戈治疗公司 肌萎缩侧索硬化症及脊髓相关病症的治疗
WO2020010035A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Voyager Therapeutics, Inc. Cannula system
CN116286669B (zh) * 2023-03-23 2023-09-22 江南大学 一株分泌托拉塞米单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2044853C (en) 1990-07-19 2004-11-09 Susan A. Greenfield Method for treating parkinson's disease employing an atp-sensitive potassium channel blocker
DE4113820A1 (de) 1991-04-27 1992-10-29 Boehringer Mannheim Gmbh Verwendung von torasemid zur behandlung von hirnoedemen
US6294350B1 (en) * 1997-06-05 2001-09-25 Dalhousie University Methods for treating fibroproliferative diseases
US20060025387A1 (en) * 1998-12-23 2006-02-02 Cytoscan Sciences Llc Compositions and methods for the treatment of disorders of the central and peripheral nervous systems
US8980952B2 (en) 2002-03-20 2015-03-17 University Of Maryland, Baltimore Methods for treating brain swelling with a compound that blocks a non-selective cation channel
CN101365451A (zh) 2005-11-21 2009-02-11 阿拉巴马大学董事会 使用小分子化合物用于神经保护的方法
US20100056444A1 (en) 2006-10-12 2010-03-04 Sven Martin Jacobson Treatment of Alzheimer's Disease Using Compounds that Reduce the Activity of Non Selective Ca Activated ATP- Sensitive Cation Channels Regulated by SUR1 Receptors
WO2009000406A1 (en) 2007-06-22 2008-12-31 Bayer Healthcare Ag Use of antibodies against the cd52 antigen for the treatment of neurological disorders, particularly transmissible spongiform encephalopathy and alzheimer's disease
US20090069419A1 (en) * 2007-09-07 2009-03-12 Bernd Jandeleit Masked carboxylate neopentyl sulfonyl ester cyclization release prodrugs of acamprosate, compositions thereof, and methods of use
SI2282778T1 (sl) 2008-04-29 2017-07-31 Pharnext Novi terapevtski pristopi za zdravljenje Alzheimerjeve bolezni in sorodnih motenj z modulacijo angiogenezo
CN102065858B (zh) 2008-04-29 2014-07-02 法奈科斯公司 使用唑尼沙胺和阿坎酸治疗阿尔茨海默病和相关病症的组合组合物
CN102065897B (zh) 2008-04-29 2013-11-13 法奈科斯公司 基于磺胺异噁唑的组合物用于制备治疗阿茨海默病的药物的应用
US20100022574A1 (en) * 2008-07-28 2010-01-28 EndogenX, Inc. Methods to Treat Pain Using an Alpha-2 Adrenergic Agonist and an Endothelin Antagonist
MX2011007759A (es) 2009-01-22 2011-10-11 Neurotherapeutics Pharma Inc Analogos de bumetanida, furosemida, piretanida, azosemida y torsemida, composiciones y metodos de uso.
EP2263665A1 (en) * 2009-06-02 2010-12-22 Pharnext New compositions for treating CMT and related disorders
EP2593104A4 (en) * 2009-07-24 2014-02-05 Mueller Prof Dr Wolfgang PROCESS FOR TREATING AND PREVENTING / REDUCING THE PROBABILITY OF MESIAL TEMPORARY PEPPER (TLE)
EP2705842A1 (en) 2012-09-05 2014-03-12 Pharnext Therapeutic approaches for treating parkinson's disease
US10010515B2 (en) 2011-03-01 2018-07-03 Pharnext Therapeutic approaches for treating Parkinson's disease
US9867837B2 (en) 2011-03-01 2018-01-16 Pharnext Compositions for treating neurological disorders
US9248111B2 (en) 2011-03-01 2016-02-02 Pharnext Therapeutic approaches for treating parkinson's disease
US9241933B2 (en) 2011-03-01 2016-01-26 Pharnext Compositions for treating amyotrophic lateral sclerosis
EP2560631B1 (en) 2011-03-01 2014-01-15 Pharnext Baclofen and acamprosate based therapy of neurogical disorders
UA115968C2 (uk) * 2011-03-01 2018-01-25 Фарнекст Нові композиції для лікування неврологічних захворювань
US9931326B2 (en) 2011-03-29 2018-04-03 Pharnext Composition comprising torasemide and baclofen for treating neurological disorders
US9700036B1 (en) 2015-04-08 2017-07-11 Justin P. Chatelain Duck decoy device
US9700037B1 (en) 2014-09-08 2017-07-11 Justin P. Chatelain Duck decoy device

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Publication number Publication date
CN105744932A (zh) 2016-07-06
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