KR101680464B1 - 시나칼셋을 유효성분으로 함유하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 칼슘 유사 작용제(calcimimetic)인 시나칼셋(cinacalcet)을 유효성분으로 함유하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 및 개선용 건강기능성 식품에 관한 것이다. 본 발명의 시나칼셋은 동물모델에서 당뇨병 미세혈관 합병증의 주된 특징들을 감소시켰으며, 세포 실험에서 세포내 칼슘 이온 및 CaMKKβ-LKB1-AMPK 경로의 활성화를 통해 당 독성을 개선하는 효과를 나타냈으므로, 당뇨병성 미세혈관 합병증 치료제 또는 기능성식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

시나칼셋을 유효성분으로 함유하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for the prevention and treatment of diabetic microvascular complications containing cinacalcet as active ingredient}

본 발명은 칼슘 유사 작용제(calcimimetic)인 시나칼셋(cinacalcet)을 유효성분으로 함유하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 및 개선용 건강기능성 식품에 관한 것이다.

당뇨병은 전세계적으로 흔히 나타나는 대표적인 만성 질병의 하나로 우리나라에서도 식습관의 변화 및 인구의 고령화 등으로 그 유병률이 지속적으로 증가하고 있다. 당뇨병은 탄수화물 대사에 관여하는 인슐린 작용의 이상에 의해 나타나는 만성 고혈당증과 여러 대사 이상을 수반하는 질환으로, 크게는 췌장 β 세포의 파괴성 병변에 의해 인슐린이 결핍되어 생기는 제1형 당뇨병과 인슐린 분비 저하와 인슐린 저항성(IR)으로 인해 생기는 제2형 당뇨병으로 분류된다.

당뇨병은 기본적으로 탄수화물 대사의 이상이 문제이나, 이로 인해 체내의 모든 영양소 대사가 영향을 받게 되므로 여러 합병증을 유발한다. 당뇨병 합병증의 예로는 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy), 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 동맥경화증, 당뇨병성 심장병 등이 있는데, 당뇨병이 발병하는 연령층이 점차 낮아지면서 이러한 합병증은 더욱 심각한 문제가 되고 있다. 특히, 고혈당에 의해 유발되는 지질대사의 이상으로 인해 혈액 내 지방 성분이 증가할 수 있고, 이러한 원인 등으로 인해 혈관의 정상적 기능을 손상시킬 수 있다. 당뇨병성 혈관 합병증은 크게 미세혈관 합병증과 거대혈관 합병증으로 나눠볼 수 있는데, 망막 및 신장의 미세혈관 합병증은 각각 당뇨병성 망막병증 및 신장병증을 야기하며, 신경혈관의 미세혈관 합병증은 신경병증을 유발한다.

당뇨병성 신증(diabetic nephropathy)은 제1형 및 제2형 당뇨병 모두에서 심각한 미세혈관 합병증이며 전세계적으로 중요한 공중보건 문제이다(Jin DC, Ha IS, Kim NH, et al. Brief report: renal replacement therapy in Korea. Kidney Res Clin Pract 2010;31:62-71). 칼슘 감지 수용체(calcium-sensing receptor, CaSR)는 7개의 막 관통 수용체를 가진 G 단백질-결합 수용체의 슈퍼패밀리 C에 속한다. CaSR 리간드는 직접적 작용제인 제1형 작용제(agonists)와 수용체의 칼슘에 대한 친화력(affinity)을 변화시키는 알로스테릭 조절제(allosteric modulator)로 작용하는 제2형 작용제로 나뉜다. 시나칼셋(cinacalcet)과 같이 새롭게 개발된 칼슘 유사 작용제(calcimimetic)들은 제2형 작용제에 속하며, 막 관통 도메인에 결합하여 CaSR을 양성적으로(positively) 조절한다. CaSR은 부갑상선호르몬(PTH)-생산 세포, 위장관(gastrointestinal tract), 심장 및 혈관 내피세포 및 평활근 세포, 및 신장 관상세포(tubular cells)에 의해 발현된다(Brown EM. Clinical utility of calcimimetics targeting the extracellular calcium-sensing receptor (CaSR). Biochemical Pharmacology 2010;80:297-307, Smajilovic S, et al. The calcium-sensing receptor and calcimimetics in blood pressure modulation, Br J Pharmacol 2011;164:884-893). CaSR은 여러 조직들에서 광범위하게 발현되어, 이온채널/트랜스포터(transporter) 활성, 펩타이드 분비, 세포 증식 및 사멸, 주화성(chemotaxis), 및 종양 유전자 조절 등에 관여한다. 신장에서 CaSR은 네프론(nephron)의 여러 분획들에서 발현되며(Riccardi D, et al. Localization of the extracellular Ca2+/polyvalent cation-sensing protein in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol 1998;274:F611-F622), 이러한 CaSR은 (1) 근위세관(proximal tubule)에서 부갑상선호르몬(PTH)의 신장 인산염 재흡수 저해효과를 감소시키며(Ba J, et al. Calcium-sensing receptor regulation of PTH-inhibitable proximal tubule phosphate transport. Am J Physiol Renal Physiol 2003, 285:F1233-F1243), (2) 상행각 콩팥세관고리(cortical thick ascending limb of the loop of Henle)에서 신장 칼슘 분비를 저해하며(Motoyama HI, Freidman PA. Calcium-sensing receptor regulation of PTH-dependent calcium absorption by mouse cortical ascending limbs. Am J Physiol Renal Physiol 2002;282:F399-F406), (3) 속수질집합관(inner medullar collecting duct)에서 요농축력(urinary concentrating capacity)을 감소시키고(Sands JM, et al. Apical extracellular calcium/polyvalent cation-sensing receptor regulates vasopressin-elicited water permeability in rat kidney inner medullary collecting duct. J Clin Invest 1997;50:1399-1405), (4) 사구체옆세포(juxtaglomerular cells)에서 레닌(renin) 생산을 억제하여 안지오텐신(angiotensin) 형성을 감소(Sands JM, et al. Apical extracellular calcium/polyvalent cation-sensing receptor regulates vasopressin-elicited water permeability in rat kidney inner medullary collecting duct. J Clin Invest 1997;50:1399-1405)시키는 등의 기능을 한다.

일산화질소(NO)의 생산 또는 활성의 결함은 내피 기능이상을 유발하는데, 이는 당뇨병성 미세혈관병증의 최초 징후의 하나로 제안되어 왔으며, 당뇨병성 신증의 진행에도 기여한다(Badal SS, Danesh FR. Strategies to reverse endothelial dysfunction in diabetic nephropathy. Kidney Int 2012;82:1151-1154). 따라서, eNOS 경로의 약리학적 활성은 내피 기능이상의 경감을 통해 당뇨병성 신증의 진행을 막는 매력적인 접근법으로 보여져 왔다. 최근에, 인간 대동맥의 불멸화된(immortalized) 내피 세포에서 CaSR이 나타났으며, 시나칼셋에 의한 이 수용체의 자극으로 일산화질소의 생산이 유도되고 그 결과 혈관이 이완되었다는 보고가 있었다. 또한, 또다른 연구에서도 HUVEC에서 칼슘 유사 작용제 R- 및 S-568이 세포내 칼슘 이온 수준을 상당히 증가시켰다는 보고가 있었다(Bonomini M, et al. Calcimimetic R-568 and its enantimor S-568 incease nitrix oxide release in human endothelial cells. PLoS One 2012;7(1):E30682).

한편, AMPK (5’ AMP-activated protein kinase)는 세포의 에너지 항상성과 관련된 효소이며, 글루코스의 흡수를 비롯하여 여러 세포내 시스템을 조절하는 핵심적인 대사조절인자이다. 세포 스트레스에 대한 AMPK 활성의 민감도가 떨어지면 대사조절 기능이 손상되고, 산화 스트레스가 증가하며, 자가포식 작용이 감소된다. AMPK는, LKB 1을 요구하는 기작(Hawley SA, et al. Complexes between the LKB1 tumor suppressor, STRAD alpha/beta and MO25 alpha/beta are upstream kinases in the AMP-activated protein kinase cascade. J Biol 2003;2:28) 및 CaMKK b 및/또는 a 또는 TAK1의 변형을 통해(Hurley RL, et al. The Ca⁺⁺/calmodulin-dependent protein kinase kinases are AMP-activated protein kinase kinases. J Biol Chem 2005;280:29060-29066, Momcilovic M, Hong SP, Carlson M. Mammalian TAK1 activtes Snf1 protein kinase in yast and phosphorylates AMP-activated protein kinase in vitro. J Biol Chem 2006;281:25336-25343), 세포 ADP:ATP 및/ AMP:ATP 비율을 증가시키는 대사 스트레스에 의해 활성화되었다. AMPK는 일단 활성화되면 ATP를 생산하는 이화작용 경로를 열고, 생합성 및 세포주기 진행 경로를 닫는다. 이러한 효과는 AMPK 활성인자들이 제2형 당뇨병의 치료 및/또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

이에 본 발명자들은 시나칼셋(cinacalcet)이 상류(upstream)의 AMPK 키나아제를 직접 조절하여 당뇨병성 미세혈관 합병증을 예방 및 치료할 수 있을 것으로 가정하고 이를 실험을 통해 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

미국공개특허 US 2014-0038927A1

본 발명의 목적은 시나칼셋을 이용한 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 또는 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 시나칼셋을 이용한 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 또는 개선용 식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 시나칼셋(cinacalcet) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시나칼셋은 세포내의 칼슘 농도를 증가시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시나칼셋은 CaMKKβ, LKB1 및 AMPK의 연속적 인산화를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시나칼셋은 eNOS의 인산화를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시나칼셋은 세포내에서 BAX에 대한 BCL-1 또는 BCL-2의 비율을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 당뇨병성 미세혈관 합병증은 제2형 당뇨병성 미세혈관 합병증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 당뇨병성 미세혈관 합병증은 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy) 및 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 시나칼셋(cinacalcet) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 당뇨병성 미세혈관 합병증은 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy) 및 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 시나칼셋은 동물모델에서 당뇨병 미세혈관 합병증의 주된 특징들을 감소시켰으며, 세포 실험에서 세포내 칼슘 이온 및 CaMKKβ-LKB1-AMPK 경로의 활성화를 통해 당 독성을 개선하는 효과를 나타냈으므로, 당뇨병성 미세혈관 합병증 치료제 또는 기능성식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 시나칼셋(cinacalcet)이 말초신경 기능 회복에 미치는 효과를 측정한 결과이다. ** dm 및 dm+시나칼셋과 비교하여 p<0.001 및 db+시나칼셋과 비교하여 p<0.05, * dm 및 dm+시나칼셋과 비교하여 p<0.01
도 2는 (A) 섬유증(fibrosis), (B) Col IV 발현, (C) F4/80-양성 세포의 존재에 의해 정의되는 염증세포 침투를 통해 시나칼셋이 신경병리에 미치는 효과를 확인한 결과이다.
도 3은 F4/80 및 TUNEL의 이중 면역형광염색(double immunofluorescence staining)을 수행한 결과이다.
도 4는 전자현미경으로 좌골신경의 초미세 구조를 관찰한 결과이다.
도 5는 고농도의 글루코스 조건이 단독으로 또는 시나칼셋 처리와의 조합으로 HSCs에 미치는 영향을 조사한 결과이다. (A) CaMKKβ-AMPK-eNOS 신호전달에 미치는 영향, (B) BCL-2/BAX 발현에 미치는 영향.
도 6은 시나칼셋 첨가에 따른 세포내 칼슘이온 증가 효과를 실험한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 실험동물에 시나칼셋을 처리한 경우 단백뇨 발생에 미치는 영향을 조사한 것이다. *p<0.01 및 **p<0.001 (dm 대조군 및 dm+시나칼셋 그룹과 비교)
도 8은 본 발명의 시나칼셋 처리가 신장의 표현형, TGF-β1, 제IV 형 콜라겐(Col IV) 및 F4/80 에 미치는 영향을 관찰한 결과이다.
도 9는 시나칼셋 처리가 CaMKKα/β-AMPK-eNOS 신호전달 경로의 신장 내 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과이다.
도 10은 시나칼셋 처리가 24 hr 8-OH-dG 및 24-hr urinary 8-isoprostane 농도에 미치는 영향을 실험한 결과이다.
도 11은 시나칼셋 처리가 BCL-2 단백질 및 Bax 단백질의 발현에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 12는 시나칼셋 처리가 신장 내 CaMKKα/β-AMPK-eNOS 신호전달 경로, BCL-2/BAX 발현, SOD1 및 SOD2 발현에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 13은 AMPK가 시나칼셋 처리에 의한 자극과 관련이 있는지 알아보기 위하여, 배양된 HGECs에서 AMPK α1, AMPK α2, 및 SIRT1 에 대한 siRNAs를 사용하여 트랜스펙션시킨 결과이다.
도 14는 고농도 글루코스 배지의 HGENs에 대해 시나칼셋의 세포내 칼슘이온 증가 효과를 실험한 결과이다.

본 발명은 칼슘 유사 작용제(calcimimetic)인 시나칼셋(cinacalcet)의 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 및 치료 효과에 관한 것이다. Ca^{2 +}-감지 수용체(CaR)를 활성화시키는 칼슘 유사 작용제인 시나칼셋(SENSIPAR™, 미국 Amgen사)은 종래 부갑상선 기능 항진증(hyperparathyroidism)의 치료에 주로 사용되어왔다. 시나칼셋의 구조 및 IUPAC 명명은 다음과 같다.

(R)-N-[1-(1-naphthyl)ethyl]-3-[3-(trifluoromethyl)phenyl]propan-1-amine

CaR은 이온채널/트랜스포터(transporter) 활성, 펩타이드 분비, 세포 증식 및 사멸, 주화성(chemotaxis), 및 종양 유전자 조절 등에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 심혈관계에서는 상피세포에 존재하며 eNOS 활성을 통해 NO의 생산을 촉진시킨다. AMPK-eNOS의 생물학적 이용효능(bioavailability)의 감소와 잠재적으로 유해한 활성산소종 발생의 증가는 당뇨병성 말초신경병증의 발병에 결정적인 역할을 한다. 따라서, 본 발명자들은 db / db 마우스 및 HSCs (human Schwann cells)에서 AMPK-eNOS 경로를 거치는 산화 스트레스의 변화를 통해 당 독성에 대한 시나칼셋 작용제의 신경 보호 효과를 조사하였다. 8주령의 수컷 C57 BLKS db / db 마우스 및 db /m 대조군을 나누어(각각 n=8), 일반적인 사료 또는 시나칼셋(10 mg/kg)이 포함된 사료를 주면서, 12주간 키운 뒤 감각신경의(sensorineural) 기능적, 병리학적 표현형 및 CaMKKβ/LKB-1-AMPK-eNOS 경로를 측정하였다.

d/m 마우스와 비교하여 db / db 마우스는 감각-운동(sensory-motor) 손상, 신경 섬유증(nerve fibrosis) 및 염증, 축삭(axonal) 수축 및 퇴화를 포함하는 무질서한 미엘린(myelin), 좌골신경(sciatic nerve)에서 나타나는 더 적은 수의 무수 신경섬유(unmylelinated fibers) 등의 특징이 있으나, 이러한 현상들은 시나칼셋 처리에 의해 상당히 개선되었다. 고농도 글루코스 배지의 HSCs에서 시나칼셋은 세포내 Ca⁺⁺ 및 CaMKKβ, LKB1 및 AMPK의 연속적 인산화를 증가시킴으로써 산화 스트레스와 세포사멸(apoptosis)을 감소시켰고, 이는 eNOS-NO의 인산화 및 Bcl-1/Bax 비율 증가와 관련이 있었다. 이러한 결과는 시나칼셋이 잠재적인 제2형 당뇨병성 신경병증 치료제가 될 수 있다는 것을 보여준다.

또한, AMPK-eNOS의 생물학적 이용효능(bioavailability)의 감소와 활성산소종 발생의 증가는 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy)의 발병에도 결정적인 역할을 하므로, 본 발명자들은 db / db 마우스 및 HGECs (human glomerular endothelial cells)에서 AMPK-eNOS-NO 경로를 통해 당 독성에 대한 시나칼셋 작용제의 신장 보호 효과를 조사하였다. 8주령의 수컷 C57 BLKS db / db 마우스 및 db /m 대조군을 나누어(각각 n=8), 일반적인 사료 또는 시나칼셋(10 mg/kg)이 포함된 사료를 주면서, 12주간 키운 뒤 신장의 기능적, 병리학적 표현형 및 AMPK-eNOS-NO 경로를 측정하였다.

그 결과 시나칼셋은 db / db 마우스에서 혈액 글루코스 및 Ca⁺⁺ 농도의 변화 없이 단백뇨를 감소시켰다. db / db 마우스와 비교할 때, 시나칼셋은 사구체에서 메산지움 확장(mesangial expansion) 및 염증세포 침윤을 개선시켰으며, CaSR 발현, CaMKKβ 및 LKB1의 인산화 및 이어지는 AMPK 활성을 증가시켰고, 이는 PGC-1α1 및 phospho-Ser1177 eNOS-NO를 활성화시켜, 결과적으로 신장 외피에서 Bcl-2/Bax의 비율을 증가시키고, SOD (superoxide dismutase) 1 및 SOD2 발현의 증가와 관련이 있는 소변의 8-히드록시-디옥시구아노신(8-hydroxy-deoxyguanosin) 및 이소프로스탄(isoprostane) 농도를 감소시켰다. 배양된 HGECs에서, 시나칼셋은 세포내 Ca⁺⁺ 및 CaMKKβ, LKB1 및 AMPK의 인산화를 증가시킴으로써 산화 스트레스 및 세포사멸을 감소시켰으며, 이는 eNOS 인산화의 증가와 관련이 있다. 이와 같은 결과는 시나칼셋이 신장, 특히 HGECs에서 세포내 Ca⁺⁺ 증가 및 CaMKKβ-LKB1-AMPK 신호전달 경로의 연속적인 활성화를 통해 당 독성을 개선하여, 잠재적인 제2형 당뇨병성 신증 치료제로 사용될 수 있음을 보여준다.

따라서 본 발명은 시나칼셋(cinacalcet) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 '약학적으로 허용 가능한' 이란 생리학적으로 허용되고 동물에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 사용하기에 적합한 담체로는 식염수, 인산염 완충 식염수, 최소 필수 배지(MEM) 또는 HEPES 완충액의 MEM을 포함하는 수성 매질을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 근육, 피하, 경피, 정맥, 비강내, 복강내 또는 경구 경로로 투여될 수 있고 바람직하게는 근육내 또는 피하 경로로 투여될 수 있다. 조성물의 투여량은 투여 경로, 동물의 연령, 성별, 체중 및 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명의 시나칼셋은 기능성 식품 조성물로 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 식품 조성물은 시나칼셋의 당뇨병성 미세혈관 합병증의 예방 및 치료 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 상기 효과를 배가시키기 위하여 다른 생리적 활성 성분, 즉 안전성이 검증된 천연의 항산화 물질 등을 추가적으로 배합하여 제조할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 그 형태에 있어서 특별히 제한은 없으며, 예를 들어 통상의 형태 이외에, 유동식품, 경장영양식품, 건강식품, 유소아 식품 등의 형태로 제조될 수 있다. 계속적 섭취의 측면에서는 쌀밥이나 각종 조미료, 조합 유지나 마가린, 쇼트닝, 마요네즈, 드레싱 등의 유지 가공품이 가능하다. 또한, 형태는 고체 형상, 반고체 형상, 겔 형상, 액체 형상, 분말 형상 등 당업계에서 통상 사용되는 어떠한 형태도 이용가능하다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 과자, 가공식품, 조합 유지, 유제품, 음료, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등의 형태로 상품화할 수 있다. 추가로, 본 발명의 식품 조성물은 본 발명의 당단백질 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

시나칼셋의 신경 보호 효과 평가

<1-1> 동물실험

당뇨병 동물모델인 db/db 마우스와 정상 대조군인 db/dm 마우스를 이용하였으며, 다음과 같이 4군으로 나누었다: 비당뇨 대조군(db/dm 마우스, Non-diabetic control, n = 8), 비당뇨 시나칼셋 치료군(db/dm 마우스 + 시나칼셋 10 mg/kg; 0.001% wt/wt, n = 8), 당뇨 대조군(db/db 마우스, Diabetic control, n = 8), 당뇨 시나칼셋 치료군(db/db 마우스 + 시나칼셋 10 mg/kg; 0.001% wt/wt, n = 8).

대조군은 일반 사료를 섭취시켰으며, 시나칼셋 치료군에는 시나칼셋(10 mg/kg; 0.001% wt/wt)이 포함된 사료를 생후 8주령부터 12주 동안 섭취하도록 하였다. 실험기간 동안 체중은 매주 측정하였으며, 공복혈당은 꼬리정맥에서 혈액을 채취하고 매 2주마다 Accu-Chek meter (Roche Diagnostics, St. Louis, MO)을 이용하여 측정하였고, 당화혈색소(HbA1c)는 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하고 Pfizer 1200 automatic analyzer (Bayer healthcare LLC, IN)를 이용하여 4주마다 측정하였다. 사육실의 온도 및 습도는 각각 20~25℃ 및 50~60%로 유지 하였으며, 12시간 간격으로 점등 및 소등 하였다. 실험 종료 시 대정맥에서 혈액을 채취하고 원심분리후 혈장은 -70℃에 보관하였다. 또한 혈액 내 ionized 칼슘 농도는 autoanalyzer (iSTAT Corporation, NJ)를 이용하여 측정하였다.

<1-2> 말초신경 기능평가

말초신경 기능평가를 위해 좌골신경의 감각역치(Tactile responses)와 운동전도속도(Sciatic motor nerve conduction studies;MNCS)를 측정하였다. 좌골신경의 감각역치는 쉽게 구부러지는 von Frey filaments를 이용해 자극에 대한 50% paw withdrawal threshold를 정량화하여 분석하였다. 운동전도속도는 호흡 정지를 피하기 위해 이소플루란(isoflurane)으로 마취한 뒤, 15분 이내에 근전도 장치를 이용하여 좌측 좌골 신경에서 수행 하였다. 좌골 신경은 동측의 좌골 절흔에서 최대치로 자극하였고, 운동 반응은 뒷발의 fifth inter-osseous 근육을 관찰하여 측정하였다. 운동신경을 반복적으로 자극하여 근육이 수축하면서 발생한 활동전위인 복합근활동전위(compound muscle action potential; CAMP)의 진폭의 증감 정도를 측정하였다.

<1-3> 조직학적 검사

근전도 검사가 끝난 후 좌골신경 절편을 채취하여 광학 및 투과 전자현미경 검사를 시행하였다.면역염색을 위해 10% 포르말린에 고정 후 파라핀에 포매하였다. 조직절편은 4 μm 두께로 박절하였으며 좌골신경 조직 내 섬유화의 정량을 위해서 Masson's Trichrome 염색을 하여 평가했다. 또한 streptavidinbiotin-peroxidase (Vector Laboratories)법을 이용하여 항 type IV collagen 항체 (Col IV (1:200; Biodesign International, Saco, ME, USA), 항F4/80 항체 (1:200; Serotek, Oxford, UK)와 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후 DAB (diaminobenzidine tetrahydrochloride)로 발색하여 발현을 확인하였다. 각각의 발현정도는 광학현미경으로 1000배 시야에서 관찰한 후 사진을 촬영하였다(Olympus BX-50, Olympus Optical, Tokyo, Japan). 투과 전자현미경 검사를 수행하기 위해, 좌골신경 표본을 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)와 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에 넣어 4℃에서 overnight 동안 고정하였다. 수세 후에 표본을 1% 사산화 오스뮴(osmium tetroxide)에 1시간 동안 후고정 하였다. 그 뒤 표본을 시리즈 에탄올과 아세톤에서 탈수과정을 거친 후, Epon 812에 포매하였다. Ultramicrotome (Leica Ultracut UCT, Leica, Germany)을 이용해 70~80 nm로 초박 절편(thin section)을 제작한 후, uranyl acetate와 lead citrate로 이중 염색을 시행하여 transmission electron microscope (JEM 1010, Tokyo, Japan) 으로 60 kV의 가속전압 하에서 미세구조를 관찰하였으며. NIH Image J 프로그램을 사용하여 unmyelinated fiber의 면적, axonal diameters 와 degenerative fiber의 수를 측정하였다.

<1-4> 이중 면역형광염색 ( TUNEL 및 F4/80)

이중 면역형광염색(double immunofluorescence staining)을 수행하기 위해 ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit (S7110; Chemicon International, Temecula, CA)를 사용하여 TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) 측정을 시행하여 세포사멸 정도를 확인하였고, 이어서 항F4/80 항체 (1:200; Serotek, Oxford, UK)항체를 반응시킨 뒤 Texas red-labeled secondary antibody를 처리하였고, 핵은 4,6-diamidino2-phenylindole (DAPI)로 대조염색 하여 형광현미경(Zeiss fluorescent microscope)을 통해 관찰하였다.

<1-5> 세포배양 및 웨스턴 블랏 분석

본 연구에서는 슈반세포주(Human schwann cell; HSCs)를 Anigio-Proteomie (Boston, MA)에서 구매하여 이용하였다. 세포는 Endo-growth media (Angio-Proteomie, Boston, MA)에서 배양하였다. 세포주는 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 또한 고농도의 당이 첨가된 배양액에서 시나칼셋의 직접적인 영향을 알아보기 위해 HSCs에 저농도 글루코스(low glucose), 고농도 글루코스(high glucose), 만니톨 대조군(mannitol control)을 처리 한 뒤 시나칼셋(1nM, 5nM, 15nM)을 24시간 동안 처리하였다. 24시간 뒤 세포에서 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏 분석을 통해 CaSR (Calcium-sensing receptor), CaMKKβ (Ca⁺⁺/calmodulin-dependent protein kinase kinaseβ), total AMPK, phospho-Thr¹⁷²AMPK, phospho-Ser¹¹⁷⁷ eNOS, BCL-2 (B cell leukaemia/lymphoma 2), BAX (BCL-2-associated X protein), β-actin 의 발현을 확인하였다.

<1-6> 세포내 칼슘농도([ Ca2 +]i) 측정

세포 내 칼슘농도를 측정하기 위하여 Ca2+과 결합할 수 있는 막투과성 형광 표지자인 fura 2-AM(acetoxymethyl ester form)을 배양액에 첨가하여 정상 농도의 당과 고농도의 당이 포함된 HSCs에 각각 37℃에서 30분간 노출시켜 Fura-2/AM이 세포내로 들어가게 한 후 다음 실험에 사용하였다. Fura-2/AM이 세포내로 부하된 후에는 세포내에 존재하는 esterase에 의해 가수분해가 일어나 유리형태의 Fura-2가 되는데, 이것이 Ca2+과 결합하면 Fura-2의 여기(excitation) 형광 분광상(spectrum) 변화를 유발하여 340 nm에서의 형광강도(flouroscence)는 점차로 증가하고 380 nm에서의 형광강도는 반대로 감소하게 된다. 이후 cinacalcet은 15nM, 100nM 농도로 처리한 뒤 Spectrofluorophotometer(Synergy MX, USA)를 사용하여 세포내 칼슘농도는 340 및 380nm의 파장으로 교대로 여기시킬 때 방출(emission)되는 형광강도를 500 nm의 파장에서의 비율(ratio)로 측정하였다.

<1-7> 통계처리

결과값은 평균과 표준편차로 표시하였고, 각 군 간의 차이는 SPSS 19.0 프로그램을 이용하였다 (SPSS, Chicago, IL, USA). 각 군 간의 평균값의 비교는 일원변량분석 (one-way ANOVA) 및 Bonferroni 사후검정(post hoc multiple comparison)을 이용하여 분석하였고, P 값이 0.05 이하인 경우를 의미 있는 것으로 정의하였다.

실험결과

말초신경 기능 평가

db/db 마우스는 대조군 db/m 마우스에 비해 감각반응역치가 증가하였고, 시나칼셋 처리는 db/m+시나칼셋 및 db/db+시나칼셋 그룹 모두에서 db/m 마우스 수준으로 감각반응역치를 회복시켰다(도 1). db/m 마우스에 비해 db/db 마우스에서 좌골신경 운동근 잠복기(sciatic motor latency)는 상당히 지연되었다. 이러한 결과는 db/db 마우스에서 좌골신경의 운동전도속도가 상당히 지연되며, 이는 시나칼셋 처리에 의해 회복된다는 것을 보여준다.

신경 병리( Nerve Pathology ) 평가

db/m 또는 db/m+시나칼셋 마우스에 비하여 db/db 마우스의 3색(trichrome)-염색 지역에서 좌골신경은 훨씬 더 많은 섬유증(fibrosis)을 나타냈다(도 2A). 또한, 면역조직화학염색 결과 Col IV 발현은 db/db 마우스의 좌골신경에서 db/m 및 db/m+시나칼셋 마우스에 비하여 높게 나타났다(도 2B). F4/80-양성 세포의 존재에 의해 정의되는 염증세포 침투는 비당뇨 db/m 마우스에 비해 db/db 마우스에서 더 심각하게 관찰 되었다(도 2C). 따라서, 12주간의 시나칼셋 처리는 db/db 마우스에서 증가된 좌골신경 섬유증 및 Col IV 및 F4/80 발현의 상향조절(upregulation)로부터 보호할 수 있음을 알 수 있다.

또한, db/db 마우스에서 F4/80 및 TUNEL-이중 양성 세포들의 수도 증가하였다(도 3). 그리고 db/db 마우스에 대한 시나칼셋 처리가 db/m 마우스에 비해 F4/80 및 TUNEL-이중 양성 세포의 수를 감소시켰다. 이와는 대조적으로, db/m 마우스에서는 시나칼셋 처리에 의한 F4/80 및 TUNEL-이중 양성 세포 수의 변화는 관찰되지 않았다.

전자현미경 관찰

초미세 구조 조사 결과, db/db 마우스의 좌골신경에서는 무수 신경섬유(unmylelinated fibers)의 총면적과 신경돌기의 직경이 감소하였고, 신경돌기 퇴화가 증가하였다(도 4). 시나칼셋을 처리한 db/db 마우스의 신경돌기는 db/db 마우스와 비교하여 신경 내 혈관의 수, 무수 신경섬유의 면적, 신경돌기의 직경, 및 신경돌기의 퇴화 정도가 db/m 대조군 마우스와 비교될만한 수준으로 회복되었다.

시나칼셋 처리가 HSCs 에 미치는 영향

고농도의 글루코스 조건이 단독으로 또는 시나칼셋 처리와의 조합으로 HSCs에 미치는 영향을 조사하였다. HSCs에서 고농도의 글루코스 처리로 인해 감소된 CaMKKβ-AMPK-eNOS 신호전달의 발현은 시나칼셋 처리에 의해 상당히 증가하였다(도 5A). 고농도 글루코스 배지에서 시나칼셋 처리는 고농도 글루코스 배지만을 단독으로 사용한 경우에 비해 BCL-2/BAX 발현을 증가시켰다(도 5B). 또한 고농도 글루코스 배지에 시나칼셋 처리는, 세포 내 Ca⁺⁺ 및 CaMKKβ, LKB1 및 AMPK의 연속적인 인산화를 증가시킴으로써, 산화 스트레스 및 세포사멸을 감소시켰다. 이것은 eNOS-NO의 인산화 및 Bcl-2/Bax 비율의 증가와 관련이 있다.

고농도 글루코스 배지의 HSCs 에 대해 시나칼셋이 세포내 Ca ++과 관련하여 미치는 직접적 영향

본 실시예의 세포 모델에서 시나칼셋 첨가가 [Ca2+]i를 조절할 수 있는지 알아보기 위하여, FURA-2AM-loaded HSCs를 고농도 글루코스 배지와 함께 서로 다른 농도(15, 100 nM)의 시나칼셋으로 자극하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 시나칼셋은 세포 밖에 칼슘이 없는 조건에서 투여량에 비례하게 세포내 Ca++을 상당히 증가시켰다.

< 실시예 2>

시나칼셋의 신장 보호 효과 평가

<2-1> 동물실험

당뇨병 동물모델인 db/db 마우스와 정상 대조군인 db/dm 마우스를 이용하였으며, 다음과 같이 4군으로 나누었다: 비당뇨 대조군(db/dm 마우스, Non-diabetic control, n = 8), 비당뇨 시나칼셋 치료군(db/dm 마우스 + 시나칼셋 10 mg/kg; 0.001% wt/wt, n = 8), 당뇨 대조군(db/db 마우스, Diabetic control, n = 8), 당뇨 시나칼셋 치료군(db/db 마우스 + 시나칼셋 10 mg/kg; 0.001% wt/wt, n = 8).

대조군은 일반 사료를 섭취 시켰으며, 시나칼셋 치료군에는 시나칼셋(10 mg/kg; 0.001% wt/wt)이 포함된 사료를 생후 8주령 부터 12주 동안 섭취하도록 하였다. 실험기간 동안 체중은 매주 측정하였으며, 공복혈당은 꼬리정맥에서 혈액을 채취하고 매 2주마다 Accu-Chek meter (Roche Diagnostics, St. Louis, MO)을 이용하여 측정하였고, 당화혈색소(HbA1c)는 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하고 Pfizer 1200 automatic analyzer (Bayer healthcare LLC, IN)를 이용하여 4주마다 측정하였다. 사육실의 온도 및 습도는 각각 20~25℃ 및 50~60%로 유지 하였으며, 12시간 간격으로 점등 및 소등 하였다.

<2-2> 혈청 파라피터 측정 및 콩팥기능 평가

실험 종료에 대정맥 또는 좌심실에 혈액을 채취하고 원심분리후 혈장은 -70 ℃에 보관하였다. 또한 혈액 내 PH, PC02, hemoglobin, hematocit, HCO3, 총 Co2, Na, K, Cl, Ca, P 농도는 autoanalyzer (iSTAT Corporation, NJ)를 이용하여 측정하였다. 매 4주마다 대사케이지(Nalgene, Rochester, NY)에서 24시간 소변을 수집하여 -70℃ deep freezer에서 냉동보관 하였다. 모아진 소변에서 ELISA 방법으로 크레아틴(creatinine)과 알부민(albumin)을 측정하였다(Exocell, Philadelphia, PA).

<2-3> 산화 스트레스 측정

혈청과 24시간 소변에서 산화적 스트레스를 확인하기 위해 8-hydroxy-deoxyguanosine (8-OH-dG; OXIS Health Products, Portland, OR, USA)와 8-epi-prosataglandin F_2a (isoprostane; OXIS Health Products)를 ELISA법으로 측정하였다.

<2-4> 조직학적 검사

신장 조직은 적출하여 무게를 측정한 후 일부는 면역염색을 위해 10% 포르말린에 고정 후 파라핀에 포매하였다. 조직절편은 4 μm 두께로 박절하였으며 신장 조직 내 glomerular hypertrophy와 mesangial expansion은periodic-Schiff (PAS) staining 을 시행하여 평가했다. 또한 streptavidinbiotin-peroxidase (Vector Laboratories)법을 이용하여 항type IV collagen 항체 (Col IV (1:200; Biodesign International, Saco, ME, USA), 항F4/80 항체 (1:200; Serotek, Oxford, UK) , 항TGF-b1 항체 (1:100; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)와 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후 DAB (diaminobenzidine tetrahydrochloride)로 발색하여 발현을 확인하였다. 각각의 발현정도는 광학현미경으로 400배 시야에서 관찰한 후 사진을 촬영하였다(Olympus BX-50, Olympus Optical, Tokyo, Japan).

<2-5> 웨스턴 블랏 분석

단백질은 Pro-Prep Protein Extraction Solution (Intron Biotechnology, Gyeonggi-Do, Korea)을 사용하여 추출 하였으며, SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 실시하였다. 이렇게 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane (Amersham Co., Buckinghamshire, England)에 이동시켜 3% skim milk를 함유한 Tris buffered saline (in TBS-T: 0.1% Tween-20 in Tris buffer saline, pH7.5)로 1시간 동안 blocking시킨 다음 blot들을 Calcium-sensing receptor (CaSR), Ca ²⁺/calmodulin-dependentproteinkinasekinaseα(CaMKKa), Ca⁺⁺/calmodulin-dependentproteinkinasekinaseb (CaMKK b), total LKB1, phospho LKB1, total AMPK, phospho-Thr¹⁷²AMPK,PGC1a, total eNOS, phospho-Ser¹¹⁷⁷ eNOS, B cell leukaemia/lymphoma 2 (BCL-2), BCL-2-associated X protein (BAX), β-actin 일차 항체 용액에 넣어 반응시킨 후 세척 하고, 각각의 1차 항체에 대항하는 이차 항체를 반응시킨 뒤 ECL (Pierce, Rockford IL)을 통해 감광하여 밴드를 확인하였다. 각 단백질의 발현 수준은 β-actin에 맞추어 표준화 하였다.

<2-6> 세포배양

본 연구에서는 사구체 혈관내피세포(Human glomerular endothelial cells ; HGECs)를 Anigio-Proteomie (Boston, MA)에서 구매하여 이용하였다. 세포는 Endo-growth media (Angio-Proteomie, Boston, MA)에서 배양하였다. 세포주는 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 또한 고농도의 당이 첨가된 배양액에서 시나칼셋의 직접적인 영향을 알아보기 위해 HGECs에 저농도 글루코스(low glucose), 고농도 글루코스(high glucose), 만니톨(mannitol) 대조군을 처리한 뒤 시나칼셋(1nM, 5nM, 15nM)을 24시간 동안 처리하였다. 24시간 뒤 세포에서 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏 분석을 통해 total AMPK, phospho-Thr¹⁷²AMPK, total eNOS, phospho-Ser¹¹⁷⁷ eNOS, BCL-2 (B cell leukaemia/lymphoma 2), BAX (BCL-2-associated X protein), SOD1 (Cu/Zn superoxide dismutase) 및 SOD2 (Mn superoxide dismutase), β-actin 의 발현을 확인하였다.

<2-7> siRNA 트랜스펙션( small interfering RNA transfection )

HGECs에 대조군 siRNA 또는 AMPKa1, AMPKa2, SIRT1 siRNA를 트랜스펙션 시약(Lipofectamin 2000; Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 트랜스펙션시켰고, 정상 배양 조건에서 30mM의 고농도 글루코스와 5nM의 시나칼셋을 처리하였다. 24시간 후 단백질을 추출하여 총 AMPK, phospho-Thr¹⁷²AMPK, SIRT1, phospho-Ser¹¹⁷⁷ eNOS, β-actin의 발현을 확인하였다. 실험에 사용된 siRNA (Bioneer, Daejeon, Korea)의 서열은 다음과 같다.

α1-AMPK : GCAUAUGCUGCAGGUAGAU

α2-AMPK : CGUCAUUGAUGAUGAGGCU

SIRT1 : AAGACGGATTGCCCTCATTTG

nonspecific scrambled siRNA : CCUACGCCACCAAUUUCGU

<2-8> 세포내 칼슘농도([ Ca2 +]i) 측정

세포 내 칼슘농도를 측정하기 위하여 Ca2+과 결합할 수 있는 막투과성 형광 표지자인 fura 2-AM(acetoxymethyl ester form)을 배양액에 첨가하여 정상 농도의 당과 고농도의 당이 포함된 HGECs에 각각 37℃에서 30분간 노출시켜 Fura-2/AM이 세포내로 들어가게 한 후 다음 실험에 사용하였다. Fura-2/AM이 세포내로 부하된 후에는 세포내에 존재하는 esterase에 의해 가수분해가 일어나 유리형태의 Fura-2가 되는데, 이것이 Ca2+과 결합하면 Fura-2의 여기(excitation) 형광 분광상(spectrum) 변화를 유발하여 340 nm에서의 형광강도(flouroscence)는 점차로 증가하고 380 nm에서의 형광강도는 반대로 감소하게 된다. 이후 cinacalcet은 15nM, 100nM 농도로 처리한 뒤 Spectrofluorophotometer(Synergy MX, USA)를 사용하여 세포내 칼슘농도는 340 및 380nm의 파장으로 교대로 여기시킬 때 방출(emission)되는 형광강도를 500 nm의 파장에서의 비율(ratio)로 측정하였다.

<2-9> 통계처리

결과값은 평균과 표준편차로 표시하였고, 각 군 간의 차이는 SPSS 19.0 프로그램을 이용하였다 (SPSS, Chicago, IL, USA). 각 군 간의 평균값의 비교는 일원변량분석 (one-way ANOVA) 및 Bonferroni 사후검정(post hoc multiple comparison)을 이용하여 분석하였고, P값이 0.05 이하인 경우를 의미 있는 것으로 정의하였다

실험결과

시나칼셋을 처리한 db /m 및 db / db 마우스의 신체적 및 생화학적 특성

시나칼셋 처리와 무관하게 db /m 마우스 그룹에 비해 db / db 마우스 그룹에서 체중, 신장 무게, 혈액 글루코스 농도 및 HbA1c가 상당히 증가하였다(표 1). 혈청 크레아틴 및 iCa⁺⁺수준은 모든 그룹에서 변화가 없었다. db /m 및 db /m 시나칼셋 마우스에 비해 db / db 마우스에서 단백뇨(albuminuria)가 상당히 증가하였으나, 시나칼셋 처리는 단백뇨를 db /m 및 db /m 시나칼셋 마우스 수준으로 낮췄다(도 7).

시나칼셋 처리가 신장의 표현형, TGF -β1, 제 IV 형 콜라겐( Col IV ), 및 F4/80 에 미치는 영향

db /m 및 db /m 시나칼셋 마우스 사이에서 메산지움 영역(mesangial area)의 큰 차이는 없었다(도 8). 반면에, db / db 마우스에서는 db /m 마우스에 비해 메산지움 영역이 상당히 증가하였다(P<0.01). 메산지움 영역의 변화와 일치하게, db /m 및 db /m 시나칼셋 마우스에 비해 db / db 마우스에서, 세포외기질인 Col IV 및 사구체 영역의 염증세포 침투와 관련이 있는 전섬유화성(pro-fibrotic) 성장인자 TGF-β1의 발현이 상당히 증가하였다(도 8). db / db 마우스에서 나타나는 당뇨병에 의해 유발된 신장의 모든 표현형의 변화와 염증세포 침윤은 시나칼셋 처리에 의해 감소하였다.

CaMKK α / β- AMPK - eNOS 신호전달 경로의 신장 내 발현

신장 내 CaMKKα/β, total LKB1, phospho LKB1, phospho-Thr¹⁷²AMPK,PGC1α, 및 phospho-Ser¹¹⁷³ eNOS 단백질 수준을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 시나칼셋 처리와 무관하게 db /m 마우스 그룹들 사이에서 CaMKKα/β, phospho-Thr¹⁷² AMPK 신호전달에는 차이가 없었다(도 9). db / db 마우스 그룹에서는 CaMKKα, phospho LKB1 및 Phospho-Thr¹⁷² AMPK 수준이 감소하였으며, 시나칼셋 처리에 의해 상당히 증가하였다. db /m 마우스에 비해 db / db cont 마우스에서 phospho-Ser¹¹⁷³ eNOS 발현은 감소하였으며(P < 0.05)(도 9) db /m 및 db / db 마우스에서 시나칼셋의 처리로 phospho-Ser¹¹⁷³ eNOS의 발현을 증가시켰고, 이로 인해 NOx가 증가하고 24 hr 8-OH-dG 및 24-hr urinary 8-isoprostane 농도가 감소하였으며, 이는 신장 내 산화 스트레스의 감소를 반영한다(도 10).

pro - apoptotic BAX , anti - apoptotic BCL -2의 신장내 발현

eNOS 인산화가 BCL-2 활성 증가 및 pro-apoptotic BAX 활성의 하향조절에 의해 항-스트레스 및 항-세포사멸 활성을 갖는다는 것이 잘 알려져 있다. eNOS의 변화와 일치하게, db / db 마우스에서 BAX 단백질 수준은 증가한 반면, BCL-2 단백질 수준은 db/m 및 db /m 시나칼셋 마우스에 비해 감소하였다. 결과적으로, db / db 마우스에서 BCL-2/BAX 비율은 상당히 감소하였다. db / db 마우스에서 시나칼셋 처리는 BCL-2 단백질을 증가시키고, Bax 단백질을 감소시켰으며, 이는 BCL-2/BAX 발현 비율의 수준을 정상화시켰다(도 11, P<0.01).

인 비트로( in vitro ) 평가

db / db 마우스에서 시나칼셋은 당뇨병에 의해 유발되는 신장에 유해한 효과를 감소시켰으므로, 배양된 HGECs에서 시나칼셋이 고농도의 글루코스에 의해 유발되는 산화 스트레스에 미치는 영향과 CaMKKα-AMPK-eNOS 신호전달과 관련된 세포사멸의 효과를 평가하였다. 웨스턴 블랏 분석 결과 고농도의 글루코스(30 mmol/l의 D-glucose)처리로 인해 phospho-Thr¹⁷²AMPK, phospho-Ser¹¹⁷³eNOS 발현이 감소 하였으며 고농도 글루코스 배지에서의 시나칼셋 처리(1nM, 5nM, 15nM)로 이들 발현이 증가되었다 (도 12). 고농도 글루코스 배지에서의 시나칼셋 처리는 고농도 글루코스(30 mmol/L 의 D-glucose) 배지를 단독으로 처리한 경우보다 BCL-2/BAX 발현을 증가시켰으며, 이는 감소된 SOD1 및 SOD2 발현과 관련이 있다(도 12). AMPK가 시나칼셋 처리에 의한 자극과 관련이 있는지 알아보기 위하여, HGECs에서 AMPK α1, AMPK α2, 및 SIRT1 에 대한 siRNAs를 사용하여 트랜스펙션을 수행하였다. 고농도 글루코스 배지에 시나칼셋을 단독으로 처리한 군과 비교하여 AMPK α1, AMPK α2, 및 SIRT1 siRNAs를 HGECs에 트랜스펙션 시켜 유전자 발현을 억제 시킨 군에서는 시나칼셋-유도 AMPKSIRT1 신호전달의 발현이 모두 억제되었다(도 13).

고농도 글루코스 배지의 HGECs 에서 시나칼셋이 세포내 Ca ++과 관련하여 미치는 직접적 영향

본 실시예의 세포 모델에서 시나칼셋 첨가가 [Ca2+]i를 조절할 수 있는지 알아보기 위하여, FURA-2AM-loaded HGECs를 고농도 글루코스 배지와 함께 서로 다른 농도(15, 100 nM)의 시나칼셋으로 자극하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 시나칼셋은 세포 밖에 칼슘이 없는 조건에서 투여량에 비례하게 세포내 Ca++을 상당히 증가시켰다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

1. 시나칼셋(cinacalcet) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 제2형 당뇨병성 신증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 시나칼셋은 세포내의 칼슘 농도를 증가시키고, CaMKKβ, LKB1 및 AMPK의 인산화를 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 시나칼셋은 eNOS의 인산화를 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 시나칼셋은 세포내에서 BAX에 대한 BCL-1 또는 BCL-2의 비율을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 시나칼셋(cinacalcet) 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 제2형 당뇨병성 신증의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
   
8. 삭제

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