TWI814760B - 脂質運載蛋白型前列腺素ｄ２合成酵素產生促進劑 - Google Patents

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Abstract

本發明的目的係提供脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素(L-PGDS)產生促進劑，更具體而言，係於外被細胞或由外被細胞經脫分化而得的缺血誘導性多潛能幹細胞(iSC)中提供L-PGDS產生促進劑。
本發明中，具有L-PGDS產生促進作用的物質經確認為牛痘病毒接種炎症組織提取物所含有。LPGDS產生促進劑對於可期待因L-PGDS表現促進所致的效果的疾患為有用性高者，亦即，作為腦梗塞等腦血管障礙、阿茲海默症等認知症或睡眠障礙的預防、治療或復發預防藥為有用性高者。

Description

脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑
本發明係關於脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素(以下有標記為「L-PGDS」。再者，可稱為「脂質運載蛋白型前列腺素D合成酵素」者亦可包含於本發明)的產生促進劑等。
前列腺素D2合成酵素(PGDS)中，已知有分布於中樞神經系、雄性生殖器、心臟等之脂質運載蛋白型(L-)PGDS，以及分布於肥胖細胞或T2細胞之造血器官型(H-)PGDS二種類。L-PGDS係具有催化由前列腺素生合成的共通中間體前列腺素H2(PGH2)至前列腺素D2(PGD2)的異構化反應的活性。另外，L-PGDS係屬於構造上發揮脂溶性物質的載子的脂質運載蛋白家族。因此，L-PGDS為具有PGD2生合成酵素與脂溶性載子的雙面性的多功能蛋白質。
分布於中樞神經系的L-PGDS亦於腦脊髓液檢出，由於具有較其他的脂質運載蛋白巨大的親油性口袋，咸信擔任作為腦內的各種各樣脂溶性分子的輸送蛋白質及清除者的角色。作為該等L-PGDS的脂質運載蛋白的功能例，可列舉例如蜘蛛膜下出血後腦內L-PDGS上升，與成為 神經毒性原因的膽紅素結合而迴避神經毒性(Inui T.et al.,J.Cereb.BlooD Flow Metab.34,1558-1567,2014)，或L-PGDS於阿茲海默症的患者或動物模式中，與類澱粉β蛋白質(Aβ、老人斑)的寡聚物形成所必要的區域強固地結合，阻礙腦脊髓液中的Aβ凝集形成及細胞傷害性(Kanekiyo T.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104,6412-6417,2007)等。
再者，已有小鼠的缺血腦中，PGD2的產生顯著地增加，經由L-PGDS及H-PGDS，或PGD2受體DP1的基因剔除造成缺血後的腦浮腫發病為重症化的報告(Tanigichi H.et al.,J.Neurosci.27,4303-4312,2007)，及經由L-PGDS的基因剔除造成腦梗塞及腦浮腫增大的報告(Saleem S.et al.,Neuroscience 160,248-254,2009)。由此咸信，腦缺血時經由L-PGDS或H-PGDS所產生的PGD2，係經由透過其受體的作用而執行腦保護。
進一步地，已有報告因半乳糖基神經醯胺酶缺損所致的脫髓性疾患克伯氏病的模式小鼠(Twitcher小鼠)中，在顯示脫髓阻抗性的軸突區域中觀察到L-PGDS基因表現的上升，當進一步地導入L-PGDS的缺損時會引起因寡樹突細胞的消失所致之脫髓的重症化(Taniike M.et al.,J.Neurosci.22,4885-4896,2002)。再者，L-PGDS缺損小鼠中，有報告末稍神經的脫髓受到誘導，發現許旺細胞的PGD2受體之Gpr44於神經髓鞘化為必要者(Trimarco A.et al.,Nature Neurosci.17,1682-1992,2014)。由該等發現，咸信寡樹突細胞(中樞神經)或許旺細胞(末梢神經)中，對於神經軸突髓鞘化與其維持而言L-PGDS及其產物之PGD2為必要者。
又，關於因L-PGDS所致之保護作用，不以神經細胞為限， 亦有報告說屬於為PGD2的代謝產物之15-去氧-前列腺素J2可迴避因過氧化壓力所致之消化道膠細胞的細胞死亡(Abdo H.et al.,J.Physiol.590,2739-2750,2012)。
進一步地，以往已知由L-PGDS所合成之腦內PGD2具有睡眠調節作用(Ueno R.et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.109,576-582,1982)。關於其機制，由日本的研究者詳細檢討的結果，PGD2係經由眼底部蜘蛛網膜DP1受體分泌腺核苷而刺激睡眠中樞者。由於L-PGDS對於酵素產物之PGD2具有高的親和性，推定確保腦脊髓液中的PGD2安全性之同時將PGD2往附近的受體輸送(Urade Y.anD Hayaishi O.,Biochim.Biophys.Acta 1482,259-271,2000)，咸信與經由PGD2的睡眠調節大為相關。
如上述方式，L-PGDS扮演作為合成PGD2的酵素蛋白質，同時擔任作為腦內的各種各樣疏水性低分子的結合、輸送及清除者的角色，咸信為具有腦內環境調整、腦保護功能或睡眠調節功能等各種各樣功能的蛋白質。因此，促進L-PGDS產生的情事，使該等功能有效果地進行，咸信L-PGDS有用於相關疾病的預防、治療等。然而，至今未有於活體內促進L-PGDS產生的物質的報告。
本發明中，雖確認牛痘病毒接種炎症組織提取物(本提取物)具有優異的L-PGDS產生促進作用，但已知本提取物或含有該提取物之製劑涉及非常多歧的作用、效果。例如，作為本提取物對於腦的作用、效果，雖已知對於腦哽塞等缺血性疾病的治療效果(日本專利特開2000-16942號公報)及BDNF等神經營養因子的產生促進作用(國際專利公開WO 2011/162317號公報)，但至今未知本提取物具有L-PGDS產生促進作用。
本發明係提供具有腦保護作用、睡眠作用等之促進L-PGDS產生的物質，及以LPGDS產生促進作用為指標之具有腦保護作用、睡眠作用的藥劑篩選系統等。再者，提供含有該物質作為有效成分，於腦梗塞等腦血管障礙、阿茲海默症等認知症、失眠症等L-PGDS相關疾病的預防、治療或復發預防中，有效且安全性高的醫藥者。進一步地，本發明之L-PGDS產生促進劑，於腦血管障礙時等中，具有抑制、緩和腦的缺血障礙、神經細胞傷害等的作用者。又，本發明中使用的「治療」，包含「減輕」、「改善」、「進展抑制」等意義。再者，具有睡眠作用之藥劑於本發明中雖標記為「安眠藥」，但稱為「眠劑」、「睡眠改善藥」、「睡眠導入劑」、「催眠藥」者亦包含於本發明。
本發明者們由使用小鼠腦梗塞模式(中大腦動脈永久閉塞模式)的研究中，藉由血流遮斷而成熟神經細胞死滅的梗塞區域內，發現亦可分化為包含神經細胞、星狀細胞、寡樹突細胞等神經系細胞以外的各種細胞的幹細胞，命名為缺血誘導性多功能幹細胞(ischemia-induced multipotent stem cells，iSCs)。強力表現iSC的神經幹細胞標記nestin係組織化學性地分布於自腦軟膜至大腦皮質的血管周圍，再者，iSC係表現稱為PDGFRβ(源自血小板的增殖因子受體β)或NG2(神經元-膠細胞抗原 2(neuron-glial antigen 2))之血管周皮細胞(外被細胞)標記等，咸信iSC起源係分布於血管周圍的外被細胞。外被細胞係與神經細胞或星狀細胞、血管內皮細胞一起，構成腦功能器質性基本單位的神經血管單位(neurovascular unit，NVU)，咸信對於血腦屏障的形成、維持或神經功能的調節、膠狀淋巴系統(glymphatic system)等，擔任重要角色。iSC係於缺血等腦傷害時，經由外被細胞被重編程(reprogramming)而生成，顯示藉由血管內皮細胞等形成之微小環境而分化為神經細胞。由此咸信，iSC係於腦中風後的血流再建後的神經修復中擔任主要角色的幹細胞。
本發明者們，作為使用iSC的研究的一環，對於牛痘病毒接種家兔炎症皮膚提取物(本提取物)對Isc的作用進行檢討。然後，於iSC添加本提取物培養後，經由約2萬8千個基因的DNA晶片進行綜合的基因表現解析的結果，發現本提取物具有選擇性地促進編碼L-PGDS的基因PTGD表現的作用。再者，於蛋白質層級，亦確認本提取物促進L-PGDS的產生。進一步地，經由免疫組織化學性手法的研究結果，顯示於缺血腦表現的L-PGDS係與外被細胞標記共分布。由該等情況認為，L-PGDS係源自外被細胞或由外被細胞經脫分化而得之iSC者。
如上所述，L-PGDS係作用為合成PGD2的酵素蛋白質，同時主要表現於腦內，擔任作為各種疏水性低分子的結合、輸送及清除者的角色，咸信為具有腦內環境調整、腦保護功能及睡眠調節功能等各種功能的蛋白質。有鑑於該等情況，認為L-PGDS產生促進劑有用於作為腦梗塞等腦血管障礙、阿茲海默症等認知症、失眠症等L-PGDS相關的疾病的預防、治療或復發預防藥。確認本提取物具有優異的L-PGDS產生促進作用， 使阿茲海默症型認知症模式的小鼠腦內的L-PGDS量增加，同時減少Aβ量，後續為改善認知功能。因此，本提取物或本提取物中含有的具有L-PGDS產生促進作用的物質，或含有本提取物的製劑，作為L-PGDS產生促進劑係大為有用。
再者，本發明者們於iSC以L-PGDS產生促進作用為指標，發現對於L-PGDS相關疾病的治療有用的藥劑的篩選方法。該篩選方法，咸信特別有助於具有腦保護作用及睡眠作用的藥劑的開發。再者，本發明於iSC以L-PGDS產生促進作用為指標，經由試驗本提取物或含有本提取物的製劑，可判定或評價本提取物或含有本提取物的製劑的作用、效果，後續為提供擔保本提取物或含有本提取物的製劑的藥效的方法。本發明者們，基於上述發現，完成本發明。
亦即，本申請發明例如包含下述的態樣。
(1)一種脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑。
(2)上述(1)記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑，為牛痘病毒接種炎症組織提取物所含有者。
(3)上述(1)記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑，係含有牛痘病毒接種炎症組織提取物。
(4)上述(1)至(3)中任一項記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑，其中，脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素係於外被細胞或由外被細胞經脫分化而得之缺血誘導性多功能幹細胞中所產生者。
(5)上述(1)至(4)中任一項記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑，係腦保護藥。
(6)上述(5)記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑，其中，腦保護藥的作用係由對膠狀淋巴系統的亢進作用所致者。
(7)上述(5)或(6)記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑，其中，腦保護藥係腦梗塞的預防、治療或復發預防藥。
(8)上述(5)或(6)記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑，其中，腦保護藥係認知症的預防、治療藥。
(9)上述(8)記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑，其中，認知症係阿茲海默症型認知症。
(10)上述(9)記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑，係具有類澱粉蛋白β沉積的阻礙作用。
(11)上述(1)至(4)中任一項記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑，係安眠藥。
(12)上述(2)至(11)中任一項記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑，其中，炎症組織為兔的炎症皮膚組織。
(13)上述(1)至(12)中任一項記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑，係注射劑。
(14)上述(1)至(12)中任一項記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑，係經口劑。
(15)一種具有腦保護作用或睡眠作用之物質的篩選方法，係以脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的表現促進作用為指標。
(16)上述(15)記載的篩選方法，係以於外被細胞或由外被細胞經脫分化而得之缺血誘導性多功能幹細胞中的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的表現促進作用為指標。
(17)上述(15)或(16)記載的篩選方法，其中，具有腦保護作用的物質係腦梗塞的預防、治療或復發預防藥，或認知症的預防、治療藥。
(18)上述(17)記載的篩選方法，其中，認知症係阿茲海默症型認知症。
(19)上述(15)或(16)記載的篩選方法，其中，具有睡眠作用的物質係安眠藥。
(20)一種具有腦保護作用或睡眠作用的物質，係藉由上述(15)至(19)中任一項記載的篩選方法所獲得者。
(21)上述(20)記載的物質，其中，腦保護作用係由類澱粉蛋白β的排出作用所致者。
(22)一種牛痘病毒接種炎症組織提取物或含有該牛痘病毒接種炎症組織提取物之製劑的判定或評價方法，係以脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的表現促進作用為指標。
(23)上述(22)記載的判定或評價方法，係以於外被細胞或由外被細胞經脫分化而得之缺血誘導性多功能幹細胞中的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的表現促進作用為指標。
(24)上述(22)或(23)記載的判定或評價方法，其中，炎症組織係兔的炎症皮膚組織。
(25)一種牛痘病毒接種炎症組織提取物或含有該牛痘病毒接種炎症組織提取物之製劑的品質規格的擔保方法，係藉由進行上述(22)至(24)中任一項記載的判定或評價而擔保其品質規格。
(26)一種品質規格係經擔保的牛痘病毒接種炎症組織提取物或含有該提取物的製劑，係藉由進行上述(22)至(24)中任一項記載的判定或評價而使其品質規格經擔保者。
(27)一種脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的產生促進方法，包含對該治療為有需要的患者投予有效量的牛痘病毒接種炎症組織提取物。
(28)上述(27)記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的產生促進方法，其中，脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素係於外被細胞或由外被細胞經脫分化而得之缺血誘導性多功能幹細胞中產生者。
(29)上述(27)或(28)記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的產生促進方法，其中，脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的產生促進係作用於腦保護或睡眠導入、改善用。
(30)上述(29)記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的產生促進方法，其中，腦保護係腦梗塞的預防、或復發預防。
(31)上述(29)記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的產生促進方法，腦保護係認知症的預防、治療。
(32)上述(31)記載的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的產生促進方法，其中，認知症係阿茲海默症型認知症。
(33)一種牛痘病毒接種炎症組織提取物，係用於脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的產生促進用。
(34)上述(33)記載的牛痘病毒接種炎症組織提取物，其中，脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素係於外被細胞或由外被細胞經脫分化而得之缺血誘導性多功能幹細胞中產生者。
(35)上述(33)或(34)記載的牛痘病毒接種炎症組織提取物，其中，脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的產生促進係用於腦保護或睡眠導入、改善用。
(36)上述(35)記載的牛痘病毒接種炎症組織提取物，其中，腦保護係腦梗塞的預防、治療或復發預防。
(37)上述(35)記載的牛痘病毒接種炎症組織提取物，其中，腦保護係認知症的預防、治療。
(38)上述(37)記載的牛痘病毒接種炎症組織提取物，其中，認知症係阿茲海默症型認知症。
(39)一種牛痘病毒接種炎症組織提取物的使用，係用於製造促進脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生之醫藥。
(40)上述(39)記載的使用，其中，脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素係於外被細胞或由外被細胞經脫分化而得之缺血誘導性多功能幹細胞中產生者。
(41)上述(39)或(40)記載的使用，其中，促進脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生之醫藥係腦保護藥或安眠藥。
(42)上述(41)記載的使用，其中，腦保護藥係腦梗塞的預防、治療或復發預防藥。
(43)上述(41)記載的使用，其中，腦保護藥係認知症的預防、治療藥。
(44)上述(43)記載的使用，其中，認知症係阿茲海默症型認知症。
本發明L-PGDS產生促進劑係經由亢進作為外被細胞或iSC表現的L-PGDS的脂質運載蛋白質的功能，作用為排出腦內的各種疏水性分子的轉運子，而強烈期待免於腦缺血時的傷害及認知症的原因的物質所致之弊害而發揮保護腦的作用。再者，本發明L-PGDS產生促進劑，係經由細胞內所合成之PGD2於腦脊髓液中分泌，經由對腦內的PGD2受體的輸送而期待發揮睡眠調節作用等。特別地，已知本提取物於小鼠的缺血腦模式中，促進L-PGDS的產生，進一步地，經由本提取物投予至阿茲海默症型認知症模式小鼠，腦內的L-PGDS量上升，同時Aβ量減少，確認認知功能改善。藉此，本提取物係具有促進L-PGDS產生的優異藥理作用亦於動物實驗中予以確認。再者，含有本提取物的製劑係作為副作用等問題點少、安全性高的藥劑而可以長年使用者。因此，本發明為有用性極高者。
再者，由於本提取物為包含非常多數的成分之多成分系的物質，其作用以單一或複數的含有成分的含量等判定或評價，擔保藥效等係極為困難。對於此點，根據本發明之L-PGDS的表現促進作用為指標之本提取物或含有本提取物的製劑的判定或評價方法，可簡便地判定或評價本提取物或含有本提取物的製劑的作用，後續的可利用於擔保本提取物或含有該提取物的製劑的藥效。對於此點，本發明為有用性高者。又，本申請 中「判定或評價」係包含經由試驗、檢查等研究對象物而確定效果、作用、適合與否等概念性的全部。
第1圖係顯示經由實時RT-PCR法研究經添加被驗物質而培養iSC的L-PGDS基因(PTGDS)的表現量的結果之圖。
第2圖係顯示經由古典的RT-PCR法研究經添加被驗物質而培養iSC的L-PGDS基因(PTGDS)的表現量之電泳圖。
第3圖係顯示經由西方墨漬法研究經添加被驗物質而培養iSC的L-PGDS蛋白質表現量的電泳圖。
第4圖係顯示經由點墨漬法研究經添加被驗物質而培養之iSC的L-PGDS蛋白質表現量結果的PVDF膜。
第5圖係顯示經由ELISA法研究經添加被驗物質而培養iSC的L-PGDS蛋白質表現量的結果之圖。
第6圖係顯示經由液體層析質量分析法研究經添加被驗物質而培養iSC的細胞提取液中的前列腺素類量的結果之圖。
第7圖係顯示經由液體層析質量分析法研究經添加被驗物質而培養iSC的培養上清部分中添加L-PGDS的受質後之反應產物量的結果之圖。
第8圖係顯示經由免疫組織化學染色法，比較經施加缺血負荷之小鼠腦內的L-PGDS、外被細胞、及血管內皮細胞的分布的結果的影像。
第9圖係顯示經由免疫電子顯微鏡法，觀察經施加缺血負荷之小鼠腦內的L-PGDS的分布結果的影像。
第10圖係經由免疫組織化學染色法，比較由人類腦梗塞病灶取出的培養iSC的L-PGDS及神經幹細胞標記nestin的分布結果的影像。
第11圖係顯示經由免疫組織化學染色法研究經投予被驗物質的阿茲海默症型認知症模式小鼠腦內沉降的類澱粉蛋白β的結果的影像。
第12圖係顯示經由免疫組織化學染色法研究經投予被驗物質的阿茲海默症型認知症模式小鼠腦內的L-PGDS的結果的影像。
第13圖係顯示經由免疫組織化學染色法比較經投予被驗物質的阿茲海默症型認知症模式小鼠腦內的L-PGDS及血管內皮細胞的分布結果的影像。
第14圖係顯示經由西方墨漬法研究經投予被驗物質的阿茲海默症型認知症模式小鼠腦內的類澱粉蛋白β及L-PGDS蛋白質的表現量的結果的電泳圖。
第15圖係顯示經由古典的RT-PCR法研究經添加被驗物質而培養外被細胞的L-PGDS基因(PTGDS)的表現量的結果的電泳圖。
本提取物係含有自接種牛痘病毒而發痘的動物的炎症組織所分離的非蛋白性的活性物質的提取物。本提取物可為經提取狀態的液體，亦可經乾燥而成為固體。本製劑作為醫藥品係非常有用者。作為本製劑，申請人係有於日本製造販賣中的具體商品「牛痘病毒接種家兎炎症皮膚提 取液含有製劑」(商品名：NEUROTROPIN[註冊商標])(以下稱為「NEUROTROPIN」)。NEUROTROPIN有注射劑及錠劑，任一者皆為處方用藥品(ethical drug)。
NEUROTROPIN注射劑的適應症，有「腰痛症、頸肩腕症候群、症候性神經痛、伴隨皮膚疾病(濕疹、皮膚炎、蕁麻疹)的搔癢、過敏性鼻炎、亞急性視神經脊髓病(SMON)後遺症狀的冷感、異常知覺、疼痛」。 NEUROTROPIN錠劑的適應症有「帶狀疱疹後神經痛、腰痛症、頸肩腕症候群、肩關節周圍炎、變形性關節症」。本製劑係申請人所創製而作為醫藥品開發者，其有效性及安全性係經評價為特別優異，歷經長年販賣，於日本的醫藥品市場確立有穩固的地位者。
本發明之牛痘病毒接種炎症組織提取物係將接種牛痘病毒而發痘之炎症組織加以破碎，加入提取溶劑並除去組織片後，進行除蛋白處理，使其吸附於吸附劑，其次藉由溶出有效成分而可獲得。亦即，例如，以下方式的步驟。
(A)採取經接種牛痘病毒而使其發痘的兔、小鼠等的皮膚組織等，將發痘組織加以破碎，加入水、酚(phenol)水、生理食鹽水或酚加甘油水等提取溶劑後，藉由過濾或離心分離而獲得提取液(濾液或上清)。
(B)將前述提取液調整為酸性的pH並加熱，進行除蛋白處理。其次將經除蛋白的溶液調整為鹼性並加熱後過濾或離心分離。
(C)使所得濾液或上清成為酸性並使其吸附於活性碳、高嶺土等吸附劑。
(D)於前述吸附劑中加入水等提取溶劑，調整為鹼性的pH，藉由溶出吸附成分而可獲得牛痘病毒接種炎症組織提取物。之後，根據期望，亦可適宜地將溶出液於減壓下蒸發乾固或凍結乾燥而做成乾固物。
作為獲得接種牛痘病毒的炎症組織用的動物。可使用兔、牛、馬、綿羊、山羊、猴、大鼠、小鼠等牛痘病毒感染的各種動物，作為炎症組織較佳為兔的炎症皮膚組織。兔只要為屬於兔目者即可。例如，有穴兔、飼兔(穴兔經家畜化者)、野兔(日本野兔)、鼠兔、雪兔等。該等之中，較適合使用飼兔。在日本，自以往雖有飼育作為家畜或實驗用動物而繁殖使用的稱為家兔者，此亦為飼兔之別名。飼兔中有多數的品種(breed)存在，可適合使用稱為日本白色種及紐西蘭白色種(New Zealand White)的品種。
牛痘病毒(vaccinia virus)可為任一株者。例如，可列舉李斯特(Lister)株、大連(Dairen)株、池田(Ikeda)株、EM-63株、紐約市公共衛生局(New York City Board of Health)株等。
上述本提取物的基本提取步驟(A)至(D)，更為詳細地，例如，可作為以下方式者實施。
關於步驟(A)
採取兔的皮膚經皮內接種牛痘病毒使其發痘之炎症皮膚組織。經採取的皮膚組織以酚等溶液等洗淨、進行消毒。破碎該炎症皮膚組織，加入其1至5倍量的提取溶液。此處，破碎意指使用切碎機等細碎成切碎狀。再者，作為提取溶劑，可使用蒸餾水、生理食鹽水、弱酸性至弱鹼性的緩衝液等，亦可適宜添加酚等殺菌、防腐劑，甘油等安定化劑，氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂等鹽類等。此時，亦可經由凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵 素或界面活性劑等的處理而破壞細胞組織使提取容易進行。所得懸浮液放置5日至12日。該期間，可適宜地攪拌或不攪拌，亦可於30℃至45℃加溫。所得之液藉由固液分離(過濾或離心分離等)除去組織片而獲得粗提取液(濾液或上清)。
關於步驟(B)
對步驟(A)所獲得之粗提取液進行除蛋白處理。除蛋白係可經由通常進行的習知法實施，可適用加熱處理、蛋白質變性劑(例如，酸、鹼、尿素、胍、丙酮等有機溶劑等)的處理、等電點沉澱、鹽析等方法。其次，除去不溶物的通常方法，例如，經由使用濾紙(纖維素、硝基纖維素等)、玻璃纖維、矽藻土、尺寸過濾板等之過濾，超過濾、離心分離等除去析出的不溶蛋白質而獲得濾液或上清。
關於步驟(C)
將步驟(B)所獲得的濾液或上清調整為酸性，較佳為pH3.5至5.5，進行對吸附劑的吸附操作。作為可使用的吸附劑，可列舉活性碳、高嶺土等，於提取液中添加吸附劑並加以攪拌，使提取液通過吸附劑填充管柱，可使有效成分吸附於該吸附劑。於提取液中添加吸附劑的情況，藉由過濾或離心分離等除去溶液，可獲得經吸附活性成分的吸附劑。
關於步驟(D)
欲自步驟(C)所獲得之吸附劑使活性成分溶出(脫離)，係於該吸附劑中加入溶出溶劑，調整為鹼性，較佳為pH9至12，於室溫或適宜加熱或攪拌使溶出，以過濾或離心分離等通常的方法除去吸附劑。作為所使用的溶出溶劑，可使用鹼性的溶劑，例如經調整為鹼性pH的水、甲醇、乙醇、異丙 醇等或該等的適當混合溶液，較佳可使用經調整為pH9至12的水。溶出溶劑的量可適宜設定。依此方式所獲得之溶出液，為了作為原藥使用，進行調整為中性附近的適宜pH等，可獲得最終的牛痘病毒接種兔炎症皮膚提取物(本提取物)。
由於本提取物於完成時點為液體，亦可藉由適宜濃縮、稀釋做成所期望的濃度者。自本提取物製造製劑的情況，較佳為施行加熱滅菌處理。為了作成注射劑，例如可加入氯化鈉等而調整為與生理食鹽液等滲之溶液。再者，雖亦可能以液體或凝膠等狀態經口投予，惟本提取物藉由進行適切的濃縮乾固等操作，亦可製造錠劑等經口用固形製劑。自本提取物製造此種經口用固形製劑的具體方法，記載於日本專利第3818657號及第4883798號說明書。依此方式所獲得之注射劑及經口用製劑等為本製劑之例。
作為對患者的投予方法，並無特別限定，可根據治療目的適宜選擇。例如，經口投予以外可列舉皮下、肌肉內、靜脈內投予、經皮投予等，投與量可根據牛痘病毒接種炎症組織提取物的種類而適宜設定。於市售製劑確定的投予量，基本上作為處方用醫藥品雖顯示內服為1日投予16NU，注射劑則1日投予3.6至7.2NU，但根據疾病種類、傷重程度、患者的個人差異、投與方法、投與期間等可能適宜增減(NU：NEUROTROPIN單位。NEUROTROPIN單位規定為，使用疼痛閾值比正常動物更低的慢性應力動物之SART應力小鼠，依據Randall-Selitto更新方法進行試驗，具有的鎮痛效力的ED50值。1NU係ED50值為100mg/kg時顯示NEUROTROPIN製劑的鎮痛活性含有成分1mg的活性)。
以下，雖揭示本提取物的製造方法之例，以及本提取物的新穎藥理作用、L-PGDS產生促進作用相關的藥理試驗結果，但本發明不以該等實施例的記載而有任何限制者。
[實施例]
實施例1 本提取物的製造
於健康的成熟家兔的皮膚進行皮內接種牛痘病毒，切取並採取已發痘的皮膚。所採取的皮膚以酚溶液進行洗淨、消毒後，除去多餘的酚溶液，加以破碎，加入酚溶液並混合，放置3至7日後，再攪拌3至4日同時加溫至35至40℃。之後，進行固液分離並將所得提取液以鹽酸調整為pH4.5至5.2，於90至100℃加熱處理30分鐘後，過濾除蛋白。再將濾液以氫氧化鈉調整為pH9.0至9.5，於90至100℃加熱處理15分鐘後，進行固液分離。
所獲得的除蛋白液以鹽酸調整為pH4.0至4.3，加入除蛋白液質量的2%量的活性碳，攪拌2小時後，進行固液分離。於所採取的活性碳中加入水，以氫氧化鈉作成pH9.5至10，於60℃攪拌90至100分鐘後，離心分離獲得上清。於經離心分離而沉澱的活性碳中再次加入水後，以氫氧化鈉作成pH10.5至11，於60℃攪拌90至100分鐘後，離心分離獲得上清。合併二上清，以鹽酸中和，獲得本提取物。
實施例2 藥理試驗
其次，顯示使用上述實施例所獲得的本提取物作為被驗物質之L-PGDS相關藥理試驗的方法及結果。又，下述的藥理試驗中，對C.B-17小 鼠導入腦梗塞，以及自該腦梗塞病灶的iSC的單離培養，係依據Nakagomi,T.et al.Eur.J.Neurosci.,29,1842-1852,2009記載的方法進行。
試驗例1：被驗物質處理iSC中綜合的基因表現解析
對C.B-17小鼠(3隻)施加因大腦動脈閉塞所致之缺血負荷，於第3日經由梗塞病灶單離3株iSC。對於各別的培養iSC(於經添加2%胎牛血清(FBS)、20ng/mL纖維母細胞增殖因子(FBS)、20ng/mL上皮成長因子(EGF)及1% N2補充劑的Dulbecco modified Eagle培養基F12(2% FBS DMEM/F12 F/E/N)，5×104細胞/3cm
Figure 107147748-A0202-12-0019-30
培養皿)添加被驗物質(50、1000mNU/mL)或生理食鹽液(對照)，於培養第4日經由RNeasy[註冊商標，以下相同]Mini Kit(QIAGEN公司)回收全RNA(全部9培養)。綜合的基因表現解析中，使用小鼠用的基因晶片SurePrint G3 Mouse GE微陣列8×60K(24,321種類的RNA及4,576種類的非編碼RNA，GE公司)，揀選由於添加被驗物質而3株以二濃度同方向的降低1/2以下至2倍以上的表現變化的基因。結果表示相對於對照，所揀選的各基因的表現量(3株的平均值±標準誤差)。結果的一例示於表1。
Figure 107147748-A0202-12-0019-1
上述解析的結果示於表1，揀選顯示表現減少的COCH基因、以及顯示表現上升的GBP6基因和PTGDS基因共計3基因。該等之中，編碼L-PGDS的PTGDS基因的表現量顯示對於被驗物質為強的用量依賴性。
試驗例2-1：對於L-PGDS基因表現的評價(實時RT-PCR法)
與試驗例1同樣方式，於培養iSC(不含FBS的DMEM/F12 F/-/-，5×104細胞/3cm
Figure 107147748-A0202-12-0020-31
培養皿)添加被驗物質(50，500mNU/mL)或生理食鹽液(對照)(n=1)，培養7日後，經由Isogen II[註冊商標]根據製造商(Japan Gene公司)的操作手冊回收RNA。以260nm及280nm的吸光度為指標檢定RNA純度後，於隨機引子存在下經由SuperScript[註冊商標，以下相同]IV RTase(Invitrogen公司)進行反轉錄反應，獲得對於全RNA之單股cDNA。關於所獲得之cDNA，使用PTGDS特異性引子經由定量的PCR法(Prism[註冊商標]7900HT、Applied Biosystems公司)，以管家基因(house keeping gene)β-Actin作為標準，進行轉錄產物的定量(閾值循環比較法)。又，所使用之PTGDS及β-Actin用引子的序列，如以下所示[PTGDS：5’-gactctgaaggacgagctgaag-3’(序列編號1)、5’-tcttgaatgcacttatccggttgg-3’(序列編號2)、β-Actin：5’-tacagcttcaccaccacagc-3’(序列編號3)、5’-aaggaaggctggaaaagagc-3’(序列編號4)]。結果係以對照作為1時，相對於β-Actin之PTGDS的表現量比表示。結果的一例示於表2及第1圖。
Figure 107147748-A0202-12-0021-2
如由表2及第1圖明確可知，與試驗例1所示的結果同樣地，確認被驗物質係於iSC中用量依賴性地促進L-PGDS基因(PTGDS)的表現。
試驗例2-2：對於L-PGDS基因表現的評價(古典的RT-PCR法)
於0(對照；生理食鹽液)、1、5、50、100mNU/mL的各用量的被驗物質存在下，於含有FGF的培養基(DMEM/F12 F/-/-)或不含有FGF的培養基(DMEM/F12 -/-/-)，培養iSC 4日。對於經由RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司)所回收的全RNA，使用SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum(Invitrogen公司)藉由古典的RT-PCR法半定量L-PGDS基因(PTGDS)的表現量(35循環)。PCR產物經由2%瓊脂膠電泳分離，PTGDS及GAPDH的條帶以溴化乙啶(ethidium bromide)染色而可目視地檢出。又，所使用的PTGDS及GAPDH用引子的序列，係如以下所示[PTGDS：5’-cctccaactcaagctggttc-3’(序列編號5)、5’-atagttggcctccaccactg-3’(序列編號6)、GAPDH：5’-atcactgccacccagaagac- 3’(序列編號7)、5’-cacattgggggtaggaacac-3’(序列編號8)]。結果的一例示於第2圖。
關於iSC中之L-PGDS基因(PTGDS)表現促進作用，以更精細的被驗物質用量進行研究，如第2圖所示，與培養基是否含有FGF無關，被驗物質係用量依賴性地使L-PGDS基因的表現量增加。
試驗例3-1：對於L-PGDS蛋白質表現的評價(西方墨漬法)
iSC於血清不存在下添加被驗物質(0、1、5、50、100mNU/mL)並培養4日(DMEM/F12 F/-/-，5×104細胞/3cm
Figure 107147748-A0202-12-0022-33
培養皿)後回收，以磷酸緩衝液洗淨後，經由RIPA緩衝液(4℃，50mM Tris鹽酸緩衝液(pH 7.6)，150mM氯化鈉、1% Nonidet[註冊商標]P-40(NP-40)、0.5%脫氧膽酸鈉及0.1%十二烷基硫酸鈉)溶解，作成均質物。總蛋白質量以成為均一的方式調整後，均質物以SDS-PAGE(BIO-RAD Any kD(商標))分離，轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Immun-Blot PVDF membrane，BIO-RAD公司)，以Bloking One(nacalai tesque公司)封阻後，使用特異性抗體經由西方墨漬法檢出L-PGDS(anti-Prostaglandin D Synthase(Lipocalin)antibody[EP12357]，Abcam公司，1：2000)及β-Actin(Monoclonal anti-β-Actin[A1978]，Sigma公司，1：100000)。檢出係使用高感度化學發光法(Chemi-Lumi One L，nacalai tesque公司)。結果的一例示於第3圖。
如由第3圖明確可知，確認被驗物質係促進iSC細胞內的L-PGDS蛋白質表現。
試驗例3-2：對於L-PGDS蛋白質表現的評價(點墨漬法)
以被驗物質(0、1、10、50、100mNU/mL)經培養4日(DMEM/F12 F/-/-，5×104細胞/3cm
Figure 107147748-A0202-12-0023-34
培養皿)的iSC的培養上清500μL於PVDF膜(Immun-Blot PVDF membrane，BIO-RAD公司)打點，以Bloking One(nacalai tesque公司)封阻後，使用抗L-PGDS抗體(anti-Prostaglandin D Synthase(Lipocalin)antibody[EP12357]，Abcam公司，1：2000)經由點墨漬法，檢出L-PGDS。結果的一例示於第4圖。
L-PGDS由於其N末端具有典型的分泌信號序列及信號肽辨識序列，咸信係分泌至細胞外。因此，測定經添加被驗物質的iSC的培養上清中的L-PGDS蛋白質，如第4圖明確可知，確認培養上清中(細胞外)的L-PGDS蛋白質量亦依賴於被驗物質的添加用量而增加。
試驗例3-3：對於L-PGDS蛋白質的表現的評價(ELISA法)
回收經被驗物質(0[對照]、1、10、50、100、1000mNU/mL)處理4日的iSC的培養(DMEM/F12 F/-/-，5×104細胞/3cm
Figure 107147748-A0202-12-0023-35
培養皿)的上清。離心分離(1500rpm、10分、4℃)後，培養上清中的L-PGDS量係使用特異的ELISA法(人類L-PGDS用ELISA套組(Prostaglandin D Synthase 21kDa(Brain)，型號：SEA724Hu，Cloud-Clone Corp.)，依據製造者的操作手冊測定。結果的一例示於表3及第5圖。
Figure 107147748-A0202-12-0024-3
由表3及第5圖明確可知，與試驗例3-2同樣地，經被驗物質處理的iSC的培養上清(細胞外)中，確認L-PGDS蛋白質量增加。由試驗例3的結果，確認被驗物質於iSC中，不僅是基因層級，於蛋白質層級亦促進L-PGDS的產生，更且，使產生的L-PGDS分泌。
試驗例4：對於L-PGDS的酵素活性的評價(液體層析(HPLC)質量分析法)
L-PGDS係以PGH2作為基質而生合成PGD2的酵素(EC 5.3.99.2)。於iSC中，由於被驗物質而產生促進的L-PGDS，係以確認經由此酵素活性更進一步產生PGD2為目的，於iSC的A：細胞內及B：細胞外，綜合性地分析PGD2及其代謝產物，以及與PGD2同樣以PGH2作為基質所產生的PGE2等前列腺素類。
A：iSC細胞內酵素活性的評價
自添加被驗物質(0、10、50mNU/mL)並經培養3日(不含FBS的DMEM/F12 F/-/-，5×104細胞/3cm
Figure 107147748-A0305-02-0027-6
培養皿)的iSC，經由RIPA緩衝液處理(4℃，20min)調製細胞提取液。經由HPLC質量分析法，各別測定細胞內提取液中的前列腺素類(PGD2、PGJ2、15-去氧-△12,14-PGJ2、13,14-二氫-15-酮基-PGD2及PGE2)的濃度。HPLC分離係使用AQUITY UPLC HSS T3管柱(Waters公司)，作為檢出器及質量分析儀器係各別使用API4000 LC/MS/MS系統及Triple Quadrupole(任一者皆AB Sciex公司)。結果的一例示於表4及第6圖。
Figure 107147748-A0305-02-0027-1
如表4及第6圖所示，PGD2及其非酵素性代謝產物之PGJ2的細胞內層級係經由被驗物質添加而用量依賴性的增加。進一步地，以50mNU/mL的被驗物質添加中，亦確認PGJ2的非酵素性代謝產物之15-去氧-△12,14-PGJ2的產生。又，15-去氧-△12,14-PGJ2的非酵素性代謝產物之13,14-二氫-15-酮基-PGD2係檢出界限以下。另一方面，關於自與PGD2 共通的基質所產生的PGE2，未觀察到依賴於被驗物質添加的用量而產生回應。
B：iSC細胞外酵素活性的評價
使iSC添加被驗物質(0、50、100、1000mNU/mL)經培養3日(不含FBS的DMEM/F12 F/-/-，5×104細胞/3cm
Figure 107147748-A0202-12-0026-37
培養皿)的培養上清，與為L-PGDS的基質之PGH2及穀胱甘肽(GSH)作用(反應條件：100mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM GSH，10mM PGH2，37℃，5min)。與上述A同樣地，經由HPLC質量分析法，各別測定反應液中的前列腺素類(PGD2、PGJ2、15-去氧-△12,14-PGJ2、13,14-二氫-15-酮基-PGD2及PGE2)的濃度。結果的一例示於表5及第7圖。
Figure 107147748-A0202-12-0026-5
如表5及第7圖所示，由於被驗物質於100mNU/mL以上濃度的反應液中的PGD2及其非酵素性代謝產物PGJ2、15-去氧-△12,14- PGJ2的濃度上升，確認iSC培養上清中存在L-PGDS活性。再者，關於15-去氧-△12,14-PGJ2的非酵素性代謝產物之13,14-二氫-15-酮基-PGD2，經由至100mNU/mL為止的濃度範圍的被驗物質添加，觀察到依賴於用量的產生，但於1000mNU/mL中為低於檢出界限。
已知L-PGDS為分泌型酵素，由上述上述A及B的結果，確認Isc係將具有酵素活性的L-PGDS釋出至細胞外，經由添加被驗物質，促進其產生及釋出。
試驗例5-1：小鼠腦內的L-PGDS產生細胞的檢討(免疫組織化學染色法)
製作經由中大腦動脈閉塞而施加了缺血負荷的C.B-17小鼠(缺血3日後)的腦切片，使用對於L-PGDS(B區，綠；抗-前列腺素D合成酵素(lipocalin)抗體[EP12357]，Abcam公司，1：1000)、外被細胞標記α-SMA(C區，紅；anti-actin，smooth muscle，clone ASM-1，Millipore公司，1：1000)及血管內皮細胞標記CD31(D區，紅；抗-小鼠CD31(PECAM-1)單株抗體，550274，BD Pharmingen公司，1：1000)之特異性抗體，經由共焦雷射顯微鏡進行免疫組織化學的研究。經由多重染色法，以經各自不同的螢光色素標示的特異性抗體檢出L-PGDS(B區)及外被細胞標記(C區)或L-PGDS(B區)及血管內皮細胞標記(D區)，將影像重疊，比較L-PGDS及外被細胞標記或L-PGDS及血管內皮細胞標記的分布(A1區，A2區)。結果的一例示於第8圖。
第8圖上段中，B區的綠色螢光表示L-PGDS的分布，C區的紅色螢光表示外被細胞標記的分布，重疊二者的A1區中，L-PGDS(綠 色螢光)與外被細胞標記(紅色螢光)的分布為部分性一致(200倍)。再者，第8圖下段中，B區的綠色螢光表示L-PGDS的分布，D區的紅色螢光表示血管內皮細胞標記的分布，重疊二者的A2區中，L-PGDS(綠色螢光)雖分布於血管內皮細胞標記(紅色螢光)的附近，但無法觀察到表示共分布(200倍)。
L-PGDS係主要分布於中樞神經系統的蛋白質，存在於蜘蛛網膜或軟膜及側腦室的脈絡叢等，咸信分泌於腦脊髓液中(Urade Y.et al.,J Lipid Mediat.Cell Signal.14,71-82,1996)，但關於腦內產生細胞未充分地解明。本發明者們藉由免疫組織化學性手法，進行關於L-PGDS的腦內分布研究，發現於C.B-17小鼠的正常腦中之表現係微弱的，上述試驗例5-1中，對本小鼠導入中大腦動脈的永久結紮，於腦梗塞病灶確認顯著的L-PGDS表現(第8圖的B區)。再者雖確認L-PGDS的分布係於血管內皮細胞的標記之CD31的周圍，但二者分布並不重疊(第8圖A2區)。另一方面，了解L-PGDS係顯示與外被細胞標記之α-SMA部分共分布(第8圖A1區)。由以上的結果，認為於腦梗塞中表現誘導的L-PGDS係源自外被細胞(或iSC)者。此事項，亦藉由後述試驗例5-2的免疫電子顯微鏡法，經由確認L-PGDS陽性產物係存在相接於血管內皮細胞與基底膜的外被細胞的細胞質內作為電子密度高的構造物而予以證實(第9圖A區及B區)。由該等結果，想像作為缺血回應中的外被細胞或iSC的生理學角色，包含L-PGDS的表現誘導。
試驗例5-2：小鼠腦內中的L-PGDS產生細胞的研究(免疫電子顯微鏡法)
製作經由中大腦動脈閉塞而施加了缺血負荷的C.B-17小鼠(缺血3日後)的腦切片，使用對於L-PGDS(抗-前列腺素D合成酶(lipocalin)抗體[EP12357]，Abcam公司，1：1000)之特異性抗體，經由免疫電子顯微鏡法觀察L-PGDS的表現部位。具體而言，以振動切片機(vibratome)製作2μm厚的腦切片，使用卵白素-生物素辣根過氧化物酶(HRP)複合物套組(Vector Laboratories)及3,3’-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)反應後，進行鋨處理，EPON包埋後，製作超薄切片進行電顯觀察。結果的一例示於第9圖。
第9圖的A區及B區之任一者中，皆確認對於L-PGDS之免疫電子顯微鏡法中，存在相接於血管內皮細胞及基底膜的血管周皮細胞(外被細胞)的細胞質內的電子密度高的區域。
試驗例6：人腦內的L-PGDS產生細胞的研究(免疫組織化學染色法)
依據Tatebayashi K.et al.,Stem Cells and Develop.26,787-797,2017記載的方法，自腦梗塞病灶(壞死組織)提取之培養iSC中，使用對於L-PGDS(B區，綠；抗-前列腺素D合成酶(lipocalin)抗體[EP12357]，Abcam公司，1：1000)及神經幹細胞標記nestin(C區，紅；抗-nestin，clone 10C2，Millipore公司，1：1000)之特異性抗體進行免疫組織化學的研究。細胞係與Alexa Fluor[註冊商標，以下相同]488-conjugated抗體或Alexa Fluor 555-conjugated抗體(1：500；Molecular Probes，Eugene)反應後經由4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；1：1000；Kirkegaard & Perry Laboratories公司)進行核染色。以螢光顯微鏡(BX60；Olympus，Japan)進行螢光觀察， 重疊L-PGDS(B區)與nestin(C區)的影像，比較L-PGDS與nestin的分布(A區)。結果的一例示於第10圖。
第10圖中，B區的綠色螢光表示L-PGDS的分布，C區的紅色螢光表示nesitin的分布，二者重疊的A區中，L-PGDS(綠色螢光)與nestin(紅色螢光)分布一致(200倍)。亦即，確認L-PGDS幾乎係表現於表現nestin的所有iSC。由以上認為，不僅是小鼠腦，於人腦中L-PGDS亦產生於iSC或外被細胞。
試驗例7：對於阿茲海默症型認知症模式動物的腦內類澱粉蛋白β沈積與L-PGDS表現的評價
(1)關於認知能力的行動學解析及樣品調製
APPswe/PS1dE9(APP/PS1)小鼠(雌性3月齡)以各群體重成為均等的方式分為被驗物質投予群及對照群(各群10至11隻)，歷時約3個月期間每週2次尾靜脈注射各被驗物質(100NU/kg體重)或生理食鹽液。最終投予後，進行關於認知能力的行動學的解析(Y字迷路試驗，新奇物體認識試驗及莫氏水迷津試驗)。各試驗中，各自於A：Y字迷路試驗中測定交替行動率(%)、B：新奇物體認識試驗中測定對於新奇物體的擷取頻率(%)、及C：莫氏水迷津試驗中測定至學習期間結束時的4日(第6至9日)的發現平台所需的平均時間(秒)，算出每個體的整合分數(A×B÷C)。各群每2個體的測定結果示於表6。
Figure 107147748-A0202-12-0031-6
由表6清楚可知，觀察被驗物質投予群的認知能力的改善作用，該作用於群間為統計學上顯著的。
關於認知能力的行動學解析後(最終投予24小時後)，於被驗物質投予群及對照群，經由麻醉斷頭採取腦，左半球以液態氮浴急速凍結。再者，剩餘的右半球經由(A)包含戊二醛的固定液(0.05%戊二醛、4%聚甲醛、0.1M磷酸緩衝液)或(B)PLP固定液(0.01M偏過碘酸鈉、0.075M離胺酸、2%聚甲醛)固定(4℃)。自固定組織標本經由冷凍切片機(Leica CM1850)製作包含大腦皮質的冠狀面切片(厚度20μm)。
(2)對於大腦皮質中類澱粉蛋白β沈積的評價(免疫組織化學染色法)
關於上述(1)所製作的被驗物質投予群及對照群的冠狀面切片，經由抗類澱粉蛋白β抗體(抗-β-類澱粉蛋白，1-16，[SIG-39300]，BioLegend公司，1：1000)進行免疫組織化學的染色。類澱粉蛋白β係與Alexa Fluor 488-conjugated抗體(1：500；Molecular Probes，Eugene)反應後經由4’,6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；1：1000；Kirkegaard & Perry Laboratories)進行核染色，以螢光顯微鏡(BX60；Olympus,Japan)進行螢光觀察。結果的一例示於第11圖。
如第11圖所示，於經由被驗物質投予而確認認知能力改善的個體中，與對照群相比，腦類澱粉蛋白斑的數目及表面積降低。
(3)對於大腦皮質中的L-PGDS表現的評價(免疫組織化學染色法)
關於上述(1)所製作的被驗物質投予群及對照群的冠狀面切片，經由抗L-PGDS抗體(抗-前列腺素D合成酶(lipocalin)抗體[EP12357]，Abcam公司，1：1000)進行免疫組織化學的染色。L-PGDS係使用卵白素-生物素辣根過氧化物酶(HRP)複合物套組(Vector Laboratories公司)與3,3’-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)反應而檢出。結果的一例示於第12圖。
如第12圖所示，相對於被驗物質投予群的腦中確認血管膣附近的L-PGDS的特異染色(B區的箭頭部分)，對照群的腦中未確認有L-PGDS的特異染色(A區)。
再者，關於上述(1)所製作的被驗物質投予群的冠狀面切片，使用對於L-PGDS(抗-前列腺素D合成酶(lipocalin)抗體[EP12357]，Abcam公司，1：1000)及血管內皮細胞標記CD31(抗-小鼠CD31(PECAM-1)單株抗體，550274，BD Pharmingen公司，1：1000)之特異性抗體進行免疫組織化學的研究。上述結合有一次抗體的切片，與Alexa Fluor 488-conjugated抗體或Alexa Fluor 555-conjugated抗體(1：500；Molecular Probes，Eugene)反應後，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；1：000； Kirkegaard & Perry Laboratories公司)進行核染色，以共焦雷射顯微鏡(LSM780；Carl Zeiss，Jena,Germany)進行螢光觀察。經由多重染色法，重疊L-PGDS(B區)與CD31(C區)的影像，比較L-PGDS與CD31的分布(A區)。結果的一例示於第13圖。
如第13圖所示，被驗物質投予群的腦中，確認L-PGDS(綠色螢光)係分布於血管內皮細胞標記CD31(紅色螢光)的周圍。藉此，認為回應被驗物質的投予，係以覆蓋血管內皮細胞的方式存在的外被細胞(或iSC)中之L-PGDS的表現上升。
(4)對於腦內類澱粉蛋白β沈積與與L-PGDS表現的評價(西方墨漬法)
將上述(1)中採取後經急速凍結之左半球腦以Potter型均質機均質化所提取的蛋白質以SDS-PAGE(BIO-RAD Any kD(商標))分離，轉印至PVDF膜(Immun-Blot PVDF membrane，BIO-RAD公司)。以Bloking One(nacalai tesque公司)封阻後，使用特異性抗體經由西方墨漬法，檢出類澱粉蛋白β(抗-β-類澱粉蛋白，1-16，[SIG-39300]，BioLegend公司，1：1000)及L-PGDS(抗-前列腺素D合成酶(Lipocalin)抗體[EP12357]，Abcam公司，1：2000)。檢出係使用高感度化學發光法(Chemi-Lumi One L,nacalai tesque公司)。結果的一例示於第14圖。
如第14圖A區的※印記部分所示，關於腦內類澱粉蛋白β量，確認經由被驗物質投予而認知能力改善的被驗物質投予群的小鼠(個體編號4、29)相較於對照群的小鼠(個體編號14、30)確認減少。該結果係與試驗例7(2)的免疫組織化學染色法(第11圖)中，相對於對照群之被驗物質 投予而腦內類澱粉蛋白β抗體陽性產物的數目及表面積尺寸受到抑制的結果為相關者。再者，如第14圖的B區的＊印記部分所示，由於被驗物質投予群中腦內L-PGDS量相較於對照群為增加，確認被驗物質係亢進腦內L-PGDS產生。由上述試驗例7的一連串結果，認為經由被驗物質使L-PGDS的腦內表現量增加，阻礙腦內類澱粉蛋白β的沉積，後續改善認知功能的可能性。
試驗例8：源自人的外被細胞中L-PGDS表現促進要因的研究(古典的RT-PCR法)
如上所述，由於認為經確認對於被驗物質回應的iSC係源自外被細胞，於市售的源自人的外被細胞株Human brain vascular pericytes(ScienCell公司)中，於不同的氧及/或葡萄糖濃度的條件下，研究被驗物質的L-PGDS表現能力。具體而言，於0、50、500mNU/mL的各用量的被驗物質存在下，各自地於，(1)iSC係顯示反應性的條件(4.5g/L葡萄糖及20% O2)，(2)低葡萄糖條件(90mg/L葡萄糖及20% O2)以及(3)低氧、低葡萄糖條件(90mg/L葡萄糖及1% O2)，培養iSC4日(不含FBS的DMEM培地F/-/-)。對於經由RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司)所回收的全RNA，使用SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum(Invitrogen公司)藉由古典的RT-PCR法半定量L-PGDS基因(PTGDS)的表現量(35循環)。PCR產物經由2%瓊脂膠電泳分離，PTGDS及β-Actin的條帶以溴化乙啶染色而可目測地檢出。又，PTGDS及β-Actin用引子，係使用與上述試驗例2-1所使用者為相同者。結果的一例示於第15圖。
如第15圖所示，以條件(1)培養的細胞的L-PGDS基因之轉錄雖可檢出，但未觀察到對於被驗物質的回應性。另一方面，以低氧(1%)且低葡萄糖濃度(90mg/L)的條件(3)培養的細胞中，觀察到對於被驗物質的回應性。由於認為低氧、低葡萄糖條件係模擬腦內的缺血狀態，該等病態時的外被細胞(或iSC)獲得對於外界刺激的回應性，認為是如L-PGDS的細胞保護性的蛋白質釋出者。
[產業上可利用性]
由於L-PGDS主要係於腦內表現，擔任各種疏水性低分子的結合、輸送及清除者的角色，屬於具有關於腦內環境調整、腦保護功能及睡眠調節功能等各種功能的蛋白質，本發明L-PGDS產生促進劑，有用於作為腦梗塞等腦血管障礙、阿茲海默症等認知症、失眠症等L-PGDS相關疾病的預防、治療或復發預防藥。特別地，本提取物及含有本提取物的製劑為優異的L-PGDS產生促進劑而副作用等問題點少且安全性高的藥劑，為有用性高者。再者，以外被細胞或由外被細胞經脫分化而得之iSC中的L-PGDS產生促進作用為指標，於L-PGDS相關疾病的預防、治療或復發預防為有用的物質，特別是具有腦保護作用或睡眠作用的物質的本發明篩選方法，有助於新治療藥的開發而為非常有用的方法。
<110> 學校法人兵庫醫科大學(Hyogo College of Medicine) 日本臟器製藥股份有限公司(Nippon Zoki Pharmaceutical Co.,Ltd.)
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<151> 2017-12-28
<160> 8
<210> 1
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Claims (20)

  1. 一種牛痘病毒接種兔炎症皮膚組織提取物之用途，係製造脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中，脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素係於外被細胞或由外被細胞經脫分化而得之缺血誘導性多功能幹細胞中所產生者。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述的用途，其中，脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑係腦保護藥。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的用途，其中，腦保護藥的作用係由對於膠狀淋巴系統的亢進作用所致者。
  5. 如申請專利範圍第3項所述的用途，其中，腦保護藥係腦梗塞的預防、治療或復發預防藥。
  6. 如申請專利範圍第3項所述的用途，其中，腦保護藥係認知症的預防、治療藥。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的用途，其中，認知症係阿茲海默症型認知症。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的用途，其中，認知症的預防、治療藥係具有類澱粉蛋白β沈積的阻礙作用。
  9. 如申請專利範圍第1或2項所述的用途，其中，脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑係安眠藥。
  10. 如申請專利範圍第1或2項所述的用途，其中，脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑係注射劑。
  11. 如申請專利範圍第1或2項所述的用途，其中，脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素產生促進劑係經口劑。
  12. 一種具有腦保護作用或睡眠作用的物質的篩選方法，係以藉由投予被驗物質所致之脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的表現促進作用為指標。
  13. 如申請專利範圍第12項所述的篩選方法，其中，以於外被細胞或由外被細胞經脫分化而得之缺血誘導性多功能幹細胞中的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的表現促進作用為指標。
  14. 如申請專利範圍第12或13項所述的篩選方法，其中，具有腦保護作用的物質係腦梗塞的預防、治療或復發預防藥或認知症的預防、治療藥。
  15. 一種牛痘病毒接種兔炎症皮膚組織提取物或含有該牛痘病毒接種炎症組織提取物的製劑的判定或評價方法，係以脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的表現促進作用為指標。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的判定或評價方法，其中，係以於外被細胞或由外被細胞經脫分化而得之缺血誘導性多功能幹細胞中的脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的表現促進作用為指標。
  17. 一種牛痘病毒接種兔炎症皮膚組織提取物或含有該牛痘病毒接種兔炎症皮膚組織提取物的製劑的藥效的擔保方法，係藉由進行申請專利範圍第15或16項所述的判定或評價而擔保其藥效，其中，該藥效是脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的表現促進作用。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的擔保方法，其中，該藥效是腦保護作用或睡眠作用。
  19. 一種藥效經擔保的牛痘病毒接種兔炎症皮膚組織提取物或含有該牛痘病毒兔接種皮膚炎症組織提取物的製劑，係藉由進行申請專利範圍第15或16項所述的判定或評價而使其藥效經擔保者，其中，該藥效是脂質運載蛋白型前列腺素D2合成酵素的表現促進作用。
  20. 如申請專利範圍第19項所述的牛痘病毒接種兔炎症皮膚組織提取物或含有該牛痘病毒接種兔炎症皮膚組織的製劑，其中，該藥效是腦保護作用或睡眠作用。
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