CN108778303A - 羊蹄甲属萃取物及其用途 - Google Patents

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简虹琪
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Abstract

在此揭示一种羊蹄甲属植物萃取物的新颖用途，所述羊蹄甲属植物萃取物能够向上调节脑啡肽酶、诱导细胞自噬作用、保护神经元免于类淀粉病变或Tau蛋白病变和/或促进轴突生长；因此，本揭示内容的羊蹄甲属植物萃取物能作为食品添加物，以预防或治疗与类淀粉蛋白相关的神经退化疾病，以期改善或缓减与类淀粉相关的神经退化疾病的症状。

Description

羊蹄甲属萃取物及其用途
【技术领域】
本揭示内容是是关于一种羊蹄甲属植物萃取物的新颖用途，特别是本揭示内容是关于羊蹄甲属植物萃取物作为用以治疗神经退化性疾病的食品添加物的用途。
【现有技术】
羊蹄甲(Bauhinia variegata Linn.(Fabaceae))是印度传统药方中常见的药物。不同的植物部位(如，花苞、花、茎、茎皮、叶、种子和根)可用来治疗气喘、黄胆(jaundice)、结核病(tuberculosis)、痲疯病(leprosy) 和皮肤病。已知羊蹄甲的茎皮具有抗肿瘤、抗溃疡和抗菌活性。近期的动物研究更指出羊蹄甲乙醇萃取物(ethanol extract ofB.variegate,BVEE)对于顺铂引发的肾脏疾病有显著的肾保护作用，且对于四氧嘧啶(alloxan)引发的高血糖活性有抗糖尿病效果。
阿兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一渐进式的神经退化性疾病，也是最常见的老年失智症。各界普遍认为阿兹海默症患者体内类淀粉蛋白(Aβ)和Tau蛋白的堆积是引发神经退化和相关致病途径的主因，而这两种现象导致阿兹海默症的发生与进展。已证实在人类偶发型阿兹海默症患者中会有截短的Tau蛋白，其能够诱发AD患者体内的Tau蛋白聚集与神经纤维缠结(neurofibrillary tangles)。越来越多证据显示，脑啡肽酶(neprilysin；NEP)是负责清除Aβ的主要内切肽酶，在老化过程和阿兹海默症患者中可观察到脑啡肽酶的功能缺损。同样地，在脑啡肽酶剔除小鼠中可观察到脑啡肽酶表现量和脑内Aβ累积量呈负相关。正因如此，在开发促进Aβ降解的阿滋海默症药物时，脑啡肽酶是公认最有潜力的药物标的。再者，细胞自噬体为清除Tau蛋白最主要的胞内液泡。此种由细胞自噬作用介导的降解系统，对于控制Aβ平衡亦扮演重要的角色。正因其具有保护神经元的功能，细胞自噬作用缺损与多种神经退化性疾病(包含AD)的发病机制有关。越来越多的证据显示，自噬体可以吞入受损的胞器和异常的蛋白质聚集物，以便在溶酶体融合后，将该多个内化的胞器与蛋白 (internalized cargo)清除。因此，可合理推知可诱导细胞自噬作用的药剂，能借由促进细胞自噬作用来清除异常蛋白聚集物(包含Aβ和Tau)，而产生神经保护功效。
本案发明人借由Tau蛋白病变斑马鱼模型、脑啡肽酶细胞分析以及自噬作用细胞分析，意外地发现羊蹄甲属植物萃取物，能够同时抑制Tau蛋白病变引起的神经毒性、增强脑啡肽酶活性和诱导自噬活性；因此，本发明证实羊蹄甲属植物萃取物能够作为健康食品食品添加物，以改善神经退化性疾病患者整体的记忆力和/或认知能力。
【发明内容】
本揭示内容是关于羊蹄甲属植物萃取物于向上调节脑啡肽酶、诱导自噬作用、保护神经元避免类淀粉病变或Tau蛋白病变发生和/ 或促进轴突生长的新颖用途，因此，本揭示内容羊蹄甲属植物萃取物可以作为食品添加物，用来预防或治疗类淀粉相关的神经退化性疾病，或用于减缓与类淀粉相关的神经退化性疾病的疾病进程及症状。
再者，本揭示内容第一方式是提供一种用以治疗患有或疑似患有类淀粉相关神经退化性疾病个体的方法。所述方法包含以下步骤，经口施用一治疗有效量的羊蹄甲属植物萃取物至所述个体，以改善或缓减与类淀粉相关的神经退化疾病的症状。
依据本揭示内容的实施方式，所述羊蹄甲属植物(Bauhinia spp.)是羊蹄甲(Bauhinia variegate)或艳紫荆(Bauhinia x blakeana)。
依据本揭示内容的实施方式，所述羊蹄甲属植物萃取物可以是水萃取物或乙醇萃取物。
依据本揭示内容某些实施方式，所述羊蹄甲属植物水萃取物是以1:5(w/v)至1:20(w/v)的比例，混合羊蹄甲属植物茎粉末和水，并且在约30-100℃下处理0.5-5小时后所制得。在较佳的实施方式中，所述羊蹄甲属植物水萃取物是以1:10(w/v)至1:20(w/v)的比例，混合羊蹄甲属植物茎粉末和水，并且在约50℃下处理2小时后所制得。
依据本揭示内容其他实施方式，所述羊蹄甲属植物的乙醇萃取物是以1:5(w/v)至1:20(w/v)的比例，混合羊蹄甲属植物茎粉末和95％乙醇(vol％)，并且在约15-35℃下处理1-10天后所制得。在较佳的实施方式中，所述羊蹄甲属植物的乙醇萃取物是以1:10(w/v)的比例，混合羊蹄甲属植物茎粉末和95％乙醇(vol％)，在约25℃下处理7天后所制得。
依据本揭示内容的实施方式，所述羊蹄甲属植物萃取物的口服剂量约为5-50毫克/公斤。在较佳的实施方式中，所述羊蹄甲属植物萃取物的口服剂量约为20毫克/公斤。
依据本揭示内容的实施方式，可利用本揭示内容羊蹄甲属植物萃取物治疗的神经退化性疾病是选自于以下成员所组成的群组：阿兹海默症、亨汀顿氏舞蹈症(Huntington’sdisease,HD)、血管型失智症(vascular dementia,VD)、颞叶型失智症(frontotemporaldementia,FTD)、语意性失智症(semantic dementia,SD)和路易氏体失智症(dementiawith Lewy bodies, DLB)、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateralsclerosis,ALS)以及帕金森氏症(Parkinson’s disease,PD)。
在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。
【图式简单说明】
为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：
图1显示在斑马鱼胚胎中，经羊蹄甲植物萃取物处理能够减少由人类Tau-GFP过量表现引起的神经元死亡。图框(A)：在单细胞期 (one-cell stage)内，将pHuC-hTau-GFP表现质体注射至斑马鱼胚胎中；接着，于受精后24、48和72小时(hours post-fertilization；hpf)，观察绿荧光蛋白(GFP)标记的神经元细胞。在24hpf胚胎中，能够在神经元细胞内观察到部分绿荧光蛋白讯号，其后，在48hpf胚胎中，绿荧光蛋白讯号分解成小点并减少。然而，仍有其他绿荧光蛋白讯号完整保留在神经元细胞中。图框(B)：计算48hpf胚胎中，呈现绿荧光蛋白讯号的神经元数量，并将结果分为二组，分别是少于2神经元(0-2个)和较多神经元(3-5个)。羊蹄甲乙醇萃取物(BVEE)处理使胚胎使其具有更多神经元(图1图框(A))；有46％的胚胎具有3-5个神经元(图1图框(B))；
图2显示羊蹄甲乙醇萃取物处理能够诱导促进斑马鱼胚胎中的轴突生长。图框(A)：在单细胞期内，先将pHuC-GFP表现质体注入至斑马鱼胚胎中；注射后8小时，再以羊蹄甲乙醇萃取物或二甲基亚砜 (DMSO)(对照组)处理经注射的胚胎。图框(B)：于处理后40小时计算出现显著轴突生长的斑马鱼数量；
图3显示羊蹄甲乙醇萃取物处理能够诱导自噬作用。图框(A)： GFP-LC3-HEK细胞在37℃下，以羊蹄甲乙醇萃取物(50微克/毫升)处理24 小时；利用自噬作用诱导剂(即，雷帕霉素)和自噬作用抑制剂(即，3-MA) 作为对照组。利用SDS-PAGE解析含等量蛋白的细胞裂解物，再以抗p62 (上排)、抗LC3(中排)和抗GAPDH(下排)抗体进行西方墨点法分析。图框(B)：过量表现海肾冷光素酶(Renilla luciferase)标记p62的稳定细胞株 p62-RL-HEK在37℃下，以羊蹄甲乙醇萃取物处理24小时；另以雷帕霉素或3-MA处理作为对照组；添加等量的腔肠素(coelenterazine)(最终浓度为5 μM)测定海肾冷光素酶讯号；以DMSO处理的细胞(对照组)所发出的冷光作为100％相对海肾冷光素酶讯号；
图4为依据本揭示内容一实施方式所示羊蹄甲乙醇萃取物对于脑啡肽酶活性的影响的折线图，结果显示羊蹄甲乙醇萃取物对于脑啡肽酶活性具有剂量依赖性；
图5显示羊蹄甲乙醇萃取物处理对于p62-RL-HEK细胞存活率的影响。于37℃下使用或不使用羊蹄甲乙醇萃取物(50或100微克/毫升) 处理24小时；另以雷帕霉素或3-MA处理作为对照；利用下列方法所述的 CellTiter 96Aqueous非放射性细胞增殖分析试剂测定活细胞，于490nm下测定吸光值，以经DMSO处理的细胞(对照组)作为100％相对活性；
第6图显示Aβ42注射的AD小鼠施用羊蹄甲乙醇萃取物能够改善认知功能。使用Morris水迷宫试验来决定逃脱延迟时间，相较于对照组小鼠的表现，经羊蹄甲乙醇萃取物处理的Aβ42注射小鼠能够记忆隐藏平台的位置。未经手术小鼠(无注射/溶剂)，n＝5；经溶剂处理的假手术小鼠(PBS注射/溶剂)，n＝5；经溶剂处理的Aβ42注射小鼠(Aβ42注射/溶剂)， n＝8；经羊蹄甲乙醇萃取物处理的Aβ42注射小鼠(Aβ42注射/BVEE)，n＝6；
图7显示羊蹄甲乙醇萃取物能够诱导Aβ42注射小鼠海马回中细胞自噬作用的活化。对C57BL/6公鼠脑内注射Aβ42，再施以载体(0.1％DMSO)或羊蹄甲乙醇萃取物(250毫克/公斤/日)长达2个月；于Morris水迷宫试验分析小鼠认知功能后，以抗p62对小鼠的脑部进行荧光组织化学分析；采用DAPI染色来观察细胞核；荧光免疫组织化学分析的代表图式显示经羊蹄甲乙醇萃取物处理的小鼠和未经处理的小鼠的海马回中的p62的量(红色)和DAPI染色(蓝色)含量；定量数据显示小鼠脑部(n＝3)连续三区块 (厚度：15μm)中p62的平均量(±SD)；
图8显示经羊蹄甲乙醇萃取物长期处理的APP/PS1基因转殖鼠能改善认知状态。3月龄的APP/PS1小鼠经口服用羊蹄甲乙醇萃取物(250 毫克/公斤体重)或食盐水，每周服用6次，持续服用至7个月。在实验动物 10月龄时，利用Morris水迷宫进行空间寻获试验(图框(A))和探索试验测试 (图框(B))，以分析经食盐水处理的APP/PS1小鼠(n＝12)、经羊蹄甲乙醇萃取物处理的APP/PS1小鼠(n＝8)和野生型同窝小鼠(n＝15)的空间和参考性记忆；数据以平均值±SEM表示；每日比较野生型组、经羊蹄甲乙醇萃取物处理的APP/PS1小鼠与经食盐水处理的APP/PS1小鼠；以双向(two-way)ANOVA分析和费雪最小显著差异(Fisher’sLSD)试验计算不同处理组之间的显著性；*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001；ns代表无显著性。
第9图显示经羊蹄甲乙醇萃取物处理的APP/PS1小鼠的类淀粉斑块负荷(plaqueburden)减少。利用酶连结免疫吸附分析法(ELISA)(图框(A))和硫代黄素S染色(图框(B))评估11月龄的野生型同窝小鼠、经食盐水和经羊蹄甲乙醇萃取物处理的APP/PS1小鼠的斑块负荷。图框(A)：于牺牲后，采集大脑皮质和海马回以进行ELISA分析；利用市售ELISA套组定量不可溶人类Aβ40和Aβ42的量(羊蹄甲乙醇萃取物处理，n＝6；食盐水处理，n＝5；野生型小鼠，n＝3)。图框(B)：利用硫代黄素S观察斑块负荷；比例尺代表800μm。图框(C)：利用ImageJ定量硫代黄素S染色区块的斑块数量、总斑块区域和斑块覆盖百分比；数据以平均值±SEM表示；相较于经食盐水处理的APP/PS1小鼠的显著和非显著结果(ns)如图所示；利用单向(one-way)ANOVA分析和费雪最小显著差异试验计算(从2只经羊蹄甲乙醇萃取物处理的小鼠中所取得的切片，n＝12；从经食盐水处理的7只小鼠中所取得的切片，n＝40；从5只野生型小鼠中取得的切片，n＝10)；*P<0.05、 **P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001；
第10图显示长期施用羊蹄甲乙醇萃取物的肝脏和肾脏毒性试验。采集经羊蹄甲乙醇萃取物处理的APP/PS1小鼠血液样本，分析AST、 ALT、ALP、BUN、CRE的量。所有结果以平均值±SEM表示(羊蹄甲乙醇萃取物处理，n＝3；食盐水处理，n＝4)；*P<0.05，相较于食盐水处理的 APP/PS1小鼠，以ANOVA和费雪最小显著差异试验计算；ns代表非显著性；从10周龄的ICR小鼠(n＝10)取得的AST、ALT、ALP、BUN、CRE的数值范围以虚线表示；以及
第11图为脑啡肽酶活性分析，此图为依据本揭示内容一实施方式所示的柱形图，分别以95％乙醇、40％乙醇和水萃取的艳紫荆萃取物对于脑啡肽酶活性的影响；
第12图显示利用不同溶剂萃取而得的羊蹄甲(BV)萃取物诱导细胞自噬作用的能力。p62-RL-HEK细胞于37℃下使用或不使用羊蹄甲萃取物处理24小时；另外以雷帕霉素(RAP)或3-MA处理作为对照；添加腔肠素(最终浓度为5M)测定海肾冷光素酶(Luc)活性；经DMSO处理的细胞(对照组)作为100％相对海肾冷光素酶讯号；从不同溶剂中萃取的萃取物经冷冻干燥，再以DMSO回溶进行后续分析；大写字母表示萃取羊蹄甲所使用的溶剂。；A为己烷；B为乙醚；C为乙酸乙酯；D为热水；E为乙醇。
【实施方式】
为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作该多个具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
1.定义
为方便起见，在此将本揭示内容中所使用的特定词汇揭示于此。除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。
在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。具体而言，本说明书和申请专利范围所示的单数名词“一(a,an)”包含复数型，除非另有定义。再者，在本说明书和申请专利范围所示的“至少一(at least one) 和一或多个(one or more)”具有相同的涵义且包含一、二、三或更多。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0。 5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将该多个数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此所示的数值范围为一端点至另一端点，或是二端点之间。在此所揭示的数值范围皆涵盖端点，除非另有指明。
在此处“治疗”(treatment)做名词用包括预防性质(如预防性(prophylactic))、治疗性质或缓解性质(palliative)的处置；而“治疗”(treating)亦包含提供预防性、治疗性或缓解性的处置。具体而言，在此所述“治疗”一词是指应用(application)或施用(administration)本发明的分子结构或包含该分子结构的药学组合物至一患有医学病症、与医学病症相关症状、继发于医学病症的疾病或征状或易于患有该医学病症的个体，以期能部分地或完全地缓和、改善、减轻一特定异常和/或病症的一或多种症状或特征，或延缓其发生、阻碍其进展、减轻其严重性和/或减低发生率。亦可对并未表出现疾病、异常和/或病症的征兆的个体和/或呈现早期征兆的个体进行治疗，以期降低发展出与该疾病、异常和/或病症相关的病理变化的风险。
所述“治疗有效量(effective amount)”是指本发明羊蹄甲属植物萃取物的用量足以产生所欲的疗效反应。一药剂的有效量不必然能够治愈一疾病或症状，但能延缓、阻碍或预防疾病或症状的发生，或延缓疾病或症状相关的病征。所述治疗有效量可分成一、二或更多剂量于单一施用剂量型式，且可于一指定期间内施用一次、二次或更多次。具体的治疗有效量或足够用量取决于多种因素，如欲治疗的特定状况、患者的生理条件(如，患者体重、年龄或性别)、接受治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、目前疗法(如果有的话)的本质以及所用的具体配方。举例来说，可将治疗有效量表示成药物的总重量，即以克、毫克、微克等单位表示的羊蹄甲属植物萃取物；或表示成药物重量与体重比例(其单位为毫克/公斤(毫克/公斤))。具体而言，所述羊蹄甲属植物萃取物的治疗有效量是指羊蹄甲属植物萃取物的量足以正调控脑啡肽酶(neprilysin)、诱导细胞自噬作用、保护神经元避免类淀粉病变或Tau蛋白病变发生和/或促进轴突生长，以减轻或减缓与个体神经退化性疾病相关的症状。本领域具有通常知识者，基于本揭示内容实施例中动物模式所测定的剂量，能够计算医药品(如，本揭示内容的化合物)的人类等效剂量(human equivalent dose,HED)。举例而言，可依据美国食品药物管理局(US Food and Drug Administration(FDA))出版的“Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials forTherapeutics in Adult Healthy Volunteers”估算人类个体的最高安全剂量。
所述“施用(administering,administration)”一词是指将羊蹄甲属植物萃取物或含有该萃取物的药学组合物施用至需要治疗的个体。
在本说明书中所述“个体(subject)”或“患者(patient)”一词可交互使用，且在此是指可接受本发明羊蹄甲属植物萃取物、药学组合物和/或方法的动物(包含，人类)。。除非另有指明，“个体”或“患者”一般包含雄性与雌性。再者，所述“个体”或“患者”包含可从本揭示内容的治疗方法得到良好治疗效果的哺乳动物。举例而言，所述“个体”或“病患”包含，但不限于，人类、大鼠、小鼠、天竹鼠、猪、猴子、猪、羊、牛、马、狗、猫、鸟和禽类。在一实例中，所述患者为人类。所述“哺乳类”一词涵盖哺乳纲的所有成员，包含：人类、灵长类动物、家畜和农畜。举例而言，所述家畜或农畜可以是兔子、猪、羊和牛。所述哺乳类亦可涵盖动物园或竞赛用动物、宠物，以及啮齿类(如，小鼠和大鼠)。所述“非人类哺乳类”一词是指除了人类以外的哺乳纲成员。
2.制备羊蹄甲属植物萃取物
本发明是基于发现依据本揭示内容实施例所制备的羊蹄甲属植物萃取物，能够正调控脑啡肽酶、诱导自噬作用，保护神经元避免类淀粉病变或Tau蛋白病变发生，和/或促进轴突生长，且对于代谢酶和/或肾功能无毒性作用，因此，所述羊蹄甲属植物萃取物能够作为食品添加物，以改善或缓减欲治疗个体中与神经退化性疾病相关的症状。
因此，本揭示内容第一方式是提供一种羊蹄甲属植物萃取物，其能够有效治疗患有或疑似患有神经退化性疾病个体。
适用于本揭示内容羊蹄甲属植物的实例包含，但不限于，羊蹄甲和艳紫荆。
在一实施例中，本揭示内容羊蹄甲属植物萃取物是以新鲜羊蹄甲茎或其干燥粉末制成。在其他实施例中，本揭示内容的羊蹄甲属植物萃取物是以新鲜艳紫荆茎或其干燥粉末制成。依据本揭示内容的实施方式，所述含有活性化合物(即，可调控脑啡肽酶(NEP)活性或促进轴突生长的成分)的羊蹄甲属植物萃取物，是以1:5(w/v)至1:20(w/v)的比例，混合羊蹄甲属植物茎干燥粉末和一无毒性溶剂，并且在适当的处理温度和时间下制得。
依据本揭示内容某些实施方式，本发明羊蹄甲属植物萃取物是以1:5(w/v)至1:20(w/v)的比例，混合羊蹄甲属植物茎粉末和水，例如1:5、 1:6 1:7、1:8、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、 1:19和1:20(w/v)，且在温度约30-100℃，例如30、40、50、60、70、80、 90和100℃，处理约0.5-5小时，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4 和5小时所制得。在较佳的实施方式中，所述羊蹄甲属植物萃取物是以1:8 (w/v)至1:15(w/v)的比例，混合羊蹄甲属植物茎粉末和水，例如1:8、1:10、 1:11、1:12、1:13、1:14和1:15(w/v)，且在温度约40-80℃，例如40、50、 60、70和80℃，处理约1-3小时，例如1、2和3小时所制得。在最佳的实施例中，所述羊蹄甲属植物萃取物是以1:10(w/v)的比例，混合羊蹄甲属茎粉末和水，且在温度约50℃下处理约2小时。
依据本揭示内容其他实施方式，本发明羊蹄甲属植物萃取物是以1:5(w/v)至1:20(w/v)的比例，混合羊蹄甲属植物茎粉末和95％乙醇 (vol％)，例如约1:5、1:6、1:7、1:8、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、 1:16、1:17、1:18、1:19或1:20(w/v)，并且在约15-35℃下，例如约15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34或35℃，处理1-10天所制得。在较佳的实施方式中，本发明羊蹄甲属植物萃取物是以1:8(w/v)至1:15(w/v)的比例，混合羊蹄甲属植物茎粉末和95％乙醇(vol％)，例如约1:8、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15(w/v)，并且在约20-30℃下，例如约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，处理3-8天所制得。在最佳的实施方式中，本发明羊蹄甲属植物萃取物是以1:10(w/v)的比例，混合羊蹄甲属植物茎粉末和95％乙醇(vol％)，并且在约25℃下处理7天所制得。
最终将所述羊蹄甲属植物萃取物冷冻干燥，并存放于阴凉、干燥且避光的环境备用。
3.羊蹄甲属植物萃取物的用途
依据本揭示内容实施方式，依据本揭示内容方法制备而成的羊蹄甲属植物萃取物，于体外试验中能够减少Tau蛋白病变诱导的神经元毒性(参见实施例1)、促进轴突生长(参见实施例2)、活化自噬作用(参见实施例3)以及正调控脑啡肽酶(NEP)活性(参见实施例4)；在体内试验中，所述羊蹄甲属植物萃取物能够改善记忆和认知功能(参见实施例6和7)。最重要的是，所述羊蹄甲属植物萃取物并不会造成代谢酶活性或肾功能损害 (参见实施例8)，亦不会产生任何细胞毒性(参见实施例5)。因此，本发明羊蹄甲属植物萃取物可以作为食品添加物，以治疗患有神经退化性疾病的个体，特别是类淀粉相关的神经退化性疾病，以改善个体整体的记忆和认知功能个体。
因此，本揭示内容第二方式是提供一种治疗患有或疑似患有神经退化性疾病的方法。所述方法包含以下步骤，经口施用一治疗有效量的羊蹄甲属植物萃取物至所述个体，改善或缓减与类淀粉相关的神经退化性疾病相关症状。
可利用本发明羊蹄甲属植物萃取物处理的神经退化性疾病的实例，包含，但不限于，阿兹海默症(Alzheimer’sdisease,AD)、亨汀顿氏舞蹈症(Huntington’sdisease,HD)、血管型失智症、颞叶型失智症、语意性失智症和and路易氏体失智症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和帕金森氏症(PD)。
适用于本方法的羊蹄甲属植物萃取物可以是羊蹄甲或艳紫荆的水萃取物或乙醇(即，95％乙醇)萃取物。在某些实施例中，是采用羊蹄甲95％乙醇萃取物；且在其他实施例中，是采用羊蹄甲或艳紫荆的水萃取物。
依据实施方式本揭示内容，所述羊蹄甲属植物萃取物是以单一剂量或多剂量经口施用至所述个体(即，2、3或4次剂量)，且施用量为约5-50毫克/公斤/天，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49或50毫克/公斤/天。在较佳的实施方式中，所述羊蹄甲属植物萃取物经口施用至个体的量为约10-40毫克/公斤/天，例如10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39或40毫克/公斤/天。在更佳的实施方式中，所述羊蹄甲属植物萃取物经口施用至所述个体的量为约15-35毫克/公斤/天，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35毫克/公斤/天。在最佳的实施方式中，所述羊蹄甲属植物萃取物经口施用至所述个体的量为约20毫克/公斤/ 天。
可以将本发明羊蹄甲属植物萃取物制备成口服剂型，例如粉末(powders)、片剂(tablets)、锭剂(caplets)、胶囊(capsules)、溶液(solutions) 和/或悬浮液(suspensions)；借由混合冻干的羊蹄甲属植物萃取物和药学可接受赋形剂(pharmaceutically acceptable excipients)、粘合剂(binders)、崩解剂(disintegrants)、分散剂(dispersants)、稀释剂(diluents)、润滑剂(lubricants)、调味剂(flavoring agents)、和/或着色剂(coloring agents)制备合适的口服剂型。举例而言，本发明羊蹄甲属植物萃取物的干燥颗粒能够直接压成药学上可快速融化的口服剂型，例如，片剂、锭剂，以及混合适当赋形剂的类似物。此外，可利用明胶胶囊包覆本发明羊蹄甲属植物萃取物的干燥颗粒。再可任选的实施方式中，本发明羊蹄甲属植物萃取物可以溶解或悬浮于适当的溶剂中，例如，水、缓冲溶液或酏剂，以产生经口施用的液体或悬浮液。
下文提出多个实验例来说明本发明的某些方式，以利本发明所属技术领域中具有通常知识者实作本发明，且不应将该多个实验例视为对本发明范围的限制。
实施例
材料与方法
制备羊蹄甲植物粗萃取物
于旋转振荡器(150rpm)中，将经空气干燥的100克羊蹄甲或艳紫荆茎粉末与95％乙醇以1:10(w/v)的比例混合，于室温下处理7天以进行萃取可得羊蹄甲的乙醇粗萃物(BVEE)或艳紫荆的乙醇粗萃物(BBEE)。水萃取物则是将上述植物分别与H2O(1:10；w/v)混合，于50℃下处理2小时后而制成。
羊蹄甲(BV)的其他有机溶剂萃取物的制备方法与前述以乙醇进行萃取的步骤类似，是利用有机溶剂，例如，己烷(hexane)、乙醚(ether)和乙酸乙酯(ethyl acetate,EA)来萃取羊蹄甲而得。再将所得的萃出物冷冻干燥后存放于-20℃中备用。
细胞培养
人类胚胎肾(HEK)细胞株293、衍生自该HEK细胞株293的稳定细胞株(GFP-LC3-HEKand p62-RL-HEK)，以及神经母细胞瘤细胞株 SH-SY5Y是培养于最低基础培养基(minimumessential medium)(其中添加 10％(v/v)热去活化胎牛血清、50％(v/v)F-12营养混合物和1％(v/v)含盘林西林和链霉素的抗生素混合物)。将细胞置于37℃、含5％CO2潮湿大气环境。将SH-SY5Y细胞接种于96孔板(密度为1x 105活细胞/孔)中，供后续分析用。
动物
C57BL/6公鼠是购自实验动物中心(台北，台湾)，并且将其饲养于中央研究院细胞与个体生物学研究所的实验动物设施中，其中每只小鼠饲养于独立通风笼(individuallyventilated cage,IVC))，光暗循环为12：12小时，且过程中提供饮水与标准饲料供任食。动物实验计划皆通过中央研究院动物实验管理小组(台北，台湾)核准。
Tau蛋白病变毒性分析
利用由神经元专一性HuC启动子调控的GFP-hTau融合蛋白来研究野生型人类Tau蛋白对于神经元细胞发展中其诱导细胞死亡的能力(Park 等人；2000)。将表现质体注射至斑马鱼的胚胎(单细胞期)。利用荧光显微镜在24、48和72hpf时期，观察绿荧光蛋白标志的神经元细胞。部分绿荧光蛋白讯号可见于24hpf胚胎的神经元细胞，接着于48hpf胚胎中该讯号分解成小点且减少。然而，仍有其他绿荧光蛋白讯号完整保留在神经元细胞中。在72hpf胚胎中，计算带有绿荧光蛋白讯号的神经元数量，并将结果分成两组，即，低于2个神经元(0-2)以及较多的神经元(3-5之间)。
分析轴突生长活性
测试羊蹄甲乙醇萃取物在斑马鱼胚胎中是否能够促进轴突生长。首先，将pHuC-GFP表现质体注射至斑马鱼胚胎(单细胞期)中，在 pHuC-GFP表现质体中绿荧光蛋白的表现是借由神经元专一性HuC启动子所调控。于注射8小时后，以羊蹄甲乙醇萃取物或DMSO(对照组)处理经注射的胚胎。于处理后40个小时，计算具有显著轴突生长的斑马鱼数量。
细胞存活率分析
将HEK或衍生自HEK的稳定细胞株(GFP-LC3-HEK和 p62-RL-HEK)(5x104细胞/100μL/孔)接种至96孔微量盘上每一个孔的培养基 (分别含有特定的化合物)内，并于37℃下培养24小时。利用CellTiter 96 AQueous非放射性增殖分析(Promega)并依据制造商手册所述的步骤测定活细胞。简而言之，添加3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑盐/吩嗪硫酸甲酯溶液 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H -tetrazolium,inner salt/phenazinemethosulfate solution)(20μL/孔)后，将96孔微量盘置于37℃培养3小时。利用荧光/冷光微量盘分析仪(SpectraMax M5, Molecular Devices)于490nm下测定吸亮度，以对活细胞中3-(4,5-二甲基噻唑 -2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑盐转换成甲臜(formazan)的程度进行定量。细胞培养中的活细胞数量与吸亮度(490nm)成正比。以仅含载体(0.1％DMSO，对照组)的培养基内的活细胞数目为100％存活率。
利用活细胞报导基因分析(Cell-based reporter assay)筛选细胞自噬作用调节剂
为了建立可用于分析细胞自噬作用的活细胞p62降解分析平台，需先制备HEK细胞的稳定细胞株p62-RL-HEK，其能表现C-端融合海肾冷光素酶报导蛋白(Renillaluciferase reporter)p62蛋白(p62-RL)。可借由测量 p62-RL-HEK细胞中的海肾冷光素酶所产生的冷光讯号来决定细胞中p62-RL 的稳定量。本研究确认冷光讯号的增加是由于抑制细胞自噬作用媒介蛋白p62 降解所导致的，而冷光素酶表现量减低则是由自噬-媒介的p62降解减少所致。分别利用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin) 评估所述细胞式分析的效果。
为了鉴别含有自噬作用调节剂活性化合物的有效植物萃取物，将p62-RL-HEK细胞(2×105细胞/孔)接种至96-孔微量盘，置于37℃下培养2天，接着以植物萃取物(200微克/毫升)于37℃下处理24小时。添加细胞穿透性海肾冷光素酶受体(即，腔肠素(coelenterazine)测定冷光素酶讯号(最终浓度为5 μM)，接着以VictorLight冷光/荧光盘式分析仪(Perkin Elmer)定量。以仅经载体(0.1％DMSO)处理的p62-RL-HEK所发射的冷光素酶讯号作为100％相对冷光量。分别以3-MA(5μM)或雷帕霉素(200nM)处理的样本作为阳性对照组。
实验结果显示，以3-MA处理的p62-RL-HEK细胞表现的冷光素酶讯号显著增加，此可作为3-MA抑制自噬作用导致p62堆积的指标。另一方面，以雷帕霉素处理的p62-RL-HEK细胞冷光素酶讯号显著降低的结果，与雷帕霉素促进自噬作用的活化加速p62降解一致。相较于3-MA或雷帕霉素的结果，羊蹄甲植物萃取物于相对冷光量中能够产生更大变化，则为有潜力的细胞自噬作用调节剂。
利用GFP-LC3表现细胞株进行细胞自噬作用活性分析
制备经绿荧光蛋白标记LC3表现质体转染的HEK293细胞，并透过重组GFP-LC3蛋白的持续性表现，确认已得到稳定转染的细胞株。从表现 GFP-LC3的HEK293细胞分离的同源族群中分离单一株细胞，并命名为 GFP-LC3-HEK。为了检验细胞自噬作用，将GFP-LC3-HEK细胞接种至6-孔微量盘，并以多种不同浓度的羊蹄甲乙醇萃取物处理24小时。分别以3-MA(5 μM)和雷帕霉素(200nM)作为阳性对照组。从经羊蹄甲乙醇萃取物处理的细胞得到的澄清细胞溶解产物以SDS-PAGE和西方墨点法且利用抗p62、抗LC3 和抗GAPDH抗体进行分析。
脑啡肽酶活性分析
将SH-SY5Y细胞培养于100公厘培养皿，当细胞长满(confluence) 时，再接种至12孔盘(1毫升；细胞密度1×106细胞/毫升)。于分盘1天后，以含有所述萃出物的新鲜DMEM/F-12(含10％FBS)(浓度为0.25至30微克/毫升) 培养基或未含有所述萃出物的新鲜DMEM/F-12(含10％FBS)培养基进行替换，并培养24小时；其后再将培养基置换为含4μM qf-Aβ(1-7)C的200毫升分析缓冲液(含5.5mM D-glucose、0.3mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)、25mM碳酸氢钠(sodium bicarbonate)和1.5μM硫酸锌(zinc sulfate)的PBS)(200毫升)，并培养1.5小时。为了测量Aβ-降解活性，取150μL分析缓冲液以SpectraMax Gemini EM(MolecularDevices，USA)测量荧光强度(激发：346nm和发射：442nm)。
脑内Aβ42注射的AD小鼠模型
为了产生急性Aβ42诱导的AD小鼠，以腹腔注射巴比妥钠 (sodiumpentobarbital)(40毫克/公斤)将8周龄C57BL/6公鼠麻醉，接着以连接有微注射器(Hamilton)的26号针注射Aβ42凝聚蛋白至其背侧海马回(dorsal hippocampus))。立体定位手术的坐标如下：前囟后2公厘、双边至中线2.1公厘和腹侧至头骨表面1.8公厘。注射体积为1μL的Aβ42凝聚蛋白或1μL PBS。接受外科手术后的小鼠恢复期为7天。此处所用的Aβ42凝聚蛋白制备方法如下：将可溶性Aβ42溶于0.01M PBS(pH 7.4)中以得到10mM Aβ42溶液，再将所述溶液于37℃下培养3天，以使Aβ42凝聚，并存放于-70℃备用。
Aβ注射小鼠模型的认知功能测量
利用Morris水迷宫(Morris water maze)试验评估经Aβ42凝聚蛋白注射的AD小鼠的认知功能。简言之，每日经由口服给药途径，给予所述注射有Aβ42凝聚蛋白的AD小鼠载体(0.1％DMSO)或羊蹄甲乙醇萃取物(250毫克/公斤)，持续施用2个月。C57BL/6公鼠分别接受假手术(sham operation)或脑内注射PBS，以及仅喂食载体的C57BL/6公鼠(作为未处理对照组)。完成给药方案后，将小鼠从4个不同象限中放入至水迷宫内，借由每只动物寻找到隐藏平台的平均延迟时间，来评估每只小鼠的空间记忆。所述认知功能试验是在一天当中光循环的最后的4小时内，于干扰最小的密死循环境中执行。连续进行所述空间寻获试验(spatial acquisition trial)5天。
免疫组织化学(Immunohistochemical,IHC)分析
为了验证羊蹄甲乙醇萃取物抗阿兹海默症的功效不会引起显著的神经毒性，利用免疫组织化学，测定经处理的动物和对照组动物脑内，细胞自噬作用活化表现型的变化。动物于牺牲后，以4％三聚甲醛(溶于0.1M 磷酸盐缓冲液)(pH 7.4)灌注动物。以水平方向对脑组织进行冷冻切片，每个切片厚度为15微米(μm)，并将其固定于披覆明胶的载玻片上，接着以阻断渗透液(blocking-permeabilizing)(5％驴血清和0.25％Triton X-100)培养1-3小时。以抗p62抗体观察动物体内羊蹄甲乙醇萃取物诱导的细胞自噬作用活化。以雷射共轭焦显微镜(Leica TCS-SP5-MP)观察荧光讯号。
利用AD双基因转殖鼠进行动物实验
所有的实验步骤皆通过中央研究院动物实验管理小组(台北，台湾)核准。利用APP/PS1基因转殖鼠(B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9) 85Dbo/Mmjax)和非基因转殖的同窝(littermate)小鼠作为对照组进行以下试验。于实验动物中心中，将APP/PS1小鼠与野生型(WT)的C57BL/6J小鼠回交，以稳定其遗传背景。以Genomic DNATMTissue MiniPrep套组(Zymo Research Corp.)分离APP/PS1小鼠和野生型小鼠的基因体DNA。以聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增人类APPswe和PSEN1dE9基因。用于扩增 APPswe的引子为5’-AGGACTGACCACTCGACCAG-3’(SEQ ID NO:：1)和 5’-CGGGGGTCTAGTTCTGCAT-3’(SEQ ID NO:：2)，且用于扩增PSEN1dE9 的引子为5’-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3’(SEQ IDNO:：3)和 5’-GCCATGAGGCACTAATCAT-3’(SEQ ID NO:：4)。利用 Safe DNA GelStain(Invitrogen)以1.5％琼脂糖凝胶电泳观察扩增的DNA片段。将冻干的羊蹄甲乙醇萃取物粉末(来自于工业技术研究院)溶于N-甲基-2-吡咯烷酮 (N-Methyl-2-pyrrolidone,NMP)作为10倍羊蹄甲乙醇萃取物储存液(200毫克/ 毫升)，此溶液二每周制备一次，并存放于4℃，使用前需稀释。于灌胃施用 (gavage administration)前，以欲混合的kolliphor/食盐水溶液(1:3.5,v/v)将10 倍羊蹄甲乙醇萃取物储存液稀释10倍。以灌胃施用方式，施用羊蹄甲乙醇萃取物或食盐水至所述APP/PS1小鼠(250毫克/公斤/天)，每周施用六天。每月依据动物的体重调整施用剂量并记录之。
利用Morris水迷宫评估长期施用羊蹄甲乙醇萃取物的APP/PS1 小鼠的认知能力
对11月龄的小鼠进行Morris水迷宫试验。所述Morris水迷宫由三个构件组成：水槽(直径：100公分；高度：35公分)、透明圆形平台(直径：10 公分)以及TopScanLite追踪系统(CleverSys Inc)。将黑色三角形、红色正方形、蓝色圆形和绿色星形物体分别置于水槽的北边、西边、东边和南边作为可视线索。将水和牛奶加到水槽中，因此，藏匿于水面下两公分的透明平台是看不见的。将水面下的平台置于水槽的象限3中，且空间寻获试验的过程中置于相同位置。所述Morris水迷宫试验是由二试验阶段组成：空间寻获试验(第1 天至第5天，每天四次)以及探索试验(第6天)。
依照先前研究所述，每次试验的起始位置是以半随机的方式选择(Vorhees CVand Williams MT(2006)Nat Protoc 1(2):848-858)。将小鼠轻放于起始位置，让小鼠于90秒寻找隐藏的平台。当小鼠于90秒内到达平台并停留在平台上达30秒时，记录到达平台的时间为脱逃时间。当小鼠无法在90秒内找到平台时，借由额外置放橘色旗30秒，将小鼠导引至平台上。当小鼠于该段期间内找到平台时，让其停留于平台上30秒，当小鼠仍无法寻找到平台时，则直接将小鼠置放于平台上并停留30秒。当结束所述试验，将小鼠置于笼内休息15分钟后，再进行下一次的试验。在认知试验过程中，可利用吹风机和卫生纸让小鼠保持温暖，避免出现低温。于空间获取试验最后一天后的 24小时，从水槽中移除平台以进行探索试验。给予每只小鼠60秒的试验时间，且记录在原来隐藏平板区域的停留时间评估小鼠空间记忆。
ELISA
于Morris水迷宫试验后，牺牲每组中5至7只小鼠，并采集小鼠海马回和大脑皮质，分装且存放于-80℃下供ELISA分析使用。采集到的脑组织以400μL的TBS缓冲液(50mMTris、2mM EDTA、150mM NaCl、蛋白酶抑制剂混合物(Sigma P8340)，pH 7.4)利用1毫升Duall组织研磨机和PTFE杵进行均质化，接着于4℃下离心(转速：15000rpm(20000×g))20分钟。收集不溶沈淀物部分，将其再次悬浮于70％甲酸(formic acid)(400微升(μL))中，以超音波震荡1分钟再于4℃下离心(转速：15000rpm(20000×g))20分钟。以20 倍体积的中性缓冲液(1M Tris,500mM Na2HPO4)平衡上清液，分装并收集为“不可溶Aβ部分”。
利用市售人类Aβ40(KHB3482，Invitrogen)和Aβ42(KHB3442， Invitrogen)ELISA套组定量海马回和大脑皮质中，不可溶人类Aβ40和Aβ42。依据制造商提供的使用手册，检测Aβ40和Aβ42。利用Bradford方法定量不可溶Aβ部分的总蛋白浓度。分别以1:500和1:1,000的比例稀释所述不可溶Aβ部分，以检测Aβ40和Aβ42。将经稀释的不可溶Aβ部分和初级检测抗体添加至测试孔中，于室温下进行震荡并培养3小时。清洗后，添加接合辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)的二级抗体，并于室温下温和搅拌30分钟。添加适当安定色原溶液(Stabilized chromogen solution)后，分别置放30分钟和15分钟，以检测Aβ40和Aβ42。之后加入终止溶液结束反应，并立即于450nm下检测吸光值。
硫代黄素S染色
于Morris水迷宫试验后，利用颈椎脱位法(cervical dislocation) 牺牲每组中3只小鼠。以PBS缓冲液(136.89mM NaCl、2.68mM KCl、1.62mM KH2PO4和10.14mM Na2HPO4，pH7.4)和4％多聚甲醛(PFA)/PBS灌注3只小鼠。经灌注的小鼠脑组织再以4％PFA/PBS固定，置于室温下温和摇晃24小时。于固定后，脑组织以PBS缓冲液清洗，且置于70％乙醇/水溶液中备用，供石蜡包埋使用。
利用微电脑全自动病理真空组织脱水机(semi-enclosed benchtop tissueprocessor(Leica TP1020))，将经PFA固定的脑组织脱水。利用 Leica EG1150H制备含脱水脑组织样本的石蜡块。于旋转切片机(Leica RM2235)上进行切片，得到3μm厚的冠状切片。以笔刷采集二脑组织切片，并将其放置在水浴中，再将其置于干净的载玻片上，并置于34℃进行加热数小时。
石蜡切片依序以二甲苯(xylene)、无水酒精、95％乙醇、70％乙醇汗水去除石蜡和进行脱水。于室温下，以1％(w/v)硫代黄素S(thioflavin S) 溶液避光处理10分钟。以80％乙醇和水清洗玻片，移除多余的荧光色素，以供观察。采用能评估绿色荧光的荧光显微镜，观察硫代黄素S阳性讯号，并且以ImageJ软件分析斑块数量、斑块区域和斑块尺寸。
肝肾毒性测试
于实验动物安乐死前，经由眼窦采集血液样本。采集到的血液样本至于冰上至少1小时，接着离心(1500×g)10分钟(4℃)。收集血清样本，分装并冷冻于-30℃。利用FujiDri-chem 4000i分析仪(Taiwan Mouse Clinic)分析血清天门冬胺酸转胺酶(aspartatetransaminase,AST)、丙胺酸转胺酶 (alkaline phosphatase,ALT)、碱性磷酸酶(alaninetransaminase,ALP)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酸酐(creatinine,CRE)。
实施例1羊蹄甲萃取物降低Tau蛋白病诱导的毒性
在此实施例中，监控斑马鱼胚胎中的GFP-hTau融合蛋白表现量，以评估利用“材料与方法”所述步骤制备出的羊蹄甲乙醇萃取物(BVEE)的影响。pHuc-hTau-GFP表现质体是在斑马鱼胚胎单细胞期时注射，接着，借由共同表现的绿荧光蛋白讯号监控Tau蛋白的表现。利用荧光显微镜于24、48 和72hpf观察绿荧光蛋白标记的神经元细胞。计算72hpf胚胎中的绿荧光蛋白讯号并将其分为二组，分别为小于2神经元(0-2)，以及更多神经元(3-5)。结果示于图1。
未经羊蹄甲乙醇萃取物处理组中，77％的胚胎具有0-2神经元，且仅有23％胚胎的有较多神经元(3-5)。相反地，经羊蹄甲乙醇萃取物处理，能降低Tau蛋白诱导的毒性，于斑马鱼胚胎中观察到神经元的表现量增加至 43％(图1图框(B))。
实施例2羊蹄甲萃取物可促进轴突生长
与实施例1大致相同，于单细胞期斑马鱼胚胎中注射 pHuC-hTau-GFP表现质体，接着羊蹄甲植物萃取物或DMSO(对照组)处理，借由计算有绿荧光蛋白表现的神经元生长数量，评估羊蹄甲乙醇萃取物是否能够促进轴突生长。结果示于图2。
如数据所述，HuC启动子调控的绿荧光蛋白表现于48hpf斑马鱼胚胎的三叉神经节和中间神经元的轴突(图2，图框(A))。以DMSO处理的斑马鱼胚胎，其轴突生长的百分比为25％(图2，图框(B))。相对地，以羊蹄甲植物萃取物处理诱导轴突生长的效果显著，其中斑马鱼胚胎轴突生长的百分比高达57％(图2，(B))。
实施例3羊蹄甲乙醇萃取物对于细胞自噬作用活化的影响
在此实施例中，借由监控有或无羊蹄甲乙醇萃取物处理的细胞中，LC3-I至LC3-II基因转换和细胞中p62表现量，来检测羊蹄甲乙醇萃取物诱导细胞自噬作用的能力。结果示于图3。
在图3，A部分是以西方墨点分析LC3-I、LC3-II和p62的表现量。数据显示，经羊蹄甲乙醇萃取物处理的细胞中LC3-II量显著上升，且p62量显著下降。所述结果和自噬作用活性的细胞冷光素酶报导蛋白分析的结果一致，以羊蹄甲乙醇萃取物处理会导致p62量大幅下降(图3，(B))。结果显示本揭示内容的羊蹄甲乙醇萃取物含可活化细胞自噬作用的活性成分。
实施例4羊蹄甲乙醇萃取物对于脑啡肽酶(NEP)活性的影响
在此实施例中，借由监控肽基质(peptide substrate)(即， qf-Aβ(1-7)C肽)被细胞表面脑啡肽酶切断后所放出的荧光强度，来评估羊蹄甲乙醇萃取物对于脑啡肽酶活性的影响，其中荧光团(fluorophore)和淬灭剂分别连结至肽的C端和N端。淬灭剂存在时能够淬灭荧光。当qf-Aβ(1-7)C被脑啡肽酶切开，使得淬灭剂和荧光团被分离，荧光团中发出强烈的荧光。脑啡肽酶是第二型膜蛋白，当细胞膜(如，SH-SY5Y或N2a细胞)含大量的脑啡肽酶，更多的qf-Aβ(1-7)C肽会被切断，导致高强度的荧光产生。结果示于图4。
如图4的结果所示，脑啡肽酶明显和羊蹄甲乙醇萃取物浓度间有剂量依赖性，当羊蹄甲乙醇萃取物的浓度上升时，脑啡肽酶活性随着增加，结果显示，以羊蹄甲植物萃取物处理，能够促进脑啡肽酶而清除Aβ。
实施例5羊蹄甲乙醇萃取物不会产生任何显著的细胞毒性
在此实施例中，借由细胞存活率来评估本揭示内容制备的羊蹄甲乙醇萃取物的毒性。结果示于图5。
如图5所示，相较于对照组细胞，无论是以低浓度(50微克/毫升) 或高浓度(100微克/毫升)羊蹄甲乙醇萃取物处理的细胞，皆能保留相当比例的存活细胞。结果显示，本揭示内容羊蹄甲乙醇萃取物对于p62-RL-HEK细胞不会产生任何毒性，因此，基于其安全性，羊蹄甲乙醇萃取物能够作为食品添加物使用。
实施例6于脑内Aβ42注射AD小鼠动物模型中经羊蹄甲乙醇萃取物处理能够改善认知功能
在此实施例中，以依据“材料与方法”所述的急性Aβ42诱导 AD小鼠动物模型，来评估本揭示内容对于认知功能改善的影响。结果示于第 6图和图7。
如第6图所示，相较于假手术组实验动物，经过羊蹄甲乙醇萃取物处理的Aβ注射AD小鼠，其认知功能明显获得改善，仅以载体处理的小鼠，则具有严重的认知功能缺损。以羊蹄甲乙醇萃取物处理的小鼠，其海马回中细胞自噬作用的诱导显著增加，与p62的表现量显著降低的结果一致(图 7)。
综上所述，实验结果显示，本揭示内容的羊蹄甲乙醇萃取物含有能够活化细胞自噬作用的活性成分，其能够抑制Aβ42诱发的神经毒性，和改善试验动物的空间学习和记忆。
实施例7羊蹄甲乙醇萃取物对于AD双基因转殖鼠的影响
在此实施例中，以依据“材料和方法”所述的Morris水迷宫评估羊蹄甲乙醇萃取物对于试验动物(即，APP/PS1小鼠)的空间和参考性记忆的影响。结果示于图8。
于试验第一天(第1天，图8)，同时接受食盐水和羊蹄甲乙醇萃取物治疗的APP/PS1小鼠与野生型同窝小鼠，在到达隐藏平台的逃脱延迟时间的表现非常类似，表示本组小鼠于羊蹄甲乙醇萃取物治疗后，具有相近的学习能力且无特定象限偏好。相反地，仅以食盐水处理的APP/PS1小鼠的表现较差，其到达隐藏平台上所需的逃脱延迟时间较长；在试验的第一天，此组别中75％的小鼠(12只小鼠中有9只)无法到达隐藏平台。于连续训练五天后，某些食盐水处理的APP/PS1小鼠能够在90秒的时间限制内到达平台，但其逃脱延迟时间保持在约60秒。另一方面，野生型小鼠终生不会发展阿兹海默症症状，该多个小鼠学习快速，在试验第一天，第二次试验后即可到达至平台上(16只小鼠中有12只)。在试验第二天后，相较于食盐水处理的APP/PS1 小鼠，野生型小鼠的逃脱延迟时间显著降低。再者，94％的野生型小鼠(16只小鼠中有15只)在空间寻获试验后，能够在33秒内到达平台。于连续训练5天后，相较于食盐水处理组，施用羊蹄甲乙醇萃取物的小鼠能够显著改善认知功能(P<0.01)，小鼠的逃脱延迟时间(即，羊蹄甲乙醇萃取物处理的APP/PS1 小鼠)在第二天和第三天显著降低50％。虽然在第四天延迟时间增加，但其仍低于食盐水处理的APP/PS1小鼠结果。在第5天，经羊蹄甲乙醇萃取物处理的小鼠和野生型小鼠的逃脱延迟时间相似，皆明显低于经食盐水处理的 APP/PS1小鼠。在结束空间获取试验五天后，进行一天探索试验，其用来评估实验动物是否学习到寻获平台位置，结果示于图8的图框(B)。空间获取试验呈现类似的结果，在探索试验中经食盐水处理的小鼠的出现认知功能缺陷 (约50秒)。相反地，经羊蹄甲乙醇萃取物处理的小鼠展现与野生型同窝小鼠类似的认知能力。
于认知试验结束后，在实验动物11月龄时将其牺牲，再以ELISA 定量海马回和大脑皮质中，不可溶人类Aβ40和Aβ42的量。结果示于第9图的图框(A)中。相较于野生型小鼠，经食盐水处理的APP/PS1小鼠的海马回和大脑皮质中发现大量的Aβ40和Aβ42斑块。在施用羊蹄甲乙醇萃取物后8个月，经羊蹄甲乙醇萃取物处理的小鼠的海马回中，β类淀粉堆积减少(Aβ40减少 25％和Aβ42减少21％)。另一方面，在大脑皮质中不可溶Aβ40和Aβ42堆积则更显著的减少，分别减少46％和33％(P<0.01)。硫代黄素S(ThS)染色定量分析也呈现一致的结果，在皮质中类淀粉斑块显著降低，且在海马回中斑块数量显著减少(第9图图框(B)和(C))。
实施例8羊蹄甲乙醇萃取物对于肝脏或肾脏功能的影响
在此实施例中，借由监控肝脏和肾脏功能来评估羊蹄甲乙醇萃取物对于试验动物的长期影响(即，8个月)。借由测量多种代谢性酶的血清含量，例如，血清天门冬胺酸转胺酶(AST)、丙胺酸转胺酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、血尿素氮(BUN)和肌酸酐(CRE)，来评估肝功能。结果示于第10图。
如第10图的数据显示，经过羊蹄甲乙醇萃取物处理，对于ALT、 BUN和CRE的量没有显著影响。然而，相较于经食盐水处理的对照组实验动物而言，经羊蹄甲乙醇萃取物处理的动物AST的量明显较高，而ALP的量明显较低。但在所有经羊蹄甲乙醇萃取物处理的动物中，并没有表现病理征状。因此，长期口服施用羊蹄甲乙醇萃取物至少达8个月，并不会影响试验动物的肝脏和/或肾脏功能。
实施例9比较本发明萃取物对于脑啡肽酶活性和诱导细胞自噬作用的影响
在此实施例中，测定本发明艳紫荆(Bauhinia blakeana Dunn.)萃取物对于脑啡肽酶活性的影响。依照“材料和方法”所示步骤制备萃取物，其中以95％乙醇、40％乙醇或热水作为溶剂萃取艳紫荆茎粉末。结果示于第 11图。
如第11图所示，相较于对照组，以95％乙醇(BBEE)、40％乙醇 (BB40EE)或热水(BBWE)萃取的艳紫荆萃取物，能够增加脑啡肽酶活性。
实施例10本发明以不同种溶剂形式制备而成的萃取物对于诱导细胞自噬作用的影响
在此实施例中，测定本发明羊蹄甲萃取物在p62-RL-HEK细胞中，对于诱导自噬作用的影响，其中所述萃取物分别利用以下溶剂制备而得：己烷(hexane)、乙醚(ether)或乙酸乙酯(ethyl acetate,EA)。依据“材料和方法”所述的步骤制备本发明羊蹄甲萃取物。结果示于第12图。
数据显示，所有试剂皆能够从羊蹄甲中成功萃取出可诱导自噬作用的成分，且以有机溶剂(如，己烷、乙醚和乙酸乙酯)来分离可诱导细胞自噬作用的成分，效果较佳(第12图)。上述结果显示，以乙醇萃取步骤能够有效分离羊蹄甲的活性成分，有助于制备羊蹄甲乙醇萃取物作为食品添加物的配方。
可以理解的是上文实施方式仅为例示，本领域技术人员当可对其进行各种更动与修饰。上述的说明书、实施例和数据已提供本发明多种例示实施方式的完整描述及实作本发明。虽然本发明已详尽揭露或引用多种实施方式，在不悖离本发明之原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰。
序列表
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财团法人工业技术研究院
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Claims (27)

1.一种利用羊蹄甲属植物萃取物制备医药品的用途，其特征在于，该医药品是用来治疗患有或疑似患有与类淀粉相关的神经退化性疾病的个体，且该羊蹄甲属萃取物的口服剂量为10-50毫克/公斤。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该羊蹄甲属植物是羊蹄甲或艳紫荆。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，该羊蹄甲属植物萃取物的口服剂量为约20毫克/公斤。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，该羊蹄甲属植物萃取物是一水萃取物或一乙醇萃取物。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，该羊蹄甲属植物水萃取物是以1:5(w/v)至1:20(w/v)的比例混合羊蹄甲属植物茎粉末和水，并且在约30-100℃下处理0.5-5小时所制得。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，该羊蹄甲属植物水萃取物是以1:10(w/v)的比例混合羊蹄甲属植物茎粉末和水，并且在约50℃下处理2小时所制得。
7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，该羊蹄甲属植物乙醇萃取物是以1:5(w/v)至1:20(w/v)的比例混合羊蹄甲属植物茎粉末和95％乙醇(vol％)，并且在约15-35℃下处理1-10天所制得。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，该羊蹄甲属植物乙醇萃取物是以1:10(w/v)的比例混合羊蹄甲属植物茎粉末和95％乙醇(vol％)，在约25℃下处理7天所制得。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该神经退化性疾病是选自于以下成员所组成的群组：阿兹海默症、亨汀顿氏舞蹈症、血管型失智症、颞叶型失智症、语意性失智症和路易氏体失智症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症以及帕金森氏症。
10.一种治疗患有或疑似患有与类淀粉相关的神经退化性疾病个体的方法，包含：
经口施用一预防或治疗有效量的羊蹄甲属植物萃取物至所述个体，以向上调节脑啡肽酶、诱导细胞自噬作用、保护神经元免于类淀粉病变或Tau蛋白病变和/或促进轴突生长，进而改善或缓减与类淀粉相关的神经退化疾病的症状。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该羊蹄甲属植物是羊蹄甲或艳紫荆。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，该羊蹄甲属植物萃取物是一水萃取物或一乙醇萃取物。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，该羊蹄甲属植物水萃取物是以1:5(w/v)至1:20(w/v)的比例混合羊蹄甲属植物茎粉末和水，并且在约30-100℃下处理0.5-5小时所制得。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，该羊蹄甲属植物水萃取物是以1:10(w/v)的比例混合羊蹄甲属植物茎粉末和水，并且在约50℃下处理2小时所制得。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，该羊蹄甲属植物乙醇萃取物是以1:5(w/v)至1:20(w/v)的比例混合羊蹄甲属植物茎粉末和95％乙醇(vol％)，并且在约15-35℃下处理1-10天所制得。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，该羊蹄甲属植物乙醇萃取物是以1:10(w/v)的比例混合羊蹄甲属植物茎粉末和95％乙醇(vol％)，在约25℃下处理7天所制得。
17.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该神经退化性疾病是选自于以下成员所组成的群组：阿兹海默症、亨汀顿氏舞蹈症、血管型失智症、颞叶型失智症、语意性失智症和路易氏体失智症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症以及帕金森氏症。
18.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该羊蹄甲属植物萃取物的口服剂量为约5-50毫克/公斤。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，该羊蹄甲属植物萃取物的口服剂量为约20毫克/公斤。
20.一种羊蹄甲属植物萃取物，用以治疗患有或疑似患有与类淀粉相关的神经退化性疾病的个体，其特征在于，该羊蹄甲属萃取物的口服剂量为5-50毫克/公斤。
21.如权利要求20所述的羊蹄甲属植物萃取物，其特征在于，该羊蹄甲属植物是羊蹄甲或艳紫荆。
22.如权利要求21所述的羊蹄甲属植物萃取物，其特征在于，该羊蹄甲属植物萃取物是一水萃取物或一乙醇萃取物。
23.如权利要求22所述的羊蹄甲属植物萃取物，其特征在于，该羊蹄甲属植物水萃取物是以1:5(w/v)至1:20(w/v)的比例混合羊蹄甲属植物茎粉末和水，并且在约30-100℃下处理0.5-5小时所制得。
24.如权利要求23所述的羊蹄甲属植物萃取物，其特征在于，该羊蹄甲属植物水萃取物是以1:10(w/v)至1:20(w/v)的比例混合羊蹄甲属植物茎粉末和水，并且在约50℃下处理2小时所制得。
25.如权利要求22所述的羊蹄甲属植物萃取物，其特征在于，该羊蹄甲属植物乙醇萃取物是以1:5(w/v)至1:20(w/v)的比例混合羊蹄甲属植物茎粉末和95％乙醇(vol％)，并且在约15-35℃下处理1-10天所制得。
26.如权利要求25所述的羊蹄甲属植物萃取物，其特征在于，该羊蹄甲属植物乙醇萃取物是以1:10(w/v)的比例混合羊蹄甲属植物茎粉末和95％乙醇(vol％)，在约25℃下处理7天所制得。
27.如权利要求20所述的羊蹄甲属植物萃取物，其特征在于，该神经退化性疾病是选自于以下成员所组成的群组：阿兹海默症、亨汀顿氏舞蹈症、血管型失智症、颞叶型失智症、语意性失智症和路易氏体失智症、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症以及帕金森氏症。
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