TWI631955B - 羊蹄甲屬萃取物及其用途 - Google Patents

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Abstract

在此揭示一種羊蹄甲屬植物萃取物的新穎用途，所述羊蹄甲屬植物萃取物能夠向上調節腦啡肽酶、誘導細胞自噬作用、保護神經元免於類澱粉病變或Tau蛋白病變和/或促進神經元突生長；因此，本揭示內容的羊蹄甲屬植物萃取物能作為食品添加物，以預防或治療與類澱粉蛋白相關的神經退化疾病，以期改善或緩減與類澱粉相關的神經退化疾病的症狀。

Description

羊蹄甲屬萃取物及其用途
本揭示內容是是關於一種羊蹄甲屬植物萃取物的新穎用途，特別是本揭示內容是關於羊蹄甲屬植物萃取物作為用以治療神經退化性疾病之食品添加物的用途。
羊蹄甲(Bauhinia variegata Linn.(Fabaceae))是印度傳統藥方中常見的藥物。不同的植物部位(如，花苞、花、莖、莖皮、葉、種子和根)可用來治療氣喘、黃膽(jaundice)、結核病(tuberculosis)、痲瘋病(leprosy)和皮膚病。已知羊蹄甲的莖皮具有抗腫瘤、抗潰瘍和抗菌活性。近期的動物研究更指出羊蹄甲乙醇萃取物(ethanol extract of B.variegata,BVEE)對於順鉑引發的腎臟疾病有顯著的腎保護作用，且對於四氧嘧啶(alloxan)引發的高血糖活性有抗糖尿病效果。
阿茲海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一漸進式的神經退化性疾病，也是最常見的老年失智症。各界普遍認為阿茲海默症患者體內類澱粉蛋白(Aβ)和Tau蛋白的堆積是引發神經退化和相關致病途徑的主因，而這兩種現象導致阿茲海默症的發生與進展。已證實在人類偶發型阿茲海默症患者中會有截短的Tau蛋白，其能夠誘發AD患者體內的Tau蛋白聚集與神經纖維纏結(neurofibrillary tangles)。越來越多證據顯示，腦啡肽酶(neprilysin；NEP)是負責清除Aβ的主要內切胜肽酶，在老化過程和阿茲海默症患者中可觀察到腦啡肽酶的功能缺損。同樣地，在腦啡肽酶剔除小鼠中可觀察到腦啡肽酶表現量和腦內Aβ累積量呈負相關。正因如此，在開發促進Aβ降解的阿滋海默症藥物時，腦啡肽酶是公認最有潛力的藥物標的。再者，細胞自噬體為清除Tau蛋白最主要的胞內液泡。此種由細胞自噬作用介導的降解系統，對於控制Aβ平衡亦扮演重要的角 色。正因其具有保護神經元的功能，細胞自噬作用缺損與多種神經退化性疾病(包含AD)的發病機制有關。越來越多的證據顯示，自噬體可以吞入受損的胞器和異常的蛋白質聚集物，以便在溶酶體融合後，將該些內化的胞器與蛋白(internalized cargo)清除。因此，可合理推知可誘導細胞自噬作用的藥劑，能藉由促進細胞自噬作用來清除異常蛋白聚集物(包含Aβ和Tau)，而產生神經保護功效。
本案發明人藉由Tau蛋白病變斑馬魚模型、腦啡肽酶細胞分析以及自噬作用細胞分析，意外地發現羊蹄甲屬植物萃取物，能夠同時抑制Tau蛋白病變引起的神經毒性、增強腦啡肽酶活性和誘導自噬活性；因此，本發明證實羊蹄甲屬植物萃取物能夠作為健康食品食品添加物，以改善神經退化性疾病患者整體的記憶力和/或認知能力。
本揭示內容是關於羊蹄甲屬植物萃取物於向上調節腦啡肽酶、誘導自噬作用、保護神經元避免類澱粉病變或Tau蛋白病變發生和/或促進神經元突(neurite)生長的新穎用途，因此，本揭示內容羊蹄甲屬植物萃取物可以作為食品添加物，用來預防或治療類澱粉相關的神經退化性疾病，或用於減緩與類澱粉相關的神經退化性疾病之疾病進程及症狀。
再者，本揭示內容第一態樣是提供一種用以治療患有或疑似患有類澱粉相關神經退化性疾病個體的方法。所述方法包含以下步驟，經口施用一治療有效量之羊蹄甲屬植物萃取物至所述個體，以改善或緩減與類澱粉相關的神經退化疾病的症狀。
依據本揭示內容的實施方式，所述羊蹄甲屬植物是羊蹄甲(Bauhinia variegata)或豔紫荊(Bauhinia x blakeana)。
依據本揭示內容的實施方式，所述羊蹄甲屬植物萃取物可以是水萃取物或乙醇萃取物。
依據本揭示內容某些實施方式，所述羊蹄甲屬植物水萃取物是以1：5(w/v)至1：20(w/v)的比例，混合羊蹄甲屬植物莖粉末和水，並且在約30-100℃下處理0.5-5小時後所製得。在較佳的實施方式中，所述羊蹄甲屬植物水萃取物是以1：10(w/v)至1：20(w/v)的比例，混合羊蹄甲屬植物莖粉末和水，並且在約50℃下處理2小時後所製得。
依據本揭示內容其他實施方式，所述羊蹄甲屬植物的乙醇萃取物是以1：5(w/v)至1：20(w/v)的比例，混合羊蹄甲屬植物莖粉末和95%乙醇(vol%)，並且在約15-35℃下處理1-10天後所製得。在較佳的實施方式中，所述羊蹄甲屬植物的乙醇萃取物是以1：10(w/v)的比例，混合羊蹄甲屬植物莖粉末和95%乙醇(vol%)，在約25℃下處理7天後所製得。
依據本揭示內容的實施方式，所述羊蹄甲屬植物萃取物的口服劑量約為5-50毫克/公斤。在較佳的實施方式中，所述羊蹄甲屬植物萃取物的口服劑量約為20毫克/公斤。
依據本揭示內容的實施方式，可利用本揭示內容羊蹄甲屬植物萃取物治療的神經退化性疾病是選自於以下成員所組成的群組：阿茲海默症、亨汀頓氏舞蹈症(Huntington’s disease,HD)、血管型失智症(vascular dementia,VD)、顳葉型失智症(frontotemporal dementia,FTD)、語意性失智症(semantic dementia,SD)和路易氏體失智症(dementia with Lewy bodies,DLB)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)以及帕金森氏症(Parkinson’s disease,PD)。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
第1圖顯示在斑馬魚胚胎中，經羊蹄甲植物萃取物處理能夠減少由人類Tau-GFP過量表現引起的神經元死亡。圖框(A)：在單細胞期(one-cell stage)內，將pHuC-hTau-GFP表現質體注射至斑馬魚胚胎中；接著，於受精後24、48和72小時(hours post-fertilization；hpf)，觀察綠螢光蛋白(GFP)標記之神經元細胞。在24hpf胚胎中，能夠在神經元細胞內觀察到部分綠螢光蛋白訊號，其後，在48hpf胚胎中，綠螢光蛋白訊號分解成小點並減少。然而，仍有其他綠螢光蛋白訊號完整保留在神經元細胞中。圖框(B)：計算48hpf胚胎中，呈現綠螢光蛋白訊號的神經元數量，並將結果分為二組，分別是少於2神經元(0-2個)和較多神經元(3-5個)。羊蹄甲乙醇萃取物(BVEE)處理使胚胎使其具有更多神經元(第1圖圖框(A))；有46%的胚胎具有3-5個神經元(第1圖圖框(B))；第2圖顯示羊蹄甲乙醇萃取物處理能夠誘導促進斑馬魚胚胎中的神經元突生長。圖框(A)：在單細胞期內，先將pHuC-GFP表現質體注入至斑馬魚胚胎中；注射後8小時，再以羊蹄甲乙醇萃取物或二甲基亞碸(DMSO)(對照組)處理經注射的胚胎。圖框(B)：於處理後40小時計算出現顯著神經元突生長的斑馬魚數量；第3圖顯示羊蹄甲乙醇萃取物處理能夠誘導自噬作用。圖框(A)：GFP-LC3-HEK細胞在37℃下，以羊蹄甲乙醇萃取物(50微克/毫升)處理24小時；利用自噬作用誘導劑(即，雷帕黴素)和自噬作用抑制劑(即，3-MA)作為對照組。利用SDS-PAGE解析含等量蛋白的細胞裂解物，再以抗p62(上排)、抗LC3(中排)和抗GAPDH(下排)抗體進行西方墨點法分析。圖框(B)：過量表現海腎冷光素酶(Renilla luciferase)標記p62之穩定細胞株p62-RL-HEK在37℃下，以羊蹄甲乙醇萃取物處理24小時；另以雷帕黴素或3-MA處理作為對照組；添加等量的腔腸素(coelenterazine)(最終濃度為5μM)測定海腎冷光素酶訊號；以DMSO處理的細胞(對照組)所發出的冷光作為100%相對海腎冷光素酶訊號； 第4圖為依據本揭示內容一實施方式所示羊蹄甲乙醇萃取物對於腦啡肽酶活性的影響的折線圖，結果顯示羊蹄甲乙醇萃取物對於腦啡肽酶活性具有劑量依賴性；第5圖顯示羊蹄甲乙醇萃取物處理對於p62-RL-HEK細胞存活率的影響。於37℃下使用或不使用羊蹄甲乙醇萃取物(50或100微克/毫升)處理24小時；另以雷帕黴素或3-MA處理作為對照；利用下列方法所述的CellTiter 96 Aqueous非放射性細胞增殖分析試劑測定活細胞，於490nm下測定吸光值，以經DMSO處理的細胞(對照組)作為100%相對活性；第6圖顯示Aβ42注射的AD小鼠施用羊蹄甲乙醇萃取物能夠改善認知功能。使用Morris水迷宮試驗來決定逃脫延遲時間，相較於對照組小鼠的表現，經羊蹄甲乙醇萃取物處理的Aβ42注射小鼠能夠記憶隱藏平台的位置。未經手術小鼠(無注射/溶劑)，n=5；經溶劑處理的假手術小鼠(PBS注射/溶劑)，n=5；經溶劑處理的Aβ42注射小鼠(Aβ42注射/溶劑)，n=8；經羊蹄甲乙醇萃取物處理的Aβ42注射小鼠(Aβ42注射/BVEE)，n=6；第7圖顯示羊蹄甲乙醇萃取物能夠誘導Aβ42注射小鼠海馬迴中細胞自噬作用的活化。對C57BL/6公鼠腦內注射Aβ42，再施以載體(0.1% DMSO)或羊蹄甲乙醇萃取物(250毫克/公斤/日)長達2個月；於Morris水迷宮試驗分析小鼠認知功能後，以抗p62對小鼠的腦部進行螢光組織化學分析；採用DAPI染色來觀察細胞核；螢光免疫組織化學分析的代表圖式顯示經羊蹄甲乙醇萃取物處理的小鼠和未經處理的小鼠的海馬迴中的p62的量(紅色)和DAPI染色(藍色)含量；定量數據顯示小鼠腦部(n=3)連續三區塊(厚度：15μm)中p62的平均量(±SD)；第8圖顯示經羊蹄甲乙醇萃取物長期處理的APP/PS1基因轉殖鼠能改善認知狀態。3月齡的APP/PS1小鼠經口服用羊蹄甲乙醇萃取物(250毫克/公斤體重)或食鹽水，每週服用6次，持續服用至7個月。在實驗動物10月齡時，利用Morris水迷宮進行空間尋獲試驗(圖框(A))和探索試驗測試(圖框(B))，以分析經食鹽水處理的APP/PS1小鼠(n=12)、經羊蹄甲乙醇萃取物處理的APP/PS1小鼠(n=8)和野 生型同窩小鼠(n=15)的空間和參考性記憶；數據以平均值±SEM表示；每日比較野生型組、經羊蹄甲乙醇萃取物處理的APP/PS1小鼠與經食鹽水處理的APP/PS1小鼠；以雙向(two-way)ANOVA分析和費雪最小顯著差異(Fisher’s LSD)試驗計算不同處理組之間的顯著性；*P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001、**** P<0.0001；ns代表無顯著性。
第9圖顯示經羊蹄甲乙醇萃取物處理的APP/PS1小鼠之類澱粉斑塊負荷(plaque burden)減少。利用酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)(圖框(A))和硫代黃素S染色(圖框(B))評估11月齡之野生型同窩小鼠、經食鹽水和經羊蹄甲乙醇萃取物處理的APP/PS1小鼠的斑塊負荷。圖框(A)：於犧牲後，採集大腦皮質和海馬迴以進行ELISA分析；利用市售ELISA套組定量不可溶人類Aβ40和Aβ42的量(羊蹄甲乙醇萃取物處理，n=6；食鹽水處理，n=5；野生型小鼠，n=3)。圖框(B)：利用硫代黃素S觀察斑塊負荷；比例尺代表800μm。圖框(C)：利用ImageJ定量硫代黃素S染色區塊的斑塊數量、總斑塊區域和斑塊覆蓋百分比；數據以平均值±SEM表示；相較於經食鹽水處理的APP/PS1小鼠的顯著和非顯著結果(ns)如圖所示；利用單向(one-way)ANOVA分析和費雪最小顯著差異試驗計算(從2隻經羊蹄甲乙醇萃取物處理的小鼠中所取得的切片，n=12；從經食鹽水處理的7隻小鼠中所取得的切片，n=40；從5隻野生型小鼠中取得的切片，n=10)；* P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001、**** P<0.0001；第10圖顯示長期施用羊蹄甲乙醇萃取物的肝臟和腎臟毒性試驗。採集經羊蹄甲乙醇萃取物處理的APP/PS1小鼠血液樣本，分析AST、ALT、ALP、BUN、CRE的量。所有結果以平均值±SEM表示(羊蹄甲乙醇萃取物處理，n=3；食鹽水處理，n=4)；* P<0.05，相較於食鹽水處理的APP/PS1小鼠，以ANOVA和費雪最小顯著差異試驗計算；ns代表非顯著性；從10週齡之ICR小鼠(n=10)取得的AST、ALT、ALP、BUN、CRE的數值範圍以虛線表示；以及 第11圖為腦啡肽酶活性分析，此圖為依據本揭示內容一實施方式所示之直條圖，分別以95%乙醇、40%乙醇和水萃取的豔紫荊萃取物對於腦啡肽酶活性的影響；第12圖顯示利用不同溶劑萃取而得的羊蹄甲(BV)萃取物誘導細胞自噬作用的能力。p62-RL-HEK細胞於37℃下使用或不使用羊蹄甲萃取物處理24小時；另外以雷帕黴素(RAP)或3-MA處理作為對照；添加腔腸素(最終濃度為5μM)測定海腎冷光素酶(Luc)活性；經DMSO處理的細胞(對照組)作為100%相對海腎冷光素酶訊號；從不同溶劑中萃取的萃取物經冷凍乾燥，再以DMSO回溶進行後續分析；大寫字母表示萃取羊蹄甲所使用的溶劑。；A為己烷；B為乙醚；C為乙酸乙酯；D為熱水；E為乙醇。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
1.定義
為方便起見，在此將本揭示內容中所使用的特定詞彙揭示於此。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。
在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。具體而言，本說明書和申請專利範圍所示之單數名詞「一(a,an)」包含複數型，除非另有定義。再者，在本說明書和申請專利範圍所示之「至少一(at least one)和一或多個(one or more)」具有相同的涵義且包含一、二、三或更多。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已儘可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0。5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此所示之數值範圍為一端點至另一端點，或是二端點之間。在此所揭示的數值範圍皆涵蓋端點，除非另有指明。
在此處「治療」(treatment)做名詞用包括預防性質(如預防性(prophylactic))、治療性質或緩解性質(palliative)的處置；而「治療」(treating)亦包含提供預防性、治療性或緩解性的處置。具體而言，在此所述「治療」一詞是指應用(application)或施用(administration)本發明的分子結構或包含該分子結構的藥學組合物至一患有醫學病症、與醫學病症相關症狀、繼發於醫學病症的疾病或徵狀或易於患有該醫學病症的個體，以期能部分地或完全地緩和、改善、減輕一特定異常和/或病症的一或多種症狀或特徵，或延緩其發生、阻礙其進展、減輕其嚴重性和/或減低發生率。亦可對並未表出現疾病、異常和/或病症之徵兆的個體和/或呈現早期徵兆的個體進行治療，以期降低發展出與該疾病、異常和/或病症相關之病理變化的風險。
所述「治療有效量(effective amount)」是指本發明羊蹄甲屬植物萃取物的用量足以產生所欲的療效反應。一藥劑的有效量不必然能夠治癒一疾病或症狀，但能延緩、阻礙或預防疾病或症狀的發生，或延緩疾病或症狀相關的病徵。所述治療有效量可分成一、二或更多劑量於單 一施用劑量型式，且可於一指定期間內施用一次、二次或更多次。具體的治療有效量或足夠用量取決於多種因素，如欲治療的特定狀況、患者的生理條件(如，患者體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動物或動物的類型、治療持續時間、目前療法(如果有的話)的本質以及所用的具體配方。舉例來說，可將治療有效量表示成藥物的總重量，即以克、毫克、微克等單位表示的羊蹄甲屬植物萃取物；或表示成藥物重量與體重比例(其單位為毫克/公斤(毫克/公斤))。具體而言，所述羊蹄甲屬植物萃取物的治療有效量是指羊蹄甲屬植物萃取物的量足以正調控腦啡肽酶(neprilysin)、誘導細胞自噬作用、保護神經元避免類澱粉病變或Tau蛋白病變發生和/或促進神經元突生長，以減輕或減緩與個體神經退化性疾病相關的症狀。本領域具有通常知識者，基於本揭示內容實施例中動物模式所測定的劑量，能夠計算醫藥品(如，本揭示內容的化合物)之人類等效劑量(human equivalent dose,HED)。舉例而言，可依據美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration(FDA))出版的「Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」估算人類個體的最高安全劑量。
所述「施用(administering,administration)」一詞是指將羊蹄甲屬植物萃取物或含有該萃取物之藥學組合物施用至需要治療的個體。
在本說明書中所述「個體(subject)」或「患者(patient)」一詞可交互使用，且在此係指可接受本發明羊蹄甲屬植物萃取物、藥學組合物和/或方法的動物(包含，人類)。。除非另有指明，「個體」或「患者」一般包含雄性與雌性。再者，所述「個體」或「患者」包含可從本揭示內容的治療方法得到良好治療效果的哺乳動物。舉例而言，所述「個體」或「病患」包含，但不限於，人類、大鼠、小鼠、天竹鼠、豬、猴子、豬、羊、牛、馬、狗、貓、鳥和禽類。在一實例中，所述患者為人類。所述「哺乳類」一詞涵蓋哺乳綱的所有成員，包含：人類、靈長類動物、家畜和農畜。舉例而言，所述家畜或農畜可以是兔子、豬、羊和牛。所述哺乳類亦可涵蓋動物園或競賽用動物、寵物，以及齧齒 類(如，小鼠和大鼠)。所述「非人類哺乳類」一詞是指除了人類以外的哺乳綱成員。
2.製備羊蹄甲屬植物萃取物
本發明是基於發現依據本揭示內容實施例所製備的羊蹄甲屬植物萃取物，能夠正調控腦啡肽酶、誘導自噬作用，保護神經元避免類澱粉病變或Tau蛋白病變發生，和/或促進神經元突生長，且對於代謝酵素和/或腎功能無毒性作用，因此，所述羊蹄甲屬植物萃取物能夠作為食品添加物，以改善或緩減欲治療個體中與神經退化性疾病相關的症狀。
因此，本揭示內容第一態樣是提供一種羊蹄甲屬植物萃取物，其能夠有效治療患有或疑似患有神經退化性疾病個體。
適用於本揭示內容羊蹄甲屬植物的實例包含，但不限於，羊蹄甲和豔紫荊。
在一實施例中，本揭示內容羊蹄甲屬植物萃取物是以新鮮羊蹄甲莖或其乾燥粉末製成。在其他實施例中，本揭示內容的羊蹄甲屬植物萃取物是以新鮮豔紫荊莖或其乾燥粉末製成。依據本揭示內容的實施方式，所述含有活性化合物(即，可調控腦啡肽酶(NEP)活性或促進神經元突生長的成分)的羊蹄甲屬植物萃取物，是以1：5(w/v)至1：20(w/v)的比例，混合羊蹄甲屬植物莖乾燥粉末和一無毒性溶劑，並且在適當的處理溫度和時間下製得。
依據本揭示內容某些實施方式，本發明羊蹄甲屬植物萃取物是以1：5(w/v)至1：20(w/v)的比例，混合羊蹄甲屬植物莖粉末和水，例如1：5、1：6 1：7、1：8、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15、1：16、1：17、1：18、1：19和1：20(w/v)，且在溫度約30-100℃，例如30、40、50、60、70、80、90和100℃，處理約0.5-5小時，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4和5小時所製得。在較佳的實施方式中，所述羊蹄甲屬植物萃取物是以1：8(w/v)至1：15(w/v)的比例，混合羊蹄甲屬植物莖粉末和水，例如1：8、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14和1：15(w/v)，且在溫度約40-80℃，例如40、50、60、70和80℃，處理約1-3小時，例如1、2和3小 時所製得。在最佳的實施例中，所述羊蹄甲屬植物萃取物是以1：10(w/v)的比例，混合羊蹄甲屬莖粉末和水，且在溫度約50℃下處理約2小時。
依據本揭示內容其他實施方式，本發明羊蹄甲屬植物萃取物是以1：5(w/v)至1：20(w/v)的比例，混合羊蹄甲屬植物莖粉末和95%乙醇(vol%)，例如約1：5、1：6、1：7、1：8、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15、1：16、1：17、1：18、1：19或1：20(w/v)，並且在約15-35℃下，例如約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35℃，處理1-10天所製得。在較佳的實施方式中，本發明羊蹄甲屬植物萃取物是以1：8(w/v)至1：15(w/v)的比例，混合羊蹄甲屬植物莖粉末和95%乙醇(vol%)，例如約1：8、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14或1：15(w/v)，並且在約20-30℃下，例如約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃，處理3-8天所製得。在最佳的實施方式中，本發明羊蹄甲屬植物萃取物是以1：10(w/v)的比例，混合羊蹄甲屬植物莖粉末和95%乙醇(vol%)，並且在約25℃下處理7天所製得。
最終將所述羊蹄甲屬植物萃取物冷凍乾燥，並存放於陰涼、乾燥且避光的環境備用。
3.羊蹄甲屬植物萃取物的用途
依據本揭示內容實施方式，依據本揭示內容方法製備而成的羊蹄甲屬植物萃取物，於體外試驗中能夠減少Tau蛋白病變誘導的神經元毒性(參見實施例1)、促進神經元突生長(參見實施例2)、活化自噬作用(參見實施例3)以及正調控腦啡肽酶(NEP)活性(參見實施例4)；在體內試驗中，所述羊蹄甲屬植物萃取物能夠改善記憶和認知功能(參見實施例6和7)。最重要的是，所述羊蹄甲屬植物萃取物並不會造成代謝酵素活性或腎功能損害(參見實施例8)，亦不會產生任何細胞毒性(參見實施例5)。因此，本發明羊蹄甲屬植物萃取物可以作為食品添加物，以治療患有神經退化性疾病的個體，特別是類澱粉相關的神經退化性疾病，以改善個體整體的記憶和認知功能個體。
因此，本揭示內容第二態樣是提供一種治療患有或疑似患有神經退化性疾病的方法。所述方法包含以下步驟，經口施用一治療有效量之羊蹄甲屬植物萃取物至所述個體，改善或緩減與類澱粉相關的神經退化性疾病相關症狀。
可利用本發明羊蹄甲屬植物萃取物處理的神經退化性疾病的實例，包含，但不限於，阿茲海默症(Alzheimer’sdisease,AD)、亨汀頓氏舞蹈症(Huntington’sdisease,HD)、血管型失智症、顳葉型失智症、語意性失智症和and路易氏體失智症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)和帕金森氏症(PD)。
適用於本方法的羊蹄甲屬植物萃取物可以是羊蹄甲或豔紫荊的水萃取物或乙醇(即，95%乙醇)萃取物。在某些實施例中，是採用羊蹄甲95%乙醇萃取物；且在其他實施例中，是採用羊蹄甲或豔紫荊的水萃取物。
依據實施方式本揭示內容，所述羊蹄甲屬植物萃取物是以單一劑量或多劑量經口施用至所述個體(即，2、3或4次劑量)，且施用量為約5-50毫克/公斤/天，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50毫克/公斤/天。在較佳的實施方式中，所述羊蹄甲屬植物萃取物經口施用至個體的量為約10-40毫克/公斤/天，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40毫克/公斤/天。在更佳的實施方式中，所述羊蹄甲屬植物萃取物經口施用至所述個體的量為約15-35毫克/公斤/天，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35毫克/公斤/天。在最佳的實施方式中，所述羊蹄甲屬植物萃取物經口施用至所述個體的量為約20毫克/公斤/天。
可以將本發明羊蹄甲屬植物萃取物製備成口服劑型，例如粉末(powders)、片劑(tablets)、錠劑(caplets)、膠囊(capsules)、溶液(solutions)和/或懸浮液(suspensions)；藉由混合凍乾的羊蹄甲屬植物萃取物和藥學可接受賦形劑 (pharmaceutically acceptable excipients)、粘合劑(binders)、崩解劑(disintegrants)、分散劑(dispersants)、稀釋劑(diluents)、潤滑劑(lubricants)、調味劑(flavoring agents)、和/或著色劑(coloring agents)製備合適的口服劑型。舉例而言，本發明羊蹄甲屬植物萃取物之乾燥顆粒能夠直接壓成藥學上可快速融化的口服劑型，例如，片劑、錠劑，以及混合適當賦形劑的類似物。此外，可利用明膠膠囊包覆本發明羊蹄甲屬植物萃取物的乾燥顆粒。再可任選的實施方式中，本發明羊蹄甲屬植物萃取物可以溶解或懸浮於適當的溶劑中，例如，水、緩衝溶液或酏劑，以產生經口施用的液體或懸浮液。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。
實施例
材料與方法
製備羊蹄甲植物粗萃取物
於旋轉振盪器(150rpm)中，將經空氣乾燥的100克羊蹄甲或豔紫荊莖粉末與95%乙醇以1：10(w/v)的比例混合，於室溫下處理7天以進行萃取可得羊蹄甲的乙醇粗萃物(BVEE)或豔紫荊的乙醇粗萃物(BBEE)。水萃取物則是將上述植物分別與H2O(1：10；w/v)混合，於50℃下處理2小時後而製成。
羊蹄甲(BV)的其他有機溶劑萃取物的製備方法與前述以乙醇進行萃取的步驟類似，是利用有機溶劑，例如，己烷(hexane)、乙醚(ether)和乙酸乙酯(ethyl acetate,EA)來萃取羊蹄甲而得。再將所得的萃出物冷凍乾燥後存放於-20℃中備用。
細胞培養
人類胚胎腎(HEK)細胞株293、衍生自該HEK細胞株293的穩定細胞株(GFP-LC3-HEK and p62-RL-HEK)，以及神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y係培養於最低基礎培養基(minimum essential medium)(其中添加10%(v/v)熱去活化胎 牛血清、50%(v/v)F-12營養混合物和1%(v/v)含盤林西林和鏈黴素的抗生素混合物)。將細胞置於37℃、含5% CO2潮濕大氣環境。將SH-SY5Y細胞接種於96孔盤(密度為1 x 105活細胞/孔)中，供後續分析用。
動物
C57BL/6公鼠係購自國家實驗動物中心(臺北，台灣，中華民國)，並且將其飼養於中央研究院細胞與個體生物學研究所的實驗動物設施中，其中每隻小鼠飼養於獨立通風籠(individually ventilated cage,IVC))，光暗循環為12：12小時，且過程中提供飲水與標準飼料供任食。動物實驗計畫皆通過中央研究院動物實驗管理小組(臺北，台灣，中華民國)核准。
Tau蛋白病變毒性分析
利用由神經元專一性HuC啟動子調控的GFP-hTau融合蛋白來研究野生型人類Tau蛋白對於神經元細胞發展中其誘導細胞死亡的能力(Park等人；2000)。將表現質體注射至斑馬魚的胚胎(單細胞期)。利用螢光顯微鏡在24、48和72hpf時期，觀察綠螢光蛋白標誌的神經元細胞。部分綠螢光蛋白訊號可見於24hpf胚胎之神經元細胞，接著於48hpf胚胎中該訊號分解成小點且減少。然而，仍有其他綠螢光蛋白訊號完整保留在神經元細胞中。在72hpf胚胎中，計算帶有綠螢光蛋白訊號的神經元數量，並將結果分成兩組，即，低於2個神經元(0-2)以及較多的神經元(3-5之間)。
分析神經元突生長活性
測試羊蹄甲乙醇萃取物在斑馬魚胚胎中是否能夠促進神經元突生長。首先，將pHuC-GFP表現質體注射至斑馬魚胚胎(單細胞期)中，在pHuC-GFP表現質體中綠螢光蛋白的表現是藉由神經元專一性HuC啟動子所調控。於注射8小時後，以羊蹄甲乙醇萃取物或DMSO(對照組)處理經注射的胚胎。於處理後40個小時，計算具有顯著神經元突生長的斑馬魚數量。
細胞存活率分析
將HEK或衍生自HEK的穩定細胞株(GFP-LC3-HEK和p62-RL-HEK)(5x 104細胞/100μL/孔)接種至96孔微量盤上每一個孔的培養基(分別含有特定的化合物)內，並於37℃下培養24小時。利用CellTiter 96 AQueous非放射性增殖分析(Promega)並依據製造商手冊所述之步驟測定活細胞。簡而言之，添加3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鹽/吩嗪硫酸甲酯溶液(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt/phenazine methosulfate solution)(20μL/孔)後，將96孔微量盤置於37℃培養3小時。利用螢光/冷光微量盤分析儀(SpectraMax M5,Molecular Devices)於490nm下測定吸光度，以對活細胞中3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鹽轉換成甲臢(formazan)的程度進行定量。細胞培養中的活細胞數量與吸光度(490nm)成正比。以僅含載體(0.1% DMSO，對照組)之培養基內的活細胞數目為100%存活率。
利用活細胞報導基因分析(Cell-based reporter assay)篩選細胞自噬作用調節劑
為了建立可用於分析細胞自噬作用的活細胞p62降解分析平台，需先製備HEK細胞的穩定細胞株p62-RL-HEK，其能表現C-端融合海腎冷光素酶報導蛋白(Renilla luciferase reporter)p62蛋白(p62-RL)。可藉由測量p62-RL-HEK細胞中的海腎冷光素酶所產生的冷光訊號來決定細胞中p62-RL的穩定量。本研究確認冷光訊號的增加是由於抑制細胞自噬作用媒介蛋白p62降解所導致的，而冷光素酶表現量減低則是由自噬-媒介的p62降解減少所致。分別利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)和自噬誘導劑雷帕黴素(rapamycin)評估所述細胞式分析的效果。
為了鑑別含有自噬作用調節劑活性化合物的有效植物萃取物，將p62-RL-HEK細胞(2×105細胞/孔)接種至96-孔微量盤，置於37℃下培養2天，接著以植物萃取物(200微克/毫升)於37℃下處理24小時。添加細胞穿透性海腎冷光 素酶受質(即，腔腸素(coelenterazine)測定冷光素酶訊號(最終濃度為5μM)，接著以VictorLight冷光/螢光盤式分析儀(Perkin Elmer)定量。以僅經載體(0.1% DMSO)處理的p62-RL-HEK所發射的冷光素酶訊號作為100%相對冷光量。分別以3-MA(5μM)或雷帕黴素(200nM)處理的樣本作為陽性對照組。
實驗結果顯示，以3-MA處理的p62-RL-HEK細胞表現的冷光素酶訊號顯著增加，此可作為3-MA抑制自噬作用導致p62堆積的指標。另一方面，以雷帕黴素處理的p62-RL-HEK細胞冷光素酶訊號顯著降低的結果，與雷帕黴素促進自噬作用的活化加速p62降解一致。相較於3-MA或雷帕黴素的結果，羊蹄甲植物萃取物於相對冷光量中能夠產生更大變化，則為有潛力的細胞自噬作用調節劑。
利用GFP-LC3表現細胞株進行細胞自噬作用活性分析
製備經綠螢光蛋白標記LC3表現質體轉染之HEK293細胞，並透過重組GFP-LC3蛋白的持續性表現，確認已得到穩定轉染之細胞株。從表現GFP-LC3之HEK293細胞分離的同源族群中分離單一株細胞，並命名為GFP-LC3-HEK。為了檢驗細胞自噬作用，將GFP-LC3-HEK細胞接種至6-孔微量盤，並以多種不同濃度的羊蹄甲乙醇萃取物處理24小時。分別以3-MA(5μM)和雷帕黴素(200nM)作為陽性對照組。從經羊蹄甲乙醇萃取物處理的細胞得到的澄清細胞溶解產物以SDS-PAGE和西方墨點法且利用抗p62、抗LC3和抗GAPDH抗體進行分析。
腦啡肽酶活性分析
將SH-SY5Y細胞培養於100公釐培養皿，當細胞長滿(confluence)時，再接種至12孔盤(1毫升；細胞密度1×106細胞/毫升)。於分盤1天後，以含有所述萃出物的新鮮DMEM/F-12(含10% FBS)(濃度為0.25至30微克/毫升)培養基或未含有所述萃出物的新鮮DMEM/F-12(含10% FBS)培養基進行替換，並培養24小時；其後再將培養基置換為含4μM qf-Aβ(1-7)C之200毫升分析緩衝液(含5.5mM D-glucose、0.3mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、25mM碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)和1.5μM硫酸鋅(zinc sulfate)之PBS)(200毫升)，並培養1.5小時。為了測量Aβ-降解活性，取150μL分析緩衝液以SpectraMax Gemini EM(Molecular Devices，USA)測量螢光強度(激發：346nm和發射：442nm)。
腦內Aβ42注射之AD小鼠模型
為了產生急性A β 42誘導的AD小鼠，以腹腔注射巴比妥鈉(sodium pentobarbital)(40毫克/公斤)將8週齡C57BL/6公鼠麻醉，接著以連接有微注射器(Hamilton)的26號針注射Aβ42凝聚蛋白至其背側海馬迴(dorsal hippocampus))。立體定位手術的座標如下：前囟後2公釐、雙邊至中線2.1公釐和腹側至頭骨表面1.8公釐。注射體積為1μL之Aβ42凝聚蛋白或1μL PBS。接受外科手術後的小鼠恢復期為7天。此處所用的Aβ42凝聚蛋白製備方法如下：將可溶性Aβ42溶於0.01M PBS(pH 7.4)中以得到10mM Aβ42溶液，再將所述溶液於37℃下培養3天，以使Aβ42凝聚，並存放於-70℃備用。
Aβ注射小鼠模型之認知功能測量
利用Morris水迷宮(Morris water maze)試驗評估經Aβ42凝聚蛋白注射之AD小鼠的認知功能。簡言之，每日經由口服給藥途徑，給予所述注射有Aβ42凝聚蛋白的AD小鼠載體(0.1% DMSO)或羊蹄甲乙醇萃取物(250毫克/公斤)，持續施用2個月。C57BL/6公鼠分別接受假手術(sham operation)或腦內注射PBS，以及僅餵食載體之C57BL/6公鼠(作為未處理對照組)。完成給藥方案後，將小鼠從4個不同象限中放入至水迷宮內，藉由每隻動物尋找到隱藏平台的平均延遲時間，來評估每隻小鼠的空間記憶。所述認知功能試驗是在一天當中光循環的最後的4小時內，於干擾最小的密閉環境中執行。連續進行所述空間尋獲試驗(spatial acquisition trial)5天。
免疫組織化學(Immunohistochemical,IHC)分析
為了驗證羊蹄甲乙醇萃取物抗阿茲海默症的功效不會引起顯著的神經毒性，利用免疫組織化學，測定經處理的動物和對照組動物腦內，細胞自噬作用活化表現型之變化。動物於犧牲後，以4%三聚甲醛(溶於0.1M磷酸鹽 緩衝液)(pH 7.4)灌注動物。以水平方向對腦組織進行冷凍切片，每個切片厚度為15微米(μm)，並將其固定於披覆明膠的載玻片上，接著以阻斷滲透液(blocking-permeabilizing)(5%驢血清和0.25% Triton X-100)培養1-3小時。以抗p62抗體觀察動物體內羊蹄甲乙醇萃取物誘導的細胞自噬作用活化。以雷射共軛焦顯微鏡(Leica TCS-SP5-MP)觀察螢光訊號。
利用AD雙基因轉殖鼠進行動物實驗
所有的實驗步驟皆通過中央研究院動物實驗管理小組(臺北，台灣，中華民國)核准。利用APP/PS1基因轉殖鼠(B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax)和非基因轉殖的同窩(littermate)小鼠作為對照組進行以下試驗。於國家實驗動物中心中，將APP/PS1小鼠與野生型(WT)的C57BL/6J小鼠回交，以穩定其遺傳背景。以Genomic DNATM Tissue MiniPrep套組(Zymo Research Corp.)分離APP/PS1小鼠和野生型小鼠的基因體DNA。以聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增人類APPswe和PSEN1dE9基因。用於擴增APPswe的引子為5’-AGGACTGACCACTCGACCAG-3’(序列編號：1)和5’-CGGGGGTCTAGTTCTGCAT-3’(序列編號：2)，且用於擴增PSEN1dE9的引子為5’-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3’(序列編號：3)和5’-GCCATGAGGCACTAATCAT-3’(序列編號：4)。利用SYBR® Safe DNA Gel Stain(Invitrogen)以1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增的DNA片段。將凍乾的羊蹄甲乙醇萃取物粉末(來自於工業技術研究院)溶於N-甲基-2-吡咯烷酮(N-Methyl-2-pyrrolidone,NMP)作為10倍羊蹄甲乙醇萃取物儲存液(200毫克/毫升)，此溶液二每週製備一次，並存放於4℃，使用前需稀釋。於灌胃施用(gavage administration)前，以欲混合的kolliphor/食鹽水溶液(1：3.5,v/v)將10倍羊蹄甲乙醇萃取物儲存液稀釋10倍。以灌胃施用方式，施用羊蹄甲乙醇萃取物或食鹽水至所述APP/PS1小鼠(250毫克/公斤/天)，每週施用六天。每月依據動物的體重調整施用劑量並記錄之。
利用Morris水迷宮評估長期施用羊蹄甲乙醇萃取物之APP/PS1小鼠的認知能力
對11月齡的小鼠進行Morris水迷宮試驗。所述Morris水迷宮由三個構件組成：水槽(直徑：100公分；高度：35公分)、透明圓形平台(直徑：10公分)以及TopScanLite追蹤系統(CleverSys Inc)。將黑色三角形、紅色正方形、藍色圓形和綠色星形物體分別置於水槽的北邊、西邊、東邊和南邊作為可視線索。將水和牛奶加到水槽中，因此，藏匿於水面下兩公分的透明平台是看不見的。將水面下的平台置於水槽的象限3中，且空間尋獲試驗的過程中置於相同位置。所述Morris水迷宮試驗是由二試驗階段組成：空間尋獲試驗(第1天至第5天，每天四次)以及探索試驗(第6天)。
依照先前研究所述，每次試驗的起始位置是以半隨機的方式選擇(Vorhees CV and Williams MT(2006)Nat Protoc 1(2)：848-858)。將小鼠輕放於起始位置，讓小鼠於90秒尋找隱藏的平台。當小鼠於90秒內到達平台並停留在平台上達30秒時，記錄到達平台之時間為脫逃時間。當小鼠無法在90秒內找到平台時，藉由額外置放橘色旗30秒，將小鼠導引至平台上。當小鼠於該段期間內找到平台時，讓其停留於平台上30秒，當小鼠仍無法尋找到平台時，則直接將小鼠置放於平台上並停留30秒。當結束所述試驗，將小鼠置於籠內休息15分鐘後，再進行下一次的試驗。在認知試驗過程中，可利用吹風機和衛生紙讓小鼠保持溫暖，避免出現低溫。於空間獲取試驗最後一天後的24小時，從水槽中移除平台以進行探索試驗。給予每隻小鼠60秒的試驗時間，且記錄在原來隱藏平板區域的停留時間評估小鼠空間記憶。
ELISA
於Morris水迷宮試驗後，犧牲每組中5至7隻小鼠，並採集小鼠海馬迴和大腦皮質，分裝且存放於-80℃下供ELISA分析使用。採集到的腦組織以400μL的TBS緩衝液(50mM Tris、2mM EDTA、150mM NaCl、蛋白酶抑制劑混合物(Sigma P8340)，pH 7.4)利用1毫升Duall組織研磨機和PTFE杵進行均質化， 接著於4℃下離心(轉速：15000rpm(20000×g))20分鐘。收集不溶沈澱物部分，將其再次懸浮於70%甲酸(formic acid)(400微升(μL))中，以超音波震盪1分鐘再於4℃下離心(轉速：15000rpm(20000×g))20分鐘。以20倍體積的中性緩衝液(1M Tris,500mM Na2HPO4)平衡上清液，分裝並收集為「不可溶Aβ部分」。
利用市售人類Aβ40(KHB3482，Invitrogen)和Aβ42(KHB3442，Invitrogen)ELISA套組定量海馬迴和大腦皮質中，不可溶人類Aβ40和Aβ42。依據製造商提供的使用手冊，偵測Aβ40和Aβ42。利用Bradford方法定量不可溶Aβ部分的總蛋白濃度。分別以1：500和1：1,000的比例稀釋所述不可溶Aβ部分，以偵測Aβ40和Aβ42。將經稀釋的不可溶Aβ部分和初級偵測抗體添加至測試孔中，於室溫下進行震盪並培養3小時。清洗後，添加接合辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)的二級抗體，並於室溫下溫和攪拌30分鐘。添加適當安定色原溶液(Stabilized chromogen solution)後，分別置放30分鐘和15分鐘，以偵測Aβ40和Aβ42。之後加入終止溶液結束反應，並立即於450nm下偵測吸光值。
硫代黃素S染色
於Morris水迷宮試驗後，利用頸椎脫位法(cervical dislocation)犧牲每組中3隻小鼠。以PBS緩衝液(136.89mM NaCl、2.68mM KCl、1.62mM KH2PO4和10.14mM Na2HPO4，pH 7.4)和4%多聚甲醛(PFA)/PBS灌注3隻小鼠。經灌注的小鼠腦組織再以4% PFA/PBS固定，置於室溫下溫和搖晃24小時。於固定後，腦組織以PBS緩衝液清洗，且置於70%乙醇/水溶液中備用，供石蠟包埋使用。
利用微電腦全自動病理真空組織脫水機(semi-enclosed benchtop tissue processor(Leica TP1020))，將經PFA固定的腦組織脫水。利用Leica EG1150 H製備含脫水腦組織樣本的石蠟塊。於旋轉切片機(Leica RM2235)上進行切片，得到3μm厚的冠狀切片。以筆刷採集二腦組織切片，並將其放置在水浴中，再將其置於乾淨的載玻片上，並置於34℃進行加熱數小時。
石蠟切片依序以二甲苯(xylene)、無水酒精、95%乙醇、70%乙醇汗水去除石蠟和進行脫水。於室溫下，以1%(w/v)硫代黃素S(thioflavin S)溶液避光處理10分鐘。以80%乙醇和水清洗玻片，移除多餘的螢光色素，以供觀察。採用能評估綠色螢光的螢光顯微鏡，觀察硫代黃素S陽性訊號，並且以ImageJ軟體分析斑塊數量、斑塊區域和斑塊尺寸。
肝腎毒性測試
於實驗動物安樂死前，經由眼竇採集血液樣本。採集到的血液樣本至於冰上至少1小時，接著離心(1500×g)10分鐘(4℃)。收集血清樣本，分裝並冷凍於-30℃。利用Fuji Dri-chem 4000i分析儀(Taiwan Mouse Clinic)分析血清天門冬胺酸轉胺酶(aspartate transaminase,AST)、丙胺酸轉胺酶(alkaline phosphatase,ALT)、鹼性磷酸酶(alanine transaminase,ALP)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酸酐(creatinine,CRE)。
實施例1 羊蹄甲萃取物降低Tau蛋白病誘導的毒性
在此實施例中，監控斑馬魚胚胎中的GFP-hTau融合蛋白表現量，以評估利用「材料與方法」所述步驟製備出的羊蹄甲乙醇萃取物(BVEE)之影響。pHuc-hTau-GFP表現質體是在斑馬魚胚胎單細胞期時注射，接著，藉由共同表現的綠螢光蛋白訊號監控Tau蛋白的表現。利用螢光顯微鏡於24、48和72hpf觀察綠螢光蛋白標記的神經元細胞。計算72hpf胚胎中的綠螢光蛋白訊號並將其分為二組，分別為小於2神經元(0-2)，以及更多神經元(3-5)。結果示於第1圖。
未經羊蹄甲乙醇萃取物處理組中，77%的胚胎具有0-2神經元，且僅有23%胚胎的有較多神經元(3-5)。相反地，經羊蹄甲乙醇萃取物處理，能降低Tau蛋白誘導的毒性，於斑馬魚胚胎中觀察到神經元的表現量增加至43%(第1圖圖框(B))。
實施例2 羊蹄甲萃取物可促進神經元突生長
與實施例1大致相同，於單細胞期斑馬魚胚胎中注射pHuC-hTau-GFP表現質體，接著羊蹄甲植物萃取物或DMSO(對照組)處理，藉由 計算有綠螢光蛋白表現的神經元生長數量，評估羊蹄甲乙醇萃取物是否能夠促進神經元突生長。結果示於第2圖。
如數據所述，HuC啟動子調控的綠螢光蛋白表現於48hpf斑馬魚胚胎的三叉神經節和中間神經元的神經元突(第2圖，圖框(A))。以DMSO處理的斑馬魚胚胎，其神經元突生長的百分比為25%(第2圖，圖框(B))。相對地，以羊蹄甲植物萃取物處理誘導神經元突生長的效果顯著，其中斑馬魚胚胎神經元突生長的百分比高達57%(第2圖，(B))。
實施例3 羊蹄甲乙醇萃取物對於細胞自噬作用活化的影響
在此實施例中，藉由監控有或無羊蹄甲乙醇萃取物處理的細胞中，LC3-I至LC3-II基因轉換和細胞中p62表現量，來檢測羊蹄甲乙醇萃取物誘導細胞自噬作用的能力。結果示於第3圖。
在第3圖，A部分是以西方墨點分析LC3-I、LC3-II和p62的表現量。數據顯示，經羊蹄甲乙醇萃取物處理的細胞中LC3-II量顯著上升，且p62量顯著下降。所述結果和自噬作用活性之細胞冷光素酶報導蛋白分析的結果一致，以羊蹄甲乙醇萃取物處理會導致p62量大幅下降(第3圖，(B))。結果顯示本揭示內容的羊蹄甲乙醇萃取物含可活化細胞自噬作用的活性成分。
實施例4 羊蹄甲乙醇萃取物對於腦啡肽酶(NEP)活性的影響
在此實施例中，藉由監控胜肽基質(peptide substrate)(即，qf-Aβ(1-7)C胜肽)被細胞表面腦啡肽酶切斷後所放出的螢光強度，來評估羊蹄甲乙醇萃取物對於腦啡肽酶活性的影響，其中螢光團(fluorophore)和淬滅劑分別連結至胜肽的C端和N端。淬滅劑存在時能夠淬滅螢光。當qf-Aβ(1-7)C被腦啡肽酶切開，使得淬滅劑和螢光團被分離，螢光團中發出強烈的螢光。腦啡肽酶是第二型膜蛋白，當細胞膜(如，SH-SY5Y或N2a細胞)含大量的腦啡肽酶，更多的qf-Aβ(1-7)C胜肽會被切斷，導致高強度的螢光產生。結果示於第4圖。
如第4圖的結果所示，腦啡肽酶明顯和羊蹄甲乙醇萃取物濃度間有劑量依賴性，當羊蹄甲乙醇萃取物的濃度上升時，腦啡肽酶活性隨著增加，結果顯示，以羊蹄甲植物萃取物處理，能夠促進腦啡肽酶而清除Aβ。
實施例5羊蹄甲乙醇萃取物不會產生任何顯著的細胞毒性
在此實施例中，藉由細胞存活率來評估本揭示內容製備的羊蹄甲乙醇萃取物的毒性。結果示於第5圖。
如第5圖所示，相較於對照組細胞，無論是以低濃度(50微克/毫升)或高濃度(100微克/毫升)羊蹄甲乙醇萃取物處理的細胞，皆能保留相當比例的存活細胞。結果顯示，本揭示內容羊蹄甲乙醇萃取物對於p62-RL-HEK細胞不會產生任何毒性，因此，基於其安全性，羊蹄甲乙醇萃取物能夠作為食品添加物使用。
實施例6 於腦內Aβ42注射AD小鼠動物模型中經羊蹄甲乙醇萃取物處理能夠改善認知功能
在此實施例中，以依據「材料與方法」所述之急性Aβ42誘導AD小鼠動物模型，來評估本揭示內容對於認知功能改善的影響。結果示於第6圖和第7圖。
如第6圖所示，相較於假手術組實驗動物，經過羊蹄甲乙醇萃取物處理的Aβ注射AD小鼠，其認知功能明顯獲得改善，僅以載體處理的小鼠，則具有嚴重的認知功能缺損。以羊蹄甲乙醇萃取物處理的小鼠，其海馬迴中細胞自噬作用的誘導顯著增加，與p62的表現量顯著降低的結果一致(第7圖)。
綜上所述，實驗結果顯示，本揭示內容之羊蹄甲乙醇萃取物含有能夠活化細胞自噬作用的活性成分，其能夠抑制Aβ42誘發的神經毒性，和改善試驗動物的空間學習和記憶。
實施例7羊蹄甲乙醇萃取物對於AD雙基因轉殖鼠的影響
在此實施例中，以依據「材料和方法」所述之Morris水迷宮評估羊蹄甲乙醇萃取物對於試驗動物(即，APP/PS1小鼠)的空間和參考性記憶的影響。結果示於第8圖。
於試驗第一天(第1天，第8圖)，同時接受食鹽水和羊蹄甲乙醇萃取物治療的APP/PS1小鼠與野生型同窩小鼠，在到達隱藏平台的逃脫延遲時間之表現非常類似，表示本組小鼠於羊蹄甲乙醇萃取物治療後，具有相近的學習能力且無特定象限偏好。相反地，僅以食鹽水處理的APP/PS1小鼠的表現較差，其到達隱藏平台上所需的逃脫延遲時間較長；在試驗的第一天，此組別中75%的小鼠(12隻小鼠中有9隻)無法到達隱藏平台。於連續訓練五天後，某些食鹽水處理的APP/PS1小鼠能夠在90秒的時間限制內到達平台，但其逃脫延遲時間保持在約60秒。另一方面，野生型小鼠終生不會發展阿茲海默症症狀，這些小鼠學習快速，在試驗第一天，第二次試驗後即可到達至平台上(16隻小鼠中有12隻)。在試驗第二天後，相較於食鹽水處理的APP/PS1小鼠，野生型小鼠的逃脫延遲時間顯著降低。再者，94%之野生型小鼠(16隻小鼠中有15隻)在空間尋獲試驗後，能夠在33秒內到達平台。於連續訓練5天後，相較於食鹽水處理組，施用羊蹄甲乙醇萃取物的小鼠能夠顯著改善認知功能(P<0.01)，小鼠的逃脫延遲時間(即，羊蹄甲乙醇萃取物處理的APP/PS1小鼠)在第二天和第三天顯著降低50%。雖然在第四天延遲時間增加，但其仍低於食鹽水處理的APP/PS1小鼠結果。在第5天，經羊蹄甲乙醇萃取物處理的小鼠和野生型小鼠的逃脫延遲時間相似，皆明顯低於經食鹽水處理的APP/PS1小鼠。在結束空間獲取試驗五天後，進行一天探索試驗，其用來評估實驗動物是否學習到尋獲平台位置，結果示於第8圖的圖框(B)。空間獲取試驗呈現類似的結果，在探索試驗中經食鹽水處理的小鼠的出現認知功能缺陷(約50秒)。相反地，經羊蹄甲乙醇萃取物處理的小鼠展現與野生型同窩小鼠類似的認知能力。
於認知試驗結束後，在實驗動物11月齡時將其犧牲，再以ELISA定量海馬迴和大腦皮質中，不可溶人類Aβ40和Aβ42的量。結果示於第9圖之圖 框(A)中。相較於野生型小鼠，經食鹽水處理的APP/PS1小鼠的海馬迴和大腦皮質中發現大量的Aβ40和Aβ42斑塊。在施用羊蹄甲乙醇萃取物後8個月，經羊蹄甲乙醇萃取物處理的小鼠的海馬迴中，β類澱粉堆積減少(Aβ40減少25%和Aβ42減少21%)。另一方面，在大腦皮質中不可溶Aβ40和Aβ42堆積則更顯著的減少，分別減少46%和33%(P<0.01)。硫代黃素S(ThS)染色定量分析也呈現一致的結果，在皮質中類澱粉斑塊顯著降低，且在海馬迴中斑塊數量顯著減少(第9圖圖框(B)和(C))。
實施例8 羊蹄甲乙醇萃取物對於肝臟或腎臟功能的影響
在此實施例中，藉由監控肝臟和腎臟功能來評估羊蹄甲乙醇萃取物對於試驗動物的長期影響(即，8個月)。藉由測量多種代謝性酵素的血清含量，例如，血清天門冬胺酸轉胺酶(AST)、丙胺酸轉胺酶(ALT)、鹼性磷酸酶(ALP)、血尿素氮(BUN)和肌酸酐(CRE)，來評估肝功能。結果示於第10圖。
如第10圖的數據顯示，經過羊蹄甲乙醇萃取物處理，對於ALT、BUN和CRE的量沒有顯著影響。然而，相較於經食鹽水處理的對照組實驗動物而言，經羊蹄甲乙醇萃取物處理的動物AST的量明顯較高，而ALP的量明顯較低。但在所有經羊蹄甲乙醇萃取物處理的動物中，並沒有表現病理徵狀。因此，長期口服施用羊蹄甲乙醇萃取物至少達8個月，並不會影響試驗動物的肝臟和/或腎臟功能。
實施例9 比較本發明萃取物對於腦啡肽酶活性和誘導細胞自噬作用的影響
在此實施例中，測定本發明豔紫荊(Bauhinia blakeana Dunn.)萃取物對於腦啡肽酶活性的影響。依照「材料和方法」所示步驟製備萃取物，其中以95%乙醇、40%乙醇或熱水作為溶劑萃取豔紫荊莖粉末。結果示於第11圖。
如第11圖所示，相較於對照組，以95%乙醇(BBEE)、40%乙醇(BB40EE)或熱水(BBWE)萃取的豔紫荊萃取物，能夠增加腦啡肽酶活性。
實施例10 本發明以不同種溶劑形式製備而成的萃取物對於誘導細胞自噬作用的影響
在此實施例中，測定本發明羊蹄甲萃取物在p62-RL-HEK細胞中，對於誘導自噬作用的影響，其中所述萃取物分別利用以下溶劑製備而得：己烷(hexane)、乙醚(ether)或乙酸乙酯(ethyl acetate,EA)。依據「材料和方法」所述之步驟製備本發明羊蹄甲萃取物。結果示於第12圖。
數據顯示，所有試劑皆能夠從羊蹄甲中成功萃取出可誘導自噬作用的成分，且以有機溶劑(如，己烷、乙醚和乙酸乙酯)來分離可誘導細胞自噬作用的成分，效果較佳(第12圖)。上述結果顯示，以乙醇萃取步驟能夠有效分離羊蹄甲的活性成分，有助於製備羊蹄甲乙醇萃取物作為食品添加物的配方。
<110> 中央研究院 財團法人工業技術研究院
<120> 羊蹄甲屬萃取物及其用途
<130> P2892-TW
<150> US62251638
<151> 2015-11-05
<160> 4
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APPswe合成引子
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APPswe合成引子
<400> 2
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PSEN1dE9合成引子
<400> 3
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PSEN1dE9合成引子
<400> 4

Claims (5)

  1. 一種利用羊蹄甲(Bauhinia variegata)或豔紫荊(Bauhinia x blakeana.)莖部萃取物製備醫藥品的用途，其中該醫藥品用以促進一個體之神經元突生長和清除或減少類澱粉聚集，且該羊蹄甲或豔紫荊莖部萃取物是一水萃取物或一乙醇萃取物，而該羊蹄甲或豔紫荊莖部乙醇萃取物是以1：5(w/v)至1：20(w/v)的比例混合羊蹄甲或豔紫荊莖粉末和95%乙醇(vol%)，並且在約15-35℃下處理1-10天所製得，以及該羊蹄甲或豔紫荊莖部水萃取物是以1：5(w/v)至1：20(w/v)的比例混合羊蹄甲或豔紫荊莖粉末和水，並且在約30-100℃下處理0.5-5小時所製得。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該羊蹄甲或豔紫荊莖部萃取物的口服劑量為約5-50毫克/公斤。
  3. 如請求項2所述之用途，其中該羊蹄甲或豔紫荊莖部萃取物的口服劑量為約20毫克/公斤。
  4. 如請求項1所述之用途，其中該羊蹄甲或豔紫荊莖部水萃取物是以1：10(w/v)至1：20(w/v)的比例混合羊蹄甲或豔紫荊莖粉末和水，並且在約50℃下處理2小時所製得。
  5. 如請求項1所述之用途，其中該羊蹄甲或豔紫荊莖部乙醇萃取物是以1：10(w/v)的比例混合羊蹄甲或豔紫荊莖粉末和95%乙醇(vol%)，在約25℃下處理7天所製得。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102138251B1 (ko) * 2016-09-21 2020-07-29 한국한의학연구원 바우히니아 추출물을 포함하는 인지기능 장애의 예방 또는 치료용 조성물
WO2019087207A2 (en) * 2017-10-31 2019-05-09 Muniyal Ayurvedic Research Centre Herbal composition for the treatment and management of thyroid dysfunction and method of preparation thereof
CN108504711B (zh) * 2018-04-08 2021-09-10 山东鲁北药业有限公司 蹄甲多肽的制备方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003011311A1 (en) 2001-07-27 2003-02-13 Merck Patent Gmbh Bauhinia extracts
US20090169585A1 (en) 2003-10-23 2009-07-02 Resveratrol Partners, Llc Resveratrol-Containing Compositions And Their Use In Modulating Gene Product Concentration Or Activity
BRPI0903215A2 (pt) 2009-08-05 2011-04-19 Vosgerau Jose Carlos Barbosa nova modalidade de uso terapêutico do composto bauhinia sp e psidium sp aplicada na influenza
US20140134283A1 (en) 2012-11-15 2014-05-15 USPlabs. LLC Compositions and Methods for Affecting Mental State and Body Composition
CN104857079A (zh) 2015-05-27 2015-08-26 李凤鹏 一种治疗非痴呆型血管性认知功能障碍的中药制剂
CN104921119A (zh) * 2015-06-06 2015-09-23 临沧市天源生物科技开发有限责任公司 一种辣木、羊蹄甲超微粉含片

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Archives of Medicine and Health Sciences /Jan-Jun 2014 /Vol2 /Issue 1,p.29-35 *
Archives of Medicine and Health Sciences /Jan-Jun 2014 /Vol2 /Issue 1,p.29-35。

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