KR20200103647A - 리포칼린형 프로스타글란딘 d2 합성 효소 산생 촉진제 - Google Patents

리포칼린형 프로스타글란딘 d2 합성 효소 산생 촉진제 Download PDF

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타카유키 나카고미
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가꼬우호우징 효고 이카다이가쿠
니폰 조키 세야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명의 목적은 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소(L-PGDS) 산생 촉진제, 보다 구체적으로는 페리사이트 또는 페리사이트로부터 탈분화한 허혈 유도성 다능성 간세포(iSC)에 있어서의 L-PGDS 산생 촉진제를 제공하는 것에 있다. 본 발명에 있어서 L-PGDS 산생 촉진 작용을 갖는 물질이 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물에 함유되는 것이 확인되었다. L-PGDS 산생 촉진제는 L-PGDS 발현 촉진에 의한 효과가 기대되는 질환, 즉 뇌경색 등의 뇌혈관 장해, 알츠하이머병 등의 인지증 또는 수면 장해의 예방·치료 또는 재발 예방약 등으로서 유용성이 높은 것이다.

Description

리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제
본 발명은 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소(이하, 「L-PGDS」라고 표기하는 경우가 있다. 또한, 「리포칼린형 프로스타글란딘 D 합성 효소」라고 칭하는 경우도 본 발명에 포함될 수 있다)의 산생 촉진제 등에 관한 것이다.
프로스타글란딘 D2 합성 효소(PGDS)에는 중추 신경계, 웅성 생식기, 심장 등에 분포하는 리포칼린형 (L-)PGDS와, 비만 세포나 Th2 세포에 분포하는 조혈기형 (H-)PGDS의 2종류가 있는 것이 알려져 있다. L-PGDS는 프로스타글란딘 생합성의 공통 중간체인 프로스타글란딘 H2(PGH2)로부터 프로스타글란딘 D2(PGD2)로의 이성화 반응을 촉매하는 활성을 갖는다. 반면, L-PGDS는 구조상은 지용성 물질의 캐리어로서 기능하는 리포칼린 패밀리에 속해 있다. 따라서, L-PGDS는 PGD2 생합성 효소와 지용성 캐리어의 양면성을 갖는 다기능 단백이다.
중추 신경계에 분포하는 L-PGDS는 뇌척수액에도 검출되며, 다른 리포칼린과 비교해서 거대한 친유성 포켓을 갖기 때문에 뇌 내의 여러 가지 지용성 분자의 수송 단백질 및 스캐빈저로서의 역할을 담당하고 있다고 생각되어 있다. 그와 같은 L-PGDS의 리포칼린으로서의 기능의 예로서는 지주막하 출혈 후에 뇌 내 L-PGDS가 상승하여 신경 독성의 원인이 되는 빌리루빈을 포합함으로써 신경 독성을 회피시키는 것(Inui T. et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 34, 1558-1567, 2014)이나, L-PGDS가 알츠하이머병의 환자나 동물 모델에 있어서 아밀로이드β 단백질(Aβ, 노인반)의 올리고머 형성에 필요한 영역에 강고하게 결합하여 뇌척수액 중에서의 Aβ 응집 형성과 세포 상해성을 저해하는 것(Kanekiyo T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 6412-6417, 2007) 등을 들 수 있다.
또한, 마우스의 허혈뇌에 있어서 PGD2의 산생이 현저히 증가하여 L-PGDS 및 H-PGDS 또는 PGD2 수용체 DP1의 녹아웃에 의해 허혈 후의 뇌부종 발증이 중증화된다는 보고(Tanigichi H. et al., J. Neurosci. 27, 4303-4312, 2007)나, L-PGDS의 녹아웃에 의해 뇌경색소나 뇌부종이 증대된다는 보고(Saleem S. et al., Neuroscience 160, 248-254, 2009)가 있다. 이 점에서 뇌허혈 시에 있어서 L-PGDS나 H-PGDS에 의해 산생되는 PGD2는 그 수용체를 통한 작용에 의해 뇌 보호적으로 작용한다고 생각되어 있다.
또한, 갈락토실세라미다아제 결손에 의한 탈수성(脫髓性) 질환 크라베병의 모델 마우스(Twitcher 마우스)에서는 탈수에 저항성을 나타내는 축삭 영역에서 L-PGDS 유전자 발현의 상승이 관찰되고, L-PGDS의 결손을 더 도입하면 올리고덴드로사이트의 소실에 의한 탈수의 중증화가 일어나는 것이 보고되어 있다(Taniike M. et al., J. Neurosci. 22, 4885-4896, 2002). 또한, L-PGDS 결손 마우스에서는 말초 신경의 탈수가 유도된다고 보고되어 있으며, 슈반 세포의 PGD2 수용체인 Gpr44가 신경 수초화에 필요하다는 것이 발견되어 있다(Trimarco A. et al., Nature Neurosci. 17, 1682-1992, 2014). 이들 지견으로부터 올리고덴드로사이트(중추 신경)나 슈반 세포(말초 신경)에 있어서의 신경 축삭 수초화와 그 유지에 L-PGDS 및 그 산물인 PGD2가 필요하다고 생각되어 있다.
또한, L-PGDS에 의한 보호 작용에 대해서는 신경 세포에 한정되지 않고, 과산화 스트레스에 의한 소화관 글리아 세포의 세포사를 PGD2의 대사 산물인 15-데옥시-프로스타글란딘 J2가 회피시키는 것도 보고되어 있다(Abdo H. et al., J. Physiol. 590, 2739-2750, 2012).
또한, L-PGDS에 의해 합성되는 뇌 내 PGD2는 수면 조절 작용을 갖는 것이 이전부터 알려져 있다(Ueno R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 109, 576-582, 1982). 그 메커니즘에 대해서는 일본의 연구자에 의해 상세하게 검토된 결과, PGD2가 안저부 지주막 DP1 수용체를 통해 아데노신을 분비함으로써 수면 중추를 자극하는 것에 의한 것으로 되어 있다. L-PGDS는 효소 산물인 PGD2에 대해서 높은 친화성을 갖는 점에서 뇌척수액 중에서의 PGD2의 안정성을 확보함과 아울러, PGD2를 근방의 수용체로 수송한다고 추정되어 있으며(Urade Y. and Hayaishi O., Biochim. Biophys. Acta 1482, 259-271, 2000), PGD2를 통한 수면 조절에 크게 관여한다고 생각된다.
상술한 바와 같이 L-PGDS는 PGD2를 합성하는 효소 단백질로서 작용함과 아울러, 뇌 내의 여러 가지 소수성 저분자의 결합·수송 및 스캐빈저로서의 역할을 담당하고, 뇌 내 환경 조정·뇌 보호 기능이나 수면 조절 기능 등의 여러 가지 기능을 갖는 단백질이라고 생각되어 있다. 따라서, L-PGDS의 산생을 촉진하는 것은 이들 기능을 효과적으로 작용시키는 것이 되며, L-PGDS가 관련되는 질환의 예방·치료 등에 유용하다고 생각된다. 그러나 지금까지 생체 내에 있어서 L-PGDS의 산생을 촉진하는 물질의 보고는 이루어져 있지 않다.
본 발명에 있어서 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물(본 추출물)이 우수한 L-PGDS 산생 촉진 작용을 갖는 것이 확인되었지만 본 추출물 또는 이것을 함유하는 제제에 대해서는 매우 다기하게 미치는 작용·효과가 알려져 있다. 예를 들면, 본 추출물의 뇌에 대한 작용·효과로서 뇌경색 등의 허혈성 질환에 대한 치료 효과(일본 특허공개 2000-16942호 공보)나 BDNF 등의 신경 영양 인자의 산생 촉진 작용(국제 공개 WO 2011/162317호 공보)이 알려져 있지만 본 추출물이 L-PGDS의 산생 촉진 작용을 갖는 것은 지금까지 알려져 있지 않다.
본 발명은 뇌 보호 작용, 수면 작용 등을 갖는 L-PGDS의 산생을 촉진하는 물질 및 L-PGDS 산생 촉진 작용을 지표로 하는 뇌 보호 작용, 수면 작용 등을 갖는 약제의 스크리닝계 등을 제공하는 것이다. 또한, 상기 물질을 유효 성분으로서 함유하고, 뇌경색 등의 뇌혈관 장해, 알츠하이머병 등의 인지증, 불면증 등의 L-PGDS가 관여하는 질환의 예방·치료 또는 재발 예방에 있어서 유효하며, 또한 안전성이 높은 의약을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명에 의한 L-PGDS 산생 촉진제는 뇌혈관 장해 시 등에 있어서의 뇌의 허혈 장해, 신경 세포 상해 등을 억제, 완화하는 작용을 갖는 것이다. 또한, 본 발명에 있어서 사용되는 「치료」에는 「경감」, 「개선」, 「진행 억제」 등의 의미가 포함된다. 또한, 수면 작용을 갖는 약제를 본 발명에서는 「수면약」이라고 표기하는 경우가 있지만 「면제」, 「수면 개선약」, 「수면 도입제」, 「최면약」이라고 칭하는 것도 본 발명에 포함될 수 있다.
본 발명자들은 마우스 뇌경색 모델(중대뇌동맥 영구 폐색 모델)을 사용한 검토로부터 혈류의 차단에 의해 성숙 신경 세포가 사멸하고 있는 경색 영역 내에 있어서 신경 세포, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트 등의 신경계 세포를 포함하여 이들 이외의 여러 가지 세포에도 분화할 수 있는 간세포를 발견하고, 허혈 유도성 다능성 간세포(ischemia-induced multipotent stem cells, iSCs)라고 명명했다. iSC에 강발현하는 신경 간세포 마커 네스틴은 조직 화학적으로는 뇌 연막으로부터 대뇌피질에 도달하는 혈관 주위에 분포하는 것, 또한 iSC는 PDGFRβ(혈소판 유래 증식 인자 수용체β)나 NG2(neuron-glial antigen 2)라는 혈관 주피 세포(페리사이트) 마커를 발현하는 것 등으로부터 iSC의 유래는 혈관 주위에 분포하는 페리사이트라고 생각되어 있다. 페리사이트는 신경 세포나 아스트로사이트, 혈관 내피 세포와 함께 뇌의 기능적, 기질적인 기본 단위인 신경 혈관 단위(neurovascular unit, NVU)를 구성하고, 혈액 뇌관문의 형성·유지나 신경 기능의 조절, 뇌 내 배출계(glymphatic system)로의 관여 등의 중요한 역할을 담당하고 있다고 생각되어 있다. iSC는 허혈 등의 뇌 상해 시에 페리사이트가 리프로그래밍됨으로써 발생하며, 혈관 내피 세포 등이 형성하는 미소 환경에 의해 신경 세포로 분화되는 것이 나타내어져 있다. 이들의 점에서 iSC는 뇌졸중 후의 혈류 재건 후의 신경 수복에 있어서 주요한 역할을 담당하는 간세포라고 생각되어 있다.
본 발명자들은 iSC를 사용한 연구의 일환으로서 백시니아 바이러스 접종 가토 염증 피부 추출물(본 추출물)의 iSC에 대한 작용의 검토를 행했다. 그리고 iSC에 본 추출물을 첨가해서 배양한 후 약 2만 8천 유전자의 DNA칩에 의한 망라적 유전자 발현 해석을 행한 결과, 본 추출물이 L-PGDS를 코드하는 유전자 PTGDS를 선택적으로 발현 촉진하는 작용을 갖는 것을 발견했다. 또한, 단백질 레벨에 있어서도 본 추출물은 L-PGDS의 산생을 촉진하는 것을 확인했다. 또한, 면역 조직 화학적 방법에 의해 검토한 결과, 허혈뇌에 발현하는 L-PGDS는 페리사이트 마커와 공분포하는 것이 나타내어졌다. 이러한 점에서 L-PGDS는 페리사이트 또는 페리사이트로부터 탈분화한 iSC로부터 유래되는 것이라고 생각되었다.
상술한 바와 같이 L-PGDS는 PGD2를 합성하는 효소 단백질로서 작용함과 아울러, 주로 뇌 내에 발현하여 여러 가지 소수성 저분자의 결합·수송 및 스캐빈저로서의 역할을 담당하고, 뇌 내 환경 조정·뇌 보호 기능이나 수면 조절 기능 등의 여러 가지 기능을 갖는 단백질이라고 생각되어 있다. 이렇게 한 것으로부터 L-PGDS 산생 촉진제는 뇌경색 등의 뇌혈관 장해, 알츠하이머병 등의 인지증, 불면증 등의 L-PGDS가 관여하는 질환의 예방·치료 또는 재발 예방약으로서 유용하다고 생각된다. 본 추출물은 우수한 L-PGDS 산생 촉진 작용을 갖는 것이 확인되어 알츠하이머형 인지증 모델 마우스의 뇌 내의 L-PGDS 양을 증가시킴과 아울러, Aβ량을 감소시키고, 나아가서는 인지 기능을 개선했다. 그 때문에 본 추출물 또는 본 추출물 중에 함유되는 L-PGDS 산생 촉진 작용을 갖는 물질 또는 본 추출물을 함유하는 제제는 L-PGDS 산생 촉진제로서 매우 유용하다.
또한, 본 발명자들은 iSC에 있어서의 L-PGDS 산생 촉진 작용을 지표로 해서 L-PGDS가 관여하는 질환의 치료에 유용한 약제의 스크리닝 방법으로서 유용하다는 것을 발견했다. 상기 스크리닝 방법은, 특히 뇌 보호 작용이나 수면 작용을 갖는 약제의 개발에 기여하는 것이 생각된다. 또한, 본 발명은 iSC에 있어서의 L-PGDS 산생 촉진 작용을 지표로 해서 본 추출물 또는 본 추출물을 함유하는 제제를 시험함으로써 본 추출물 또는 본 추출물을 함유하는 제제의 작용·효과를 판정 또는 평가할 수 있고, 나아가서는 본 추출물 또는 본 추출물을 함유하는 제제의 약효를 담보하는 방법을 제공한다. 본 발명자들은 이상의 지견에 의거하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본원 발명에는, 예를 들면 하기 실시형태가 포함된다.
(1) 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
(2) 상기 (1)에 있어서, 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물이 함유하는 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
(3) 상기 (1)에 있어서, 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물을 함유하는 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소가 페리사이트 또는 페리사이트로부터 탈분화한 허혈 유도성 다능성 간세포에 있어서 산생되는 것인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 뇌 보호약인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
(6) 상기 (5)에 있어서, 뇌 보호약의 작용이 뇌 내 배출계에 대한 항진 작용에 의한 것인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
(7) 상기 (5) 또는 (6)에 있어서, 뇌 보호약이 뇌경색의 예방·치료 또는 재발 예방약인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
(8) 상기 (5) 또는 (6)에 있어서, 뇌 보호약이 인지증의 예방·치료약인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
(9) 상기 (8)에 있어서, 인지증이 알츠하이머형 인지증인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
(10) 상기 (9)에 있어서, 아밀로이드β 침착의 저해 작용을 갖는 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
(11) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 수면약인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
(12) 상기 (2) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, 염증 조직이 토끼의 염증 피부 조직인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
(13) 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서, 주사제인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
(14) 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서, 경구제인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
(15) 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 발현 촉진 작용을 지표로 하는 뇌 보호 작용 또는 수면 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법.
(16) 상기 (15)에 있어서, 페리사이트 또는 페리사이트로부터 탈분화한 허혈 유도성 다능성 간세포에 있어서의 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 발현 촉진 작용을 지표로 하는 스크리닝 방법.
(17) 상기 (15) 또는 (16)에 있어서, 뇌 보호 작용을 갖는 물질이 뇌경색의 예방·치료 또는 재발 예방약 또는 인지증의 예방·치료약인 스크리닝 방법.
(18) 상기 (17)에 있어서, 인지증이 알츠하이머형 인지증인 스크리닝 방법.
(19) 상기 (15) 또는 (16)에 있어서, 수면 작용을 갖는 물질이 수면약인 스크리닝 방법.
(20) 상기 (15) 내지 (19) 중 어느 하나에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어진 뇌 보호 작용 또는 수면 작용을 갖는 물질.
(21) 상기 (20)에 있어서, 뇌 보호 작용이 아밀로이드β의 배출 작용에 의한 것인 물질.
(22) 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 발현 촉진 작용을 지표로 하는 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물 또는 이것을 함유하는 제제의 판정 또는 평가 방법.
(23) 상기 (22)에 있어서, 페리사이트 또는 페리사이트로부터 탈분화한 허혈 유도성 다능성 간세포에 있어서의 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 발현 촉진 작용을 지표로 하는 판정 또는 평가 방법.
(24) 상기 (22) 또는 (23)에 있어서, 염증 조직이 토끼의 염증 피부 조직인 판정 또는 평가 방법.
(25) 상기 (22) 내지 (24) 중 어느 하나에 기재된 판정 또는 평가를 행함으로써 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물 또는 이것을 함유하는 제제의 품질 규격을 담보하는 방법.
(26) 상기 (22) 내지 (24) 중 어느 하나에 기재된 판정 또는 평가를 행함으로써 품질 규격이 담보된 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물 또는 이것을 함유하는 제제.
(27) 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물의 유효량을 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 산생 촉진 방법.
(28) 상기 (27)에 있어서, 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소가 페리사이트 또는 페리사이트로부터 탈분화한 허혈 유도성 다능성 간세포에 있어서 산생되는 것인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 산생 촉진 방법.
(29) 상기 (27) 또는 (28)에 있어서, 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 산생 촉진이 뇌 보호 또는 수면 도입·개선을 위해서 작용하는 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 산생 촉진 방법.
(30) 상기 (29)에 있어서, 뇌 보호가 뇌경색의 예방·치료 또는 재발 예방인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 산생 촉진 방법.
(31) 상기 (29)에 있어서, 뇌 보호가 인지증의 예방·치료인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 산생 촉진 방법.
(32) 상기 (31)에 있어서, 인지증이 알츠하이머형 인지증인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 산생 촉진 방법.
(33) 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 산생 촉진에 사용하기 위한 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물.
(34) 상기 (33)에 있어서, 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소가 페리사이트 또는 페리사이트로부터 탈분화한 허혈 유도성 다능성 간세포에 있어서 산생되는 것인 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물.
(35) 상기 (33) 또는 (34)에 있어서, 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 산생 촉진이 뇌 보호 또는 수면 도입·개선에 사용하기 위해서인 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물.
(36) 상기 (35)에 있어서, 뇌 보호가 뇌경색의 예방·치료 또는 재발 예방인 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물.
(37) 상기 (35)에 있어서, 뇌 보호가 인지증의 예방·치료인 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물.
(38) 상기 (37)에 있어서, 인지증이 알츠하이머형 인지증인 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물.
(39) 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 산생을 촉진하는 의약의 제조에 있어서의 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물의 사용.
(40) 상기 (39)에 있어서, 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소가 페리사이트 또는 페리사이트로부터 탈분화한 허혈 유도성 다능성 간세포에 있어서 산생되는 것인 사용.
(41) 상기 (39) 또는 (40)에 있어서, 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 산생 촉진하는 의약이 뇌 보호약 또는 수면약인 사용.
(42) 상기 (41)에 있어서, 뇌 보호약이 뇌경색의 예방·치료 또는 재발 예방약인 사용.
(43) 상기 (41)에 있어서, 뇌 보호약이 인지증의 예방·치료약인 사용.
(44) 상기 (43)에 있어서, 인지증이 알츠하이머형 인지증인 사용.
(발명의 효과)
본 발명 L-PGDS 산생 촉진제는 페리사이트 또는 iSC가 발현하는 L-PGDS의 리포칼린으로서의 기능을 항진함으로써 뇌 내의 여러 가지 소수성 분자를 배출하는 트랜스 포터로서 작용하고, 뇌허혈 시의 상해나 인지증의 원인이 되는 물질에 의한 폐해로부터 뇌를 보호하는 작용을 발휘하는 것이 강하게 기대된다. 또한, 본 발명 L-PGDS 산생 촉진제는 세포 내에서 합성한 PGD2를 뇌척수액 중에 분비하고, 뇌 내의 PGD2 리셉터로 수송함으로써 수면 조절 작용 등을 발휘하는 것이 기대된다. 특히, 본 추출물은 마우스의 허혈뇌에 있어서 L-PGDS의 산생을 촉진하는 것이 명백해지고, 또한 본 추출물을 알츠하이머형 인지증 모델 마우스에 투여함으로써 뇌 내의 L-PGDS 양이 상승함과 아울러, Aβ량이 감소하여 인지 기능이 개선되는 것이 확인되었다. 이와 같이 본 추출물이 L-PGDS의 산생을 촉진시켜서 우수한 약리 작용을 갖는 것은 동물 실험에서도 확인되어 있다. 또한, 본 추출물을 함유하는 제제는 부작용 등의 문제점이 적어 안정성이 높은 약제로서 오랜 세월 사용되고 있는 것이다. 그 때문에 본 발명은 매우 유용성이 높은 것이다.
또한, 본 추출물은 매우 방대한 수의 성분으로 이루어지는 다성분계의 물질인 점에서 그 작용을 단일 또는 복수의 함유 성분의 함량 등으로 판정 또는 평가하고, 약효 등을 담보하는 것은 매우 곤란하다. 그 점 본 발명의 L-PGDS의 발현 촉진 작용을 지표로 하는 본 추출물 또는 본 추출물을 함유하는 제제의 판정 또는 평가 방법에 의하면 간편하게 본 추출물 또는 본 추출물을 함유하는 제제의 작용을 판정 또는 평가할 수 있고, 나아가서는 본 추출물 또는 이것을 함유하는 제제의 약효를 담보하는 것에 이용할 수 있다. 이 점에서도 본 발명은 유용성이 높은 것이다. 또한, 본원에 있어서의 「판정 또는 평가」에는 시험, 검사 등에 의해 대상물을 조사하여 효과, 작용, 적부 등을 보고 확인하는 개념의 전부가 포함되는 것이다.
도 1은 피험물질을 첨가한 배양 iSC의 L-PGDS 유전자(PTGDS)의 발현량을 리얼 타임 RT-PCR법에 의해 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 피험물질을 첨가한 배양 iSC의 L-PGDS 유전자(PTGDS)의 발현량을 고전적 RT-PCR법에 의해 조사한 결과를 나타내는 전기영동도이다.
도 3은 피험물질을 첨가한 배양 iSC의 L-PGDS 단백의 발현량을 웨스턴 블로팅법에 의해 조사한 결과를 나타내는 전기영동도이다.
도 4는 피험물질을 첨가한 배양 iSC의 L-PGDS 단백의 발현량을 도트 블로팅법에 의해 조사한 결과를 나타내는 PVDF막이다.
도 5는 피험물질을 첨가한 배양 iSC의 L-PGDS 단백의 발현량을 ELISA법에 의해 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 피험물질을 첨가한 배양 iSC의 세포 추출액 중의 프로스타글란딘류 양을 액체 크로마토그래피 질량 분석법에 의해 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 피험물질을 첨가한 배양 iSC의 배양 상청에 L-PGDS의 기질을 첨가 후 액체 크로마토그래피 질량 분석법에 의해 반응 산물량을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 허혈 부하를 실시한 마우스의 뇌 내의 L-PGDS, 페리사이트, 및 혈관 내피 세포의 분포를 면역 조직 화학 염색법에 의해 비교한 결과를 나타내는 화상이다.
도 9는 허혈 부하를 실시한 마우스의 뇌 내의 L-PGDS의 분포를 면역 전자 현미경법에 의해 관찰한 결과를 나타내는 화상이다.
도 10은 인간 뇌경색소로부터 추출한 배양 iSC의 L-PGDS 및 신경 간세포 마커 네스틴의 분포를 면역 조직 화학 염색법에 의해 비교한 결과를 나타내는 화상이다.
도 11은 피험물질을 투여한 알츠하이머형 인지증 모델 마우스 뇌 내에 침착하는 아밀로이드β를 면역 조직 화학 염색법에 의해 조사한 결과를 나타내는 화상이다.
도 12는 피험물질을 투여한 알츠하이머형 인지증 모델 마우스 뇌 내의 L-PGDS를 면역 조직 화학 염색법에 의해 조사한 결과를 나타내는 화상이다.
도 13은 피험물질을 투여한 알츠하이머형 인지증 모델 마우스 뇌 내의 L-PGDS 및 혈관 내피 세포의 분포를 면역 조직 화학 염색법에 의해 비교한 결과를 나타내는 화상이다.
도 14는 피험물질을 투여한 알츠하이머형 인지증 모델 마우스 뇌 내의 아밀로이드β 및 L-PGDS 단백의 발현량을 웨스턴 블로팅법에 의해 조사한 결과를 나타내는 전기영동도이다.
도 15는 피험물질을 첨가한 배양 페리사이트의 L-PGDS 유전자(PTGDS)의 발현량을 고전적 RT-PCR법에 의해 조사한 결과를 나타내는 전기영동도이다.
본 추출물은 백시니아 바이러스를 접종해서 발두(發痘)한 동물의 염증 조직으로부터 추출 분리한 비단백성의 활성 물질을 함유하는 추출물이다. 본 추출물은 추출된 상태로는 액체이지만 건조함으로써 고체로 할 수도 있다. 본 제제는 의약품으로서 매우 유용한 것이다. 본 제제로서 출원인이 일본에 있어서 제조하여 판매하고 있는 구체적인 상품에 「백시니아 바이러스 접종 가토 염증 피부 추출액 함유 제제」(상품명: 뉴로트로핀/NEUROTROPIN〔등록 상표〕)(이하, 「뉴로트로핀」이라고 한다)가 있다. 뉴로트로핀에는 주사제와 정제가 있으며, 모두 의료용 의약품(ethical drug)이다.
뉴로트로핀의 주사제의 적응증은 「요통증, 경견완 증후군, 증후성 신경통, 피부 질환(습진, 피부염, 심마진)에 수반하는 소양, 알레르기성 비염, 스몬(SMON) 후유증상의 냉감·이상 지각·통증」이다. 뉴로트로핀의 정제의 적응증은 「대상포진 후 신경통, 요통증, 경견완 증후군, 견관절 주위염, 변형성 관절증」이다. 본 제제는 출원인이 창제하여 의약품으로서 개발한 것이며, 그 유효성과 안전성에 있어서의 우수한 특장점이 평가되고, 오랜 세월에 걸쳐 판매되어 일본의 의약품 시장에서 확고한 지위를 확립하고 있는 것이다.
본 발명에 있어서의 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물은 백시니아 바이러스를 접종해서 발두한 염증 조직을 파쇄하고, 추출 용매를 첨가해서 조직편을 제거한 후 제단백 처리를 행하고, 이것을 흡착제에 흡착시키고, 이어서 유효 성분을 용출함으로써 얻을 수 있다. 즉, 예를 들면 이하와 같은 공정이다.
(A) 백시니아 바이러스를 접종해서 발두시킨 토끼, 마우스 등의 피부 조직 등을 채취하고, 발두 조직을 파쇄하여 물, 페놀수, 생리 식염액 또는 페놀 첨가 글리세린수 등의 추출 용매를 첨가한 후, 여과 또는 원심 분리함으로써 추출액(여액 또는 상청)을 얻는다.
(B) 상기 추출액을 산성의 pH로 조정해서 가열하여 제단백 처리한다. 이어서, 제단백한 용액을 알칼리성으로 조정해서 가열한 후에 여과 또는 원심 분리한다.
(C) 얻어진 여액 또는 상청을 산성으로 해서 활성탄, 카올린 등의 흡착제에 흡착시킨다.
(D) 상기 흡착제에 물 등의 추출 용매를 첨가해서 알칼리성의 pH로 조정하고, 흡착 성분을 용출함으로써 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물을 얻을 수 있다. 그 후 소망에 따라 적당히 용출액을 감압하에 증발 건고 또는 동결 건조함으로써 건고물로 할 수도 있다.
백시니아 바이러스를 접종해서 염증 조직을 얻기 위한 동물로서는 토끼, 소, 말, 양, 염소, 원숭이, 래트, 마우스 등 백시니아 바이러스가 감염되는 다양한 동물을 사용할 수 있고, 염증 조직으로서는 토끼의 염증 피부 조직이 바람직하다. 토끼는 토끼목에 속하는 것이면 어떠한 것이어도 좋다. 예로서는 굴토끼, 집토끼(굴토끼를 가축화한 것), 산토끼(일본 산토끼), 우는토끼, 고산토끼 등이 있다. 이들 중 집토끼가 사용하기에는 적합하다. 일본에서는 과거로부터 사육되어 가축 또는 실험용 동물로서 번용(繁用)되어 있는 가토(집토끼)라고 불리는 경우가 있지만 이것도 집토끼의 별칭이다. 집토끼에는 다수의 품종(브리드)이 존재하지만 일본 백색종이나 뉴질랜드 백색종(뉴질랜드 화이트)이라는 품종이 적합하게 사용될 수 있다.
백시니아 바이러스(vaccinia virus)는 어떠한 주의 것이어도 좋다. 예로서는 리스터(Lister)주, 다이렌(Dairen)주, 이케다(Ikeda)주, EM-63주, 뉴욕시 공중 위생국(New York City Board of Health)주 등을 들 수 있다.
상술한 본 추출물의 기본적인 추출 공정 (A)~(D)는 보다 상세하게는, 예를 들면 이하와 같은 것으로서 실시할 수 있다.
공정 (A)에 대해서
토끼의 피부에 백시니아 바이러스를 피내 접종해서 발두시킨 염증 피부 조직을 채취한다. 채취한 피부 조직은 페놀 용액 등으로 세정, 소독을 행한다. 이 염증피부 조직을 파쇄하고, 그 1~5배량의 추출 용매를 첨가한다. 여기에서 파쇄란 민스기 등을 사용해서 민스형상으로 잘게 부수는 것을 의미한다. 또한, 추출 용매로서는 증류수, 생리 식염수, 약산성 내지 약염기성의 완충액 등을 사용할 수 있고, 페놀 등의 살균·방부제, 글리세린 등의 안정화제, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘 등의 염류 등을 적당히 첨가해도 좋다. 이때 동결 융해, 초음파, 세포막 용해 효소 또는 계면 활성제 등의 처리에 의해 세포 조직을 파괴해서 추출을 용이하게 할 수도 있다. 얻어진 현탁액을 5일~12일간 방치한다. 그동안 적당히 교반하면서 또는 교반하지 않고 30~45℃로 가온해도 좋다. 얻어진 액을 고액 분리(여과 또는 원심 분리 등)에 의해 조직편을 제거해서 조추출액(여액 또는 상청)을 얻는다.
공정 (B)에 대해서
공정 (A)에서 얻어진 조추출액에 대해서 제단백 처리를 행한다. 제단백은 통상 행해지고 있는 공지의 방법에 의해 실시할 수 있고, 가열 처리, 단백질 변성제 (예를 들면 산, 염기, 요소, 구아니딘, 아세톤 등의 유기 용매 등)에 의한 처리, 등전점 침전, 염석 등의 방법을 적용할 수 있다. 이어서, 불용물을 제거하는 통상의 방법, 예를 들면 여지(셀룰로오스, 니트로셀룰로오스 등), 유리 필터, 셀라이트, 자이츠 여과판 등을 사용한 여과, 한외 여과, 원심 분리 등에 의해 석출되어 온 불용 단백질을 제거한 여액 또는 상청을 얻는다.
공정 (C)에 대해서
공정 (B)에서 얻어진 여액 또는 상청을 산성, 바람직하게는 pH3.5~5.5로 조정하고, 흡착제로의 흡착 조작을 행한다. 사용 가능한 흡착제로서는 활성탄, 카올린 등을 들 수 있고, 추출액 중에 흡착제를 첨가해서 교반하거나 추출액을 흡착제 충전 컬럼에 통과시켜서 상기 흡착제에 유효 성분을 흡착시킬 수 있다. 추출액 중에 흡착제를 첨가한 경우에는 여과나 원심 분리 등에 의해 용액을 제거하고, 활성 성분을 흡착시킨 흡착제를 얻을 수 있다.
공정 (D)에 대해서
공정 (C)에서 얻어진 흡착제로부터 활성 성분을 용출(탈리)시키기 위해서는 상기 흡착제에 용출 용매를 첨가해서 염기성, 바람직하게는 pH9~12로 조정하고, 실온 또는 적당히 가열하거나 또는 교반해서 용출하고, 여과나 원심 분리 등의 통상의 방법으로 흡착제를 제거한다. 사용되는 용출 용매로서는 염기성의 용매, 예를 들면 염기성의 pH로 조정한 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등 또는 이들의 적당한 혼합 용액을 사용할 수 있고, 바람직하게는 pH9~12로 조정한 물을 사용할 수 있다. 용출 용매의 양은 적당히 설정할 수 있다. 이와 같이 해서 얻어진 용출액을 원약으로서 사용하기 위해서 적당히 pH를 중성 부근으로 조정하는 등 하여 최종적으로 백시니아 바이러스 접종 토끼 염증 피부 추출물(본 추출물)을 얻을 수 있다.
본 추출물은 완성된 시점에서는 액체이므로 적당히 농축·희석함으로써 소망의 농도의 것으로 할 수도 있다. 본 추출물로부터 제제를 제조할 경우에는 가열 멸균 처리를 실시하는 것이 바람직하다. 주사제로 하기 위해서는, 예를 들면 염화나트륨 등을 첨가해서 생리 식염액과 등장의 용액으로 조제할 수 있다. 또한, 액체 또는 겔 등의 상태로 경구 투여하는 것도 가능하지만 본 추출물에 적절한 농축 건고 등의 조작을 행함으로써 정제 등의 경구용 고형 제제를 제조할 수도 있다. 본 추출물로부터 이와 같은 경구용 고형 제제를 제조하는 구체적인 방법은 일본 특허 제3818657호나 동 제4883798호의 명세서에 기재되어 있다. 이렇게 해서 얻어진 주사제나 경구용 제제 등이 본 제제의 예이다.
환자로의 투여 방법으로서는 특별히 한정되지 않고, 치료 목적에 따라 적당히 선택할 수 있다. 예를 들면, 경구 투여 외에 피하, 근육 내, 정맥 내 투여, 경피 투여 등을 들 수 있고, 투여량은 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물의 종류에 따라 적당히 설정할 수 있다. 시판된 제제로 확인되어 있는 투여량은 기본적으로는 내복으로는 1일 16NU, 주사제로는 1일 3.6~7.2NU를 투여하도록 의료용 의약품으로서는 나타내어져 있지만 질환의 종류, 중상도, 환자의 개인차, 투여 방법, 투여 기간 등에 따라 적당히 증감 가능하다(NU: 뉴로트로핀 단위. 뉴로트로핀 단위란 동통(疼痛) 역치가 정상 동물보다 저하된 만성 스트레스 동물인 SART 스트레스 마우스를 사용하고, Randall-Selitto 변법에 준하여 시험을 행하여 진통 효력의 ED50값을 갖고 규정한다. 1NU는 ED50값이 100㎎/㎏일 때의 뉴로트로핀 제제의 진통 활성 함유 성분 1㎎을 나타내는 활성이다).
이하에 본 추출물의 제조 방법의 예 및 본 추출물의 신규인 약리 작용, L-PGDS 산생 촉진 작용에 관한 약리 시험 결과를 나타내지만 본 발명은 이들 실시예의 기재에 의해 조금도 제한되는 것은 아니다.
(실시예)
실시예 1 본 추출물의 제조
건강한 성숙 가토의 피부에 백시니아 바이러스를 피내 접종하고, 발두한 피부를 잘라내어 채취했다. 채취한 피부는 페놀 용액으로 세정·소독을 행한 후 여분의 페놀 용액을 제거하여 파쇄하고, 페놀 용액을 첨가해서 혼합하고, 3~7일간 방치한 후 추가로 3~4일간 교반하면서 35~40℃로 가온했다. 그 후 고액 분리해서 얻은 추출액을 염산으로 pH4.5~5.2로 조정하고, 90~100℃에서 30분간 가열 처리한 후 여과해서 제단백했다. 또한, 여액을 수산화나트륨으로 pH9.0~9.5로 조정하고, 90~100℃에서 15분간 가열 처리한 후 고액 분리했다.
얻어진 제단백액을 염산으로 pH4.0~4.3으로 조정하고, 제단백액 질량의 2% 양의 활성탄을 첨가하여 2시간 교반한 후 고액 분리했다. 채취한 활성탄에 물을 첨가하여 수산화나트륨으로 pH9.5~10으로 하고, 60℃에서 90~100분간 교반한 후 원심 분리해서 상청을 얻었다. 원심 분리에 의해 침전된 활성탄에 다시 물을 첨가한 후 수산화나트륨으로 pH10.5~11로 하고, 60℃에서 90~100분간 교반한 후 원심 분리해서 상청을 얻었다. 양 상청을 합쳐서 염산으로 중화하여 본 추출물을 얻었다.
실시예 2 약리 시험
이어서, 상기 실시예 1에서 얻어진 본 추출물을 피험물질로서 사용한 L-PGDS 산생 촉진 작용에 관한 약리 시험의 방법 및 결과를 나타낸다. 또한, 하기 약리 시험에 있어서 C.B-17 마우스로의 뇌경색의 도입이나 상기 뇌경색소로부터의 iSC의 단리 배양에 대해서는 Nakagomi, T. et al. Eur. J. Neurosci., 29, 1842_1852, 2009에 기재된 방법에 준하여 행했다.
시험예 1: 피험물질 처리 iSC에 있어서의 망라적 유전자 발현 해석
C.B-17 마우스(3 마리)에 중대뇌동맥 폐쇄에 의한 허혈 부하를 실시하고, 3 일째에 경색소로부터 3주의 iSC를 단리했다. 각각의 배양 iSC(2% 소태아혈청(FBS), 20ng/mL 섬유아세포 증식인자(FBS), 20ng/mL 상피 성장인자(EGF), 및 1% N2 서플리먼트를 첨가한 둘베코 개변 이글 배지 F12(2% FBS DMEM/F12 F/E/N), 5×104 cell/3㎝φdish)에 대해서 피험물질(50, 1000mNU/mL) 또는 생리 식염액(컨트롤)을 첨가하고, 배양 4일째에 RNeasy〔등록 상표, 이하 마찬가지〕 Mini Kit(QIAGEN GmbH)에 의해 전체 RNA를 회수했다(전체 9배양). 망라적 유전자 발현 해석에는 마우스용의 유전자 칩 SurePrint G3 Mouse GE 마이크로 어레이 8×60K(24,321 종류의 RNA 및 4,576 종류의 논코딩 RNA, General Electric company)를 사용하고, 피험물질의 첨가에 따라 3주 모두 양 농도에서 동 방향으로 1/2 이하의 저하 내지 2배 이상의 발현 변화를 나타내는 유전자를 선별했다. 결과는 컨트롤에 대한 선별한 각 유전자의 발현량비로서 나타냈다(3주의 평균값 ±표준 오차). 결과의 일례를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
상기 해석의 결과, 표 1에 나타내는 바와 같이 발현 감소를 나타낸 COCH 유전자 및 발현 상승을 나타낸 GBP6 유전자 및 PTGDS 유전자의 합계 3유전자가 선별되었다. 이들 중 L-PGDS를 코드하는 PTGDS 유전자의 발현량은 피험물질에 대한 강한 용량 의존성을 나타냈다.
시험예 2-1: L-PGDS 유전자 발현에 대한 평가(리얼 타임 RT-PCR법)
시험예 1과 마찬가지로 배양 iSC(FBS 불포함 DMEM/F12 F/-/-, 5×104 cell/3㎝φdish)에 피험물질(50, 500mNU/mL) 또는 생리 식염액(컨트롤)을 첨가하고(n=1), 7일간 배양한 후 Isogen II〔등록 상표〕에 의해 제조원(NIPPON GENE CO., LTD.)의 매뉴얼에 따라서 RNA를 회수했다. 260㎚ 및 280㎚의 흡광도를 지표로 RNA 순도를 검정한 후 랜덤 프라이머 존재하에서 SuperScript〔등록 상표, 이하 마찬가지〕 IV RTase(Invitrogen Corporation)에 의한 역전사 반응을 행하여 전체 RNA에 대한 1개쇄 cDNA를 얻었다. 얻어진 cDNA에 대해서 PTGDS 특이적 프라이머를 사용한 정량적 PCR법(Prism〔등록 상표〕 7900HT, Applied Biosystems, Inc.)에 의해 하우스키핑 유전자 β-Actin을 표준으로 해서 전사 산물의 정량을 행했다(역치 리사이클 비교법). 또한, 사용한 PTGDS 및 β-Actin용 프라이머의 서열은 이하와 같다〔PTGDS: 5'-gactctgaaggacgagctgaag-3'(서열번호 1), 5'-tcttgaatgcacttatccggttgg-3'(서열번호 2), ·-Actin: 5'-tacagcttcaccaccacagc-3'(서열번호 3), 5'-aaggaaggctggaaaagagc-3'(서열번호 4)〕. 결과는 컨트롤을 1로 했을 때의 ·-Actin에 대한 PTGDS의 발현량비로 나타냈다. 결과의 일례를 표 2 및 도 1에 나타낸다.
Figure pct00002
표 2 및 도 1로부터 명백한 바와 같이 시험예 1에서 나타내어진 결과와 마찬가지로 피험물질은 iSC에 있어서 L-PGDS 유전자(PTGDS)의 발현을 용량 의존적으로 촉진하는 것이 확인되었다.
시험예 2-2: L-PGDS 유전자 발현에 대한 평가(고전적 RT-PCR법)
0(컨트롤; 생리 식염액), 1, 5, 50, 100mNU/mL의 각 용량의 피험물질 존재 하, FGF를 함유하는 배지(DMEM/F12 F/-/-) 또는 FGF를 함유하지 않는 배지(DMEM/F12 -/-/-)에서 iSC를 4일간 배양했다. RNeasy Mini Kit(QIAGEN GmbH)에 의해 회수된 전체 RNA에 대해서 SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum(Invitrogen Corporation)을 사용한 고전적 RT-PCR법에 의해 L-PGDS 유전자(PTGDS)의 발현량을 반정량했다(35 사이클). PCR 산물을 2% 아가로오스겔 전기영동에 의해 분리하고, PTGDS 및 GAPDH의 밴드를 브롬화에티듐으로 염색하여 가시적으로 검출했다. 또한, 사용한 PTGDS 및 GAPDH용 프라이머의 서열은 이하와 같다〔PTGDS: 5'-cctccaactcaagctggttc-3'(서열번호 5), 5'-atagttggcctccaccactg-3'(서열번호 6), GAPDH: 5'-atcactgccacccagaagac-3'(서열번호 7), 5'-cacattgggggtaggaacac-3'(서열번호 8)〕. 결과의 일례를 도 2에 나타낸다.
iSC에 있어서의 L-PGDS 유전자(PTGDS) 발현 촉진 작용에 대해서 보다 상세한 피험물질의 용량으로 조사한 결과, 도 2에 나타내어지는 바와 같이 피험물질은 배지의 FGF 함유의 유무에 관계되지 않고, L-PGDS 유전자의 발현량을 용량 의존적으로 증가시켰다.
시험예 3-1: L-PGDS 단백의 발현에 대한 평가(웨스턴 블로팅법)
iSC를 혈청 비존재하에서 피험물질(0, 1, 5, 50, 100mNU/mL)을 첨가하여 4일간 배양(DMEM/F12 F/-/-, 5×104cell/3㎝φdish)한 후 회수하고, 인산 완충액으로 세정 후 RIPA 완충액(4℃, 50mM 트리스염산 완충액(pH7.6), 150mM 염화나트륨, 1% NONIDET〔등록 상표〕P-40(NP-40), 0.5% 데옥시콜산 나트륨, 및 0.1% 도데실황산 나트륨)에 의해 용해하고, 호모지네이트라고 했다. 총 단백량이 균일해지도록 조정 후 호모지네이트를 SDS-PAGE(BIO-RAD Any kD(상표))로 분리하고, 폴리불화비닐리덴(PVDF)막(Immun-Blot PVDF 멤브레인, Bio-Rad Laboratories, Inc.)에 전사하고, Bloking One(NACALAI TESQUE, INC.)으로 블로킹 후 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블로팅법에 의해 L-PGDS(anti-Prostaglandin D Synthase (Lipocalin) antibody [EP12357], Abcam plc., 1:2000) 및 β-Actin(Monoclonal anti-β-Actin [A1978], Sigma Chemical Company, 1:100000)을 검출했다. 검출에는 고감도 화학 발광법(Chemi-Lumi One L, NACALAI TESQUE, INC.)을 사용했다. 결과의 일례를 도 3에 나타낸다.
도 3으로부터 명백한 바와 같이 피험물질은 iSC 세포 내의 L-PGDS 단백의 발현을 촉진시키는 것이 확인되었다.
시험예 3-2: L-PGDS 단백의 발현에 대한 평가(도트 블로팅법)
피험물질(0, 1, 10, 50, 100mNU/mL)로 4일간 배양(DMEM/F12 F/-/-, 5×104cell/3㎝φdish)한 iSC의 배양 상청 500μL를 PVDF막(Immun-Blot PVDF 멤브레인, Bio-Rad Laboratories, Inc.)에 스폿하고, Bloking One(NACALAI TESQUE, INC.)으로 블로킹 후 항L-PGDS 항체(anti-Prostaglandin D Synthase (Lipocalin) antibody [EP12357], Abcam plc., 1:2000)를 사용한 도트 블로팅법에 의해 L-PGDS를 검출했다. 결과의 일례를 도 4에 나타낸다.
L-PGDS는 그 N 말단에 전형적인 분비 시그널 서열 및 시그널 펩티다아제 인식 서열을 갖는 점에서 세포 외로 분비된다고 생각된다. 그래서 피험물질을 첨가한 iSC의 배양 상청 중의 L-PGDS 단백을 측정한 결과, 도 4로부터 명백한 바와 같이 배양 상청 중(세포 외)의 L-PGDS 단백량도 피험물질의 첨가 용량에 의존하여 증가하는 것이 확인되었다.
시험예 3-3: L-PGDS 단백질의 발현에 대한 평가(ELISA법)
피험물질(0〔컨트롤〕, 1, 10, 50, 100, 1000mNU/mL)로 4일간 처리한 iSC의 배양(DMEM/F12 F/-/-, 5×104cell/3㎝φdish)의 상청을 회수했다. 원심 분리(1500rpm, 10분, 4℃) 후 배양 상청 중의 L-PGDS 양을 특이적 ELISA법(인간 L-PGDS용 ELISA KIT(Prostaglandin D Synthase 21kDa(Brain), 형번: SEA724Hu, Cloud-Clone Corp.)을 사용해서 제조자의 매뉴얼에 따라서 측정했다. 결과의 일례를 표 3 및 도 5에 나타낸다.
Figure pct00003
표 3 및 도 5로부터 명백한 바와 같이 시험예 3-2와 마찬가지로 피험물질로 처리한 iSC의 배양 상청(세포 외)에 있어서 L-PGDS 단백량이 증가하는 것이 확인되었다. 시험예 3의 결과로부터 피험물질은 iSC에 있어서 유전자 레벨뿐만 아니라 단백 레벨에 있어서도 L-PGDS의 산생을 촉진하고, 또한 산생된 L-PGDS를 분비시키는 것이 확인되었다.
시험예 4: L-PGDS의 효소 활성에 대한 평가(액체 크로마토그래피(HPLC) 질량 분석법)
L-PGDS는 PGH2를 기질로서 PGD2를 생합성하는 효소(EC 5.3.99.2)이다. iSC에 있어서 피험물질에 의해 산생 촉진된 L-PGDS가 그 효소 활성에 의해 추가로 PGD2를 산생하는 것을 확인하는 목적으로 iSC의 A: 세포 내 및 B: 세포 외에 있어서 PGD2 및 그 대사 산물, 및 PGD2와 동일하게 PGH2를 기질로 하여 산생되는 PGE2 등의 프로스타글란딘류를 망라적으로 분석했다.
A: iSC 세포 내 효소 활성의 평가
피험물질(0, 10, 50mNU/mL)을 첨가하여 3일간 배양(FBS 불포함 DMEM/F12 F/-/-, 5×104cell/3㎝φ dish)한 iSC로부터 RIPA 완충액 처리(4℃, 20min)에 의해 세포 추출액을 조제했다. HPLC 질량 분석법에 의해 세포 내 추출액 중의 프로스타글란딘류(PGD2, PGJ2, 15-데옥시-Δ12,14-PGJ2, 13,14-디히드로-15-케토-PGD2, 및 PGE2)의 농도를 각각 측정했다. HPLC 분리에는 AQUITY UPLC HSS T3 칼럼(Waters Corporation)을 사용하고, 검출기 및 질량 분석 기기로서 각각 API4000 LC/MS/MS 시스템 및 Triple Quadrupole(모두 AB Sciex Pte. Ltd.)을 사용했다. 결과의 일례를 표 4 및 도 6에 나타낸다.
Figure pct00004
표 4 및 도 6에 나타내어지는 바와 같이 PGD2 및 그 비효소적 대사 산물인 PGJ2의 세포 내 레벨은 피험물질 첨가에 의해 용량 의존적으로 증가했다. 또한, 50mNU/mL에서의 피험물질 첨가에 있어서는 PGJ2의 비효소적 대사 산물인 15-데옥시-Δ12,14-PGJ2의 산생도 확인되었다. 또한, 15-데옥시-Δ12,14-PGJ2의 비효소적 대사 산물인 13,14-디히드로-15-케토-PGD2는 검출 한계 이하이었다. 한편, PGD2와 공통의 기질 PGH2로부터 산생되는 PGE2에 대해서는 피험물질 첨가의 용량에 의존한 산생 응답을 관찰할 수 없었다.
B: iSC 세포 외 효소 활성의 평가
iSC를 피험물질(0, 50, 100, 1000mNU/mL)을 첨가하여 3일간 배양(FBS 불포함 DMEM/F12 F/-/-, 5×104cell/3㎝φ dish)한 배양 상청에 L-PGDS의 기질인 PGH2 및 글루타티온(GSH)을 작용시켰다(반응 조건: 100mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM GSH, 10mM PGH2, 37℃, 5min). 상기 A.와 마찬가지로 HPLC 질량 분석법에 의해 반응액 중의 프로스타글란딘류(PGD2, PGJ2, 15-데옥시-Δ12,14-PGJ2, 13,14-디히드로-15-케토-PGD2, 및 PGE2)의 농도를 각각 측정했다. 결과의 일례를 표 5 및 도 7에 나타낸다.
Figure pct00005
표 5 및 도 7에 나타내어지는 바와 같이 피험물질은 100mNU/mL 이상의 농도로 반응액 중의 PGD2 및 그 비효소적 대사 산물 PGJ2, 15-데옥시-Δ12,14-PGJ2의 농도를 상승시킨 점에서 iSC 배양 상청 중에 L-PGDS 활성이 존재하는 것이 확인되었다. 또한, 15-데옥시-Δ12,14-PGJ2의 비효소적 대사 산물인 13,14-디히드로-15-케토-PGD2에 대해서는 100mNU/mL까지의 농도 범위의 피험물질 첨가에 의해 용량에 의존한 산생을 관찰했지만 1000mNU/mL에 있어서는 검출 한계를 하회했다.
L-PGDS는 분비형 효소인 것이 알려져 있지만 상기 A. 및 B.의 결과로부터 iSC는 효소 활성을 갖는 L-PGDS를 세포 외로 방출하고 있으며, 피험물질 첨가에 의해 그 산생과 방출이 촉진되는 것이 확인되었다.
시험예 5-1: 마우스 뇌 내에 있어서의 L-PGDS 산생 세포의 검토(면역 조직 화학 염색법)
중대뇌동맥 폐쇄에 의한 허혈 부하를 실시한 C.B-17 마우스(허혈 3일 후)의 뇌 절편을 제작하고, L-PGDS(패널 B, 녹; anti-prostaglandin D synthase (lipocalin) antibody [EP12357], Abcam plc., 1:1000), 페리사이트 마커α-SMA(패널 C, 적; anti-actin, smooth muscle, clone ASM-1, Millipore Corporation, 1:1000) 및 혈관 내피 세포 마커 CD31(패널 D, 적; anti-mouse CD31(PECAM-1) monoclonal antibody, 550274, BD Pharmingen company, 1:1000)에 대한 특이적 항체를 사용하여 공초점 레이저 현미경에 의한 면역 조직 화학적 검토를 행했다. 다중 염색법에 의해 L-PGDS(패널 B)와 페리사이트 마커(패널 C) 또는 L-PGDS(패널 B)와 혈관 내피 세포 마커(패널 D)를 각각 상이한 형광 색소로 표지된 특이적 항체로 검출하고, 화상을 중합하여 L-PGDS와 페리사이트 마커 또는 L-PGDS와 혈관 내피 세포 마커의 분포에 대해서 비교했다(패널 A1, 패널 A2). 결과의 일례를 도 8에 나타낸다.
도 8 상단에 있어서 패널 B의 녹색 형광은 L-PGDS의 분포를 나타내고, 패널 C의 적색 형광은 페리사이트 마커의 분포를 나타내지만 양자를 중합한 패널 A1에 있어서 L-PGDS(녹색 형광)는 페리사이트 마커(적색 형광)의 분포와 부분적으로 일치했다(200배). 또한, 도 8 하단에 있어서 패널 B의 녹색 형광은 L-PGDS의 분포를 나타내고, 패널 D의 적색 형광은 혈관 내피 세포 마커의 분포를 나타내지만 양자를 중합한 패널 A2에 있어서 L-PGDS(녹색 형광)는 혈관 내피 세포 마커(적색 형광)의 근방에 분포하지만 공분포를 나타내는 관찰은 얻어지지 않았다(200배).
L-PGDS는 주로 중추 신경계에 분포하는 단백이며, 지주막이나 연막 및 측뇌실의 맥락총 등에 존재하여 뇌척수액 중에 분비된다고 생각되어 있지만(Urade Y. et al., J Lipid Mediat. Cell Signal. 14, 71-82, 1996), 뇌 내 산생 세포에 대해서는 충분히 해명되어 있지 않다. 본 발명자들은 면역 조직 화학적 방법에 의해 L-PGDS의 뇌 내 분포에 관한 검토를 행한 결과, C.B-17 마우스의 정상뇌에 있어서의 발현은 미약했지만 상기 시험예 4-1에 있어서 본 마우스에 중대뇌동맥의 영구 결찰을 도입하면 뇌경색소에 현저한 L-PGDS 발현이 확인되었다(도 8의 패널 B). 또한, L-PGDS의 분포는 혈관 내피 세포의 마커인 CD31의 주위에 확인되었지만 양자의 분포가 겹치는 경우는 없었다(도 8의 패널 A2). 한편, L-PGDS는 페리사이트의 마커인 α-SMA와 일부 공분포를 나타내는 것을 알 수 있었다(도 8의 패널 A1). 이상의 결과에 의해 뇌경색소에 있어서 발현 유도되는 L-PGDS는 페리사이트(또는 iSC)로부터 유래되는 것이라고 생각되었다. 이것은 후술하는 시험예 4-2의 면역 전자 현미경법에 의해서도 L-PGDS 양성 산물이 혈관 내피 세포와 기저막에 접해서 존재하는 페리사이트의 세포질 내에 전자 밀도가 높은 구조물로서 확인된 것에 의해 검증되었다(도 9의 패널 A 및 패널 B). 이들 결과에 의해 허혈 응답에 있어서의 페리사이트 또는 iSC의 생리학적 역할로서 L-PGDS의 발현 유도가 포함된다고 상상되었다.
시험예 5-2: 마우스 뇌 내에 있어서의 L-PGDS 산생 세포의 검토(면역 전자 현미경법)
중대뇌동맥 폐쇄에 의한 허혈 부하를 실시한 C.B-17 마우스(허혈 3일 후)의 뇌 절편을 제작하고, L-PGDS(anti-prostaglandin D synthase (lipocalin) antibody [EP12357], Abcam plc., 1:1000)에 대한 특이적 항체를 사용한 면역 전자 현미경법에 의해 L-PGDS의 발현 부위를 관찰했다. 구체적으로는 비브라톰에 의해 2㎛ 두께의 뇌 절편을 제작하고, avidin-biotin horseradish peroxidase(HRP) complex 키트(Vector Laboratories Inc.)와 3,3'-디아미노벤지딘테트라히드로클로라이드(DAB)를 사용한 반응 후 오스뮴 처리를 행하고, 에폰 처리 후 초박절편을 제작하여 전자 현미경 관찰을 행했다. 결과의 일례를 도 9에 나타낸다.
도 9의 패널 A 및 패널 B 중 어느 것에 있어서도 L-PGDS에 대한 면역 전자 현미경법에서는 혈관 내피 세포와 기저막에 접해서 존재하는 혈관 주피 세포(페리사이트)의 세포질 내에 전자 밀도가 높은 영역이 확인되었다.
시험예 6: 인간 뇌 내에 있어서의 L-PGDS 산생 세포의 검토(면역 조직 화학 염색법)
Tatebayashi K. et al., Stem Cells and Develop. 26, 787-797, 2017에 기재된 방법에 준하여 인간 뇌경색소(괴사 조직)으로부터 추출한 배양 iSC에 있어서 L-PGDS(패널 B, 녹; anti-prostaglandin D synthase (lipocalin) antibody [EP12357], Abcam plc., 1:1000)와 신경 간세포 마커 네스틴(패널 C, 적; anti-nestin, clone 10C2, Millipore Corporation, 1:1000)에 대한 특이적 항체를 사용한 면역 조직 화학적 검토를 행했다. 세포는 Alexa Fluor〔등록 상표, 이하 마찬가지〕 488-conjugated 항체 또는 Alexa Fluor 555-conjugated 항체(1:500; Molecular Probes, Eugene)와 반응 후에 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; 1:1000; Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.)에 의한 핵염색을 행했다. Fluorescent microscope(BX60; Olympus Corporation, Japan)으로 형광 관찰하여 L-PGDS(패널 B)와 네스틴(패널 C)의 화상을 중합하여 L-PGDS와 네스틴의 분포에 대해서 비교했다(패널 A). 결과의 일례를 도 10에 나타낸다.
도 10에 있어서 패널 B의 녹색 형광은 L-PGDS의 분포를 나타내고, 패널 C의 적색 형광은 nesitin의 분포를 나타내지만 양자를 중합한 패널 A에서는 L-PGDS(녹색 형광)는 네스틴(적색 형광)의 분포와 일치했다(200배). 즉, L-PGDS는 네스틴을 발현하고 있는 거의 모든 iSC에서 발현하는 것이 확인되었다. 이상으로부터 마우스 뇌뿐만 아니라 인간 뇌에 있어서도 L-PGDS는 iSC 또는 페리사이트에서 산생된다고 생각되었다.
시험예 7: 알츠하이머형 인지증 모델 동물의 뇌 내 아밀로이드β 침착과 L-PGDS 발현에 대한 평가
(1) 인지능에 관한 행동학적 해석 및 샘플 조제
APPswe/PS1dE9(APP/PS1) 마우스(자성(雌性) 3개월령)을 각 군 체중이 균등해지도록 피험물질 투여군과 컨트롤군으로 나누고(각 군 10~11마리), 약 3개월간에 걸쳐 각각 피험물질(100NU/㎏ 체중) 또는 생리 식염액을 주 2회, 꼬리 정맥 주사했다. 최종 투여 후 인지능에 관한 행동학적 해석(Y자 미로 시험, 신기 물체 인식 시험, 및 모리스 수미로 시험)을 행했다. 각 시험에 있어서 A: Y자 미로 시험에서는 교체 행동률(%), B: 신기 물체 인식 시험에서는 신기 물체에 대한 액세스 빈도(%), 및 C: 모리스 수미로 시험에서는 학습 기간의 종료 시까지의 4일간(6~9일째)의 플랫폼 발견에 요하는 평균 시간(초)을 각각 측정하고, 개체마다 통합 스코어(A×B÷C)를 산출했다. 각 군 2개체씩의 측정 결과를 표 6에 나타낸다.
Figure pct00006
표 6으로부터 명백한 바와 같이 피험물질 투여군에 의한 인지능의 개선 작용이 관찰되고, 이 작용은 군 간에서는 통계학적으로 유의이었다.
인지능에 관한 행동학적 해석 후(최종 투여 24시간 후) 피험물질 투여군 및 컨트롤군에 있어서 마취하 단두에 의해 뇌를 채취하고, 좌반구를 액체 질소 배스에서 급속 동결했다. 또한, 나머지의 우반구는 (A) 글루타르알데히드를 포함하는 고정액(0.05% 글루타르알데히드, 4% 파라포름알데히드, 0.1M 인산 버퍼) 또는 (B) PLP 고정액(0.01M 메타과요오드산 나트륨, 0.075M 리신, 2% 파라포름알데히드)에 의해 고정했다(4℃). 고정 조직 표본으로부터 크라이오스탯(Leica CM1850)에 의해 대뇌피질을 포함하는 관상면 절편(두께 20㎛)을 제작했다.
(2) 대뇌피질에 있어서의 아밀로이드β 침착에 대한 평가(면역 조직 화학 염색법)
상기 (1)에서 제작한 피험물질 투여군 및 컨트롤군의 관상면 절편에 대해서 항아밀로이드β 항체(anti-β-amyloid, 1-16, [SIG-39300], BioLegend, Inc., 1:1000)에 의한 면역 조직 화학적 염색을 행했다. 아밀로이드β는 Alexa Fluor 488-conjugated 항체(1:500; Molecular Probes, Eugene)와 반응 후에 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; 1:1000; Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.)에 의한 핵염색을 행하고, Fluorescent microscope(BX60; Olympus Corporation, Japan)으로 형광 관찰했다. 결과의 일례를 도 11에 나타낸다.
도 11에 나타내어지는 바와 같이 피험물질 투여에 의해 인지능의 개선이 확인된 개체에서는 컨트롤군에 비해서 뇌 아밀로이드반의 수 및 표면적이 저하되어 있었다.
(3) 대뇌피질에 있어서의 L-PGDS 발현에 대한 평가(면역 조직 화학 염색법
상기 (1)에서 제작한 피험물질 투여군 및 컨트롤군의 관상면 절편에 대해서 항L-PGDS 항체(anti-prostaglandin D synthase (lipocalin) antibody [EP12357], Abcam plc., 1:1000)에 의한 면역 조직 화학적 염색을 행했다. L-PGDS는 avidin-biotin horseradish peroxidase(HRP) complex 키트(Vector Laboratories Inc.)와 3,3'-디아미노벤지딘테트라히드로클로라이드(DAB) 반응을 사용하여 검출했다. 결과의 일례를 도 12에 나타낸다.
도 12에 나타내어지는 바와 같이 피험물질 투여군의 뇌에서는 혈관질 근방에 L-PGDS의 특이 염색이 확인된(패널 B의 화살표 부분) 것에 대하여 컨트롤군의 뇌에서는 L-PGDS의 특이 염색은 확인되지 않았다(패널 A).
또한, 상기 (1)에서 제작한 피험물질 투여군의 관상면 절편에 대해서 L-PGDS(anti-prostaglandin D synthase (lipocalin) antibody [EP12357], Abcam plc., 1:1000) 및 혈관 내피 세포 마커 CD31(anti-mouse CD31(PECAM-1) monoclonal antibody, 550274, BD Pharmingen company, 1:1000)에 대한 특이적 항체를 사용한 면역 조직 화학적 검토를 행했다. 상기 1차 항체를 결합시킨 절편에 있어서 Alexa Fluor 488-conjugated 항체 또는 Alexa Fluor 555-conjugated 항체(1:500; Molecular Probes, Eugene)와 반응 후에 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; 1:000; Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.)에 의한 핵염색을 행하고, confocal laser microscope(LSM780; Carl Zeiss Jena GmbH, Germany)으로 형광 관찰했다. 다중 염색법에 의해 L-PGDS(패널 B)와 CD31(패널 C)의 화상을 중합하여 L-PGDS와 CD31의 분포에 대해서 비교했다(패널 A). 결과의 일례를 도 13에 나타낸다.
도 13에 나타내어지는 바와 같이 피험물질 투여군의 뇌에서는 L-PGDS(녹색 형광)가 혈관 내피 세포 마커 CD31(적색 형광)의 주위에 분포되어 있는 것이 확인되었다. 이것에 의해 피험물질의 투여에 응답하고, 혈관 내피 세포를 덮도록 존재하는 페리사이트(또는 iSC)에 있어서 L-PGDS의 발현이 상승했다고 생각되었다.
(4) 뇌 내 아밀로이드β 침착과 L-PGDS 발현에 대한 평가(웨스턴 블로팅법)
상기 (1)에서 채취 후 급속 동결한 좌반구 뇌를 Potter형 호모지나이저에 의해 호모나이즈해서 추출한 단백을 SDS-PAGE(BIO-RAD Any kD(상표))로 분리하고, PVDF막(Immun-Blot PVDF 멤브레인, Bio-Rad Laboratories, Inc.)에 전사했다. Bloking One(NACALAI TESQUE, INC.)으로 블록킹 후 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블로팅법에 의해 아밀로이드β(anti-β-amyloid, 1-16, [SIG-39300], BioLegend, Inc., 1:1000) 및 L-PGDS(anti-Prostaglandin D Synthase (Lipocalin) antibody [EP12357], Abcam plc., 1:2000)를 검출했다. 검출에는 고감도 화학 발광법(Chemi-Lumi One L, NACALAI TESQUE, INC.)을 사용했다. 결과의 일례를 도 14에 나타낸다.
도 14의 패널 A ※표시 부분에 나타내어지는 바와 같이 뇌 내 아밀로이드β 양에 대해서는 피험물질 투여에 의해 인지능의 개선이 확인된 피험물질 투여군의 마우스(개체번호 4, 29)에서는 컨트롤군의 마우스(개체번호 14, 30)에 비해서 감소하고 있는 것이 확인되었다. 이 결과는 시험예 7 (2)의 면역 조직 화학 염색법(도 11)에 있어서 컨트롤군에 대해서 피험물질 투여에서는 뇌 내 아밀로이드β 항체 양성 산물의 수 및 표면적 사이즈가 억제되어 있던 결과와 상관하는 것이었다. 또한, 도 14의 패널 B ＊표시 부분에 나타내어지는 바와 같이 피험물질 투여군에서는 뇌 내 L-PGDS 양이 컨트롤군에 비해서 증가하고 있는 점에서 피험물질이 뇌 내 L-PGDS 산생을 항진하고 있는 것이 확인되었다. 상기 시험예 7의 일련의 결과로부터 피험물질이 L-PGDS의 뇌 내 발현량을 증가시킴으로써 뇌 내 아밀로이드β의 침착을 저해하고, 나아가서는 인지 기능을 개선시키는 가능성이 생각되었다.
시험예 8: 인간 유래 페리사이트에 있어서의 L-PGDS 발현 촉진 요인의 검토(고전적 RT-PCR법)
상술한 바와 같이 피험물질에 대한 응답성이 확인된 iSC는 뇌 페리사이트로부터 유래된다고 생각되어 있는 점에서 시판된 인간 유래 페리사이트주 Human brain vascular pericytes(ScienCell Research Laboratories, Inc.)에 있어서 상이한 산소 및/또는 글루코스 농도의 조건하에서 피험물질의 L-PGDS 발현능을 조사했다. 구체적으로는 0, 50, 500mNU/mL의 각 용량의 피험물질 존재하, 각각 (1) iSC가 반응성을 나타내는 조건(4.5g/L 글루코스 및 20% O2), (2) 저글루코스 조건(90mg/L 글루코스 및 20% O2) 및 (3) 저산소·저글루코스 조건(90mg/L 글루코스 및 1% O2)으로 iSC를 4일간 배양(FBS 불포함 DMEM 배지 F/-/-)했다. RNeasy Mini Kit(QIAGEN GmbH)에 의해 회수된 전체 RNA에 대해서 SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum(Invitrogen Corporation)을 사용한 고전적 RT-PCR법에 의해 L-PGDS 유전자(PTGDS)의 발현량을 반정량했다(35 사이클). PCR 산물을 2% 아가로오스겔 전기영동에 의해 분리하고, PTGDS 및 β-Actin의 밴드를 브롬화에티듐으로 염색해서 가시적으로 검출했다. 또한, PTGDS 및 β-Actin용 프라이머는 상기 시험예 2-1에서 사용한 것과 동일한 것을 사용했다. 결과의 일례를 도 15에 나타낸다.
도 15에 나타내어지는 바와 같이 조건 (1)에서 배양한 세포의 L-PGDS 유전자의 전사는 검출 가능했지만 피험물질에 대한 응답성은 관찰되지 않았다. 한편, 저산소(1%)이며, 또한 저글루코스 농도(90㎎/L)인 조건 (3)에서 배양한 세포에 있어서는 피험물질에 대한 현저한 응답성이 관찰되었다. 저산소·저글루코스 조건은 뇌 내의 허혈 상태를 모방한다고 생각되기 때문에 이와 같은 병태 시에 페리사이트(또는 iSC)가 외계의 자극에 대한 응답성을 획득하고, L-PGDS와 같은 세포 보호성의 단백을 유리하는 것으로 생각되었다.
(산업상 이용가능성)
L-PGDS는 주로 뇌 내에 발현되어 여러 가지 소수성 저분자의 결합·수송 및 스캐빈저로서의 역할을 담당하고, 뇌 내 환경 조정·뇌 보호 기능이나 수면 조절 기능 등의 여러 가지 기능을 갖는 단백질이라고 되어 있는 점에서 본 발명 L-PGDS 산생 촉진제는 뇌경색 등의 뇌혈관 장해, 알츠하이머병 등의 인지증, 불면증 등의 L-PGDS가 관여하는 질환의 예방·치료 또는 재발 예방약으로서 유용하다. 특히, 본 추출물 및 본 추출물을 함유하는 제제는 우수한 L-PGDS 산생 촉진제임과 아울러, 부작용 등의 문제점이 적고, 안정성이 높은 약제로서 유용성이 높은 것이다. 또한, 페리사이트 또는 페리사이트로부터 탈분화한 iSC에 있어서의 L-PGDS 산생 촉진 작용을 지표로 해서 L-PGDS가 관여하는 질환의 예방·치료 또는 재발 예방에 유용한 물질, 특히 뇌 보호 작용 또는 수면 작용을 갖는 물질의 본 발명 스크리닝 방법은 새로운 치료약의 개발에 기여하는 매우 유용한 방법이다.
SEQUENCE LISTING <110> Hyogo College of Medicine Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Agent for Promoting the Production of Lipocalin-type Prostaglandin D2 Synthase <130> FP-961 <160> 8 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <223> Inventor: MATSUYAMA, Tomohiro; NAKAGOMI, Takayuki; FUKUDA, Yu <400> 1 gactctgaag gacgagctga ag 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 tcttgaatgc acttatccgg ttgg 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 tacagcttca ccaccacagc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 aaggaaggct ggaaaagagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 cctccaactc aagctggttc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 atagttggcc tccaccactg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 atcactgcca cccagaagac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 cacattgggg gtaggaacac 20

Claims (24)

  1. 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물이 함유하는 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
  3. 제 1 항에 있어서,
    백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물을 함유하는 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소가 페리사이트 또는 페리사이트로부터 탈분화한 허혈 유도성 다능성 간세포에 있어서 산생되는 것인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뇌 보호약인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
  6. 제 5 항에 있어서,
    뇌 보호약의 작용이 뇌 내 배출계에 대한 항진 작용에 의한 것인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    뇌 보호약이 뇌경색의 예방·치료 또는 재발 예방약인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
  8. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    뇌 보호약이 인지증의 예방·치료약인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
  9. 제 8 항에 있어서,
    인지증이 알츠하이머형 인지증인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
  10. 제 9 항에 있어서,
    아밀로이드β 침착의 저해 작용을 갖는 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
  11. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    수면약인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
  12. 제 2 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    염증 조직이 토끼의 염증 피부 조직인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    주사제인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
  14. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    경구제인 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소 산생 촉진제.
  15. 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 발현 촉진 작용을 지표로 하는 뇌 보호 작용 또는 수면 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    페리사이트 또는 페리사이트로부터 탈분화한 허혈 유도성 다능성 간세포에 있어서의 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 발현 촉진 작용을 지표로 하는 스크리닝 방법.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
    뇌 보호 작용을 갖는 물질이 뇌경색의 예방·치료 또는 재발 예방약 또는 인지증의 예방·치료약인 스크리닝 방법.
  18. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어진 뇌 보호 작용 또는 수면 작용을 갖는 물질.
  19. 제 18 항에 있어서,
    뇌 보호 작용이 아밀로이드β의 배출 작용에 의한 것인 물질.
  20. 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 발현 촉진 작용을 지표로 하는 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물 또는 이것을 함유하는 제제의 판정 또는 평가 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    페리사이트 또는 페리사이트로부터 탈분화한 허혈 유도성 다능성 간세포에 있어서의 리포칼린형 프로스타글란딘 D2 합성 효소의 발현 촉진 작용을 지표로 하는 판정 또는 평가 방법.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    염증 조직이 토끼의 염증 피부 조직인 판정 또는 평가 방법.
  23. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 기재된 판정 또는 평가를 행함으로써 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물 또는 이것을 함유하는 제제의 품질 규격을 담보하는 방법.
  24. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 기재된 판정 또는 평가를 행함으로써 품질 규격이 담보된 백시니아 바이러스 접종 염증 조직 추출물 또는 이것을 함유하는 제제.
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