JP5903044B2 - 被検物質の判定又は評価方法 - Google Patents
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Description
kinase:MAPキナーゼキナーゼ)/ERK(extracellular-signal-regulated kinase)経路によるCREB活性化、並びにPI3K(phosphoinositide 3-kinase)/Akt経路によるCREB活性化(本願では、両経路を合わせてMAPキナーゼ/CREB経路という。)が導かれるとされている。
(a)ワクシニアウイルスを接種し発痘させたウサギ、マウス等の皮膚組織等を採取し、発痘組織を破砕し、水、フェノール水、生理食塩液またはフェノール加グリセリン水等の抽出溶媒を加えた後、濾過または遠心分離することによって抽出液(濾液または上清)を得る。
(b)前記抽出液を酸性のpHに調整して加熱し、除蛋白処理する。次いで除蛋白した溶液をアルカリ性に調整して加熱した後に濾過または遠心分離する。
(c)得られた濾液または上清を酸性とし活性炭、カオリン等の吸着剤に吸着させる。
(d)前記吸着剤に水等の抽出溶媒を加え、アルカリ性のpHに調整し、吸着成分を溶出することによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物を得ることができる。その後、所望に応じて、適宜溶出液を減圧下に蒸発乾固または凍結乾燥することによって乾固物とすることもできる。
(a)について
ワクシニアウイルスを接種し炎症組織を得るための動物としては、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、ラット、マウスなどワクシニアウイルスが感染する種々の動物を用いることができ、炎症組織としてはウサギの発痘皮膚組織が好ましい。
得られた乳状抽出液を濾過又は遠心分離等によって組織片を除去した後、除蛋白処理を行う。除蛋白操作は、通常行われている公知の方法により実施でき、加熱処理、タンパク質変性剤、例えば、酸、塩基、尿素、グアニジン、アセトン等の有機溶媒などによる処理、等電点沈澱、塩析等の方法を適用することができる。次いで、不溶物を除去する通常の方法、例えば、濾紙(セルロース、ニトロセルロース等)、グラスフィルター、セライト、ザイツ濾過板等を用いた濾過、限外濾過、遠心分離などにより析出してきた不溶タンパク質を除去する。
こうして得られた有効成分含有抽出液を、塩酸、硫酸、臭化水素酸等の酸を用いて酸性、好ましくはpH3.5乃至5.5に調整し、吸着剤への吸着操作を行う。使用可能な吸着剤としては、活性炭、カオリン等を挙げることができ、抽出液中に吸着剤を添加し撹拌するか、抽出液を吸着剤充填カラムに通過させて、該吸着剤に有効成分を吸着させることができる。抽出液中に吸着剤を添加した場合には、濾過や遠心分離等によって溶液を除去して、有効成分を吸着させた吸着剤を得ることができる。
吸着剤より有効成分を溶出(脱離)させるには、前記吸着剤に溶出溶媒を加え、室温又は適宜加熱して或いは撹拌して溶出し、濾過や遠心分離等の通常の方法で吸着剤を除去して達成できる。用いられる溶出溶媒としては、塩基性の溶媒、例えば塩基性のpHに調整した水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等又はこれらの適当な混合溶液を用いることができ、好ましくはpH9乃至12に調整した水を使用することができる。
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し、発痘した皮膚を剥出し、これを破砕してフェノール水を加えた。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸でpH5に調整した後、90〜100℃で30分間加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸化ナトリウムでpH9とし、さらに90〜100℃で15分間加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約pH4.5に調整し、2%の活性炭を加えて2時間撹拌した後、遠心分離した。採取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH10とし、60℃で1.5時間撹拌した後、遠心分離濾過して上清を得た。採取した活性炭に再び水を加え、水酸化ナトリウムでpH11とし、60℃で1.5時間撹拌した後、遠心分離して上清を得た。両上清を合せて、塩酸で中和し、ワクシニアウイルス接種家兔炎症皮膚抽出物を得た。
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し感染させた後、発痘した皮膚を無菌的に剥出しこれを細切した後フェノール加グリセリン水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状とした。次いでこれを濾過し、得た濾液を塩酸で弱酸性(pH4.5乃至5.5)に調整した後、100℃で加熱処理し濾過した。濾液を水酸化ナトリウムで弱アルカリ性(pH8.5乃至10.0)とし、さらに100℃で加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約pH4.5とし、約1.5%の活性炭を加えて1乃至5時間撹拌した後濾過した。濾取した活性炭に水を加え水酸化ナトリウムでpH9.4乃至10に調整し、3乃至5時間撹拌した後、濾過し濾液を塩酸で中和した。
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し、活性化させた後、活性化した皮膚を無菌的に剥出し、これを細切して水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状物とした。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸でpH5.0に調整した後、流通蒸気下100℃で加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸化ナトリウムでpH9.1とし、さらに100℃で加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸でpH4.1に調整し、活性炭2%を加えて2時間撹拌した後濾過した。濾液は更に活性炭5.5%を加えて2時間攪拌した後濾過した。最初に濾取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH9.9とし、60℃で1.5時間撹拌した後濾過した。最初の活性炭及び次の活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH10.9とし、60℃で1.5時間撹拌した後濾過した。濾液を合わせ塩酸で中和した後、分子量100の膜を用いた電気透析法で脱塩処理を行い、減圧下に乾固した。
System version 8.2、SAS Institute Japan社)により統計解析し、0.05(5%)及び0.01(1%)を有意水準として有意差検定を行った。
SH-SY5Y細胞(5×105細胞)を被検物質(30mNU/mL)又はポジティブコントロールとしてレチノイン酸(1μM)で処理し、無血清DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培地で0、1、3、6、12、18、24時間培養した。培養上清を除去した後、トータルRNAをトリゾル試薬(Invitrogen社)により単離し、回収率と純度を260nm及び280nmの紫外部吸収より測定した(GeneQuant Pro、GE Healthcare社)。RNA等量をスーパースクリプトIIIファーストストランドDNA合成キット(Invitrogen社)によってランダムプライマーを用いて一本鎖DNAに逆転写し、続いてTaq DNAポリメラーゼ(Invitrogen社)による半定量的PCR(Polymerase chain reaction)を行った。なお、BDNF及びシクロフィリンA(内部標準遺伝子)用のPCRプライマー(Invitrogen社)はYamamoto等の方法(Neurochemical Research、21巻、8号、929−938頁、1996年)に従って設計した。PCR産物を3%アガロースゲル(NuSieve 3:1 アガロース、タカラバイオ社)電気泳動により分離し、BDNF及びシクロフィリンAのバンドをエチジウムブロマイド(0.1μg/mL)染色して可視的に検出した。PCRにおける鋳型と産物の量の直線性は別途確認した。上記試験結果の一例を図1に示す。
SH-SY5Y細胞(約5×105細胞)を被検物質(0、2、10、50、250mNU/mL)で処理し、無血清DMEM培地で24時間培養した。次に、上記薬理試験1と同様に、抽出したトータルRNAについて半定量的PCRを行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離して、NGF、BDNF、NT-3、TrkA、TrkB及びGAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)のバンドを可視的に検出した。なお、NGF、BDNF及びNT-3用の各PCRプライマー(Invitrogen社)はYamamoto等の方法(Neurochemical Research、21巻、8号、929−938頁、1996年)に従って設計し、TrkA(Tropomyosin-related kinase A)、TrkB(Tropomyosin-related kinase B)及びGAPDH用の各PCRプライマー(Sigma Genosys社)は以下の配列として独自に設計した〔TrkA(178bp):5'-tggacaaccctttcgagttc-3'
5'-cgtccacatttgttgagcac-3'、TrkB(188bp):5'-ccgagattggagcctaacag-3' 5'-tgcaggttgctgtttttcag-3'、GAPDH:5'-atcactgccacccagaagac-3' 5'-tttctagacggcaggtcagg-3'〕。
5'-atgggattgcacttggtctc-3'、GAPDH:5'-atcactgccacccagaagac-3' 5'-tttctagacggcaggtcagg-3'〕。結果は、GAPDHに対するBDNFの転写コピー数の比率を8回測定した平均値を得、コントロール(生理食塩水処理)を1.0とした場合の値として表示した。上記試験の半定量的PCRの結果の一例を図2に、定量的PCRの結果の一例を図3に示す。
SH-SY5Y細胞(1×106細胞)を被検物質(0、2、10、50mNU/mL)存在下で24時間培養した。次に、SH-SY5Y細胞(1×106細胞)をプレートよりこそげ取り、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、細胞ペレットをプロテアーゼ阻害剤混合物(Sigma社)を含有する溶解バッファー(20mM HEPES:4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic
acid;pH7.2、1%Nonidet P-40、10%glycerol、50mM NaF、1mM phenylmethylsulfonyl fluoride、1mM NaVO4)で処理した。細胞残屑を除去した後、ELISA(enzyme-lnked immuno-solvent assay、酵素免疫測定法)を行うまで細胞溶解物を-80℃で保存した。なお、細胞溶解物のタンパク含量はBCAタンパクアッセイキット(Thermo Fisher Scientific社)で測定した。
peroxidase :HRP)で標識した種特異的抗体により検出した。結合していない標識抗体を除去した後、マイクロプレートリーダー(Benchmark microplate reader、BioRad社)で450nmにおける発色性基質を測定して、結合している酵素の活性を算定した。これらキットを使用して、3.9〜500pg/mLの範囲で細胞内BDNFを定量した。なお、他の神経栄養因子タンパク質との交差反応は2%未満である。結果はn=3の平均値及び標準誤差で示した。上記試験結果の一例を図4に示す。
SH-SY5Y細胞(5×105細胞)を被検物質(0、2、10、50mNU/mL)で24時間培養した。次に、上記薬理試験1と同様に、単離したRNAについて半定量的RT-PCRを行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離して、c-Fosのバンドを可視的に検出した。なお、c-Fos用のPCRプライマー(Sigma
Genosys社)は以下の配列として独自に設計した〔c-Fos (178bp):5'-gcttcccttgatctgactgg-3' 5'-atgatgctgggaacaggaag-3'〕。上記試験結果の一例を図5に示す。
細胞内シグナル伝達分子を、CREB(MAB5432;Millipore社)、リン酸化CREB(P-CREB:Clone 10E9;Millipore社)、P42/44 MAPキナーゼ(ERK1/2;Cell Signaling Technology社)、リン酸化P42/44 MAPキナーゼ(P-MAPK: Tyr202/Tyr204;Cell Signaling Technology社)及びc-Fos(Gene Tex社)に対して産生される各特異抗体を用いてイムノブロット法により検出した。すなわち、まずSH-SY5Y細胞(1×106細胞)を無血清DMEM培地で6時間培養し、ヒトリコンビナントBDNF(50pg/mL;Peprotech社)又は被検物質(0、2、10、50mNU/mL)で10分又は30分間処理した。次いで、該細胞をセルスクレイパー(BD Biosciences社)でこそげ取り、すぐに氷冷したPBSで洗浄した後、Mutoh等の方法(Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America、92巻、5087−5091頁、1995年)に従って細胞溶解した。細胞溶解物について4〜20%ゲル(ePAGEL;Atto Chmicals社)のSDS-PAGE電気泳動を行い、PVDF(Polyvinylidene floride)メンブレンにブロッティングした。該メンブレンを3%無脂肪乳及び0.1%Tween20(TBS-T)を含有するトリス緩衝生理食塩水(TBS;20mM Tris-HCl、pH 7.5、0.15M NaCl)で1時間ブロッキングした後、一次抗体及びHRP標識二次抗体との反応をTBS-T中室温で1時間行った。CREB、リン酸化CREB、P42/44 MAPキナーゼ、リン酸化P42/44 MAPキナーゼ及びc-Fosの免疫反応性バンドを電気化学的発光による検出システム(ECL;GE Healthcare社)により可視的に検出した。上記試験結果の一例を図6に示す。
SH-SY5Y細胞(5×105細胞)を被検物質(10mNU/mL)存在下、無血清DMEM培地中で24時間培養した。培養終了30分前に、培地に溶解したPD98059(MEK阻害剤、10μM)、LY294002(PI-3K阻害剤、15μM)又はSB203580(p38 MAPK阻害剤、0.5μM)を培養物に添加した。次に、上記薬理試験1と同様に、抽出したトータルRNAについて半定量的RT-PCRを行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離して、BDNF及びシクロフィリンAのバンドを可視的に検出した。上記試験結果の一例を図7に示す。
SH-SY5Y細胞を24well培養プレートに3.75×105細胞/wellで播種し、無血清DMEM培地において、被検物質(2、10、50 mNU/mL)又はポジティブコントロールとしてのフォルスコリン(10μM;Sigma社)で30分間処理した。培養上清を除去した後、すぐに300μL/wellの0.1M塩酸で4℃にて細胞溶解した。細胞溶解物の細胞内cAMP含有量をEIA(enzyme
immunoassay)キット(Cayman Chemicals社)により、メーカーの使用説明書に従って直接測定した。なお、タンパク質濃度はBSA標準液(Thermo Fisher Scientific社)を用いたBCAプロトコール(Thermo Fisher Scientific社)により測定した。結果は4回測定の平均値及び標準偏差で示す。上記試験結果の一例を図8に示す。
SH-SY5Y細胞(5×105細胞)を被検物質(10mNU/mL)で無血清DMEM培地中24時間培養した。培養終了30分前に、K252a(チロシンキナーゼ阻害剤、500nM)又はヒトTrkB特異抗体のウサギIgG(αTrkB、20μg/mL)を培養物に添加した。次に、上記薬理試験1と同様に、抽出したトータルRNAについて半定量的RT-PCRを行い、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離して、BDNF及びシクロフィリンAのバンドを可視的に検出した。上記試験結果の一例を図9に示す。
細胞表面のTrkB分子の密度を一部改良されたSerresとCarneyの方法(Brain Research、1101巻、36-42頁、2006年)により測定した。すなわち、まず、SH-SY5Y細胞を1×105/mLで播種して培養し、1%FCS含有DMEM培地において被検物質(2, 10, 50 mU/mL)で処理した。受容体の内在化を防ぐために0.1mM塩化カルシウムと1mM塩化マグネシウムを添加した氷冷PBSで細胞を3回洗浄した。次に、細胞表面上の分子を、PBSに溶解した250μg/mL EZ-Link
sulfo-LC-LC-NHS-biotin(Thermo Fisher Scientific社)により4℃で30分間ビオチン化した。未反応のビオチン化試薬を抑制するために10mMグリシン含有氷冷PBSで2回洗浄した後、プロテアーゼ阻害剤混合物(Sigma社)を含有する最低量の細胞溶解バッファー(1% Nonidet P-40、0.5% sodium deoxycholate、0.1% SDS in PBS)で細胞溶解した。タンパク濃度を細胞溶解バッファーで50μg/mLに調整して試料とした。
Santa Cruz Biotechinology社)を1:1,000に希釈して添加し、1時間置いた。洗浄後、HRPで標識した抗ウサギIgG(1:1,000、 100μL;AP132P、Chemicon
International社)を添加して1時間置き、次いで、TMB
One Substrate(100μL;Promega社)との酵素反応を行った。0.1N塩酸(50μL)を添加して反応を停止し、結合した特異的抗体を450nmでの吸光度を測定することにより定量した(Benchmark
micloplate reader)。結果はn=3の平均値及び標準誤差で示し、コントロールに対するパーセンテージで表示した。上記試験結果の一例を図10に示す。
(1)被検物質によるSH-SY5Y細胞におけるBDNF発現促進
薬理試験1の結果(図1)より、SH-SY5Y細胞を被検物質で処理することにより、BDNFの発現がmRNAレベルで経時的に亢進されることが確認された。また、培養24時間後の被検物質によるBDNF誘導の強さは、ポジティブコントロールであるレチノイン酸と同程度であった。
BDNF等の発現はTrk受容体の下流に位置するRas-MAPキナーゼカスケードやCREBのリン酸化等、細胞内シグナル伝達カスケードにより制御されていることが知られている(Current Opinion in Neurobiology、11巻、272−280頁、2001年)。BDNFの発現と同様に、プロトオンコジーン遺伝子であるc-Fosの発現もCREBの活性化により上昇するが、薬理試験4の結果(図5)より、SH-SY5Y細胞を被検物質で処理することによって、c-Fosの発現が亢進されることが確認された。
細胞外から与えたBDNFでも同様にこれらCREBや42/44MAPキナーゼのリン酸化を亢進したが、図1に示した通り、被検物質によるBDNFの発現促進作用は比較的時間がかかるため、細胞外に放出促進されたBDNFがこの被検物質の作用を間接的に起こしているのではないと考えられた。また、この結果に符合して、PI3K、MEK1/2、p38MAPKはいずれもTrkB受容体から開始されるCREB活性化経路のモジュレーター(介在するタンパク質)であるが、薬理試験6の結果(図7)より、これらモジュレーターに対する阻害剤によって、被検物質によるBDNFの発現促進が抑制されることが認められた。つまり、PI3K阻害剤(LY294002)によってAktのリン酸化が、MEK1/2阻害剤(PD98059)によってERK1/2のリン酸化が、p38MAPK阻害剤(SB203580)によってCREBのリン酸化が各々阻害される。このことから、被検物質はPI3K/MAPキナーゼ経路やRas-MAPキナーゼカスケードといった上流のシグナル伝達カスケードを標的とすると考えられた。
MAPキナーゼ/CREB経路における神経作用はTrkBの活性化を通じて協調的に調節されることが知られているが、上記薬理試験より、被検物質の作用におけるTrkBの関与が明らかにされた。具体的には、薬理試験8の結果(図9)より、チロシンキナーゼ阻害剤K252a又はTrkB特異抗体の存在下で、被検物質により促進されたBDNFの発現はほほ完全に抑制されることが確認された。このことより、被検物質は直接TrkBを標的にして内因性のチロシンキナーゼを活性化し、MAPキナーゼ/CREB経路の活性化によりBDNFの発現を促進していると考えられた。
(1)細胞における神経栄養因子の発現に対する作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。
(2)作用が発現促進作用である(1)記載の判定又は評価方法
(3)神経栄養因子がBDNFである(1)又は(2)記載の判定又は評価方法。
(4)神経栄養因子がNGF又はNT-3である(1)又は(2)記載の判定又は評価方法。
(5)細胞におけるCREBに対する作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。
(6)作用がCREBのリン酸化促進作用である(5)記載の判定又は評価方法。
(7)CREBのリン酸化促進作用をc−Fosの産生を測定して指標とする(6)記載の判定又は評価方法。
(8)細胞におけるMAPキナーゼ/CREB経路に介在するタンパク質活性化に対する作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。
(9)作用がタンパク質のリン酸化促進作用である(8)記載の判定又は評価方法。
(10)MAPキナーゼ/CREB経路に介在するタンパク質が、MEK/ERK経路におけるタンパク質である(9)記載の判定又は評価方法。
(11)MEK/ERK経路におけるタンパク質が、Grb2、Sos、Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2又はRskである(10)記載の判定又は評価方法。
(12)MAPキナーゼ/CREB経路に介在するタンパク質が、PI3K/Akt経路におけるタンパク質である(11)記載の判定又は評価方法。
(13)PI3K/Akt経路におけるタンパク質が、PI3K、Akt又はP38MAPKである(12)記載の判定又は評価方法。
(14)細胞が培養細胞である(1)乃至(13)にいずれかに記載の判定又は評価方法。
(15)細胞がSH-SY5Y細胞である(14)記載の判定又は評価方法。
(16)炎症組織が皮膚組織である(1)乃至(15)のいずれかに記載の判定又は評価方法。
(17)炎症組織がウサギの炎症皮膚組織である(1)乃至(15)のいずれかに記載の判定又は評価方法。
(18)(1)乃至(17)のいずれかに記載の判定又は評価方法によって品質規格が担保されたワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物。
(19)(1)乃至(17)のいずれかに記載の判定又は評価を行うことによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の品質規格を担保する方法。
Claims (18)
- 細胞におけるBDNF又はNT-3の発現に対する作用を指標とするワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の判定又は評価方法。
- 神経栄養因子がBDNFである請求項1記載の判定又は評価方法。
- 神経栄養因子がNT-3である請求項1記載の判定又は評価方法。
- BDNF又はNT-3の発現に対する作用が促進作用である請求項1乃至3のいずれか一項記載の判定又は評価方法。
- BDNF又はNT-3の発現に対する作用を、細胞におけるCREBに対する作用を指標として測定する請求項1乃至4のいずれか一項記載の判定又は評価方法。
- CREBに対する作用がCREBのリン酸化促進作用である請求項5記載の判定又は評価方法。
- CREBのリン酸化促進作用をc−Fosの発現亢進を指標として測定する請求項6記載の判定又は評価方法。
- BDNF又はNT-3の発現に対する作用を、細胞におけるMAPキナーゼ/CREB経路に介在するタンパク質活性化に対する作用を指標として測定する請求項1乃至4のいずれか一項記載の判定又は評価方法。
- MAPキナーゼ/CREB経路に介在するタンパク質が、MEK/ERK経路におけるタンパク質である請求項8記載の判定又は評価方法。
- MEK/ERK経路におけるタンパク質が、Grb2、Sos、Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2又はRskである請求項9記載の判定又は評価方法。
- MAPキナーゼ/CREB経路に介在するタンパク質が、PI3K/Akt経路におけるタンパク質である請求項8記載の判定又は評価方法。
- PI3K/Akt経路におけるタンパク質が、PI3K、Akt又はP38MAPKである請求項11記載の判定又は評価方法。
- MAPキナーゼ/CREB経路に介在するタンパク質活性化に対する作用がタンパク質のリン酸化促進作用である請求項8乃至12のいずれか一項記載の判定又は評価方法。
- 細胞が培養細胞である請求項1乃至13のいずれか一項記載の判定又は評価方法。
- 細胞がSH-SY5Y細胞である請求項14記載の判定又は評価方法。
- 炎症組織が皮膚組織である請求項1乃至15のいずれか一項記載の判定又は評価方法。
- 炎症組織がウサギの炎症皮膚組織である請求項1乃至15のいずれか一項記載の判定又は評価方法。
- 請求項1乃至17のいずれか一項記載の判定又は評価を行うことによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出物の品質規格を担保する方法。
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