JP3818657B2 - 乾燥物及びその製造方法 - Google Patents
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Description
(a)ワクシニアウイルスを接種し発痘させたウサギの皮膚組織を採取し、発痘組織を破砕し、水、フェノール水、生理食塩液又はフェノール加グリセリン水等の抽出溶媒を加えた後、濾過又は遠心分離することによって抽出液(濾液又は上清)を得る。
(b)前記抽出液を酸性のpHに調整して加熱し、除蛋白処理する。次いで除蛋白した溶液をアルカリ性に調整して加熱した後に濾過又は遠心分離する。
(c)得られた濾液又は上清を酸性とし活性炭、カオリン等の吸着剤に吸着させる。
(d)前記吸着剤に水等の抽出溶媒を加え、アルカリ性のpHに調整し、吸着成分を溶出することによってワクシニアウイルス接種炎症組織抽出液を得ることができる。その後、適宜中性付近のpHに調整して、製剤用原体とすることもできる。
上記各工程を更に詳しく述べると次のとおりである。
ワクシニアウイルスを家兎等のウサギに接種して発痘させた炎症皮膚組織を採取して破砕し、その1乃至5倍量の抽出溶媒を加えて乳化懸濁液とする。抽出溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、弱酸性乃至弱塩基性の緩衝液などを用いることができ、グリセリン等の安定化剤、フェノール等の殺菌・防腐剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類などを適宜添加してもよい。この時、凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵素又は界面活性剤等の処理により細胞組織を破壊して抽出を容易にすることもできる。
得られた乳状抽出液を濾過又は遠心分離等によって組織片を除去した後、除蛋白処理を行う。除蛋白操作は、通常行われている公知の方法により実施でき、加熱処理、蛋白質変性剤、例えば、酸、塩基、尿素、グアニジン、アセトン等の有機溶媒などによる処理、等電点沈澱、塩析等の方法を適用することができる。次いで、不溶物を除去する通常の方法、例えば、濾紙(セルロース、ニトロセルロース等)、グラスフィルター、セライト、ザイツ濾過板等を用いた濾過、限外濾過、遠心分離等により析出してきた不溶蛋白質を除去する。
こうして得られた有効成分含有抽出液を、塩酸、硫酸、臭化水素酸等の酸を用いて酸性、好ましくはpH3.5乃至5.5に調整し、吸着剤への吸着操作を行う。使用可能な吸着剤としては、活性炭、カオリン等を挙げることができ、抽出液中に吸着剤を添加し撹拌するか、抽出液を吸着剤充填カラムに通過させて、該吸着剤に有効成分を吸着させることができる。抽出液中に吸着剤を添加した場合には、濾過や遠心分離等によって溶液を除去して、有効成分を吸着させた吸着剤を得ることができる。
吸着剤より有効成分を溶出(脱離)させるには、前記吸着剤に溶出溶媒を加え、室温又は適宜加熱して或いは撹拌して溶出し、濾過や遠心分離等の通常の方法で吸着剤を除去して達成できる。用いられる溶出溶媒としては、塩基性の溶媒、例えば塩基性のpHに調整した水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等又はこれらの適当な混合溶液を用いることができ、好ましくはpH9乃至12に調整した水を使用することができる。
参考例1
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し、発痘した皮膚を剥出し、これを破砕してフェノール水を加えた。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸でpH5に調整した後、90〜100℃で30分間加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸化ナトリウムでpH9とし、さらに90〜100℃で15分間加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約pH4に調整し、2%の活性炭を加えて2時間撹拌した後、遠心分離した。採取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH10とし、60℃で1.5時間撹拌した後、遠心分離して上清を得た。遠心分離で沈澱した活性炭に再び水を加え、水酸化ナトリウムでpH11とし、60℃で1.5時間撹拌した後、遠心分離して上清を得た。両上清を合せて、塩酸で中和し、本抽出液を得た。
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し感染させた後、発痘した皮膚を無菌的に剥出しこれを細切した後フェノール加グリセリン水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状とした。次いでこれを濾過し、得た濾液を塩酸で弱酸性(pH4.5乃至5.5)に調整した後、100℃で加熱処理し濾過した。濾液を水酸化ナトリウムで弱アルカリ性(pH8.5乃至10.0)とし、さらに100℃で加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸で約pH4.5とし、約1.5%の活性炭を加えて1乃至5時間撹拌した後濾過した。濾取した活性炭に水を加え水酸化ナトリウムでpH9.4乃至10に調整し、3乃至5時間撹拌した後、濾過した。濾液を塩酸で中性付近に中和した。
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを接種し、活性化させた後、活性化した皮膚を無菌的に剥出し、これを細切して水を加え、ホモゲナイザーで磨砕し乳状物とした。次いでこれを加圧濾過し、得られた濾液を塩酸でpH5.0に調整した後、流通蒸気下100℃で加熱処理した。濾過して除蛋白した後、水酸化ナトリウムでpH9.1とし、さらに100℃で加熱処理した後濾過した。濾液を塩酸でpH4.1に調整し、活性炭2%を加えて2時間撹拌した後濾過した。濾液は更に活性炭5.5%を加えて2時間攪拌した後濾過した。最初に濾取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH9.9とし、60℃で1.5時間撹拌した後濾過した。最初の活性炭及び次の活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH10.9とし、60℃で1.5時間撹拌した後濾過した。濾液を合わせ塩酸で中和した後、分子量100の膜を用いた電気透析法で脱塩処理を行った。
血漿カリクレイン様物質産生に対する被験物質の阻害活性(KPI活性)を、文献記載の方法に従って測定した(「基礎と臨床」、第20巻、第17号、8889-8895頁、1986年)。即ち、同文献8890頁に詳述されているように、被験溶液と生理食塩水で希釈したヒト正常血漿を混合し、これにカオリン懸濁液を加えて血漿カリクレインの産生反応を開始させ、一定時間後にリマ豆トリプシンインヒビター(LBTI)等の活性型血液凝固第XII因子に対する特異的阻害剤を添加してカリクレインの産生反応を停止させた後、産生したカリクレインを発色性合成基質(S-2302、chromogenix社製)を用いて定量した。合成基質S-2302はカリクレインによって発色性のp-ニトロアニリンを遊離するため、遊離してくるp-ニトロアニリン量を405nmにおける吸光度で測定することにより産生したカリクレインの量(活性量)を測定できる。被験物質のKPI活性は、被験物質を添加しない群(コントロール)と被験物質添加群の吸光度差を求めることによって判定することができる。
上記参考例1に従って製造したワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液の乾固物重量を測定し、1mg/mL、pH9.5となるように被験抽出液を調製した。該被験抽出液100mLを量りとり、約40℃の温浸下で減圧下濃縮乾燥を行った。乾燥物に水を加えて溶かし1mg/mLの被験溶液とした。この被験溶液0.2mLと0.5M塩化ナトリウム溶液0.2mLを混和し、以下、上述したKPI活性測定法の試験操作に従って測定試験を実施した。表1は被験抽出液をそのまま濃縮乾燥した場合と乳糖を1重量%となるように添加して調製した被験抽出液を濃縮乾燥した場合の試験結果(n=2)の一例を示すものである。なお、コントロールは水である(以下、同じ)。
実施例1と同様に被験抽出液に乳糖を添加して濃縮乾燥した場合と被験抽出液の濃縮乾燥後に乳糖を添加した場合を比較した。また、ブランクとして乳糖溶液についても測定した。結果の一例を表2に示す。表2に示した結果のとおり、乳糖を添加しておき濃縮乾燥した被験溶液のみがKPI活性を示し、被験抽出液を濃縮乾燥後に乳糖を添加した場合及び乳糖のみの溶液の場合にはKPI活性は全く認められなかった。
乳糖以外の添加剤を実施例1と同様に被験抽出液に加え濃縮乾燥した結果を表3に示す。ブドウ糖(単糖類)やプルラン(多糖類)などの糖類を添加(いずれも1重量%)して乾燥したものはKPI活性を示したが、リン酸水素カルシウム等の糖類以外の賦形剤や水に不溶の多糖類である結晶セルロースやドウモロコシデンプンを用いた場合には、KPI活性は認められなかった。
上記実施例で記載した糖類以外の糖類を用いて実施例1と同様に行った結果を表4に示す(いずれも被験抽出液の1重量%を添加)。また、乳糖を0.5重量%、0.1重量%添加した場合の結果も同表に示した。表4は複数回の試験結果をまとめたものであり(コントロールの吸光度値:0.306〜0.363)、被験溶液の吸光度並びにそれとコントロールとの吸光度差(KPI活性)を示す。
実施例1と同様に、本抽出液の乾固物重量を測定し、1mg/mL、pH8.8乃至9.3となるように被験抽出液を調製した。該被験抽出液10Lを量りとり、約40℃の濃縮液温度で維持されるように温度調節しつつ減圧下にて濃縮を行った。200mL (50mg/mL)まで濃縮し、これに200gの乳糖及びその他の賦形剤や崩壊剤など約160gを添加し練合後、造粒乾燥した。こうして得られた乾燥顆粒は、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤を加え圧縮成型して錠剤を製造する等、経口用固形製剤にすることができる。
実施例1と同様に被験抽出液に乳糖を添加して濃縮乾燥するとき、被験抽出液を種々のpHに調整して試験を行った結果の一例を表6に示す。被験抽出液のpHが10.5の場合にはKPI活性がほとんど認められず、pH9.5から酸性になるに従って乾燥物のKPI活性は徐々に低下した。
実施例5記載の方法と同様にして本抽出液の乾燥顆粒を製造し、これを圧縮成型して錠剤を製造した。即ち、1錠中ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液の乾燥物4mg、乳糖104mg、結晶セルロース40mg、カルボキシメチルセルロースカルシウム20mgの成分量となるように各成分を練合後、造粒乾燥した。この乾燥顆粒にステアリン酸マグネシウム(1錠中2mgの含有量)を添加して混合し、打錠機で圧縮成型して錠剤を製造した。
処方例1と同様に、1錠中ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液の乾燥物5mg、乳糖80mg、リン酸水素カルシウム20mg、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース42mg、ヒドロキシプロピルセルロース2mg、ステアリン酸マグネシウム1mgを含有する錠剤を製造した。この素錠を、コーティング液(ヒドロキシプロピルセルロース40g、10gのマクロゴール6000、酸化チタン3g、タルク5g、レーキ色素0.5g、精製水941.5gを混合したもの)でスプレーコーティングしてフィルムコーティング錠を製造した。
Claims (23)
- ワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚抽出液に単糖類、オリゴ糖類及び/又は水に可溶な多糖類を加えて混合し、これを濃縮乾燥する該抽出液のカリクレイン様物質産生阻害活性を有する乾燥物の製造方法。
- ワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚抽出液を濃縮し、該抽出液が乾固する前に単糖類、オリゴ糖類及び/又は水に可溶な多糖類を加えて混合し、これを乾燥する該抽出液のカリクレイン様物質産生阻害活性を有する乾燥物の製造方法。
- ワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚抽出液を、ブドウ糖、マンノース、アラビノース、キシロース、ガラクトース又はソルボースの存在下に濃縮乾燥する該抽出液のカリクレイン様物質産生阻害活性を有する乾燥物の製造方法。
- ワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚抽出液を、乳糖、ショ糖、麦芽糖、ラフィノース又はメレチトースの存在下に濃縮乾燥する該抽出液のカリクレイン様物質産生阻害活性を有する乾燥物の製造方法。
- ワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚抽出液を、プルラン、デキストリン、β−シクロデキストリン又はデキストランの存在下に濃縮乾燥する該抽出液のカリクレイン様物質産生阻害活性を有する乾燥物の製造方法。
- 単糖類、オリゴ糖類及び/又は水に可溶な多糖類として、ブドウ糖、マンノース、アラビノース、キシロース、ガラクトース、ソルボース、乳糖、ショ糖、麦芽糖、ラフィノース、メレチトース、プルラン、デキストリン、β−シクロデキストリン及びデキストランのいずれか1種又は2種以上を用いる請求項1又は2に記載の乾燥物の製造方法。
- 該抽出液の濃縮乾燥を10以下のpHにて行うことを特徴とする請求項1乃至6のいずれか1項に記載の乾燥物の製造方法。
- 該抽出液の濃縮乾燥をpH8.5乃至9.7にて行うことを特徴とする請求項1乃至6のいずれか1項に記載の乾燥物の製造方法。
- ワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚抽出液に単糖類、オリゴ糖類及び/又は水に可溶な多糖類を加えて混合し、これを濃縮乾燥して得られる該抽出液のカリクレイン様物質産生阻害活性を有する乾燥物。
- ワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚抽出液を濃縮し、該抽出液が乾固する前に単糖類、オリゴ糖類及び/又は水に可溶な多糖類を加えて混合し、これを乾燥して得られる該抽出液のカリクレイン様物質産生阻害活性を有する乾燥物。
- ワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚抽出液を、ブドウ糖、マンノース、アラビノース、キシロース、ガラクトース又はソルボースの存在下に濃縮乾燥して得られる該抽出液のカリクレイン様物質産生阻害活性を有する乾燥物。
- ワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚抽出液を、乳糖、ショ糖、麦芽糖、ラフィノース又はメレチトースの存在下に濃縮乾燥して得られる該抽出液のカリクレイン様物質産生阻害活性を有する乾燥物。
- ワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚抽出液を、プルラン、デキストリン、β−シクロデキストリン又はデキストランの存在下に濃縮乾燥して得られる該抽出液のカリクレイン様物質産生阻害活性を有する乾燥物。
- 単糖類、オリゴ糖類及び/又は水に可溶な多糖類として、ブドウ糖、マンノース、アラビノース、キシロース、ガラクトース、ソルボース、乳糖、ショ糖、麦芽糖、ラフィノース、メレチトース、プルラン、デキストリン、β−シクロデキストリン及びデキストランのいずれか1種又は2種以上を用いる請求項9又は10に記載の乾燥物。
- 該抽出液の濃縮乾燥を10以下のpHにて行うことを特徴とする請求項9乃至14のいずれか1項に記載の乾燥物。
- 該抽出液の濃縮乾燥をpH8.5乃至9.7にて行うことを特徴とする請求項9乃至14のいずれか1項に記載の乾燥物。
- ワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚抽出液を濃縮し、該抽出液が乾固する前に少なくとも1種の単糖類、オリゴ糖類又は水に可溶な多糖類を含む賦形剤を加えて練合し、これを造粒乾燥して得られる該抽出液のカリクレイン様物質産生阻害活性を有する乾燥顆粒。
- ワクシニアウイルスを接種したウサギの炎症皮膚抽出液を濃縮し、該抽出液が乾固する前に少なくとも1種の単糖類、オリゴ糖類又は水に可溶な多糖類を含む賦形剤を加えて練合し、これを造粒乾燥して得られる乾燥顆粒を用いて製造した、該抽出液を有効成分として含有するカリクレイン様物質産生阻害活性を有する経口用固形製剤。
- 錠剤である請求18記載の経口用固形製剤。
- ワクシニアウイルスを接種した家兎の炎症皮膚抽出液を濃縮し、該抽出液が乾固する前に少なくとも1種の単糖類、オリゴ糖類又は水に可溶な多糖類を含む賦形剤を加えて練合し、これを造粒乾燥して得られる乾燥顆粒を用いて製造することによる、該抽出液を有効成分として含有するカリクレイン様物質産生阻害活性を有する経口用固形製剤の製造方法。
- ワクシニアウイルスを接種した家兎の炎症皮膚抽出液を濃縮し、該抽出液が乾固する前に少なくとも1種の単糖類、オリゴ糖類又は水に可溶な多糖類を含む賦形剤を加えて練合し、これを造粒乾燥して得られるカリクレイン様物質産生阻害活性を有する乾燥物。
- ワクシニアウイルスを接種した家兎の炎症皮膚抽出液を濃縮し、該抽出液が乾固する前に少なくとも1種の単糖類、オリゴ糖類又は水に可溶な多糖類を含む賦形剤を加えて練合し、これを造粒乾燥して得られるカリクレイン様物質産生阻害活性を有する乾燥顆粒。
- ワクシニアウイルスを接種した家兎の炎症皮膚抽出液を濃縮し、該抽出液が乾固する前に少なくとも1種の単糖類、オリゴ糖類又は水に可溶な多糖類を含む賦形剤を加えて練合し、これを造粒乾燥して得られる乾燥顆粒を用いて製造することによる、該抽出液を有効成分として含有するカリクレイン様物質産生阻害活性を有する経口用固形製剤。
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