JP5490939B2 - 抽出物及び製剤 - Google Patents

Description

本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸を所定の量含有するワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物及び当該抽出物を有効成分とする製剤等に関する。

医薬品は、その品質が確保されてはじめて、製造販売の承認が受けられるものである。日本においては、薬事法第１４条にこのことが定められている。その他の国々においても、医薬品の性格上、このような取扱いは基本的に同様である。このように医薬品において品質の確保が重要とされるのは、品質が医薬品の有効性と安全性を担保するものだからである。逆に言えば、品質が確保されていない医薬品は、有効性と安全性が担保されないことになり、医薬品としての適格を欠くことになる。

日本においては、医薬品の生産に使用される原料物質で、医薬品の有効成分となるものは「原薬」と呼ばれる。原薬もまた、医薬品と同様、その品質の確保が必要とされる。なぜなら、医薬品の品質は、原薬の品質に依存するからである。なお、日本の薬事関係法令においては、原薬は、専ら他の医薬品の製造のために用いられる医薬品とされており、定義上、原薬は医薬品に含まれている。しかしながら、本願においては、便宜上、医薬品と原薬を別々に呼ぶことがあり、この場合の医薬品は、原薬を除くものを意味する。

一般的に、医薬品や原薬は、所定の製造方法により製造されることで所定の品質のものが製造される。また、実際に所定の品質を有するかどうかは、製造された後に行われる試験や検査によって確認されている。そのような試験や検査の結果が、予め定められた基準に適合しない場合は、当該医薬品や原薬は、出荷、販売等が認められない。このようにして、医薬品や原薬は、その品質が管理されているのである。

ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物（以下「本抽出物」ということがある）は、ワクシニアウイルスを接種して発痘したウサギの炎症皮膚組織から抽出分離した非蛋白性の活性物質を含有する抽出物である。本抽出物は、抽出された状態では液体であるが、乾燥することにより固体にすることもできる。

本抽出物を有効成分として含有する製剤（以下「本製剤」ということがある）は、後述するとおり、医薬品として非常に有用なものである。この場合、本抽出物が本製剤の有効成分であるから、本抽出物は本製剤の原薬ということになる。本製剤として出願人が日本において製造し販売している具体的な商品に「ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液含有製剤」（商品名：ノイロトロピン/ NEUROTROPIN〔登録商標〕、以下「NTP製剤」という）がある。NTP製剤には、注射剤（以下「NTP注射剤」という）と錠剤（以下「NTP錠剤」という）があり、いずれも医療用医薬品（ethical drug）である。NTP製剤の有効成分であるワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液（以下「NTP抽出液」という）が、NTP製剤の原薬である。NTP抽出液は、本抽出物に包含され、NTP製剤（NTP注射剤とNTP錠剤）は本製剤に包含される。

NTP注射剤の適応症は、「腰痛症、頸肩腕症候群、症候性神経痛、皮膚疾患（湿疹、皮膚炎、蕁麻疹）に伴う掻痒、アレルギー性鼻炎、スモン（SMON）後遺症状の冷感・異常知覚・痛み」である。NTP錠剤の適応症は、「帯状疱疹後神経痛、腰痛症、頸肩腕症候群、肩関節周囲炎、変形性関節症」である。NTP製剤は、出願人が創製し、医薬品として開発したものである。NTP製剤は、その有効性と安全性における優れた特長が評価され、長年にわたり販売され、日本の医薬品市場で確固たる地位を確立しているものである。また、現在、NTP製剤は、中国に輸出され、「神経妥楽平/NEUROTROPIN」の商品名で販売されている。中国におけるNTP製剤の適応症は、日本と同じである。

このように、本製剤は医薬品として大変有用なものであり、本抽出物は本製剤の原薬としてやはり大変有用なものである。しかしながら、本抽出物は、上記のとおり、ワクシニアウイルスを接種して発痘したウサギの炎症皮膚組織から抽出分離したものである。そのため、本抽出物は極めて多数の物質（成分）を含有しており、本抽出物を用いて製造される本製剤もやはり極めて多数の物質（成分）を含有している。従って、本抽出物や本製剤の品質をいかに管理するかは、非常に重要な事項である。

多くの医薬品は、一種類あるいはせいぜい２〜３種類の物質（成分）を有効成分とする製剤であり、通常、それらの物質は化学的に合成される化合物である。そのため、当該製剤中の当該化合物の含有量を測定して、所定の量が含有されていれば、当該製剤の有効成分の含有量の面からの品質は担保される。しかしながら、本抽出物は、ワクシニアウイルスを接種して発痘したウサギの炎症皮膚組織からの抽出物で、極めて多種類の物質を含有している。本抽出物を有効成分とする本製剤も、当然ながら同様に極めて多種類の物質を含有している。このように、本抽出物や本製剤は、特定の一種類ないし数種類の物質を有効成分とするものではないことから、有効成分が物質として特定された通常の医薬品におけるような品質管理を行うことができない。そのため、出願人が製造する本抽出物及び本製剤、すなわちNTP抽出液及びNTP製剤の有効成分の定量（quantitative determination）は、その生物活性（力価、titer）を測定する方法によって行われている。

その方法とは、疼痛閾値が正常動物より低下した慢性ストレス動物であるSARTストレス（反復寒冷負荷）動物を用いて鎮痛係数を求める生物学的試験法である（「日薬理誌」、第72巻、第5号、573-584頁、1976年）。この文献に記載された方法により、疼痛閾値が正常動物より低下した慢性ストレス動物であるSARTストレス（反復寒冷負荷）動物を用いてランダル−セリット（Randall-Selitto）法により鎮痛試験を行って鎮痛係数を求める。この方法は、マウスの尾部に圧刺激を加え、マウスが逃避反応を示すまでの加圧重量を指標にして鎮痛効果を測定するものである。鎮痛係数とは、薬物を投与した後に測定した加圧重量を、薬物投与前の値で除した値である。NTP抽出液及びNTP製剤については、出願人が定めた一定値以上の鎮痛係数を示した場合を鎮痛効果陽性として、陽性と判定された動物匹数の割合を求め、鎮痛有効率（％）とする。この値から、種々の濃度に希釈した標準品について測定した結果よりED₅₀値を求める。出願人がNTP製剤について使用している生物活性（力価）の単位である「ノイロトロピン単位（NU）」とは、ED₅₀値が投与量100mg/kg（マウス体重）の本抽出物1mgの示す活性を１ノイロトロピン単位とすることにより定義されている。そして各NTP製剤についてED₅₀値を測定して、標準品と比較して鎮痛活性（有効成分量）を定量している。以下、本願においては、本抽出物及び本製剤の有効成分量（力価）の尺度として、「単位」という表示を用いるが、実質的には、NTP抽出液及びNTP製剤で用いられている「ノイロトロピン単位」と同じ意味である。

ところで、出願人が製造する本抽出物及び本製剤、すなわちNTP抽出液及びNTP製剤においては、上記鎮痛活性の定量以外にも、次のような複数の確認試験を行い、これらに適合すべきことが定められている。
・液体クロマトグラフ法によるアミノ酸の確認試験
・紫外可視吸光度測定法による紫外部吸収物質の確認試験
・呈色反応法によるリンの確認試験
・液体クロマトグラフ法による核酸塩基の確認試験
・in vitro試験法によるカリクレイン様物質産生阻害作用の確認試験

一般的に言って、動物や植物といった生物からの抽出物や、当該抽出物を有効成分として含有する製剤を製造する者にとっては、当該製剤が適合しなければならない基準は少ないほうが、試験や検査のための時間、労力、費用を要さず、また製造したものが不適合となる可能性も低くなるため、有利である。しかしながら、上記のような抽出物や製剤の品質を担保する観点からは、適合すべき基準がより厳格に定められている方が望ましい。本発明は、このような観点から、出願人が製造する本抽出物及び本製剤について、適合すべき新たな基準として適切なものを鋭意研究した結果見出したものである。これにより、本抽出物及び本製剤の品質がより安定的なものになる。また、これにより、本抽出物及び本製剤の有効性と安全性がより厳格に担保されるものである。

本抽出物あるいは本製剤を開示する文献として特許文献１乃至３が存在する。これらには、本抽出物あるいは本製剤におけるアミノ酸及び核酸塩基の含量に関する記載がある。また、同じく本抽出物あるいは本製剤に関して、特許文献４にはケイ素類の含有量に関する記載がある。しかしながら、これら特許文献１乃至４には、本抽出物あるいは本製剤がＮ−アセチルノイラミン酸という特定の物質をどれほど含有することについては何ら記載されていない。まして、それら文献には、本抽出物あるいは本製剤中のＮ−アセチルノイラミン酸の含有量を本抽出物あるいは本製剤の品質管理のための指標とすることについては、記載も示唆もされていない。

中国特許公開ＣＮ１２０５２３３Ａ公報 国際公開ＷＯ２００４／０６０３８１号公報 中国特許公開ＣＮ１６１３３０５Ａ公報 特開平７−９７３３６号公報

上記のとおり、本抽出物及び本製剤においては、有効成分として単一の物質が同定されていない。そのため、本抽出物及び本製剤の品質は、ＳＡＲＴストレスマウスを用いて鎮痛係数を求める生物学的試験による力価検定や複数の確認試験等により確保されている。それでもなお、本抽出物や本製剤に含まれる各種の成分は、製造ロット毎に相当程度ばらつきを有することが避けられない。しかしながら、本製剤が病気を治療するための医薬品として使用されるものである以上、その品質はできるだけ一定であることが望ましい。本抽出物及び本製剤の品質をより安定なものとして確保することは、本抽出物や本製剤の有効性や安全性をより恒常的なものにすることにつながり、非常に有意義なことである。

本発明は、本抽出物及び本製剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量を指標として、本抽出物及び本製剤の品質を確保するものである。これに基づき、本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸が規定された量含有されている本抽出物及び本製剤、本抽出物及び本製剤の品質をＮ−アセチルノイラミン酸の含有量によって管理又は評価する方法、あるいはそのような方法で品質が管理された本抽出物及び本製剤を提供するものである。

本発明に係る本抽出物及び本製剤は、Ｎ−アセチルノイラミン酸を所定の量含有しているものである。これにより、本抽出物及び本製剤の品質がより安定的に確保され、本抽出物及び本製剤の有効性と安全性がより恒常的となる。

Ｎ−アセチルノイラミン酸はシアル酸の一種である。シアル酸はノイラミン酸のアシル誘導体の総称であり、天然界には多種類のシアル酸が存在するが、その中でもＮ−アセチルノイラミン酸が最も多く、ついでＮ−グリコリルノイラミン酸が多い。シアル酸は糖蛋白、糖脂質、糖ペプチド等の構成成分として生体内に広く分布しており、特に、動物又は細菌の細胞膜表面に存在し、細胞の特異的認識機構への関与など、重要な生物学的機能を担っている。また、シアル酸は、癌、炎症、免疫、ウイルス感染、細胞分化、ホルモンレセプター等に関与する物質として医学的及び薬学的に重要視され、シアル酸含有生体成分やシアル酸及びその誘導体については種々の研究がなされている。

そのシアル酸、特にＮ−アセチルノイラミン酸について、出願人は、驚くべきことに、当該物質が鎮痛作用、特に神経因性疼痛（neuropathic pain disease）等の非炎症性疼痛疾患（non‐inflammatory pain diseases）に対する効果を有することを見出し、かかる知見を基に特許を取得しているものである（日本特許第4005115号、中国授権公告号CN101600438B）。出願人の製造販売するNTP製剤の特徴も神経因性疼痛等に対する治療効果であるので、本抽出物や本製剤の品質をより厳格に管理するための指標として、Ｎ−アセチルノイラミン酸は理にかなった物質（成分）である。

次に、本抽出物並びに本製剤を製造する方法について説明する。
本抽出物は、ワクシニアウイルスをウサギの皮膚に接種して発痘した炎症皮膚組織を採取し、破砕して抽出溶媒を加えて処理した後、組織片を除去し除蛋白処理を行い、これを酸性条件において吸着剤に吸着させ、次いで有効成分を塩基性条件において溶出することによって得ることができる。

ここで、ワクシニアウイルス（vaccinia virus）は、いかなる株のものであってもよい。例としては、リスター（Lister）株、大連（Dairen）株、池田（Ikeda）株、ＥＭ−６３株、ニューヨーク市公衆衛生局（New York City Board of Health）株等が挙げられる。

また、ウサギはウサギ目に属するものであればいかなるものでもよい。例としては、アナウサギ、カイウサギ（アナウサギを家畜化したもの）、ノウサギ（ニホンノウサギ）、ナキウサギ、ユキウサギ等がある。これらのうち、カイウサギが使用するには好適である。日本では過去から飼育され家畜又は実験用動物として繁用されている家兎（イエウサギ）と呼ばれるものがあるが、これもカイウサギの別称である。カイウサギには、多数の品種（ブリード）が存在するが、日本白色種やニュージーランド白色種（ニュージーランドホワイト）といった品種が好適に用いられ得る。

本抽出物の基本的な抽出工程としては、例えば、以下のような工程が用いられる。
（A）ワクシニアウイルスを皮内接種し発痘させたウサギの皮膚組織を採取し、発痘組織を破砕し、水、フェノール水、生理食塩液又はフェノール加グリセリン水等の抽出溶媒を加えて数日間抽出処理を行った後、濾過又は遠心分離することによって組織片が除去された粗抽出液（濾液又は上清）を得る。
（B）（A）で得られた粗抽出液を酸性のpHに調整して加熱し、濾過又は遠心分離して除蛋白処理する。次いで除蛋白した溶液を塩基性のpHに調整して加熱し、更に濾過又は遠心分離して除蛋白処理された濾液又は上清を得る。
（C）（B）で得られた濾液又は上清を酸性のpHに調整して、活性炭、カオリン等の吸着剤に吸着させる。
（D）（C）で得られた吸着剤に水等の抽出溶媒を加え、塩基性のpHに調整し、吸着成分を溶出することによってワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物（本抽出物）を得る。
以上が基本的な工程であるが、これらの工程を更に詳しく述べると次のとおりである。

（A）について
ウサギの皮膚にワクシニアウイルスを皮内接種して発痘させた炎症皮膚組織を採取する。採取した皮膚組織はフェノール溶液等で洗浄、消毒を行なう。この炎症皮膚組織を破砕し、その1乃至5倍量の抽出溶媒を加える。ここで、破砕とは、ミンチ機等を使用してミンチ状に細かく砕くことを意味する。また、抽出溶媒としては、蒸留水、生理食塩水、弱酸性乃至弱塩基性の緩衝液などを用いることができ、フェノール等の殺菌・防腐剤、グリセリン等の安定化剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類などを適宜添加してもよい。この時、凍結融解、超音波、細胞膜溶解酵素又は界面活性剤等の処理により細胞組織を破壊して抽出を容易にすることもできる。得られた懸濁液を、5日乃至12日間放置する。その間、適宜攪拌しながら又は攪拌せずに、30乃至45℃に加温してもよい。得られた液を濾過又は遠心分離等によって組織片を除去して粗抽出液（濾液又は上清）を得る。

（B）について
（A）で得られた粗抽出液について除蛋白処理を行う。除蛋白は、通常行われている公知の方法により実施でき、加熱処理、蛋白質変性剤（例えば、酸、塩基、尿素、グアニジン、アセトン等の有機溶媒など）による処理、等電点沈澱、塩析等の方法を適用することができる。次いで、不溶物を除去する通常の方法、例えば、濾紙（セルロース、ニトロセルロース等）、グラスフィルター、セライト、ザイツ濾過板等を用いた濾過、限外濾過、遠心分離などにより析出してきた不溶蛋白質を除去した濾液又は上清を得る。

（C）について
（B）で得られた濾液又は上清を、酸性、好ましくはpH3.5乃至5.5に調整し、吸着剤への吸着操作を行う。使用可能な吸着剤としては、活性炭、カオリン等を挙げることができ、抽出液中に吸着剤を添加し撹拌するか、抽出液を吸着剤充填カラムに通過させて、該吸着剤に有効成分を吸着させることができる。抽出液中に吸着剤を添加した場合には、濾過や遠心分離等によって溶液を除去して、活性成分を吸着させた吸着剤を得ることができる。

（D）について
（C）で得られた吸着剤から活性成分を溶出（脱離）させるには、当該吸着剤に溶出溶媒を加え、塩基性、好ましくはpH9乃至12に調整し、室温又は適宜加熱して或いは撹拌して溶出し、濾過や遠心分離等の通常の方法で吸着剤を除去する。用いられる溶出溶媒としては、塩基性の溶媒、例えば塩基性のpHに調整した水、メタノール、エタノール、イソプロパノール等又はこれらの適当な混合溶液を用いることができ、好ましくはpH9乃至12に調整した水を使用することができる。溶出溶媒の量は適宜設定することができる。このようにして得られた溶出液を、原薬として用いるために、適宜pHを中性付近に調整するなどして、最終的にワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物（本抽出物）を得ることができる。

本抽出物は、できた時点では液体であるので、適宜濃縮・希釈することによって所望の濃度のものにすることもできる。本抽出物から製剤を製造する場合には、加熱滅菌処理を施すのが好ましい。注射剤にするためには、例えば塩化ナトリウム等を加えて生理食塩液と等張の溶液に調製することができる。また、液体の状態の本抽出物に適切な濃縮乾固等の操作を行うことによって、錠剤等の経口用固形製剤を製造することもできる。本抽出物からこのような経口用固形製剤を製造する具体的な方法は、日本特許第3818657号や同第4883798号の明細書に記載されている。本製剤はこうして得られる注射剤や経口用固形製剤等である。

本抽出物や本製剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量は、通常使用されている定量法によって測定することができる。具体的には、例えば、液体クロマトグラフ質量分析計（LC−MS）やキャピラリー電気泳動質量分析計（CE−MS）を用いた測定法、DMB（1,2−diamino−4,5−methylenedioxybenzene）による蛍光標識法、酵素法等を使用することができる。いずれの方法においても、検量用のＮ−アセチルノイラミン酸試料で作成した検量線を用いて、本抽出物や本製剤中のＮ−アセチルノイラミン酸を定量することができる。

上記のような方法で出願人が製造した本抽出物及び本製剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量を測定した。その結果、本抽出物及び本製剤には、ばらつきはあるものの、1単位当たりＮ−アセチルノイラミン酸が4000ng以上含有されていた。さらに言えば、本抽出物及び本製剤には、1単位当たり4000〜18000ngのＮ−アセチルノイラミン酸が含有されていた。従って、本抽出物及び本製剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量を指標として本抽出物及び本製剤の品質を管理する場合、このような含有量を基準に設けることが可能と判断された。なお、出願人において、本抽出物及び本製剤の製造方法上の変動があった場合は、Ｎ−アセチルノイラミン酸の含有量が1単位当たり4000ngを下回ることがあることを確認した。

ここで、「1単位当たり」というのは、前述の説明からわかるとおり、本抽出物や本製剤における有効成分の含有量当たりという意味である。出願人が製造している本抽出物（NTP抽出液）には、有効成分が1.2単位／mL含有されている。これを用いて製造された注射用の本製剤（NTP注射剤）も同じく有効成分を1.2単位／mL含有している。NTP注射剤には、容量が3mLのものと1ｍLのものが存在する。従って、3mLの製剤の中には3.6単位の有効成分が含有されており、1mLの製剤の中には1.2単位の有効成分が含有されている。一方、出願人が製造する経口用の本製剤（NTP錠剤）では、有効成分が1錠当たり4単位含有されている。

ところで、本抽出物は濃縮したり希釈したりすることができる。また、本製剤もいろいろな単位を含有するものを製造することができる。こうした場合、本抽出物や本製剤の分量当たり（1mL当たり、1mg当たり、1管当たり、1錠当たり等）に含有される有効成分の量も変わり得る。そのため、基本的には、本抽出物や本製剤の有効成分の量との関係でＮ−アセチルノイラミン酸の含有量を規定することに意味がある。なぜなら、そのことが本抽出物や本製剤の有効性や安全性との関係につながるからである。従って、出願人は、本抽出物や本製剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量を、有効成分の含有量当たり（「1単位当たり」）で規定した。一方で、出願人は現にNTP製剤を製造販売していることから、具体的な注射剤の1mL当たり及び1管当たり、また錠剤1錠当たりで規定することも、投与量との関係で一定の意味があることから、そのような規定も行った。

ところで、NTP注射剤には、日本と中国において、出願人以外の会社（以下「他社」という）が製造する後発品（generic drug）あるいは類似製剤（similar drug）（以下、これらを「他社注射剤」という）が存在する。これら他社注射剤も、NTP製剤と同様に、SARTストレスマウスを用い、鎮痛効果を指標として、有効成分であるワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物（本抽出物）の定量が行われている。表示の上では、これら他社注射剤の有効成分の含有量は、日本における複数の他社注射剤である「ローズモルゲン注/ROSEMORGEN Inj.」（登録商標）、「ナブトピン注/NABUTOPIN Inj.」（登録商標）及び「ノルポート注/NOLPORT Inj.」（登録商標）のように、単に「単位」と表示されているものもあれば、中国における他社注射剤である「恩再適/ANALGECINE」（登録商標）のように「Analgecine単位」あるいは「AGC単位」と表示されているものもある。しかしながら、これらいずれの製剤においても、有効成分の含有量は、NTP注射剤と同じく1mL当たり1.2単位あるいは1.2Analgecine（1.2AGC）単位であり、3mL入りの製品1管には3.6単位あるいは3.6Analgecine（3.6AGC）単位を含有している。結局、NTP製剤で用いられている「ノイロトロピン単位」と他社の用いている「単位」や「Analgecine単位」は、表示方法が異なるのみで、有効成分の含有量を規定するものとしては同じ尺度になっている。そこで、本願において、NTP製剤のみならず、すべての他社注射剤を含めて、有効成分である本抽出物の含有量を示す表示として「単位」を用いている。このように複数のワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を有効成分とする製剤が「単位」で有効成分量を表示しており、当該製剤に関しては「単位」表示は当業者にとって明確である。

以上のことから明らかなとおり、本願において、「本製剤」は、NTP製剤（NTP注射剤及びNTP錠剤）と他社注射剤を包含する概念である。また、他社がNTP錠剤の後発品あるいは類似品として錠剤（以下「他社錠剤」という）を製造・販売するようになった場合は、他社錠剤も包含する概念である。

以下、本抽出物及び本製剤の製造の具体例、並びに本抽出物及び本製剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量の測定結果を実施例として示すが、本発明はこれらの実施例の記載によって何ら制限されるものではない。

実施例１（本抽出物の製造）
健康な成熟家兎の皮膚にワクシニアウイルスを皮内接種し、発痘した皮膚を切り取り採取した。採取した皮膚はフェノール溶液で洗浄・消毒を行なった後、余分のフェノール溶液を除去し、破砕して、フェノール溶液を加え混合し、3〜７日間放置した後、さらに3〜４日間攪拌しながら35〜40℃に加温した。その後、固液分離して得た抽出液を塩酸でpH4.5〜5.2に調整し、90〜100℃で30分間、加熱処理した後、濾過して除蛋白した。さらに、濾液を水酸化ナトリウムでpH9.0〜9.5に調整し、90〜100℃で15分間、加熱処理した後、固液分離した。

得られた除蛋白液を塩酸でpH4.0〜4.3に調整し、除蛋白液質量の2％量の活性炭を加えて2時間撹拌した後、固液分離した。採取した活性炭に水を加え、水酸化ナトリウムでpH9.5〜10とし、60℃で90〜100分間撹拌した後、遠心分離して上清を得た。遠心分離で沈澱した活性炭に再び水を加えた後、水酸化ナトリウムでpH10.5〜11とし、60℃で90〜100分間撹拌した後、遠心分離して上清を得た。両上清を合せて、塩酸で中和し、本抽出物を得た。

実施例２（Ｎ−アセチルノイラミン酸含有量の測定方法）
本抽出物及び本製剤のＮ−アセチルノイラミン酸含有量を、以下のとおり高速液体クロマトグラフ質量分析計（LC−MS）で測定した。
実施例１に従って製造した本抽出物（1.2単位／mL）を、水で10倍希釈してLC−MSに注入した。
実施例１に従って製造された本抽出物を用いて製造された本製剤（NTP注射剤）も同様に水で10倍希釈してLC−MSに注入した。
実施例１に従って製造された本抽出物を用いて製造された本製剤（NTP錠剤）は、3錠をメタノール／クロロホルム（1：1）3mLで3回洗浄してフィルムコート層を除去して乾燥後、水12mLを加えて懸濁し（1単位／mL）、遠心後に上清を水で10倍希釈してLC−MSに注入した。
Ｎ−アセチルノイラミン酸は水溶液の標準溶液を調製して検量線を作成した。

LC−MSは、HPLC部にAgilent製1100シリーズ、質量分析装置にAPI3000（Applied Biosystems/MDS Sciex製）を用いた。分析条件は以下のとおりである。
カラム：Inertsil ODS-3（φ2.1×150 mm）
カラム温度：25℃、流速：200μL/分
移動相：メタノール／0.05%ギ酸
メタノール%／分：0/0-0/1-44/8-100/8.1-100/11
注入量：5μL、試料庫設定温度：4℃
検出：正イオン検出MRM
表１にLC−MSの測定条件を示す。表１中の各パラメータの意味は以下のとおりである。
・DP：オリフィスプレートにかかる電圧
・FP：フォーカスリングにかかる電圧
・CE：コリージョンエネルギー
・CXP：Q2の出口にかかる電圧
・NEB：ネブライザーガスの圧
・CUR：カーテンガスの圧
・IS：イオンスプレーの電圧
・CAD：コリージョンガスの圧
・TEM：ターボガス温度

実施例３（本抽出物のＮ−アセチルノイラミン酸含有量の測定結果）
本抽出物におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量を上記実施例２に記載した方法で測定した結果を表２に示す。本抽出物における有効成分含有量は1.2単位／mLである。本抽出物におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量を、本抽出物の1単位当たり（「／単位」）と本抽出物の1mL当たり（「／mL」）の両方で表示した。なお、ロット番号におけるA〜Cの記号は出願人における製造場所（施設）の違いを表す。なお、測定値は有効数字３桁でそろえた（以下、すべての測定値において同じ）。

実施例４（本製剤のＮ−アセチルノイラミン酸含有量の測定結果１）
本製剤のうち、NTP注射剤（1mL当たり1.2単位を含有）におけるＮ−アセチルノイラミン酸含有量を上記実施例２に記載した方法で測定した結果を表３に示す。結果は、本製剤の有効成分の1単位当たり（「／単位」）、本製剤の1mL当たり（「／mL」）、並びに3mL入りアンプル1管当たり（「／管」）の各含有量で示した。

実施例５（本製剤のＮ−アセチルノイラミン酸含有量の測定結果２）
本製剤のうち、NTP錠剤（1錠当たり４単位を含有）におけるＮ−アセチルノイラミン酸含有量を上記実施例２に記載した方法で測定した結果を表４に示す。結果は、有効成分の1単位当たり（「／単位」）並びに1錠当たり（「／錠」）の各含有量で示した。

比較例１（他社注射剤のＮ−アセチルノイラミン酸含有量の測定結果）
次に、他社注射剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸含有量を、NTP注射剤と同様に測定した結果を表５に示す。なお、「ローズモルゲン注」は、本願の出願時点において販売が終了されており、市場には存在しないものであるが、下記測定結果は、出願人が過去に市場で入手し測定した結果である。

以上の結果から、同じワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液製剤であっても、製造した会社によってＮ−アセチルノイラミン酸の含有量は大きく異なっていることがわかる（表３〜表５）。また、出願人も含め、同じ会社の製剤であっても、Ｎ−アセチルノイラミン酸の含有量がかなり異なる場合があることもわかる（表３〜表５）。ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液製剤の原薬であるワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液については、他社のものは入手できないため、出願人の製造したもの（NTP抽出液）のみが測定された。そして、これについても、Ｎ−アセチルノイラミン酸の含有量にある程度のばらつきがあることがわかる（表２）。

しかしながら、出願人が製造する本抽出物及び本製剤においては、Ｎ−アセチルノイラミン酸が4000ng／単位以上含有されていた（表２〜表４）。また、出願人が製造する本抽出物及び本製剤には、4000〜22500ng／単位の範囲でＮ−アセチルノイラミン酸が含有されていた。一方、他社の製造する本製剤でこれほどのＮ−アセチルノイラミン酸含有量を有するものは存在しなかった（表５）。各社の製造する本製剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量の差が何に起因するかは明確にはわからないが、各社における本製剤の製造方法の違いに起因することが強く推定される。いずれにせよ、Ｎ−アセチルノイラミン酸が鎮痛作用、特に神経因性疼痛等の非炎症性疼痛疾患に対する効果を有することは上記のとおりであるから、出願人としては、この物質（成分）が、出願人の製造する本製剤（NTP注射剤）に他社注射剤に比して多く含有されることは、それ自体特徴となることであり、かつ好ましい特徴であると解している。

以上のとおり、本抽出物及び本製剤において、Ｎ−アセチルノイラミン酸が4000ng／単位以上含有されていることは、本抽出物及び本製剤の特徴となるものである。同様に、本抽出物及び本製剤において、実施例２に記載した本抽出物及び本製剤（注射剤、錠剤）におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量の測定方法（以下「10倍希釈法」という）で測定した場合、Ｎ−アセチルノイラミン酸が4000〜15000ng／単位の範囲で含有されていることは、本抽出物及び本製剤の特徴となるものである。10倍希釈法で水による希釈倍率が10倍とされているところを、例えば水で50倍希釈や250倍希釈等の別の希釈倍率にした測定方法（以下「別希釈法」という）で本抽出物及び本製剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量を測定した場合、Ｎ−アセチルノイラミン酸が4000〜22500ng／単位の範囲で含有されていることは、本抽出物及び本製剤の特徴となるものである。ここで上限が10倍希釈法の場合に比べて1.5倍になっている理由は後述する。

また、本製剤のうち、1mL当たり1.2単位を含有する注射剤（以下「本注射剤」という）については、Ｎ−アセチルノイラミン酸が4800ng／mL以上含有されていることが、本注射剤の特徴となるものである。同様に、10倍希釈法で測定した場合、Ｎ−アセチルノイラミン酸が4000〜18000ng／単位の範囲で含有されていることは、本注射剤の特徴となるものである。別希釈法で本注射剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量を測定した場合、Ｎ−アセチルノイラミン酸が4800〜27000ng／mLの範囲で含有されていることは、本注射剤の特徴となるものである。さらに、本注射剤が3mL容量のアンプル入りのものである場合（以下、このような本注射剤を「本3mL入り注射剤」という）、Ｎ−アセチルノイラミン酸が1管当たり14400ng／管以上含有されていることが、本3mL入り注射剤の特徴となるものである。同様に、10倍希釈法で測定した場合、Ｎ−アセチルノイラミン酸が14400〜54000ng／単位の範囲で含有されていることは、本3mL入り注射剤の特徴となるものである。別希釈法で本3mL入り注射剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量を測定した場合、Ｎ−アセチルノイラミン酸が14400〜81000ng／管の範囲で含有されていることは、本3mL入り注射剤の特徴となるものである。ここで上限が10倍希釈法の場合に比べて1.5倍になっている理由も後述する。

また、本製剤のうち、1錠当たり4単位を含有する錠剤（以下「本錠剤」という）については、Ｎ−アセチルノイラミン酸が16000ng／錠以上含有されていることが、本錠剤の特徴となるものである。同様に、10倍希釈法で測定した場合、Ｎ−アセチルノイラミン酸が16000〜60000ng／単位の範囲で含有されていることは、本錠剤の特徴となるものである。別希釈法で本錠剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量を測定した場合、Ｎ−アセチルノイラミン酸が16000〜90000ng／錠の範囲で含有されていることは、本錠剤の特徴となるものである。ここで上限が10倍希釈法の場合に比べて1.5倍になっている理由も後述する。

このようなことから、本抽出物及び本製剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量を指標として、本抽出物及び本製剤の品質を管理することが可能である。すなわち、本抽出物及び本製剤のＮ−アセチルノイラミン酸の含有量を測定し、それが4000ng／単位以上であれば適切なものと評価することが可能である。また、本抽出物及び本製剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量が10倍希釈法で測定した場合であれば4000〜15000ng／単位、別希釈法で測定した場合であれば4000〜22500ng／単位の範囲であることを、本抽出物及び本製剤の適性の判断基準とすることも可能である。

本注射剤の場合は、本注射剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量が4800ng／mL以上であれば適切なものと評価することが可能である。また、本注射剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量が10倍希釈法で測定した場合であれば4800〜18000ng／単位、別希釈法で測定した場合であれば4800〜27000ng／mLの範囲であることを、本注射剤の適性の判断基準とすることも可能である。また同様に、本3mL入り注射剤の場合は、Ｎ−アセチルノイラミン酸の含有量が14400ng／mL以上であること、あるいは、10倍希釈法で測定した場合であれば14400〜54000ng／単位、別希釈法で測定した場合であれば14400〜81000ng／mLの範囲であることを、本3mL入り注射剤の適性の判断基準とすることも可能である。

本錠剤の場合は、本錠剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量が16000ng／錠以上であれば適切なものと評価することが可能である。また、本錠剤におけるＮ−アセチルノイラミン酸の含有量が10倍希釈法で測定した場合であれば16000〜60000ng／単位、別希釈法で測定した場合であれば16000〜90000ng／錠の範囲であることを、本錠剤の適性の判断基準とすることも可能である。

なお、上記のＮ−アセチルノイラミン酸の含有量を下限〜上限の範囲で示した場合の、上限にあたる数値が、別希釈法によって測定した場合、実施例３〜５で得られた測定結果（表２〜４）よりかなり大きくなる（約1.5倍程度）ことは、次の理由と根拠によるものである。

すなわち、上記実施例においてＮ−アセチルノイラミン酸の含有量はLC−MSにより測定しているが、Ｎ−アセチルノイラミン酸は夾雑イオンの影響（イオンサプレッション）を受けやすい。本発明者らは、基本的には本抽出物等の試料を10倍希釈して測定しているが、50倍又は250倍に希釈した場合は、10倍希釈時の測定値より高い値が測定されることがあった。この現象は、希釈度が高い場合には夾雑イオン濃度の影響が低下するためではないかと考えられた。本発明者らが複数の試料で各希釈倍率での定量値を比較して検証した結果、50倍又は250倍に希釈した場合は、10倍希釈時の最大1.5倍程度の値が測定されることを確認した（表６）。この事実に基づき、本願では、Ｎ−アセチルノイラミン酸の含有量の上限にあたる数値を上記のように設定した。

以上のことから、本発明として、次のようなものを導くことができる。もっとも、これらは例示であって、本発明はこれらに限られるものではない。
(1) 1単位当たり4000ng以上のＮ−アセチルノイラミン酸を含有するワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物。
(2) 1単位当たり4000〜22500ngのＮ−アセチルノイラミン酸を含有するワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物。
(3) 1mL当たり4800ng以上のＮ−アセチルノイラミン酸を含有する、液体であるワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物。
(4) 1mL当たり4800〜27000ngのＮ−アセチルノイラミン酸を含有する、液体であるワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物。
(5) 1単位当たり4000ng以上のＮ−アセチルノイラミン酸を含有するワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する製剤。
(6) 1単位当たり4000〜22500ngのＮ−アセチルノイラミン酸を含有するワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する製剤。
(7) 1mL当たり4800ng以上のＮ−アセチルノイラミン酸を含有する、ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する注射剤。
(8) 1mL当たり4800〜27000ngのＮ−アセチルノイラミン酸を含有する、ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する注射剤。
(9) 1管当たり14400ng以上のＮ−アセチルノイラミン酸を含有する、ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する3mL入りの注射剤。
(10) 1管当たり14400〜81000ngのＮ−アセチルノイラミン酸を含有する、ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する3mL入りの注射剤。
(11) 1錠当たり16000ng以上のＮ−アセチルノイラミン酸を含有する、ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する錠剤。
(12) 1錠当たり16000〜90000ngのＮ−アセチルノイラミン酸を含有する、ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する錠剤。
(13) 鎮痛剤である(5)又は(6)に記載の製剤。
(14) 鎮痛剤である(7)〜(10)のいずれかに記載の注射剤。
(15) 鎮痛剤である(11)又は(12)に記載の錠剤。
(16) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量を測定することにより、該抽出物の品質を管理する方法。
(17) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が、該抽出物1単位当たり4000ng以上である場合に該抽出物の品質が適切なものとする(16)に記載の該抽出物の品質を管理する方法。
(18) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が、該抽出物1単位当たり4000〜22500ngである場合に該抽出物の品質が適切なものとする(16)に記載の該抽出物の品質を管理する方法。
(19) (16)〜(18)のいずれかに記載の方法で品質が管理されたワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物。
(20) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する製剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量を測定することにより、該製剤の品質を管理する方法。
(21) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する製剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が、該製剤中のワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物1単位当たり、4000ng以上である場合に該製剤の品質が適切なものとする(20)に記載の該製剤の品質を管理する方法。
(22) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する製剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が、該製剤中のワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物1単位当たり、4000〜22500ngである場合に該製剤の品質が適切なものとする(20)に記載の該抽出物の品質を管理する方法。
(23) (20)〜(22)のいずれかに記載の方法で品質が管理された製剤。
(24) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する注射剤において、該注射剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量を測定することにより、該注射剤の品質を管理する方法。
(25) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する注射剤において、該注射剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が、該注射剤1mL当たり4800ng以上である場合に該注射剤の品質が適切なものとする(24)に記載の該注射剤の品質を管理する方法。
(26) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する注射剤において、該注射剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が、該注射剤1mL当たり4800〜27000ngである場合に該注射剤の品質が適切なものとする(24)に記載の該注射剤の品質を管理する方法。
(27) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する3mL入りの注射剤において、該注射剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が、該注射剤1管当たり14400ng以上である場合に該注射剤の品質が適切なものとする(24)に記載の該注射剤の品質を管理する方法。
(28) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する3mL入りの注射剤において、該注射剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が、該注射剤1管当たり14400〜81000ngである場合に該注射剤の品質が適切なものとする(24)に記載の該注射剤の品質を管理する方法。
(29) (24)〜(28)のいずれかに記載の方法で品質が管理された注射剤。
(30) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する錠剤において、該錠剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量を測定することにより、該錠剤の品質を管理する方法。
(31) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する錠剤において、該錠剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が、該錠剤1錠当たり16000ng以上である場合に該注射剤の品質が適切なものとする(30)に記載の該錠剤の品質を管理する方法。
(32) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する錠剤において、該錠剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が、該錠剤1錠当たり16000〜90000ngである場合に該錠剤の品質が適切なものとする(30)に記載の該錠剤の品質を管理する方法。
(33) (30)〜(32)のいずれかに記載の方法で品質が管理された錠剤。
(34) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量を測定することにより、該抽出物を評価する方法。
(35) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する製剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量を測定することにより、該製剤を評価する方法。
(36) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する注射剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量を測定することにより、該注射剤を評価する方法。
(37) ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を含有する錠剤に含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量を測定することにより、該錠剤を評価する方法。

以上のように、本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸を所定の量含有するワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物又は当該抽出物を有効成分とする製剤を提供するものである。また、本発明は、かかる抽出物又は製剤にＮ−アセチルノイラミン酸が所定の量含有されることを確保することによって、当該抽出物や製剤をより厳格に品質管理する方法、あるいは、そのようにして品質管理された抽出物又は製剤を提供するものである。かかる抽出物や製剤は、生体組織を用いて製造されることから、その品質の恒常性をより厳格に確保することが可能となり非常に有用である。

Claims (11)

1. ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を製造する方法において、破砕した発痘組織に抽出溶媒を加えて３〜７日間放置した後、さらに３〜４日間３０〜４５℃に加温する工程を有することにより、1mL当たりに含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が4800ng以上である該抽出物を製造することを特徴とするワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物の製造方法。
2. ワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を製造する方法において、破砕した発痘組織に抽出溶媒を加えて３〜７日間放置した後、さらに３〜４日間３０〜４５℃に加温する工程を有することにより、1mL当たりに含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が4800〜27000ngである該抽出物を製造することを特徴とするワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物の製造方法。
3. ３〜４日間攪拌しながら３５〜４０℃に加温する工程を有することを特徴とする請求項１又は２に記載のワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物の製造方法。
4. 破砕した発痘組織に加える抽出溶媒がフェノール溶液である請求項１乃至３のいずれか一項に記載のワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物の製造方法。
5. フェノール溶液の量が破砕した発痘組織の１乃至５倍量である請求項４記載のワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物の製造方法。
6. 請求項１乃至５のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を用いて、1mL当たりに含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が4800ng以上であるワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を有効成分として含有する注射剤を製造する方法。
7. 請求項１乃至５のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を用いて、1mL当たりに含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が4800〜27000ngであるワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を有効成分として含有する注射剤を製造する方法。
8. 請求項１乃至５のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を用いて、1管当たりに含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が14400ng以上であるワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を有効成分として含有する3mL入りの注射剤を製造する方法。
9. 請求項１乃至５のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を用いて、1管当たりに含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が14400ng〜81000ngであるワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を有効成分として含有する3mL入りの注射剤を製造する方法。
10. 請求項１乃至５のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を用いて、1錠当たりに含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が16000ng以上であるワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を有効成分として含有する錠剤を製造する方法。
11. 請求項１乃至５のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を用いて、1錠当たりに含有されるＮ−アセチルノイラミン酸の量が16000〜90000ngであるワクシニアウイルス接種ウサギ炎症皮膚抽出物を有効成分として含有する錠剤を製造する方法。