CN1613305B - 一种从含新型活性物质的兔皮中提取的活性制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从兔皮中提取的活性制剂，它是用牛痘病毒株接种家兔，将接种过的家兔进行饲养，待其皮肤组织发痘良好时处死，然后采皮。将采集的兔皮经溶剂提取、酸处理、碱处理、吸咐和洗脱以及浓缩等步骤而制得活性制剂。本发明具有大于或等于1.4～2.8iu/g的SART活性，并具有血管舒缓素生成抑制活性以及浓硫酸反应性糖诱导体量(硫酸糖显色物)。
Description
技术领域
本发明涉及一种从兔皮中提取的活性制剂。
背景技术
曾经有人报道，从感染了痘病毒的家兔皮肤获得的提取物对过敏性疾病有治疗效果，并且具有针对神经病变性疼痛等疼痛的镇痛作用，增强免疫作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的从兔皮中提取的活剂制剂。
本发明发明人经过多年的潜心研究，终于达到了上述目的。
本发明所述从兔皮中提取的活性制剂含有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、尿刊酸、尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、胸腺嘧啶，它是由下述步骤制备的：
1)用牛痘病毒株接种家兔(Oryctolaguscuniculus)：按每只2～3千克的家兔皮内注射100到200处，每处注射每毫升含107～1010个病毒的溶液0.1-0.3毫升进行；
2)将接种过的家兔进行饲养，待其皮肤组织发痘良好时处死，然后采皮；
3)将兔皮200克切成0.5～1平方厘米左右的小块，向其中加入4倍重量的10～18℃的3％苯酚水溶液，置于4℃环境下72小时，液体成为乳液后离心，取出上清液，过滤，得到褐色溶液A；前述兔皮具有大于或等于1.4～2.8iu/g的SART活性
4)在氮气环境下用1M盐酸将该溶液的pH值调至5.0，于水浴中煮沸40分钟，立即降温至25℃，接着离心，然后过滤上清液，在氮气环境下得到溶液B；
5)用1M氢氧化钠将滤液的pH值调至9.2，于水浴中煮沸40分钟，立即降温至25℃，然后过滤，得到溶液C；
6)用1M盐酸将滤液的pH值调至4.5，向其中加入50克活性炭，于40℃和不断搅拌下浸泡4小时，停止搅拌，使其静置30分钟，抽掉上层清液，在氮气环境下过滤，然后以注射水浸泡及洗净活性炭，过滤，弃去滤液收集和贮存活性炭，把载有活性炭的器皿加进注射水中，用1M氢氧化钠将pH调至11.0，于40℃和连续搅拌4小时，在氮 气环境下用0.45μm滤膜过滤，再以40毫升注射水洗净活性炭，得到溶液D；
7)用1M盐酸将pH调至6.0，密封容器，加热分解至121℃，保持20分钟，然后冷却至30℃以下，得到溶液E；
8)将溶液E抽入减压蒸馏器，使减压蒸馏器内的空气更换成氮气，在60℃下减压蒸馏至体积为5毫升，过滤，得到5毫升制剂。
牛痘病毒是本世纪广泛使用的一类病毒，各种牛痘病毒(vaccinia virus)株都可以用来制备本发明的兔皮，所说的病毒株例如牛痘病毒株Lister株、Ikeda株、Dairen株、EM-63株、青山株、天坛(Temple of Heaven)株、LMC株、Tashkent株、Williamsport株、纽约市健康委员会(New York City Board of Health)株。其中优选的是Lister株、Iketa株、Dairen株、EM-63株、青山株，最优选的是Lister株。这些病毒株都可以从市场上购得。用于接种得病毒可以是直接从市场上购得的，也可以是用家兔继代培养获得的。
用于制备本发明的兔皮的家兔可以是各种家兔，所说的家兔例如日本大耳白兔、新西兰白兔、中国本兔、青紫兰兔、银灰色兔(Silver Fox)、维也纳兔、长毛兔、喜马拉雅白化兔(Himalayan albio rabbit)、力克施兔(Pex)、比利时兔(Belgian Hare)、公羊兔(Lop)、加利福尼亚兔、花巨兔(Chekered Giant)、丹麦白兔、西德长毛兔。优选的是日本大耳白兔、新西兰白兔、中国本兔、青紫兰兔，最优选的是日本大耳白兔。
皮肤组织发痘良好是指皮肤组织明显出痘，颜色由红润转为紫红，皮肤增厚，皮下和臀部水肿。处死兔的方法以颈脱臼法为宜。
本发明的兔皮具有大于或等于1.4～2.8iu/g的SART活性，并具有血管舒缓素生成抑制活性以及浓硫酸反应性糖诱导体量(硫酸糖显色物)。
经溶剂抽提、酸处理、碱处理、吸附和洗脱以及送所等步骤可以从所说的兔皮制备含有多种氨基酸和核酸的活性制剂，其中的氨基酸包括谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸；其中的核酸包括尿刊酸、尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、胸腺嘧啶。
将上述活性制剂与药用辅料组合可制成药品，这种药品可以是各种适于临床使用的剂型，包括针剂、片剂、喷雾剂等，优选的是针剂。在针剂中，辅料可以是注射用蒸馏水，生理盐水、注射用植物油。葡萄糖注射液、丙二醇、聚乙二醇等，还可以是各种稳定剂、乳化剂等；在片剂、胶囊剂和颗粒剂中，辅料可以是淀粉、乳糖、甘露醇等赋形剂，结晶纤维素、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、聚乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷铜等结合剂，羧甲基纤维素、聚乙二醇、马铃薯淀粉定崩解剂，滑石粉、硬脂酸美等润滑剂， 甘油等湿润剂等。在软膏剂中，辅料可以是脂肪油、石蜡、羊毛脂、凡士林、乙二醇、甘油等基质等。
药理和临床试验表明，利用本发明的制备的药品对多种疾病具有针对神经病变性疼痛等疼痛的镇痛作用，增强免疫作用。这些疾病包括各种神经痛、腰痛、胆绞痛、心绞痛、动脉栓塞性疼痛、创伤烧伤烫伤等的剧烈疼痛、手术期间和手术后的疼痛、消化性溃疡病疼痛、痛经分娩后的缩宫痛、头痛、各种肿瘤引起的疼痛、知觉异常、交感神经异常、带状疱疹后神经痛、糖尿病性神经病变等。
研究显示，利用本发明制备的药品可以有效地促进巨噬细胞活化作用，明显抑制作为I型变态反应模型的小数的IgE抗体而引起的48小时同漂PCA反应，并且可以抑制作为II型变态反应的模型抗补体活性，其作用与用量成线性关系。由此可知，从本发明的兔皮制备的药品具有抑制与免疫机能有关的炎症的作用，可以改善免疫功能。
此外，利用本发明制备的药品还具有抗过敏、抗溃疡、镇静等作用。
将利用本发明制备的药品连续28天向大鼠腹腔给药，在任意一组中都没有出现死亡，尿检、眼科检查、血液化学检查、病理组织学检查和解剖均说明不存在由于本发明的镇痛药的给药引起的变化。这些说明本发明的镇痛药毒性很小。
将上述活性制剂与食品添加剂和营养物质组合可以制成保健品。所说的食品添加剂和营养物质包括维生素和各种调味剂等。利用本发明制备的保健品具有增强免疫功能、缓和疼痛、抗过敏和抗神经紧张等功能。
SART活性的试验方法是本领域公知的(参见喜多富太郎等，日药理志(Foliapharmacol.japon.)71：211-220(1975))。
本文所称的血管舒缓素生成抑制活性是由以下方法测定的：
将兔皮切成0.5～1平方厘米左右的小块，向其中加入4倍量(重量)的3％苯酚水溶液(约10～18℃)。将其置于4℃环境下72小时，液体成为乳液后离心，取出上清液，过滤，得到褐色溶液A；在氮气环境下用1M盐酸将该溶液的pH值调至5.0，于水浴中煮沸40分钟，立即降温至25℃，接着离心，然后过滤上清液，得到溶液B；用1M氢氧化钠将滤液的pH值调至9.2，于水浴中煮沸40分钟，立即降温至25℃，然后过滤，得到溶液C；用1M盐酸将滤液的pH值调至4.5，向其中加入活性炭，于40℃和不断搅拌下浸泡4小时，停止搅拌，使其静置30分钟，抽掉上层清液，在氮气环境下过滤，然后以注射水浸泡及洗净活性炭，过滤，弃去滤液收集和贮存活性炭，把载有活性炭的器皿加进注射水中，用1M氢氧化钠将pH调至11.0，于40℃和连续搅拌4小时。在氮气环境下用0.45μm滤膜过滤，再以注射水洗净活性炭，得到溶液D；用1M盐酸将pH 调至6.0，密封容器，加热分解至121℃，保持20分钟，然后冷却至30℃以下，得到溶液E；将溶液E抽入减压蒸馏器，使减压蒸馏器内的空气更换成氮气，在60℃下减压蒸馏，过滤，加热分解至121℃保持20分钟。得到含生物活性物质的溶液，测定其SART活性。经蒸发浓缩和加蒸馏水稀释将上述溶液的SART活性调节至1.2iu/ml，取该溶液10ml，在最终电导度为10μs/cm的条件下脱盐，减压干燥后，加入0.25M氯化钠溶液1.5ml，得到试验溶液。将0.25M氯化钠溶液0.2ml作为对照溶液，与0.2ml试验溶液平行进行以下处理。将0.5ml稀释的人血浆分别注入试验溶液和对照溶液中，在冰点下放置5分钟，加入白陶土悬浊液0.25ml，再在冰点下放置20分钟。经隔膜过滤，取0.1ml滤液与0.1M三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液0.2ml及基质溶液0.1ml混合，在30℃的条件下反应20分钟，在反应溶液中加入1％的柠檬酸0.8ml使反应停止，测定405nm下的吸光度，将对照溶液的吸光度设定为0.4，测定试验溶液的吸光度值A，如果A小于0.4，则试验溶液所对应的兔皮具有血管舒缓素生成抑制活性。
本文所称的浓硫酸反应性糖诱导体是由以下方法测定的：
正确采量试料溶液及标准溶液，分别加入试管内，再分别在试管内加入25％苯酚溶液溶液0.4ml混合后再加入浓硫酸5ml摇动混合后，在室温下放置20分钟。
为了分别作上述溶液的对照，用水按上记的操作程序进行后，即是对照溶液。测定波长520nm的吸光度A和B。
计算式：
试料溶液的制造方法：
正确采量本品5ml经过已用0.2M磷酸-氢化钠溶液2ml平衡过的柱子[1]，然后用0.2M磷酸-氢化钠溶液2ml清洗柱子，再用1N硫酸溶出后，即为试料溶液。
[1]柱子的制作
内径0.85cm聚丙烯制的注射管内加入粒径为40的微小仪表，使用充填后的孔径60A°的第4级胺修饰型氧化硅胶注射筒。
标准溶液的制造方法
精密测量葡萄糖0.06g，加入水正确溶解到100ml，再在从液体中抽取5ml中加水混合正确溶解到100ml的溶液，即为标准溶液。
25％苯酚溶液
量取苯酚25g，加入10％氢氧化钠溶液至100ml。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明：
实施例1制备兔皮
将牛痘病毒Lister株的干燥痘疮疫苗用PBS(-)溶液(氯化钠80克，氯化钾2克，磷酸二氢钾11.5克，二水磷酸二氢钾2克，加注射水至10升)溶解，摇匀。用针管抽取0.4毫升向已知日本大耳白兔睾丸的中央内层注射，第4天用力拉断颈椎，无菌环境下剪开阴囊，去处睾丸结缔组织。将已剪采的睾丸放入装有冰块的专用容器内，再放入-80℃的超低温冰箱中保存。将睾丸组织拿出冰箱软化1小时，4℃下磨碎，以1∶1与EAGLE’s培养基(Eagle’s粉末9.4克，10％碳酸氢钠12.5-22.0毫升，谷胺酰胺10毫升，注射水1升)混合，分装后，放入-80℃的超低温冰箱中冻结1小时，再取出在37℃的水浴箱中解冻。然后，进行低温离心(4℃，3500rpm，20分钟)。分装为10毫升一只。将此抗原继代培养物放入-80℃的超低温冰箱中保存。
从-80℃的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液，放入30℃的温箱中使其慢慢溶化。用一支10毫升的针管抽取5毫升，注入500毫升的PBS(-)溶液中，摇匀，得到每毫升含109个病毒的注射溶液。将一只健康的成熟大耳白兔(2.5千克)背上的毛剪去，用75％酒精棉球擦拭已剪去毛的部位。用以上制得的注射溶液皮内注射该兔，共注射150处，每次注射0.3毫升，注意不漏水、不空打，不注穿皮肤。将注射过得兔饲养4天。发痘良好，颜色由红润转为紫红，皮肤增厚，皮下有水肿，臀部水肿明显。用颈椎脱臼法处死兔，15分钟内无菌条件下完成采皮。用塑料袋包装兔皮，立即存放在-18℃～20℃的冰柜中备用。获得的兔皮重量为270克，其SART活性为2.0iu/g。血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为0.08，表面其具有血管舒缓素生成抑制活性。
实施例2制备兔皮
采用牛痘病毒Ikeda株和新西兰白兔，按照实施例1的方法制备抗原继代培养物。
从-80℃的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液，放入30℃的温箱中使其慢慢溶化。用一支10毫升的针管抽取5毫升，注入500毫升的PBS(-)溶液中，摇匀，得到每毫升含108个病毒的注射溶液。将一只健康的成熟新西兰白兔(2.75千克)背上的毛剪去，用75％酒精棉球擦拭已剪去毛的部位。用以上制得的注射溶液皮内注射该兔， 共注射130处，每次注射0.25毫升，注意不漏水、不空打，不注穿皮肤。将注射过得兔饲养4天。发痘良好，颜色由红润转为紫红，皮肤增厚，皮下有水肿，臀部水肿明显。用颈椎脱臼法处死兔，15分钟内无菌条件下完成采皮。用塑料袋包装兔皮，立即存放在-18℃～20℃的冰柜中备用。获得的兔皮重量为310克，其SART活性为2.5iu/g。血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为0.1，表面其具有血管舒缓素生成抑制活性。
实施例3 制备兔皮
采用牛痘病毒Dairen株和中国本兔，按照实施例1的方法制备抗原继代培养物。
从-80℃的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液，放入30℃的温箱中使其慢慢溶化。用一支10毫升的针管抽取5毫升，注入500毫升的PBS(-)溶液中，摇匀，得到每毫升含107个病毒的注射溶液。将一只健康的成熟中国本兔(2.0千克)背上的毛剪去，用75％酒精棉球擦拭已剪去毛的部位。用以上制得的注射溶液皮内注射该兔，共注射200处，每次注射0.25毫升，注意不漏水、不空打，不注穿皮肤。将注射过得兔饲养3～4天。发痘良好，颜色由红润转为紫红，皮肤增厚，皮下有水肿，臀部水肿明显。用颈椎脱臼法处死兔，15分钟内无菌条件下完成采皮。用塑料袋包装兔皮，立即存放在-18℃～20℃的冰柜中备用。获得的兔皮重量为310克，其SART活性为2.3iu/g。血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为0.08，表面其具有血管舒缓素生成抑制活性。
实施例4 制备兔皮
采用牛痘病毒EM-63株和青紫兰兔，按照实施例1的方法制备抗原继代培养物。
从-80℃的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液，放入30℃的温箱中使其慢慢溶化。用一支10毫升的针管抽取5毫升，注入500毫升的PBS(-)溶液中，摇匀，得到每毫升含107个病毒的注射溶液。将一只健康的成熟青紫兰白兔(2.0千克)背上的毛剪去，用75％酒精棉球擦拭已剪去毛的部位。用以上制得的注射溶液皮内注射该兔，共注射100处，每次注射0.2毫升，注意不漏水、不空打，不注穿皮肤。将注射过得兔饲养3天。发痘良好，颜色由红润转为紫红，皮肤增厚，皮下有水肿，臀部水肿明显。用颈椎脱臼法处死兔，15分钟内无菌条件下完成采皮。用塑料袋包装兔皮，立即存放在-18℃～20℃的冰柜中备用。获得的兔皮重量为230克，其SART活性为1.9iu/g。血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为0.11，表面其具有血管舒缓素生成抑制活性。
实施例5 制备兔皮
采用牛痘病毒青山株和新西兰兔，按照实施例1的方法制备抗原继代培养物。
从-80℃的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液，放入30℃的温箱中使其慢慢溶化。用一支10毫升的针管抽取5毫升，注入500毫升的PBS(-)溶液中，摇匀，得到每毫升含109个病毒的注射溶液。将一只健康的成熟新西兰白兔(2.0千克)背上的毛剪去，用75％酒精棉球擦拭已剪去毛的部位。用以上制得的注射溶液皮内注射该兔，共注射180处，每次注射0.3毫升，注意不漏水、不空打，不注穿皮肤。将注射过得兔饲养3～4天。发痘良好，颜色由红润转为紫红，皮肤增厚，皮下有水肿，臀部水肿明显。用颈椎脱臼法处死兔，15分钟内无菌条件下完成采皮。用塑料袋包装兔皮，立即存放在-18℃～20℃的冰柜中备用。获得的兔皮重量为360克，其SART活性为3.0iu/g。血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为0.07，表面其具有血管舒缓素生成抑制活性。
实验例6 制备兔皮
采用牛痘病毒Lister株和中国本兔，按照实施例1的方法制备抗原继代培养物。
从-80℃的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液，放入30℃的温箱中使其慢慢溶化。用一支10毫升的针管抽取5毫升，注入500毫升的PBS(-)溶液中，摇匀，得到每毫升含106个病毒的注射溶液。将一只健康的成熟中国本兔(1.5千克)背上的毛剪去，用75％酒精棉球擦拭已剪去毛的部位。用以上制得的注射溶液皮内注射该兔，共注射200处，每次注射0.1毫升，注意不漏水、不空打，不注穿皮肤。将注射过得兔饲养3天。发痘良好，颜色由红润转为紫红，皮肤增厚，皮下有水肿，臀部水肿明显。用颈椎脱臼法处死兔，15分钟内无菌条件下完成采皮。用塑料袋包装兔皮，立即存放在-18℃～20℃的冰柜中备用。获得的兔皮重量为310克，其SART活性为1.75iu/g。血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为0.12，表面其具有血管舒缓素生成抑制活性。
实施例7 制备兔皮
采用牛痘病毒Lister株和青紫兰兔，按照实施例1的方法制备抗原继代培养物。
从-80℃的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液，放入30℃的温箱中使其慢慢溶化。用一支10毫升的针管抽取5毫升，注入500毫升的PBS(-)溶液中，摇匀，得到每毫升含107个病毒的注射溶液。将一只健康的成熟青紫兰兔(2千克)背上的毛剪去，用75％酒精棉球擦拭已剪去毛的部位。用以上制得的注射溶液皮内注射该兔，共注射100处，每次注射0.2毫升，注意不漏水、不空打，不注穿皮肤。将注射过得兔饲养3天。发痘良好，颜色由红润转为紫红，皮肤增厚，皮下有水肿，臀部水肿明显。用 颈椎脱臼法处死兔，15分钟内无菌条件下完成采皮。用塑料袋包装兔皮，立即存放在-18℃～20℃的冰柜中备用。获得的兔皮重量为240克，其SART活性为1.5iu/g。血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为0.10，表面其具有血管舒缓素生成抑制活性。
实施例8 制备兔皮
采用牛痘病毒Ikeda株和日本大耳白兔，按照实施例1的方法制备抗原继代培养物。
从-80℃的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液，放入30℃的温箱中使其慢慢溶化。用一支10毫升的针管抽取5毫升，注入500毫升的PBS(-)溶液中，摇匀，得到每毫升含109个病毒的注射溶液。将一只健康的成熟日本大耳白兔(3千克)背上的毛剪去，用75％酒精棉球擦拭已剪去毛的部位。用以上制得的注射溶液皮内注射该兔，共注射200处，每次注射0.3毫升，注意不漏水、不空打，不注穿皮肤。将注射过得兔饲养3～4天。发痘良好，颜色由红润转为紫红，皮肤增厚，皮下有水肿，臀部水肿明显。用颈椎脱臼法处死兔，15分钟内无菌条件下完成采皮。用塑料袋包装兔皮，立即存放在-18℃～20℃的冰柜中备用。获得的兔皮重量为320克，其SART活性为2.6iu/g。血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为0.13，表面其具有血管舒缓素生成抑制活性。
实施例9 制备兔皮
采用牛痘病毒Dairen株和日本大耳白兔，按照实施例1的方法制备抗原继代培养物。
从-80℃的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液，放入30℃的温箱中使其慢慢溶化。用一支10毫升的针管抽取5毫升，注入500毫升的PBS(-)溶液中，摇匀，得到每毫升含109个病毒的注射溶液。将一只健康的成熟日本大耳白兔(3千克)背上的毛剪去，用75％酒精棉球擦拭已剪去毛的部位。用以上制得的注射溶液皮内注射该兔，共注射200处，每次注射0.2毫升，注意不漏水、不空打，不注穿皮肤。将注射过得兔饲养3天。发痘良好，颜色由红润转为紫红，皮肤增厚，皮下有水肿，臀部水肿明显。用颈椎脱臼法处死兔，15分钟内无菌条件下完成采皮。用塑料袋包装兔皮，立即存放在-18℃～20℃的冰柜中备用。获得的兔皮重量为270克，其SART活性为2.1iu/g。血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为0.11，表面其具有血管舒缓素生成抑制活性。
实施例10 制备兔皮
采用牛痘病毒EM-63株和日本大耳白兔，按照实施例1的方法制备抗原继代培养物。
从-80℃的超低温冰箱中取出抗原继代培养物病毒溶液，放入30℃的温箱中使其慢慢溶化。用一支10毫升的针管抽取5毫升，注入500毫升的PBS(-)溶液中，摇匀，得到每毫升含107个病毒的注射溶液。将一只健康的成熟日本大耳白兔(2.8千克)背上的毛剪去，用75％酒精棉球擦拭已剪去毛的部位。用以上制得的注射溶液皮内注射该兔，共注射130处，每次注射0.2毫升，注意不漏水、不空打，不注穿皮肤。将注射过得兔饲养3～4天。发痘良好，颜色由红润转为紫红，皮肤增厚，皮下有水肿，臀部水肿明显。用颈椎脱臼法处死兔，15分钟内无菌条件下完成采皮。用塑料袋包装兔皮，立即存放在-18℃～20℃的冰柜中备用。获得的兔皮重量为290克，其SART活性为2.7iu/g。血管舒缓素生成抑制试验中吸光度值为0.07，表面其具有血管舒缓素生成抑制活性。
实施例11 提取活性物质
分别将实施例1-10的兔皮(各200克)切成0.5～1平方厘米左右的小块，向其中加入4倍量(重量)的3％苯酚水溶液(约10～18℃)。将其置于4℃环境下72小时，液体成为乳液后离心，取出上清液，过滤，得到褐色溶液A；在氮气环境下用1M盐酸将该溶液的pH值调至5.0，于水浴中煮沸40分钟，立即降温至25℃，接着离心，然后过滤上清液，在氮气环境下得到溶液B；用1M氢氧化钠将滤液的pH值调至9.2，于水浴中煮沸40分钟，立即降温至25℃，然后过滤，得到溶液C；用1M盐酸将滤液的pH值调至4.5，向其中加入50克活性炭，于40℃和不断搅拌下浸泡4小时，停止搅拌，使其静置30分钟，抽掉上层清液，在氮气环境下过滤，然后以注射水浸泡及洗净活性炭，过滤，弃去滤液收集和贮存活性炭，把载有活性炭的器皿加进注射水中，用1M氢氧化钠将pH调至11.0，于40℃和连续搅拌4小时。在氮气环境下用0.45μm滤膜过滤，再以40毫升注射水洗净活性炭，得到溶液D；用1M盐酸将pH调至6.0，密封容器，加热分解至121℃，保持20分钟，然后冷却至30℃以下，得到溶液E；将溶液E抽入减压蒸馏器，使减压蒸馏器内的空气更换成氮气，在60℃下减压蒸馏至体积为5毫升，过滤，得到5毫升制剂。对所得制剂进行测定，其中的氨基酸和核酸的含量(ug/ml)见表1。
实施例12 制备药品
采用以下配方，按照常规方法制备用于镇痛的针剂：
从实施例2的兔皮获得的制剂4毫升
氯化钠2.7克
注射用蒸馏水300毫升
实施例13制备片剂
采用以下配方，按照常规方法制备用于镇痛的片剂：
实施例所获得的活性制剂200毫升
偏硅酸铝酸镁544克
微晶纤维素80克
无水磷酸氢化钾160克
羧甲基纤维素钠12克
硬脂酸镁2％
根据需要，原料溶液可进行浓缩或者冻干后使用。
实施例14 制备保健品
采用以下配方，按照常规制备方法制备营养保健品：
从实施例1的兔皮获得的制剂5毫升
蔗糖125毫克
柠檬酸20毫克
维生素C5毫克
水1000毫升
实施例15制备喷雾剂I
从实施例1的兔皮获得的制剂4毫升
PGE-7氢化蓖麻油0.25克
苯扎氯铵0.05克
灭菌精制水5毫升
实施例16制备喷雾剂II
从实施例1的兔皮获得的制剂4毫升
卡拉胶I型(阿欧塔型)0.2克
4％聚乙烯12毫升
P-羟化苯甲酸酒精0.013克
P-羟化苯甲酸丙基0.013克
酒精0.2毫升
灭菌精制水50毫升
Claims (14)
1.一种从含新型活性物的兔皮中提取的活性制剂，其中含有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、尿刊酸 、尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、胸腺嘧啶，其特征在于具有血管舒缓素生成抑制活性，具有浓硫酸反应性糖诱导体量 ；该活性制剂通过下述步骤制备：
1)用牛痘病毒株接种家兔：按每只2～3千克的家兔皮内注射100到200处，每处注射每毫升含107～1010个病毒的溶液0.1-0.3毫升进行；
2)将接种过的家兔进行饲养，待其皮肤组织发痘良好时处死，然后采皮；
3)取兔皮200克切成0.5～1平方厘米左右的小块，向其中加入4倍重量的10～18℃的3％苯酚水溶液，置于4℃环境下72小时，液体成为乳液后离心，取出上清液，过滤，得到褐色溶液A；前述兔皮具有大于或等于1.4～2.8iu/g的SART活性；
4)在氮气环境下用1M盐酸将该溶液的pH值调至5.0，于水浴中煮沸40分钟，立即降温至25℃，接着离心，然后过滤上清液，在氮气环境下得到溶液B；
5)用1M氢氧化钠将滤液的pH值调至9.2，于水浴中煮沸40分钟，立即降温至25℃，然后过滤，得到溶液C；
6)用1M盐酸将滤液的pH值调至4.5，向其中加入50克活性炭，于40℃和不断搅拌下浸泡4小时，停止搅拌，使其静置30分钟，抽掉上层清液，在氮气环境下过滤，然后以注射水浸泡及洗净活性炭，过滤，弃去滤液收集和贮存活性炭，把载有活性炭的器皿加进注射水中，用1M氢氧化钠将pH调至11.0，于40℃和连续搅拌4小时，在氮气环境下用0.45μm滤膜过滤，再以40毫升注射水洗净活性炭，得到溶液D；
7)用1M盐酸将pH调至6.0，密封容器，加热分解至121℃，保持20分钟，然后冷却至30℃以下，得到溶液E；
8)将溶液E抽入减压蒸馏器，使减压蒸馏器内的空气更换成氮气，在60℃下减压蒸馏至体积为5毫升，过滤，得到5毫升制剂。
2.根据权利要求1所述从含新型活性物的兔皮中提取的活性制剂，其特征在于所说的牛痘病毒株是Lister株。
3.根据权利要求1所述从含新型活性物的兔皮中提取的活性制剂，其特征在于所说的牛痘病毒株是Ikeda株。
4.根据权利要求1所述从含新型活性物的兔皮中提取的活性制剂，其特征在于所 说的牛痘病毒株是Dairen株。
5.根据权利要求1所述从含新型活性物的兔皮中提取的活性制剂，其特征在于所说的牛痘病毒株是EM-63株。
6.根据权利要求1所述从含新型活性物的兔皮中提取的活性制剂，其特征在于所说的牛痘病毒株是青山株。
7.根据权利要求1所述从含新型活性物的兔皮中提取的活性制剂，其特征在于所说的家兔是日本大耳白兔。
8.根据权利要求1所述从含新型活性物的兔皮中提取的活性制剂，其特征在于所说的家兔是新西兰白兔。
9.根据权利要求1所述从含新型活性物的兔皮中提取的活性制剂，其特征在于所说的家兔是中国本兔。
10.根据权利要求1所述从含新型活性物的兔皮中提取的活性制剂，其特征在于所说的家兔是青紫兰兔。
11.根据权利要求1所述从含新型活性物的兔皮中提取的活性制剂，其特征在于其中所说的皮肤组织发痘良好是指皮肤组织明显出痘，颜色由红润转为紫红，皮肤增厚，皮下和臀部水肿。
12.根据权利要求1所述从含新型活性物的兔皮中提取的活性制剂 ，其特征在于用于制备药品。
13.根据权利要求1所述从含新型活性物的兔皮中提取的活性制剂，其特征在于用于制备保健品。
14.根据权利要求1所述从含新型活性物的兔皮中提取的活性制剂，其特征在于用于制备喷雾剂。
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