CN101628119B - 户尘螨纯螨体变应原原材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种由户尘螨(Dermatophagoides pterronyssinus简称Der p)引起的速发型过敏性疾病的变应原诊断试剂的制备方法，该变应原诊断试剂为户尘螨(Der p)变应原点刺液。本发明还提供了该变应原诊断试剂的原材料即户尘螨纯螨体变应原的制备方法、该变应原诊断试剂效价的评定方法以及用于特异性诊断过敏性病症的用途。本发明的变应原诊断试剂利用致敏原理达到测定患者是否对某种物质过敏而引发疾病的目的。本发明的户尘螨纯螨体变应原原料培养周期短，纯度高，由此制备的点刺液活性强，大大降低了过敏患者皮试的风险性，提高了临床医疗的安全性。

Description

户尘螨纯螨体变应原原材料的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过致敏法来诊断户尘螨过敏性疾病的变应原诊断试剂及其制备方法。 

背景技术

过敏性疾病是当今世界上最常见、最顽固的疾患之一，涉及临床各科。速发型过敏反应是一种常见的过敏反应，主要为呼吸道过敏反应、消化道过敏反应、皮肤过敏反应以及过敏性休克。病症主要表现为过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性肠胃炎以及湿疹、荨麻疹等过敏性皮肤病。 

变态反应性疾病被世界卫生组织(WHO)认为是当前世界性的重大卫生学问题，世界各国变态反应性疾病的总发病率约为10～20％，包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎及过敏性眼结膜炎等，是临床常见病、多发病。当前，变态反应疾病日趋严重，引起过敏的主要变应原有尘螨、花粉、屋尘、霉菌、羽毛等，而尘螨是世界性分布最强烈的变应原之一。它主要引起过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等；尘螨性哮喘的发病被认为是速发型变态反应代表疾病。 

目前对户尘螨的培养，国内外都有研究。国外已经有建立起户尘螨培养体系的报道，而ALLERGON公司也专门培养并且出售螨系列的原材料。但是培养基的选择是一个很重要的问题，有酵母粉、鱼粉、肝粉、人皮屑、猪肉、动物饲料等其中若干种混合使用，培养周期至少三个月，而且饲料成分里含有的动物蛋白或其他本身能够引起人的二次过敏，潜在的危险性很高。所以虽然有多家单位能够大量培养户尘螨，但是真正的不含其它动物蛋白的户尘螨变应原显有报道。 

过敏性疾病的治疗首先需要诊断，而诊断试剂在目前市场上是一个空缺，一种很准确、有效的诊断试剂是至关重要的，同时这也就要求诊断试剂的专一特异性非常强，能引起二次过敏的成分不能存在。目前国内没有户尘螨纯螨体变应原制成的变应原诊断试剂，而国外少有的几家公司的产品也大部分是全螨体诊断试剂。 

发明内容

本发明目的之一是提供一种诊断过敏性疾病(支气管哮喘、过敏性鼻炎等)的诊断试剂，即户尘螨(Der p)变应原及其诊断试剂。该诊断试剂利用致敏原理，使病人受试部位皮肤产生风团及红晕反应，从而达到测定患者是否对某种物质过敏而引发疾病的目的。本发明户尘螨(Der p)变应原及其诊断试剂适于诊断速发型过敏性疾病。 

本发明过敏性疾病诊断试剂中的螨是指户尘螨(Dermatophagoidespterronyssinus)，户尘螨属于节肢动物门、蛛形纲、无气门目、麦食螨科、尘螨属中的一种。体型椭圆，腹背较扁。雄螨大小为240～280×155～220微米，具前背板及后背板，后背板长大于宽，前缘达第2对背毛之前；足I和足II等粗，足I基节内突不相连，无胸骨。雌螨大小为290～380×220～260微米，有前背板，后体背中央皮纹纵行；各足分5节，足III粗长，足IV短小；交合囊小，受精囊花瓣状。 

本发明另一目的是提供了户尘螨纯螨体变应原原材料的制备方法。 

本发明的再一目的是提供了户尘螨变应原点刺液效价的评定方法，包括总蛋白含量的测定、主要致敏蛋白的定性定量分析以及户尘螨变应原点刺液的免疫活性测定方法；从而达到户尘螨变应原点刺液标准化的目的。 

本发明公开的户尘螨变应原及其诊断试剂是通过下述技术方案来获得： 

户尘螨纯螨体变应原原材料一般可通过螨种收集、分离鉴定、螨种培养、接种、培养、收获、纯化等步骤制备。 

1)螨种收集：广泛收集起居室床上、枕头、被褥、沙发、地毯等中的 粉尘以及房舍灰尘。 

2)分离鉴定：把收集到的粉尘过2号分样筛，筛除杂质，再过4号分样筛，将剩余粉尘平铺于培养皿中，用盖玻片抚平表面，避光置于阴凉潮湿的地点2～4小时，每半小时观察一次。发现粉尘中有尘螨活动产生的凸起，即用接种针挑起少许凸起处粉尘，制片，对尘螨进行形态学鉴定，确认粉尘中尘螨种类后，于显微镜下将户尘螨分离出来，用于菌种培养。 

3)菌种培养：取250ml无菌细胞培养瓶，每个培养瓶以无菌操作接入4药匙(约3～7克)培养基，培养基为：蛋白粉23.7％、复合维生素0.2％、矿物质4.7％，其余为全麦粉，经过钴60照射灭菌处理。然后接入半药匙(约0.2～0.6克)上述已分离鉴定好的户尘螨，置于温度25℃，湿度75％～80％，避光条件下培养，至户尘螨达到50％左右作为工作螨种。户尘螨工作螨种于25℃、75％～80％条件下避光保存，每3～4个月传代一次；或者挑取取户尘螨占培养基总量的50％以上的培养瓶留作螨种，将培养瓶置于2～8℃、30％～60％湿度条件下保存，每月传代一次。 

4)接种：取250ml无菌细胞培养瓶，每个培养瓶以无菌操作接入4药匙(约3～7克)培养基，培养基为：蛋白粉23.7％、复合维生素0.2％、矿物质4.7％，其余为全麦粉，经过钴60照射灭菌处理。然后接入半药匙(约0.2～0.6克)上述给培养好的户尘螨螨种。 

5)培养：将接种好的培养瓶置于温度25℃，湿度75％～80％，避光条件下培养，培养6～8周。 

6)收获：将培养瓶内的户尘螨与培养基的混合物倒入准备好的三角烧瓶中，向瓶内加入2～3倍混合物体积的95％乙醇，使混合物被完全浸没。静置，期间手动振摇1～3次，每次2～4分钟。30～50分钟后用纱布将混合物与溶剂分离，混合物在阴凉干燥处风干24～36小时。 

7)纯化：将户尘螨原材料根据螨与饲料的物理性质不同、比重不同而 逐步分离纯化，重复3～5次，镜检户尘螨含量可达95％以上。 

8)保存：2～8℃密封避光保存。 

本领域的技术人员应认识到，依据上述制备方法，结合本领域常用技术和方法，增加、减少、替代、合并、拆分上述制备户尘螨变应原原材料步骤，或对每步所用的试剂或条件进行一定的改变，也能实现制备户尘螨变应原原材料的目的，同样属于本发明范围之内。 

其他尘螨变应原原材料可采用与户尘螨变应原原材料制备方法类似方法制备。 

户尘螨变应原点刺液可通过对户尘螨变应原原材料进行提取、过滤等工艺制备。 

1)提取：户尘螨纯螨变应原原材料与磷酸盐缓冲提取液(氯化钠8.0～11.0g、磷酸二氢钾0.6～0.8g、磷酸氢二钠12.0～16.0g、苯酚6.0～9.0g，加注射用水至1000ml)按1～1.5∶100(W/V)的比例混合，在温度2～8℃的条件下，连续振荡提取24小时。 

2)粗滤：采用滤纸去渣。 

3)除菌过滤：0.22μm膜超滤膜正压过滤或错流除菌过滤。最佳方案为0.22μm膜+0.45μm纸板错流除菌过滤，得到变应原浸提液。 

4)把上述得到的变应原浸提液与等体积甘油无菌条件下混合，得到户尘螨点刺液。 

通过测定其点刺液的总蛋白含量、致敏蛋白成分及主要致敏蛋白Der p1活性浓度、总生物活性以控制诊断试剂的效价。 

变应原点刺液蛋白含量可采用Bradford法测定。 

户尘螨点刺液主要致敏蛋白的定性分析采用SDS-PAGE电泳-银染法，结果表明含有24KD和14KD两种蛋白质组分。 

主要致敏组份Der p1浓度的测定采用双夹心单克隆抗体法。 

户尘螨点刺液总生物活性的测定 

UniCAP是临床广泛应用的变应原特异性IgE检测的实验系统，其基本原理与RAST相同，所采用的荧光检测系统有较高的敏感性，本方案在UniCAP基础上建立一种类似RAST抑制试验的方法，应用于户尘螨点刺液生物总活性的体外测定和比较。 

采用不同稀释度的户尘螨点刺液，与包含有特异性IgE抗体的血清池预先结合，点刺液中可溶性的变应原物质与特异性IgE结合后，可以抑制特异性IgE与UniCAP纤维基质吸附的变应原结合，导致特异性IgE在UniCAP系统进行检测时荧光值下降，荧光值下降水平与户尘螨点刺液生物活性相关。 

户尘螨变应原点刺液可以采用药学常规制备方法制备成皮下注射剂、片剂、胶囊、气雾剂、鼻腔剂、贴剂、滴丸剂或喷雾剂等。 

户尘螨变应原点刺液可由医师根据患者种族、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。 

本发明的再一发明目的是公开上述户尘螨变应原点刺液在诊断过敏性病症中的应用。 

本发明可用于由户尘螨引起的过敏性疾病的诊断。诊断时，对患者皮肤消毒，滴上点刺液，用点刺针作一直排点刺，同时作阴阳对照，以点刺部位隆起或红晕来判断是否过敏。 

用本发明户尘螨变应原点刺液对30例变态反应性鼻炎和/或哮喘患者进行诊断，其阳性率达100％。 

本发明户尘螨纯满变应原原材料纯度高，最大程度避免饲料成分带来二次致敏的风险，制备方法工艺简单；制备得到的点刺液效价高、生物活性强，可大规模工业化生产。 

附图说明

图1为Bradford法测户尘螨变应原点刺液中蛋白含量的标准曲线。 

图2为SDS聚丙酰胺凝胶电泳法测户尘螨变应原点刺液中主要致敏蛋白成分的电泳图。 

图3为双夹心单克隆抗体法测户尘螨变应原点刺液中主要致敏蛋白Derp1的标准曲线。 

图4为UniCAP法测户尘螨变应原点刺液总生物活性的百分抑制率曲线。 

具体实施方式

实施例1  户尘螨纯螨体变应原原材料的制备 

1)螨种收集：起居室床上、枕头、被褥、沙发、地毯中的粉尘。 

2)分离鉴定：把收集到的粉尘过2号分样筛，筛除杂质，再过4号分样筛，将剩余粉尘平铺于培养皿中，用盖玻片抚平表面，避光置于阴凉潮湿的地点4小时，每半小时观察一次。用接种针挑起少许凸起处粉尘，制片，对尘螨进行形态学鉴定，确认粉尘中尘螨为户尘螨后，于显微镜下将户尘螨分离出来，用于菌种培养。 

3)菌种培养：取250ml无菌细胞培养瓶，每个培养瓶以无菌操作接入4药匙(约3～7克)培养基，培养基为：蛋白粉23.7％、复合维生素0.2％、矿物质4.7％，其余为全麦粉，经过钴60照射灭菌处理。然后接入半药匙(约0.2～0.6克)上述已分离鉴定好的户尘螨，置于温度25℃，湿度75％～80％，避光条件下培养，至户尘螨达到50％左右作为工作螨种。 

4)接种：取250ml无菌细胞培养瓶，每个培养瓶以无菌操作接入4药匙(约3～7克)培养基，培养基为：蛋白粉23.7％、复合维生素0.2％、矿物质4.7％，其余为全麦粉，经过钴60照射灭菌处理。然后接入半药匙(约0.2～0.6克)上述给培养好的户尘螨螨种。 

5)培养：将接种好的培养瓶置于温度25℃，湿度75％～80％，避光 条件下培养，培养7周。 

6)收获：将培养瓶内的户尘螨与培养基的混合物倒入准备好的三角烧瓶中，向瓶内加入2倍混合物体积的95％乙醇，使混合物被完全浸没。静置，期间手动振摇2次，每次3分钟。30分钟后用纱布将混合物与溶剂分离，混合物在阴凉干燥处风干24小时。 

7)纯化：将户尘螨原材料根据螨与饲料的物理性质不同、比重不同而逐层分离纯化。重复4次此项操作，镜检户尘螨含量可达95％以上。 

8)保存：2～8℃密封避光保存。 

实施例2  户尘螨变应原点刺液的制备 

1)提取：户尘螨纯螨变应原原材料与磷酸盐缓冲提取液(氯化钠8.0～11.0g、磷酸二氢钾0.6～0.8g、磷酸氢二钠12.0～16.0g、苯酚6.0～9.0g，加注射用水至1000ml)按1∶100(W/V)的比例混合，在温度2～8℃的条件下，连续振荡提取24小时。 

2)粗滤：采用滤纸去渣。 

3)除菌过滤：0.22μm膜超滤膜正压过滤，得到变应原浸提液。 

4)把上述得到的变应原浸提液与等体积甘油无菌条件下混合，得到户尘螨点刺液。 

实施例3  户尘螨变应原点刺液蛋白含量的测定(Bradford法) 

1)染料工作液配制：用蒸馏水将5×Coomassie浓缩液稀释为400ml 1×染料工作液。稀释的1×染料工作液用普通滤纸过滤除去沉淀。 

2)标准蛋白溶液配制：将标准牛血清白蛋白(BSA，4mg/ml，-20℃)用溶媒稀释。稀释BSA标准溶液至500、400、300、200、100、50、10、5μg/ml各稀释度，充分混匀，放置2min。 

3)标准曲线制作：取上述每一稀释度标准BSA溶液各取15μl，与285μl染料工作液混合。反应终体积300μl。用96孔微板，置酶标仪中，在 595nm处测定吸光收值OD595。以标准蛋白质浓度(μg/ml)为横座标，用吸光度值OD595为纵座标作图，即得标准曲线。 

4)样品测定与浓度计算：样品测定方法同上(标准曲线制作)。根据标准曲线和测出的未知样品的OD595值，得出未知样品的蛋白质浓度。此浓度是与染料工作液混合之前的待测样品中的蛋白浓度。如果样品在与染料工作液混合之前经过稀释，最后估计样品蛋白浓度时须乘以实际稀释倍数。 

5)户尘螨变应原点刺液的蛋白含量为0.06mg/ml。 

实施例4  户尘螨变应原点刺液主要致敏蛋白成分分析(SDS-PAGE电泳、银染法) 

1)点刺液样品与5×SDS凝胶加样缓冲液按4∶1的比例混匀，沸水浴加热5分钟。待冷却后即可上样。处理好的样品可在-20℃保存比较长的时间，使用前取出沸水浴加热约2分钟。 

2)凝胶制备 

15％分离胶制备(10ml)：蒸馏水2.45ml、30％丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液5ml、4×分离胶缓冲液2.5ml，充分混匀静置10分钟消除气泡或抽真空5分钟；加入10％过硫酸铵50μl、四甲基乙二胺5μl。 

5％浓缩胶的制备(5ml)：蒸馏水2.89ml、30％丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液0.83ml、4×分离胶缓冲液1.25ml，充分混匀静置10分钟消除气泡或抽真空5分钟；加入10％过硫酸铵25μl、四甲基乙二胺5μl。制好胶后装入电泳槽，倒入适量电泳缓冲液，准备上样。 

3)电泳条件：根据总蛋白含量每孔约上样0.5-1μg(约10-20μl)。标准蛋白采用低分子量标准蛋白系列：鸡蛋清溶菌酶14.4kDa、胰蛋白酶抑制剂20.1kDa、牛碳酸酐酶31000、兔肌动蛋白43kDa、牛血清白蛋白66.2kDa、兔磷酸化酶B 97.4kDa。电流稳流为10mA，当染料前沿进入分离胶后把电  流提高到20mA，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，约2-3小时，关闭电源。 

4)卸下玻璃板取下凝胶，采用银染法染色。 

固定：电泳后立即将凝胶置干净的培养皿中，用少量蒸馏水漂洗，用固定液浸泡1小时后换一次固定液，然后浸泡2小时或过夜，弃去固定液。用蒸馏水漂洗3次，每次平缓摇动10分钟。弃去水，将凝胶置1％戊二醛溶液中浸泡30分钟。弃去戊二醛溶液，再用蒸馏水洗2次，每次平缓摇动15分钟。银染：将凝胶置氨银溶液中平缓摇动30分钟，弃去氨银溶液，再用蒸馏水洗3次，每次平缓摇动5分钟。 

显色：将凝胶置显色液中，平缓摇动，待蛋白质条带显色到适当的程度后，置10％乙酸中数分钟停止染色，然后用水洗3次，每次10分钟。 

实施例5  户尘螨变应原点刺液致敏蛋白Der p1浓度的测定 

1)把经过HPLC纯化的抗Der p1单克隆抗体10B9是以2mg/ml备液的浓度溶解在PBS溶液中(产品编号MA-10B9)。用0.05M pH9.6的包被缓冲液按1∶1000稀释10B9 Der p1单克隆抗体至2μg/ml。包被聚乙烯板，4℃孵育过夜。用PBS-T洗板3次。 

2)加入含1％BSA牛血清白蛋白或10％小牛血清的PBS-T溶液100μl/孔，室温孵育30min。用PBS-T洗板3次。 

3)加入100μl/孔稀释的过敏原标准品或样品，标准品在0～250ng之间稀释成不同阶梯浓度，样品直接2倍稀释成不同浓度，室温孵育1小时。用PBS-T洗板3次。 

4)加入100μl稀释的生物素化抗Der p1的单克隆抗体5H8(产品编号B1-5H8)。此抗体溶液含有50％甘油，应该使用含有1％BSA牛血清白蛋白或10％小牛血清的PBS-T按1∶1000比例稀释。室温孵育1小时。用PBS-T洗板3次。 

5)加入100μl稀释的链霉素卵蛋白-过氧化酶(Sigma公司S5512，使用1ml双蒸水复溶0.25mg粉末)。然后再使用含有1％BSA牛血清白蛋白或10％小牛血清的PBS-T按1∶1000比例稀释。室温孵育30min。用PBS-T洗板3次。 

6)加入100μl用底物缓冲液溶解的1mMABTS显色，显色时还要加入1∶1000比例的稀释的30％H2O2。当405nm光密度值在2.0～2.4时读板。 

7)户尘螨变应原点刺液主要致敏蛋白Der p1的活性浓度为2.0ug/ml。 

实施例6  户尘螨变应原点刺液总生物活性的测定 

1)把户尘螨变应原点刺液用生理盐水等体积2倍梯度稀释。 

2)把病人血清用生理盐水稀释后，加入上述稀释好的户尘螨变应原点刺液，同时设立正常人血清池的空白对照和病人血清池在不加入户尘螨变应原点刺液的对照。37℃孵育1小时。 

3)依据上述方法同时作内部参考品以及国际标准品的对照。 

4)在UniCAP上检测户尘螨特异性IgE的荧光值，每个样品检测2次。 

5)根据百分抑制率(％)＝[F(0)-FNSB-F(x)]/[F(0)-FNSB]×100％，计算出户尘螨变应原点刺液产品在不同稀释浓度下的百分抑制率，作出百分抑制率最佳趋势线，通过平行线分析法比较户尘螨变应原点刺液产品的相对生物活性。 

实施例7  户尘螨变应原点刺液用于诊断过敏性疾病 

1)户尘螨过敏患者：30例，男14例，女16例，年龄7～58岁，病程1～8年，平均3.5年。在医院作诊断，同时有阴阳性对照，30例全部为阳性。 

Claims (1)

1.户尘螨纯螨体变应原原材料的制备方法，其特征在于，采用下述步骤制备：

1)螨种收集：广泛收集起居室床上、枕头、被褥、沙发或地毯中的粉尘以及房舍灰尘；

2)分离鉴定：把收集到的粉尘过2号分样筛，筛除杂质，再过4号分样筛，将剩余粉尘平铺于培养皿中，用盖玻片抚平表面，避光置于阴凉潮湿的地点2～4小时，每半小时观察一次；发现粉尘中有尘螨活动产生的凸起，即用接种针挑起少许凸起处粉尘，制片，对尘螨进行形态学鉴定，确认粉尘中尘螨种类后，于显微镜下将户尘螨分离出来，用于菌种培养；

3)菌种培养：取250ml无菌细胞培养瓶，每个培养瓶以无菌操作接入3～7克培养基，培养基为：蛋白粉23.7％、复合维生素0.2％、矿物质4.7％，其余为全麦粉，经过钴60照射灭菌处理；然后接入0.2～0.6克上述已分离鉴定好的户尘螨，置于温度25℃，湿度75％～80％，避光条件下培养，至户尘螨达到50％作为工作螨种；户尘螨工作螨种于25℃、湿度75％～80％条件下避光保存，每3～4个月传代一次；或者挑取取户尘螨占培养基总量的50％以上的培养瓶留作螨种，将培养瓶置于2～8℃、30％～60％湿度条件下保存，每月传代一次；

4)接种：取250ml无菌细胞培养瓶，每个培养瓶以无菌操作接入3～7克培养基，培养基为：蛋白粉23.7％、复合维生素0.2％、矿物质4.7％，其余为全麦粉，经过钴60照射灭菌处理；然后接入0.2～0.6克上述给培养好的户尘螨螨种；

5)培养：将接种好的培养瓶置于温度25℃，湿度75％～80％，避光条件下培养，培养6～8周；

6)收获：将培养瓶内的户尘螨与培养基的混合物倒入准备好的三角烧瓶中，向瓶内加入2～3倍混合物体积的95％乙醇，使混合物被完全浸没，静置，期间手动振摇1～3次，每次2～4分钟；30～50分钟后用纱布将混合物与溶剂分离，混合物在阴凉干燥处风干24～36小时；

7)纯化：将户尘螨原材料根据螨与饲料的物理性质不同、比重不同而逐层分离纯化；重复4～5次此项操作，镜检户尘螨含量达95％以上；

8)保存：2～8℃密封避光保存。

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