CN109939226A - 一种大籽蒿花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了本发明涉及一种大籽蒿花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法。该大籽蒿花粉变应原浸提物，其中含有大籽蒿花粉变应原蛋白如SEQ ID NO.4‑SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。一种大籽蒿花粉变应原浸液经大籽蒿花粉收集、干燥、脱脂、提取、超滤浓缩、冷冻干燥、复溶等工艺方法制得。该大籽蒿花粉变应原浸液具有特异性高的特点，大籽蒿致敏蛋白组分提取充分，总生物效价稳定，有效期长，无菌效果好；其原液可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断、经适当稀释后可用于体外嗜碱性粒细胞活化试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由大籽蒿花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。

Description

一种大籽蒿花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种大籽蒿花粉标准化变应原浸提物、浸液及其制备方法。

背景技术

人们对变态反应疾病的认识始于“花粉热”，花粉热又称过敏性鼻炎。1911年Noon和Freeman首次利用花粉提取液来治疗花粉热，变态原疾病治疗的历史从此开始。目前，变态反应性疾病是全球性重大卫生问题之一。工业化国家超过25％的人口被变应性哮喘、变应性鼻结膜炎及变应性皮炎困扰，其中以变应性哮喘最为常见。吸入致敏花粉是引发变应性哮喘及其他呼吸道变态反应性疾病的最重要因素。VRTA—L.A等调查发现近50％的变态反应性疾病患者对草类花粉过敏。

尹佳的《应用皮内试验和血清特异性IgE诊断蒿属花粉症的临床价值》中指出北京地区夏秋季花粉症患者中蒿属花粉过敏者占86.7％；赵京的《北京地区儿童呼吸道过敏性疾病与皮肤过敏原试验的调查》对北京地区13-14岁儿童进行的呼吸道过敏性疾病流行病学调查结果显示，蒿属花粉敏感者占同年龄段普通人群的5.7％；张宏誉的《北京市气传蒿属花粉浓度调查》指出北京地区在蒿属花粉临床季节内，日平均浓度在100g/m³；曹绥平的《变态反应性疾病201例致敏原分析》指出陕西省榆林地区主要致敏花粉为蒿属花粉；西安医科大学二附院呼吸内科的《西安地区气传花粉动态的初步调查》发现西安地区秋季主要致敏花粉为蒿属花粉；孟和宝力高的《呼和浩特地区气传与致敏花粉的探讨》结果显示呼和浩特地区的主要致敏花粉为蒿属花粉；

刘光辉的《武汉地区花粉症患者主要致敏花粉的研究》和刘光辉、祝绒飞的《武汉地区蒿属花粉分布及对过敏性鼻炎患者起到反应学的影响》均指出蒿属花粉是武汉地区秋季主要致敏花粉之一；孙娟的《气传致敏花粉区域性调查现状》指出我国八达地区均有蒿属花粉过敏；河南科技大学第三附属医院变态反应室发表的《洛阳市区360例花粉症患者变应原分析》指出洛阳地区秋季诱导花粉症和哮喘症状的主要致敏花粉为蒿属花粉。

以上蒿属花粉流行病学调查研究显示，蒿属花粉过敏广泛分布我国各个地方，在北方地区蒿属花粉是过敏性鼻炎和哮喘主要致病因素。

蒿属(Artemisia L.，sensu sricto)为菊科植物，种类较多、分布较广，全世界蒿属植物有344种、69个变种，主产地位于北半球温带至亚热带地区，其中亚欧大陆最多，北美洲次之。我国蒿属植物有187种、46个变种，范围遍及全国，但以东北、华北、西北及西南等省区多见。上世纪八十年代，由叶世泰、乔秉善牵头、全国数十家医院参与完成的中国气传致敏花粉调查显示，我国多地区夏秋季空气中蒿属花粉含量最多。近年的花粉调查显示，蒿属花粉仍为中国北方地区夏秋季最重要的致敏花粉。

进行大籽蒿花粉变应原特异性免疫治疗(allergen specific immunotherapy,SIT)需要大籽蒿花粉体内诊断制剂和治疗制剂。现在变应原特异免疫治疗的方法主要分为皮下注射给药免疫治疗和舌下给药免疫治疗。皮下注射给药免疫治疗已有100多年历史，其安全性和有效性已经被得到证明。上世纪90年代初，变应原舌下滴剂疫苗诞生，1998年，WHO宣布了变应原舌下滴剂疫苗安全和有效。

但是舌下给药免疫脱敏的方式相比皮下注射免疫给药，治疗周期长，短时间内疗效不显著，平均脱敏周期3-5年。在一个治疗周期中，舌下给药方式免疫脱敏给药量是皮下注射给药量的100倍。所以皮下注射给药免疫脱敏的方式相比舌下给药，虽然病人依从性差，但是治疗周期短，见效快，治疗费用低。目前，用于大籽蒿花粉变应原的作为皮下注射免疫制剂的稳定性差，蛋白含量和生物效价都会随时间下降，成分不确定试剂存放一定时间后用于诊断大籽蒿花粉诱发的变态反应疾病时，阳性率降低，准确性低。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种大籽蒿花粉变应原浸提物、及其浸液，所述大籽蒿花粉变应原浸液具有于特异性高，大籽蒿致敏蛋白组分提取充分且比例恒定，总生物效价稳定，有效期长的特点。其可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由大籽蒿花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种大籽蒿花粉变应原浸提物，其含有大籽蒿花粉变应原蛋白Art Si 1’、Art Si3’、Art Si 4、Art Si 5、Art Si6和Art Si7；其中，所述Art Si 1’含有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，所述Art Si 3’含有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，所述Art Si 4含有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，所述Art Si 5含有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，所述Art Si6含有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，所述Art Si7含有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。

一种的大籽蒿花粉变应原浸液，其特征在于，所述变应原浸液中含如上所述的大籽蒿花粉变应原浸提物、体积比为0.2～0.4％的苯酚、体积比为45～55％的甘油和4.5～5.5g/L的NaCl，其pH值为6.0～8.0。

如上所述的大籽蒿花粉变应原浸液，优选地，所述大籽蒿花粉变应原的活性浓度为50000～200000BAU/ml，所述大籽蒿花粉变应原浸液的总蛋白浓度0.47～0.70mg/ml。

进一步地，通过SDS-PAGE和Western Blotting检测，大籽蒿花粉变应原蛋白分布主要在10kDa、12kDa、14kDa、15.3kDa、20kDa、24kDa、28kDa、44kDa、62kDa、94kDa、117kDa。

进一步，通过全蛋白质谱检测，所述大籽蒿花粉变应原浸提物主要包含且不限于如SEQ ID NO.18-SEQ ID NO.25所示的特征性肽段。

如上所述的大籽蒿花粉变应原浸液的制备方法，其包括如下步骤：

S1、采集大籽蒿花粉，常温干燥或真空干燥或流化床干燥；

S2、对干燥后的花粉脱脂、干燥；

S3、将脱脂干燥后的大籽蒿花粉按重量g体积ml比1:50～1:10加入pH为7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，搅拌速度为150～300rpm条件下2-8℃浸提22～26h；

S4、取步骤S3后的浸提液，离心取上清液；将上清液过滤及除菌过滤；

S5、将过滤后的上清液进行超滤浓缩，获得超滤浓缩液；

S6、将所述超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，真空冻干获得大籽蒿花粉变应原冻干品；

S7、将所述大籽蒿花粉变应原冻干品用pH 6.5～7.5磷酸盐—盐水缓冲液复溶配置为大籽蒿花粉变应原原液，2～8℃放置，与等体积灭菌的甘油混匀，调节溶液pH值至6.0～8.0。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，所述花粉脱脂采用花粉与丙酮以1：5～1:1的重量g体积ml比进行脱脂处理，重复脱脂至上层液体澄清。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S4中，所述离心的条件为8000～12000g，离心温度2～8℃，时间为15～20min；所述过滤及除菌过滤为先用4000目滤布过滤后，再通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S5中，所述超滤浓缩用3KD超滤膜超滤，当超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml，停止超滤；当超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，更换超滤膜之后对超滤透过液重复超滤，直至超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml为止。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S6中，所述真空冻干的条件为-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％。

如上所述的制备方法，优选地，所述步骤S1还包括对原料大籽蒿花粉进行镜检鉴别和/或DNA鉴定的步骤，其中DNA鉴定方法为，以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2为引物，对鉴别大籽蒿花粉原料进行PCR扩增，并检测扩增产物。

如上所述的制备方法，优选地，所述磷酸盐—盐水缓冲液包括4.5～5.5g/L的氯化钠、0.03％～0.05％的磷酸二氢钾、1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠和0.2％～0.4％的苯酚。

在制备大籽蒿花粉变应原进行浸提时，发明人尝试了多种浸提液，并且比较了它们的浸提效率。所使用的浸提液包括：0.8％的氯化钠、pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH8.2的coca’s液、pH8.9的Tris-盐酸缓冲液、pH为7.9～8.2的含有4.5～5.5g/L的氯化钠及重量百分比含量为0.03％～0.05％的磷酸二氢钾，1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠，0.2％～0.4％的苯酚等。实验结果证实，使用pH为7.9～8.2的含有4.5～5.5g/L的氯化钠及0.03％～0.05％的磷酸二氢钾，1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠，0.2％～0.4％的苯酚的浸提效率较高，且制备的大籽蒿花粉变应原浸液可长期有效的保存，稳定性高。

本发明还提供一种大籽蒿花粉变应原浸提物冻干品，其由包括大籽蒿花粉收集-干燥-脱脂-提取-超滤浓缩-冻干的步骤制得：

(1)收集：用自然脱落法收集大籽蒿花粉；

(2)干燥：常温下干燥，直至花粉不再粘附，将干燥后的花粉过150～250目分样筛；

(3)脱脂：将(2)所得到的花粉与丙酮分别按g与ml计，以1：5～1:1的重量体积比进行脱脂处理，振荡脱脂30分钟后，静置分层，倒出上层液，加入新的丙酮，重复脱脂至上层液体澄清，将脱脂后的花粉均匀摊开，室温下干燥48小时至72小时；

(4)提取：将脱脂干燥后的大籽蒿大籽蒿花粉按重量体积比1:50～1:10加入10L，pH 7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2～8℃搅拌22～26h进行浸提；取提取后的浸提液，在离心力8000～12000g，离心温度2～8℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清；先用4000目滤布过滤后，将滤液依次通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；

(5)超滤浓缩：将过滤后的浸提液，用3KD超滤膜超滤，取样超滤浓缩液、超滤透过液，检测其总蛋白含量；其中，当超滤透过液中总蛋白含量≤0.02mg/ml，则直接排弃透过液；超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，则对超滤膜进行完整性测试，超滤膜未破损，则排弃透过液；若超滤膜破损，则更换超滤膜之后对透过液重复超滤；

(6)冻干：将超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，按照冻干工艺条件，-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％，获得大籽蒿花粉变应原冻干品。

如上所述大籽蒿花粉变应原浸提物、所述大籽蒿花粉变应原浸提液及其所述大籽蒿花粉变应原冻干品的应用，用于在制备诊断变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗制剂中的应用，所述诊断变态反应疾病包括过敏性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和慢性荨麻疹。

进一步，所述大籽蒿花粉变应原浸提物冻干品用于制备成片剂、口崩片，所述大籽蒿花粉变应原浸液用于制备注射液、舌下滴剂、变应原斑贴剂、变应原浸液稀释液(10^-2～10^-20倍稀释)。

本发明提供的大籽蒿花粉变应原浸液用于制备治疗大籽蒿花粉过敏性疾病的药物使用。

具体而言，采用本发明提供的大籽蒿花粉变应原浸液或冻干品按治疗有效量或诊断有效量的大籽蒿花粉变应原、以及药学上可接受的载体可制备用于治疗大籽蒿花粉过敏性疾病的药物。

用于治疗大籽蒿花粉过敏性疾病的药物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者年龄、体重和大致疾病状况等因素确定对病人有益的剂量进行施用。用于治疗大籽蒿花粉过敏性疾病的药物的剂型选自口服剂、(皮下)注射剂、舌下含服剂、气雾剂、鼻腔剂、或皮肤点刺剂等液体剂型；优选(皮下)注射剂、舌下含服剂、或皮肤点刺剂。其中，(皮下)注射剂、舌下含服剂一般是作为特异性免疫治疗时常用的剂型，而皮肤点刺剂是作为体内变应原检测时常用的剂型。

当采用本发明大籽蒿花粉变应原浸液应用于诊断由大籽蒿花粉引起的过敏性疾病时(即变应原皮肤点刺诊断试验)，除了本发明大籽蒿花粉变应原浸液外，一般还应包括阴性对照液、阳性对照液、以及点刺针。阴性对照液一般为对人体无过敏性反应的液体(例如甘油与盐溶液的混合物等)，阳性对照液一般为1.0～5.0mg/ml的磷酸组胺/盐酸组胺溶液。

本发明制备的大籽蒿花粉变应原浸液可应用于斑贴试验中。其原理为：将可疑致敏物质(变应原)敷贴于患者皮肤上，通过皮肤或粘膜进入机体后由抗原呈递细胞将抗原呈递给T淋巴细胞，使特异性T淋巴细胞活化，诱发炎症反应。

本发明的有益效果在于：

1、大籽蒿作为北方地区主要花粉过敏原，本发明提供的大籽蒿花粉标准化变应原浸液可以有效诊断由大籽蒿花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。

2、加入稳定剂甘油，提高了稳定性和缓释作用，提高了用药的有效性和安全性。

3、变态反应疾病皮下注射免疫脱敏给药方式，相比舌下含服滴剂给药方式，见效快，周期短。整个治疗周期给药剂量远小于舌下滴剂给药量(约100倍)，其治疗费用远小于舌下滴剂给药免疫脱敏，减轻患者的医疗负担。

4、本发明通过使用制备的应变原浸液以原液做点刺试验分别与变态反应专科医生临床综合特异性诊断和血清特异性IgE(specific IgE，sIgE)诊断进行对比，评价皮内试验结果与临床综合特异性诊断及与血清sIgE诊断的结果一致、具有较好的灵敏度和特异度，安全性好。

5、本发明通过使用制备的变应原浸液以1：10³～10⁸稀释后做体外嗜碱性粒细胞活化试验，能临床特异性诊断大籽蒿过敏患者，避免部分体外sIgE检测假阳性，同时也能避免变应原皮肤试验(点刺或皮内)给部分蒿属花粉过敏患者带来过敏性休克的风险。

本发明提供的大籽蒿花粉变应原浸液具有特异性高的特点，大籽蒿致敏蛋白组分提取充分，总生物效价稳定，有效期长，无菌保证好；可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由大籽蒿花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。可实现标准化控制，使用有效期有效延长，能带来较好的经济效益。

本发明方法通过冻干复溶后得到的浸液，相比北京协和医院研制的大籽蒿花粉变应原注射原液更稳定，生物效价和蛋白含量都比较稳定，且效期为3年。

附图说明

图1为大籽蒿花粉原料ITS2序列PCR电泳结果。

图2为不同批次大籽蒿花粉不同脱脂时间脂肪含量变化趋势

图3不同批次大籽蒿花粉不同提取搅拌时间点蛋白含量变化趋势。

图4为大籽蒿花粉变应原浸液SDS-PAGE蛋白电泳结果(示意成分鉴别)。

图5为大籽蒿花粉变应原浸液与大籽蒿过敏患者血清Western Blotting反应检测结果(示意大籽蒿变应原成分鉴别)。

图6为大籽蒿花粉变应原浸液产品pH值在长期稳定性试验中的测试结果。

图7为大籽蒿花粉变应原浸液产品苯酚含量在长期稳定性试验中的测试结果。

图8为大籽蒿花粉变应原浸液产品甘油含量在长期稳定性试验中的测试结果。

图9为大籽蒿花粉变应原浸液产品氯化钠含量在长期稳定性试验中的测试结果。

图10为大籽蒿花粉变应原浸液产品总蛋白含量在长期稳定性试验中的测试结果。

图11为大籽蒿花粉变应原浸液产品总应变原活性在长期稳定性试验中的测试结果。

图12为大籽蒿变应原浸液与大籽蒿变应原注射液医疗机构制剂品种稳定性Western Blotting对比研究

图13为大籽蒿花粉变应原浸液产品应用于临床大籽蒿花粉过敏患者体外嗜碱性粒细胞活化试验结果示例。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1大籽蒿花粉原料的鉴别

由于原料的鉴别和纯度对于后续变应原诊断及治疗制剂极为重要，本实施例采用DNA特异性序列检测加显微镜检对大籽蒿原料进行双重鉴别及质控。

1、大籽蒿DNA提取

采用天根快速DNA提取扩增试剂盒(天根生化KG203)。

提取方法：称取5mg大籽蒿花粉样品置于1.5mL离心管中，加入Buffer 1 100μl后用一次性研磨杵将样品彻底研碎后加入Buffer 2 100μl后震荡混匀，离心机12000r/min离心5min后取上清液于新的离心管中作为DNA模版备用。

2、引物设计及合成

引物序列如下：

Art ITS2-F(SEQ ID NO.1)：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'

Art ITS2-R(SEQ ID NO.2)：5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'

引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。合成后分装-20℃保存。

3、PCR反应体系

PCR扩增试剂盒(天根生化)。对提取的DNA采用如下50μl体系的配制PCR反应体系见表1：

表1.大籽蒿花粉ITS2序列PCR反应体系

4、PCR反应条件见表2.

表2.大籽蒿花粉ITS2序列PCR反应条件

对PCR扩增后的反应液进行2％琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳观察，电泳结果如图1所示。

5、测序

利用PCR产物纯化回收试剂盒(生工SK1141)，回收PCR产物进行测序，测序结果编号Art si ITS2，如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.3：

AGGTAAACGCCGATTTCAGCTGGGCTGTTCCGGTTCGCTCGCCGTTACTAAGGGAATCCTTGTAAGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGGTAGTCCCGCCTGACCTGGGGTCGCGGTCGAAGCGTCGTCAAGAGACGACACGTTGGGGTTTTCTAAGAGTTTCCCTAGCGACTAACGGCACGAAACAAAAGACGAGGGTTTTTACGACCACCACTAGTTCGTGCGTCCATCGAAGGGACTCCTATTTCGGCCAACCACGCCATGAGAGCACGGGAGACCAATATCCGCCCCCAATACACAAGTTCCCTTTGCGGAGAACTGTGGGGGGGCGACGCGATGCGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCAAAAGGCTTCGGGCGCAACTTGCGTTCAAAAACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAGGTA

6、大籽蒿的显微镜检

大籽蒿花粉显微镜下形态学鉴别：花粉粒球形或扁球形，大小为19.6×19.0微米。极面观三裂圆形，赤道面观圆形或椭圆形。具3孔沟。外壁三层，内层较薄，外层具明显基柱，表面具小刺状突起。

实施例2大籽蒿花粉脱脂及浸提关健工艺步重要参数的确定

1、大籽蒿花粉脱脂工艺步参数确定

(1)将大籽蒿花粉(g)与丙酮(ml)以1：2的重量体积比(w/v)进行脱脂处理。对不同批次(不同采集时间)的大籽蒿花粉不同脱脂时间样品进行脂肪含量进行检测，以确定最优的脱脂时间。

采用海能SOX500脂肪测定仪测定大籽蒿花粉中脂肪含量，通过索式萃取及干燥称重的方法，对比萃前后花粉重量的变化，得到相对应的脂肪含量，并根据脂肪含量结果对之后脱脂后花粉进行质量控制.

结果见图2，可见丙酮脱脂时间为30min后，脂肪含量几乎不随脱脂时间延长而下降，因此脱脂时间确定为30min。

(2)脱脂参数的验证：对不同批次(不同采集时间)的大籽蒿花粉进行30min脱脂后检测脂肪含量，结果如表3所示。表3.不同批次大籽蒿花粉脱脂30min

后脂肪含量降低百分比

从结果得知，大籽蒿花粉中脂肪含量在1.5％～2.5％，故在之后脱脂过程中，脱脂后的大籽蒿花粉在脂肪含量上应该下降1.5～2.5％。

2、大籽蒿花粉蛋白浸提工艺步重要参数确定

(1)将大籽蒿花粉(g)与丙酮(ml)以1：2的重量体积比(w/v)进行搅拌或振荡脱脂30分钟处理，静置分层，观察上层液体澄清情况，重复脱脂至上层液体澄清后，将脱脂后的花粉均匀摊开，室温下干燥48小时以上。

(2)将脱脂干燥后的大籽蒿花粉按重量体积比1:10加入10L，pH 7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2～8℃，在搅拌速度为250rpm条件下，在搅拌时间分别为3h、6h、9h、12h、18h、24h、48h、72h等提取点时，将提取后的提取液，将浸提液全部加入到离心桶内，调节平衡，离心力8000～12000g，离心温度4℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清。

(3)将离心分离后的上清液先用4000目滤布过滤后，通过纸板过滤，0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；得到大籽蒿花粉粗提取液。

取取样以Bradford法测定蛋白含量，结果见图3大籽蒿花粉浸液总蛋白含量与浸提时间的关系。

如图3结果表明，在蛋白提取过程中，随搅拌提取时间延长，蛋白提取含量增大，提取时间24h含量达到最高1406±13μg/ml，可见蛋白类物质提取时间过长会影响其蛋白含量，故提取时间优选为22～26h左右。

实施例3大籽蒿花粉原料工艺

1、花粉采集

自然脱落法，收集大籽蒿花粉。常温或真空或流化床干燥，直至花粉不再粘附。将干燥后的花粉过150～250目分样筛，本实施例中优选为180目分样筛。

2、干燥

将花粉摊放于通风干燥处自然干燥，或真空干燥、或流化床干燥6-48h，直至花粉不再粘附。

3、脱脂

将上述所得花粉(g)与丙酮(ml)以1：5～1:1的重量体积比(w/v)进行脱脂处理。本实施例中优选为1：2。搅拌或振荡脱脂30分钟后，静置分层，观察上层液体澄清情况。倒出上层液，加入新的丙酮，重复脱脂至上层液体澄清。

4、再干燥

将脱脂后的花粉均匀摊开，室温干燥、或真空干燥、或流化床干燥6-48h。

5、杂质控制

(1)显微镜下用颗粒计数法测定，其中的杂质颗粒含量应满足如下标准：孢子含量≤1％，无关花粉含量≤2％，其它杂质含量≤10％。

(2)重金属及有害元素

总重金属≤50mg/kg；砷≤5mg/kg。

(3)丙酮残留

丙酮残留量≤0.5％(体积分数)。

实施例4大籽蒿花粉变应原原液(冻干品)制备工艺

1、按实施例3大籽蒿花粉原料工艺制备大籽蒿花粉原料。

2、浸提

将脱脂干燥后的大籽蒿花粉按重量体积比1:50～1:10加入10L，本实施例中优选为1：20，以pH 7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2-8℃搅拌22～26h进行浸提。其中以配制1000ml磷酸盐—盐水缓冲液(pH 8.2)为例的配方如表4。磷酸盐—盐水缓冲液充分溶解后除菌过滤，2～8℃放置，保存期不超过30天。

表4磷酸盐—盐水缓冲液(pH 8.2)配方

3、固液分离

取提取后的浸提液，将浸提液全部加入到离心桶内，调节平衡，离心力8000～12000g，离心温度2～8℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清；

4、澄清

将离心分离后的上清液先用4000目滤布过滤后，将滤液依次通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；

5、超滤、透析、浓缩

过滤后的浸提液，用3KD或1KD超滤膜切向流超滤，优选地，本实施例中用3KD超滤膜超滤。透析液选用25-125mM的NH₄HCO₃，本实施例中优选为50mM的NH₄HCO₃。根据蛋白含量质量标准，超滤浓缩至适当体积，检测蛋白含量至质量标准的总蛋白含量区间。取样超滤浓缩液、超滤透过液，检测其总蛋白含量。当超滤透过液中总蛋白含量≤0.02mg/ml，则直接排弃透过液；超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，则对超滤膜进行完整性测试，超滤膜未破损，则排弃透过液；若超滤膜破损，则更换超滤膜之后对透过液重复超滤。

6、无菌过滤

用0.22μm膜除菌过滤。

7、冻干

按照冻干工艺条件，-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％；获得大籽蒿花粉变应原原液(冻干品)。

实施例5大籽蒿花粉变应原浸液成品制备工艺

1、复溶

将实施例4制备的大籽蒿花粉变应原冻干品用磷酸盐—盐水缓冲液(pH6.5～7.5，配方见表5)复溶，至总蛋白含量位于质量标准2倍范围区间。2～8℃放置。

表5.磷酸盐—盐水缓冲液(pH值6.5-7.5)配制

2、半成品配制

原液复溶后，在净化车间内A级洁净条件下，将复溶液与等体积预先湿热灭菌(121℃、30分钟)并冷却的甘油混匀，调节溶液pH值至6.0～8.0。

3、半成品除菌过滤、无菌分装为成品

在净化车间内A级洁净条件下，将半成品通过0.22μm滤膜除菌过滤，无菌分装为成品，得到pH6.0～8.0浅黄色至棕色液体即为大籽蒿花粉标准化变应原浸液成品。

实施例6大籽蒿花粉变应原浸液成品质量控制

1、大籽蒿花粉标准化变应原浸总蛋白成分SDS-PAGE法鉴别

通过SDS-PAGE检测，结果如图3所示。M为Genstar M223-01Marker，R为冻干内部参考品(即冻干的大籽蒿花粉变应原原液)，L₁，L₂和L₃为不同批次大籽蒿花粉标准化变应原浸液，其蛋白分布主要在10-117kDa之间，其中鉴定的致敏蛋白分子量、序列、过敏血清阳性率、对应全蛋白质谱鉴定肽段概览见表6。

2、大籽蒿花粉标准化变应原浸总变应原成分Western Blotting法鉴别

采用还原型SDS-PAG电泳，分离胶浓度为4～12％，0.2μm PVDF ImmobilonR-PSQ转印膜，一抗血清反应稀释度1：3，室温杂交2h，随后置于4℃冰箱杂交过夜，1×PBST洗3次，10min/次。。二抗Ms mAb to Hu IgE(ab99806)1：1000室温杂交2h，1×PBST洗3次，10min/次。将ECL显影液A液和B液1:1混匀后曝光显色。

结果见图4所示。其中，M为Genstar M223-01Marker，R为内部参考品，N为浸液与健康受试者血清反应条带，P_1-24分别为浸液与24例临床确诊的大籽蒿过敏阳性患者(sIgE≥3级，皮试≥+++，典型的夏秋季花粉症病史)血清反应条带结果，其中致敏Art Si 1’-Art Si11的分子量及过敏血清阳性率汇总如表6，由此确定血清阳性率最高的Art Si 1’(28kDa)为大籽蒿花粉的主要致敏蛋白(血清阳性率最高，为83.3％)。

3、致敏蛋白序列测定

本发明产品对相应致敏蛋白(见表6)进行了全蛋白序列测定，并对大籽蒿花粉原料中每一致敏蛋白对应mRNA进行了核苷酸全长测序，致敏蛋白代码、序列标识及氨基酸全长序列、对应mRNA全长序列结果详见表6。

其中本发明所含大籽蒿致敏蛋白的全序列依次为：

Art Si 1’致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.4：

MAKCSYVFCAVLLIFILAIGEIEAAGSKLCEKTSKTWSGKCDNKKCDKKCIEWEKAQHGACHKREAGKESCFCYFDCSKSPPGATPAPPGAAPPPAAGGSPSPPADGGSPPPPADGGSPPADGGSPPPPSGH

Art Si 2致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.5：

MGHLRNISLVLAISFAILHLSHAHETYGEPGNTPDDYVHAHNCIRRVLGMKPLCWDDELAKVAQAWAEARTADCSLVHSDRCGENMAQGAINGSMAVQLWLDERLDYDYNENKCIKMCGHYTQIVWANSERVGCGRALCSNGWAYIIVCNYDPPGNVVGQKPY

Art Si 3’致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.6：

MAMKMMKFFCAMVVCMVVSSSYAEALKCSDVSNKISACLSYLKQGGEVPADCCAGVKGLNDAAKTTPDRQTACNCLKTTFKSNKDFKSDFAASLPSKCGVNIPYKISLETDCNKVK

Art Si 4致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.7

MSWQTYVDDHLMCDIEGTGQHLTAAAILGLDGTVWAKSDKFPEFKAEEMKGIINEFNEVGTLAPTGLFLGGAKYMVLQGEAGAVIRGKKGAGGICIKKTGQAMVMGIYDEPVAPGQCNMIVERLGDYLVDQNM

Art Si 5致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.8

MADEDKAECDRIFGAFDKNGDGKISAAELGESLMKLGSVSPEEVQTMMDELDTDGDGYISYDEFAEFFNANRGLMKDVGKIF

Art Si 6致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.9

MEIHYFVILFTAAFVFVGAAARADIGDELVAAQLNSTRRGLHESCAAHNIIDKCWRCRADWEKNRQALAKCAQGFAKGTTGGLGGEIYVVTDCSDDNAANPKPGTLRCAVTQDKPLWIIFKKDMVIKLKHELVINKDKTIDGRGANVEITCGGLTIHNVCNVIIHNIHIHDIKVTEGGIIKATDGKPGHRHKSDGDGICVAGSSKIWIDHCTLSHGPDGLIDVTLGSTAVTISNCKFSHHQKILLLGADNSHVDDKKMHVTVAFNRFAEACDQRMPRCRFGFFQVVNNDYTSWGTYAIGGSANPTILSQGNRFHAPNDPMKKNVLVRADAPHAESMKWNWRSEKDLLENGAIFVASGCDPHLTPEQKSHLIPAEPGSAVLQLTGCAGTLKCVPGKPC

Art Si 7致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.10

MASSIKTVILFLLPLLLAYSILAAPDITDGAGDKPGPQVDDGGGDKPVPGNNDGASDYAKPAIESEFMGQWVIDNPNAGVAAMQLQLMPNDQIVWFDTTSLGASGYKLPEGTPCPINPDANNQPDCYVHGIAYDWKTSKYRPLTLQGDAWCSSGNLWPNGNLMATGGTFSGDKAIRVIPNDDPNGDFTTKIGALADTRWYSSNQVLPDGSSVVLGGRDSYSYEIVPPQMEFKPKRFDLPFMQQTTEPPLGPGRPVENNLYPFLFLLPDGNIFLFANNRAITFEPATGKTVKEFPVLPGGSRNYPPSGSAALFPLKLTADNAPVVPEIVICGGNQPNAYELVDARHVTEKQFLPALQDCNRIKPMAADAAWIPEQNMPSPRTMGDLIHLANGDMLMLNGAKKGTSGWEDATEPNLTPVLYTPYKPMGQRFKELRPTTIARMYHSCSALLPDTRVLVAGSNMHQFYTFDTEFPTELRVEKFSPPYLDPALELERSQIDPANTDVVLKYGKPFKITAGLMEKQPLVLGEVKVTLLYPPFTTHGFSQNQRMIVPAITSVENGVITAIAPPSGEIAPPGYYIMFVSHLGIPGAGIWVHID

通过对大籽蒿花粉原料中上述每一致敏蛋白对应mRNA进行了核苷酸全长测序后，其mRNA对应序列如下

Art Si 1’致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.11：

ATGGCAAAGTGTTCATATGTTTTTTGTGCGGTTCTTCTGATTTTCATACTTGCTATCGGAGAAATAGAGGCCGCTGGTTCAAAGCTGTGTGAAAAGACAAGCAAGACGTGGTCGGGTAAGTGCGACAACAAGAAATGTGACAAAAAGTGTATAGAATGGGAGAAAGCACAACATGGTGCTTGTCACAAGAGAGAAGCCGGTAAAGAAAGTTGCTTTTGCTACTTTGACTGTTCCAAATCGCCTCCTGGAGCGACACCAGCGCCTCCTGGAGCGGCTCCTCCCCCAGCTGCTGGCGGCTCTCCATCACCTCCCGCTGATGGTGGCTCACCACCTCCTCCAGCTGATGGTGGATCTCCTCCTGCCGATGGTGGCTCTCCACCTCCTCCATCCGGTCACTAA

Art Si 2致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.12：

ATGGGACATTTGCGTAACATTTCGCTTGTTCTTGCTATATCATTTGCAATTCTACATTTATCACATGCTCACGAAACGTACGGGGAGCCAGGAAACACACCAGATGACTACGTTCATGCCCATAACTGTATCCGAAGAGTGTTAGGTATGAAACCTTTGTGTTGGGACGATGAATTGGCTAAAGTTGCACAAGCTTGGGCCGAAGCAAGGACGGCCGATTGCAGTCTCGTTCATTCTGACAGGTGCGGTGAGAATATGGCACAAGGAGCCATCAACGGTTCGATGGCAGTCCAATTGTGGCTTGATGAGAGACTCGACTATGATTACAACGAAAACAAATGCATTAAGATGTGTGGTCACTATACTCAAATTGTTTGGGCAAACTCTGAACGCGTTGGATGTGGTAGGGCTTTATGTAGCAACGGCTGGGCTTATATTATTGTTTGCAATTACGACCCTCCCGGTAACGTTGTTGGTCAGAAACCTTACTAG

Art Si 3’致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.13：

ATGGCAATGAAAATGATGAAGTTTTTTTGTGCTATGGTAGTTTGCATGGTGCTATCATCCTCATATGCAGAAGCTCTTACGTGTAGTGATGTGTCAAATAAGATAACGCCATGCCTAAACTACTTGAAGCAAGGTGGTGAAGTGCCAGCAGATTGTTGCGCTGGTGTTAAAGGACTGAACGATGCTGCCAAAACGACCCCTGACCGCCAGACAGCTTGTAATTGTCTGAAGACCTCCTTTAAATCTAACAAGGATCTCAAATCCGACTTTGCCGCTAGTCTTCCTAGCAAGTGTGGTGTAAATATACCATACAAGATCAGCTTGGAAACTGATTGCAACAAGGTGAAATAA

Art Si 4致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.14：

ATGTCGTGGCAAACTTACGTTGATGACCATTTGATGTGTGATATTGAGGGCACTGGTCAGCATCTCACCGCTGCCGCTATTCTTGGCCTAGATGGTACCGTTTGGGCTAAGAGTGATAAGTTTCCTGAGTTTAAAGCAGAGGAGATGAAAGGCATTATTAATGAATTCAATGAAGTAGGTACCCTCGCCCCTACGGGTTTATTCCTTGGGGGTGCAAAGTACATGGTACTCCAAGGAGAGGCCGGAGCTGTCATCCGTGGAAAGAAGGGAGCTGGAGGAATATGCATCAAGAAAACTGGTCAGGCCATGGTGATGGGTATCTATGATGAGCCGGTAGCTCCTGGACAATGCAACATGATTGTCGAGAGGTTGGGTGATTATCTCGTTGATCAGAACATGTAG

Art Si 5致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.15：

ATGGCTGATGAAGACAAGGCAGAATGTGATCGCATCTTTGGTGCATTTGATAAAAATGGAGATGGTAAGATCTCTGCAGCTGAGCTTGGAGAATCTTTGATGAAGCTCGGCTCCGTGTCACCTGAAGAGGTCCAAACTATGATGGATGAACTTGATACCGATGGAGATGGGTACATTTCTTATGATGAGTTCGCTGAATTTTTCAACGCAAACCGGGGCTTAATGAAGGACGTTGGCAAAATCTTCTAA

Art Si 6致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.16：

ATGGAAATACATTATTTTGTCATATTGTTCACCGCAGCGTTTGTTTTCGTTGGTGCAGCTGCTCGGGCTGACATTGGTGATGAGCTCGTAGCGGCTCAATTGAATTCAACAAGGAGGGGCTTACACGAATCATGTGCAGCACATAACATAATAGATAAGTGTTGGAGGTGCAGAGCTGATTGGGAAAAAAACCGACAAGCATTAGCCAAATGCGCACAAGGTTTTGCAAAGGGAACAACTGGCGGATTGGGTGGGGAAATCTACGTGGTGACTGATTGTTCAGATGACAATGCTGCAAATCCAAAGCCAGGGACACTTCGTTGTGCTGTCACCCAAGATAAACCGCTGTGGATCATCTTTAAGAAAGATATGGTCATAAAACTTAAACACGAGCTCGTGATAAACAAAGACAAGACAATTGATGGAAGAGGTGCAAATGTTGAGATCACTTGTGGCGGTCTCACCATTCACAACGTTTGCAATGTGATCATTCATAACATTCACATACATGATATTAAAGTAACGGAAGGTGGAATTATTAAGGCAACGGACGGTAAACCAGGACATAGACATAAGAGCGACGGAGATGGTATTTGTGTTGCTGGTTCTTCAAAGATATGGATCGATCATTGCACACTTAGTCATGGTCCAGATGGCCTCATTGATGTCACGTTGGGTAGCACAGCCGTTACCATTTCCAACTGCAAATTTAGCCATCACCAAAAAATTCTATTACTCGGAGCAGACAATTCACATGTAGACGATAAAAAAATGCATGTCACAGTCGCATTCAACAGGTTCGCAGAAGCATGTGATCAAAGAATGCCACGATGTCGATTTGGATTTTTCCAAGTTGTTAACAACGACTACACCAGCTGGGGAACGTACGCCATTGGTGGTAGTGCCAATCCTACTATCCTTAGCCAAGGCAACCGATTCCATGCTCCCAATGACCCAATGAAAAAAAATGTGTTGGTGAGGGCTGATGCACCACATGCAGAGTCAATGAAGTGGAACTGGAGATCTGAGAAAGACTTACTAGAAAATGGAGCTATATTTGTAGCATCCGGGTGCGACCCGCATCTAACCCCTGAACAAAAAAGCCATTTGATTCCAGCTGAACCAGGATCAGCAGTTCTTCAACTCACCGGTTGTGCTGGCACACTCAAATGCGTTCCTGGAAAACCTTGCTAAArt Si 7致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.17：

ATGGCTTCATCAATTAAAACAGTCATCCTTTTCCTTCTCCCTCTATTGCTTGCATATTCTATCCTTGCTGCCCCAGATATAACCGATGGTGCAGGTGACAAACCAGGGCCCCAAGTCGATGATGGTGGTGGTGACAAACCTGTACCCGGAAACAACGATGGTGCATCTGATTATGCAAAGCCAGCAATCGAGTCTGAATTTATGGGTCAATGGGTAATTGACAATCCTAACGCTGGTGTTGCTGCCATGCAACTCCAGTTGATGCCTAATGATCAGATCGTATGGTTTGATACCACGTCACTTGGGGCTTCGGGATATAAATTACCTGAGGGAACTCCTTGCCCTATTAACCCAGATGCAAATAACCAGCCTGATTGTTATGTTCATGGCATCGCTTATGACTGGAAGACCTCAAAATACAGGCCGCTTACGTTACAAGGTGATGCATGGTGCTCGTCAGGAAACTTGTGGCCAAATGGTAACCTAATGGCTACGGGAGGTACCTTCAGTGGTGATAAAGCTATTCGAGTGATCCCTAACGATGATCCTAATGGAGACTTTACCACCAAAATTGGTGCTCTTGCTGATACAAGATGGTATTCATCTAACCAGGTCTTGCCAGACGGAAGTTCAGTCGTGTTGGGAGGCAGGGATTCCTACAGCTACGAAATCGTACCACCACAAATGGAATTCAAACCCAAGAGATTTGATCTCCCGTTCATGCAACAAACAACTGAACCTCCTTTAGGACCAGGAAGACCGGTCGAGAACAACCTGTACCCGTTCCTTTTCCTCCTTCCTGATGGAAACATTTTCCTCTTTGCTAACAATCGTGCCATCACCTTCGAACCAGCTACAGGAAAAACCGTTAAGGAGTTCCCCGTGTTACCTGGTGGCTCTCGCAACTATCCACCTTCAGGATCGGCAGCTCTTTTCCCATTGAAGCTCACGGCTGATAATGCCCCGGTCGTTCCTGAGATTGTAATTTGCGGTGGTAACCAACCAAATGCATATGAACTCGTTGACGCAAGGCATGTCACCGAAAAGCAGTTCCTGCCTGCCCTCCAAGATTGTAATAGAATCAAACCCATGGCAGCTGATGCAGCGTGGATCCCCGAACAAAACATGCCATCACCAAGAACCATGGGTGATTTGATACATCTTGCCAATGGTGATATGTTGATGCTTAATGGTGCGAAAAAAGGTACTTCAGGTTGGGAAGATGCGACAGAGCCTAACCTAACACCTGTTTTATATACACCATACAAACCTATGGGACAAAGATTTAAAGAACTGAGACCAACAACAATTGCTAGAATGTATCATTCTTGCTCGGCTTTATTGCCCGACACTAGAGTCTTGGTCGCGGGTAGCAACATGCACCAGTTCTATACGTTTGACACTGAGTTTCCTACAGAATTGAGGGTTGAGAAATTCTCACCACCTTACTTGGACCCAGCCCTAGAACTGGAAAGATCCCAGATCGATCCAGCTAATACGGATGTTGTCTTAAAGTACGGAAAACCATTTAAGATTACAGCTGGTCTTATGGAAAAACAACCCCTGGTGCTTGGTGAGGTTAAGGTAACCTTGCTATATCCACCATTCACCACTCATGGTTTCTCTCAAAACCAAAGGATGATTGTTCCGGCAATAACCAGTGTTGAGAATGGTGTAATCACAGCCATTGCACCTCCTTCTGGAGAGATTGCTCCACCAGGATACTACATTATGTTTGTGAGTCACCTCGGTATTCCTGGTGCGGGTATTTGGGTTCACATCGACTAA

(4)质谱检测

对大籽蒿变应原浸液进行全蛋白质谱分析以及对大籽蒿变应原经SDS-PAGE分离后对应的胶条分别取样进行质谱鉴定，其主要包含且不限于以下肽段如：

Art Si 1’质谱鉴定的肽段：

SEQ ID NO.18：EAGKESCFCYFDCSK

SEQ ID NO.19：ESCFCYFDCSK

Art Si 3’质谱鉴定的肽段：

SEQ ID NO.20：QGGEVPADCCAGVK

Art Si 4质谱鉴定的肽段：

SEQ ID NO.21：YMVIQGEAGAVIR

SEQ ID NO.22：SASFPEFKPNEIDAIIK

SEQ ID NO.23：EFNEAGQLAPTGLFLGGAK

Art Si 6质谱鉴定的肽段：

SEQ ID NO.24：ADAPHAESMK

SEQ ID NO.25：SHLIPAEPGSAVLQLTGCAGTLK

表6大籽蒿花粉致敏蛋白分子量、序列、过敏血清阳性率情况概览

备注：SEQ ID NO.12与AVD29827.1一致，但终止密码TAG替代TAA；SEQ ID NO.17与ARQ16442.1一致，但mRNA不同。

(5)理化性质检测

该大籽蒿变应原浸液经理化性质检验后，其质量标准如表7：

表7大籽蒿花粉变应原浸液理化性质质量标准

(6)总变应原活性测定

当变应原浸液包含治疗有效量或诊断有效量的大籽蒿花粉变应原时，用竞争性ELISA法测定相对生物效价为50000BAU/ml-200000BAU/ml。

(7)无菌检查

不得有菌生长。

实施例7大籽蒿花粉标准化变应原浸液稳定性试验

对按实施例5制备的大籽蒿花粉标准化变应原浸液成品在2-8℃下进行长期稳定性研究试验，分别对三个批次样品分别检测0时，3个月，6个月，9个月和12个月的pH值变化，苯酚含量，甘油含量，氯化钠含量，蛋白含量和总变应原活性的变化情况，结果如图6至图11所示。

从上述稳定性结果中，可以发现在12个月长期试验中，大籽蒿花粉标准化变应原浸液各质控参数虽有不规则波动，可能是实验误差导致，但均在质量标准质控范围内，且不同批次间变化趋势基本一致，这说明按照本发明所述的大籽蒿花粉标准化变应原浸液，在2-8℃条件下，12月内能稳定地保存。

实施例8本发明大籽蒿变应原浸液与大籽蒿变应原注射液医疗机构制剂(北京协和医院)品种稳定性Western Blotting对比研究

本发明变应原浸液组方中加入了50％的甘油作为稳定剂，优化了磷酸盐缓冲液pH及配方，使其更适合花粉变应原的浸提及保存，且原料经DNA条码技术鉴定，保障了纯度，原液采用了优化的冻干工艺，上述设计及工艺实现使按发明获得的变应原浸液成品稳定好、变应原活性得到良好保存，从而提高临床使用的有效性和安全性。为验证本发明下的处方及工艺对大籽蒿变应原活性保存优于已有工艺及处方配制的同品种大籽蒿变应原粗提液，本实施例针对大籽蒿变应原浸液(本发明，即下述为A的产品)及大籽蒿变应原注射液医疗机构制剂(北京协和医院配制，采用pH为8.2的Coca’s液提取，主要成分0.5％的NaCl、0.275％NaHCO3、0.4％的苯酚和注射用水，即下述为B的产品)做了稳定性对比研究。

本实施例通过对比A产品和B产品4℃(温度控制2～6℃，避光保存)长期放置12月后，分别在0点和12月取样，以产品与大籽蒿过敏患者血清池(15例大籽蒿过敏患者组成的血清池，sIgE≥3级，皮试≥+++，典型的夏秋季花粉症病史者入选)的Western Blotting反应评价稳定性差异。

试验采用还原型SDS-PAG电泳，分离胶浓度为4～12％，0.2μm PVDF ImmobilonR-PSQ转印膜，一抗血清反应稀释度1：3，室温杂交2h，随后置于4℃冰箱杂交过夜，1×PBST洗3次，10min/次。。二抗Ms mAb to Hu IgE(ab99806)1：1000室温杂交2h，1×PBST洗3次，10min/次。将ECL显影液1:1混匀后曝光显色。

结果见图12所示，其中，M为蛋白分子量Marker(Genstar)，N为浸液与健康受试者血清反应条带，L1和L2分别为本发明产品0时(A0)和12月(A12)与血清池反应结果，L3和L4分别为原医院制剂0时(B0)和12月(B12)与临床血清池反应条带结果。结果表明，本发明产品比原医院制剂产品在4℃放置12月后，不仅主要致敏蛋白条带清晰，其余多个致敏条带反应仍较明显，说明本发明产品中大籽蒿致敏蛋白更为丰富，保存较好，活性也较高从而证实本发明产品更为稳定、有效。

实施例9评价应用1

本发明的制备的大籽蒿花粉变应原浸液对大籽蒿花粉过敏进行临床特异性皮试诊断的有效性和安全性。方法：选择2015-08-24日至2016-09-21间，在北京协和医院变态反应科门诊就诊的、患有过敏性结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性哮喘、荨麻疹、特应性皮炎等过敏性疾病的门诊患者1026例。对受试者进行大籽蒿花粉变应原皮肤点刺试验(Skin pricktest，SPT)，采用原液进行，以平均风团直径(Mean wheal diameter，MWD)为判读标准；以花粉sIgE为标准，做ROC分析，分析不同诊断界值下，采用大籽蒿花粉变应原浸液用于诊断大籽蒿花粉过敏的准确性。同时记录不良事件，评价安全性。结果(Results)共入组门诊患者1026例(4～70岁)，无脱落病例，剔除率21.6％。安全集(Safety Set，SS)1026例，全分析集(Full Analysis Set，FAS)992例，符合方案集(Per protocol set，PPS)804例。年龄最小6岁，最大67岁。分析PPS集的ROC曲线，估算大籽蒿花粉SPT的最佳诊断阈值为MWD 5.25mm；特异度达95％时的诊断阈值为MWD 5.75mm。分别以MWD 3mm(国际通用阈值)、5.25mm、5.75mm为诊断阈值，本发明的大籽蒿花粉变应原浸液用于诊断大籽蒿花粉过敏的灵敏度依次降低，分别为0.9454(95％CI：0.9287～0.9620)、0.7689(95％CI：0.7380～0.7998)、0.7199(95％CI：0.6869～0.7528)；特异度依次升高，分别为0.3889(95％CI：0.2882～0.4896)、0.9111(95％CI：0.8523～0.9699)、0.9556(95％CI：0.9130～0.9981)。1026例患者中有7例出现8次不良事件，不良事件发生率0.68％(7/1026)，主要表现为流涕，喷嚏，鼻痒、呼吸不畅、眼痒、胸闷、点刺局部皮肤反应等。无严重不良事件。结论：本发明大籽蒿花粉变应原浸液用于诊断大籽蒿花粉过敏，诊断价值较高，安全性好，可作为大籽蒿花粉过敏原特异性体内诊断的临床检查方法。

实施例10评价应用2

本发明的制备的大籽蒿花粉变应原浸液对大籽蒿花粉过敏患者全血进行嗜碱性粒细胞活化试验，能进行临床特异性过敏体外诊断。这个检测方法在IgE或非IgE介导的过敏反应中均适用，可以用于部分sIgE体外诊断存在假阴性、假阳性患者的确诊及部分过敏性休克患者不适于进行皮试诊断的情况。

试验原理：变应原与患者全血细胞反应可以模拟人体内变态反应过程：即特异性IgE抗体通过与相应的变应原桥联结合到细胞表面，激活细胞内信号级联导致嗜碱性粒细胞(CCR3持续表达于嗜碱性粒细胞，是其特异性标记)的活化脱颗粒。在这个脱颗粒的过程中，细胞内复合物影响跨膜蛋白CD63(gp53)，使其外表达于细胞表面，并暴露于细胞外基质中，因此可以依赖流式细胞术原理(使用抗人趋化因子受体CCR3-藻红蛋白(anti-CCR3-PE)对嗜碱性粒细胞进行标记，使用抗人CD63单克隆抗体-异硫氰酸荧光素(anti-CD63-FITC)对活化状态的嗜碱性粒细胞进行标记，非特异性细胞活化剂fMLP作为一种阳性质控)，并以嗜碱性粒细胞脱颗粒的百分数变化来判断受试者是否对特定变应原过敏。方法：选择健康受试者、大籽蒿过敏患者，取其EDTA抗凝全血样本，以刺激缓冲液(阴性对照)、大籽蒿变应原浸液(对1：10³～10¹⁰稀释比例进行优化，本实施例中取1：10⁸)、fMLP刺激液(阳性质控)作为嗜碱性粒细胞的激活物，加入到全血中，然后加入anti-CD63-FITC、anti-CCR3-PE染色，48h内上流式细胞仪进行检测。结果：见图13。健康受试者以阴性对照、大籽蒿变应原浸液、阳性对照为嗜碱性粒细胞活化物时，其嗜碱性粒细胞活化率分别应＜15％、＜15％、≥15％，大籽蒿花粉过敏患者以阴性对照、大籽蒿变应原浸液、阳性对照为嗜碱性粒细胞活化物时，其嗜碱性粒细胞活化率分别应＜15％、≥15％、≥15％。结论：该大籽蒿变应原浸液能有效作为活化物运用于嗜碱性粒细胞活化试验，并依据其判断标准有效做出临床诊断。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国医学科学院北京协和医院

<120> 一种大籽蒿花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgcgatact tggtgtgaat 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gacgcttctc cagactacaa t 21

<210> 15

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aggtaaacgc cgatttcagc tgggctgttc cggttcgctc gccgttacta agggaatcct 60

tgtaagtttc ttttcctccg cttattgata tgcttaaact cagcgggtag tcccgcctga 120

cctggggtcg cggtcgaagc gtcgtcaaga gacgacacgt tggggttttc taagagtttc 180

cctagcgact aacggcacga aacaaaagac gagggttttt acgaccacca ctagttcgtg 240

cgtccatcga agggactcct atttcggcca accacgccat gagagcacgg gagaccaata 300

tccgccccca atacacaagt tccctttgcg gagaactgtg ggggggcgac gcgatgcgtg 360

acgcccaggc agacgtgccc tcggccaaaa ggcttcgggc gcaacttgcg ttcaaaaact 420

cgatggttca cgggattctg caattcacac caggta 456

<210> 1

<211> 132

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 1

Met Ala Lys Cys Ser Tyr Val Phe Cys Ala Val Leu Leu Ile Phe Ile

1 5 10 15

Leu Ala Ile Gly Glu Ile Glu Ala Ala Gly Ser Lys Leu Cys Glu Lys

20 25 30

Thr Ser Lys Thr Trp Ser Gly Lys Cys Asp Asn Lys Lys Cys Asp Lys

35 40 45

Lys Cys Ile Glu Trp Glu Lys Ala Gln His Gly Ala Cys His Lys Arg

50 55 60

Glu Ala Gly Lys Glu Ser Cys Phe Cys Tyr Phe Asp Cys Ser Lys Ser

65 70 75 80

Pro Pro Gly Ala Thr Pro Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Pro Pro Ala

85 90 95

Ala Gly Gly Ser Pro Ser Pro Pro Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro Pro

100 105 110

Pro Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro Ala Asp Gly Gly Ser Pro Pro Pro

115 120 125

Pro Ser Gly His

130

<210> 5

<211> 163

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 5

Met Gly His Leu Arg Asn Ile Ser Leu Val Leu Ala Ile Ser Phe Ala

1 5 10 15

Ile Leu His Leu Ser His Ala His Glu Thr Tyr Gly Glu Pro Gly Asn

20 25 30

Thr Pro Asp Asp Tyr Val His Ala His Asn Cys Ile Arg Arg Val Leu

35 40 45

Gly Met Lys Pro Leu Cys Trp Asp Asp Glu Leu Ala Lys Val Ala Gln

50 55 60

Ala Trp Ala Glu Ala Arg Thr Ala Asp Cys Ser Leu Val His Ser Asp

65 70 75 80

Arg Cys Gly Glu Asn Met Ala Gln Gly Ala Ile Asn Gly Ser Met Ala

85 90 95

Val Gln Leu Trp Leu Asp Glu Arg Leu Asp Tyr Asp Tyr Asn Glu Asn

100 105 110

Lys Cys Ile Lys Met Cys Gly His Tyr Thr Gln Ile Val Trp Ala Asn

115 120 125

Ser Glu Arg Val Gly Cys Gly Arg Ala Leu Cys Ser Asn Gly Trp Ala

130 135 140

Tyr Ile Ile Val Cys Asn Tyr Asp Pro Pro Gly Asn Val Val Gly Gln

145 150 155 160

Lys Pro Tyr

<210> 6

<211> 116

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 6

Met Ala Met Lys Met Met Lys Phe Phe Cys Ala Met Val Val Cys Met

1 5 10 15

Val Val Ser Ser Ser Tyr Ala Glu Ala Leu Lys Cys Ser Asp Val Ser

20 25 30

Asn Lys Ile Ser Ala Cys Leu Ser Tyr Leu Lys Gln Gly Gly Glu Val

35 40 45

Pro Ala Asp Cys Cys Ala Gly Val Lys Gly Leu Asn Asp Ala Ala Lys

50 55 60

Thr Thr Pro Asp Arg Gln Thr Ala Cys Asn Cys Leu Lys Thr Thr Phe

65 70 75 80

Lys Ser Asn Lys Asp Phe Lys Ser Asp Phe Ala Ala Ser Leu Pro Ser

85 90 95

Lys Cys Gly Val Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Ser Leu Glu Thr Asp Cys

100 105 110

Asn Lys Val Lys

115

<210> 7

<211> 133

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 7

Met Ser Trp Gln Thr Tyr Val Asp Asp His Leu Met Cys Asp Ile Glu

1 5 10 15

Gly Thr Gly Gln His Leu Thr Ala Ala Ala Ile Leu Gly Leu Asp Gly

20 25 30

Thr Val Trp Ala Lys Ser Asp Lys Phe Pro Glu Phe Lys Ala Glu Glu

35 40 45

Met Lys Gly Ile Ile Asn Glu Phe Asn Glu Val Gly Thr Leu Ala Pro

50 55 60

Thr Gly Leu Phe Leu Gly Gly Ala Lys Tyr Met Val Leu Gln Gly Glu

65 70 75 80

Ala Gly Ala Val Ile Arg Gly Lys Lys Gly Ala Gly Gly Ile Cys Ile

85 90 95

Lys Lys Thr Gly Gln Ala Met Val Met Gly Ile Tyr Asp Glu Pro Val

100 105 110

Ala Pro Gly Gln Cys Asn Met Ile Val Glu Arg Leu Gly Asp Tyr Leu

115 120 125

Val Asp Gln Asn Met

130

<210> 8

<211> 82

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 8

Met Ala Asp Glu Asp Lys Ala Glu Cys Asp Arg Ile Phe Gly Ala Phe

1 5 10 15

Asp Lys Asn Gly Asp Gly Lys Ile Ser Ala Ala Glu Leu Gly Glu Ser

20 25 30

Leu Met Lys Leu Gly Ser Val Ser Pro Glu Glu Val Gln Thr Met Met

35 40 45

Asp Glu Leu Asp Thr Asp Gly Asp Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Glu Phe

50 55 60

Ala Glu Phe Phe Asn Ala Asn Arg Gly Leu Met Lys Asp Val Gly Lys

65 70 75 80

Ile Phe

<210> 9

<211> 397

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 9

Met Glu Ile His Tyr Phe Val Ile Leu Phe Thr Ala Ala Phe Val Phe

1 5 10 15

Val Gly Ala Ala Ala Arg Ala Asp Ile Gly Asp Glu Leu Val Ala Ala

20 25 30

Gln Leu Asn Ser Thr Arg Arg Gly Leu His Glu Ser Cys Ala Ala His

35 40 45

Asn Ile Ile Asp Lys Cys Trp Arg Cys Arg Ala Asp Trp Glu Lys Asn

50 55 60

Arg Gln Ala Leu Ala Lys Cys Ala Gln Gly Phe Ala Lys Gly Thr Thr

65 70 75 80

Gly Gly Leu Gly Gly Glu Ile Tyr Val Val Thr Asp Cys Ser Asp Asp

85 90 95

Asn Ala Ala Asn Pro Lys Pro Gly Thr Leu Arg Cys Ala Val Thr Gln

100 105 110

Asp Lys Pro Leu Trp Ile Ile Phe Lys Lys Asp Met Val Ile Lys Leu

115 120 125

Lys His Glu Leu Val Ile Asn Lys Asp Lys Thr Ile Asp Gly Arg Gly

130 135 140

Ala Asn Val Glu Ile Thr Cys Gly Gly Leu Thr Ile His Asn Val Cys

145 150 155 160

Asn Val Ile Ile His Asn Ile His Ile His Asp Ile Lys Val Thr Glu

165 170 175

Gly Gly Ile Ile Lys Ala Thr Asp Gly Lys Pro Gly His Arg His Lys

180 185 190

Ser Asp Gly Asp Gly Ile Cys Val Ala Gly Ser Ser Lys Ile Trp Ile

195 200 205

Asp His Cys Thr Leu Ser His Gly Pro Asp Gly Leu Ile Asp Val Thr

210 215 220

Leu Gly Ser Thr Ala Val Thr Ile Ser Asn Cys Lys Phe Ser His His

225 230 235 240

Gln Lys Ile Leu Leu Leu Gly Ala Asp Asn Ser His Val Asp Asp Lys

245 250 255

Lys Met His Val Thr Val Ala Phe Asn Arg Phe Ala Glu Ala Cys Asp

260 265 270

Gln Arg Met Pro Arg Cys Arg Phe Gly Phe Phe Gln Val Val Asn Asn

275 280 285

Asp Tyr Thr Ser Trp Gly Thr Tyr Ala Ile Gly Gly Ser Ala Asn Pro

290 295 300

Thr Ile Leu Ser Gln Gly Asn Arg Phe His Ala Pro Asn Asp Pro Met

305 310 315 320

Lys Lys Asn Val Leu Val Arg Ala Asp Ala Pro His Ala Glu Ser Met

325 330 335

Lys Trp Asn Trp Arg Ser Glu Lys Asp Leu Leu Glu Asn Gly Ala Ile

340 345 350

Phe Val Ala Ser Gly Cys Asp Pro His Leu Thr Pro Glu Gln Lys Ser

355 360 365

His Leu Ile Pro Ala Glu Pro Gly Ser Ala Val Leu Gln Leu Thr Gly

370 375 380

Cys Ala Gly Thr Leu Lys Cys Val Pro Gly Lys Pro Cys

385 390 395

<210> 10

<211> 595

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 10

Met Ala Ser Ser Ile Lys Thr Val Ile Leu Phe Leu Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ala Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Pro Asp Ile Thr Asp Gly Ala Gly

20 25 30

Asp Lys Pro Gly Pro Gln Val Asp Asp Gly Gly Gly Asp Lys Pro Val

35 40 45

Pro Gly Asn Asn Asp Gly Ala Ser Asp Tyr Ala Lys Pro Ala Ile Glu

50 55 60

Ser Glu Phe Met Gly Gln Trp Val Ile Asp Asn Pro Asn Ala Gly Val

65 70 75 80

Ala Ala Met Gln Leu Gln Leu Met Pro Asn Asp Gln Ile Val Trp Phe

85 90 95

Asp Thr Thr Ser Leu Gly Ala Ser Gly Tyr Lys Leu Pro Glu Gly Thr

100 105 110

Pro Cys Pro Ile Asn Pro Asp Ala Asn Asn Gln Pro Asp Cys Tyr Val

115 120 125

His Gly Ile Ala Tyr Asp Trp Lys Thr Ser Lys Tyr Arg Pro Leu Thr

130 135 140

Leu Gln Gly Asp Ala Trp Cys Ser Ser Gly Asn Leu Trp Pro Asn Gly

145 150 155 160

Asn Leu Met Ala Thr Gly Gly Thr Phe Ser Gly Asp Lys Ala Ile Arg

165 170 175

Val Ile Pro Asn Asp Asp Pro Asn Gly Asp Phe Thr Thr Lys Ile Gly

180 185 190

Ala Leu Ala Asp Thr Arg Trp Tyr Ser Ser Asn Gln Val Leu Pro Asp

195 200 205

Gly Ser Ser Val Val Leu Gly Gly Arg Asp Ser Tyr Ser Tyr Glu Ile

210 215 220

Val Pro Pro Gln Met Glu Phe Lys Pro Lys Arg Phe Asp Leu Pro Phe

225 230 235 240

Met Gln Gln Thr Thr Glu Pro Pro Leu Gly Pro Gly Arg Pro Val Glu

245 250 255

Asn Asn Leu Tyr Pro Phe Leu Phe Leu Leu Pro Asp Gly Asn Ile Phe

260 265 270

Leu Phe Ala Asn Asn Arg Ala Ile Thr Phe Glu Pro Ala Thr Gly Lys

275 280 285

Thr Val Lys Glu Phe Pro Val Leu Pro Gly Gly Ser Arg Asn Tyr Pro

290 295 300

Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Phe Pro Leu Lys Leu Thr Ala Asp Asn

305 310 315 320

Ala Pro Val Val Pro Glu Ile Val Ile Cys Gly Gly Asn Gln Pro Asn

325 330 335

Ala Tyr Glu Leu Val Asp Ala Arg His Val Thr Glu Lys Gln Phe Leu

340 345 350

Pro Ala Leu Gln Asp Cys Asn Arg Ile Lys Pro Met Ala Ala Asp Ala

355 360 365

Ala Trp Ile Pro Glu Gln Asn Met Pro Ser Pro Arg Thr Met Gly Asp

370 375 380

Leu Ile His Leu Ala Asn Gly Asp Met Leu Met Leu Asn Gly Ala Lys

385 390 395 400

Lys Gly Thr Ser Gly Trp Glu Asp Ala Thr Glu Pro Asn Leu Thr Pro

405 410 415

Val Leu Tyr Thr Pro Tyr Lys Pro Met Gly Gln Arg Phe Lys Glu Leu

420 425 430

Arg Pro Thr Thr Ile Ala Arg Met Tyr His Ser Cys Ser Ala Leu Leu

435 440 445

Pro Asp Thr Arg Val Leu Val Ala Gly Ser Asn Met His Gln Phe Tyr

450 455 460

Thr Phe Asp Thr Glu Phe Pro Thr Glu Leu Arg Val Glu Lys Phe Ser

465 470 475 480

Pro Pro Tyr Leu Asp Pro Ala Leu Glu Leu Glu Arg Ser Gln Ile Asp

485 490 495

Pro Ala Asn Thr Asp Val Val Leu Lys Tyr Gly Lys Pro Phe Lys Ile

500 505 510

Thr Ala Gly Leu Met Glu Lys Gln Pro Leu Val Leu Gly Glu Val Lys

515 520 525

Val Thr Leu Leu Tyr Pro Pro Phe Thr Thr His Gly Phe Ser Gln Asn

530 535 540

Gln Arg Met Ile Val Pro Ala Ile Thr Ser Val Glu Asn Gly Val Ile

545 550 555 560

Thr Ala Ile Ala Pro Pro Ser Gly Glu Ile Ala Pro Pro Gly Tyr Tyr

565 570 575

Ile Met Phe Val Ser His Leu Gly Ile Pro Gly Ala Gly Ile Trp Val

580 585 590

His Ile Asp

595

<210> 11

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggcaaagt gttcatatgt tttttgtgcg gttcttctga ttttcatact tgctatcgga 60

gaaatagagg ccgctggttc aaagctgtgt gaaaagacaa gcaagacgtg gtcgggtaag 120

tgcgacaaca agaaatgtga caaaaagtgt atagaatggg agaaagcaca acatggtgct 180

tgtcacaaga gagaagccgg taaagaaagt tgcttttgct actttgactg ttccaaatcg 240

cctcctggag cgacaccagc gcctcctgga gcggctcctc ccccagctgc tggcggctct 300

ccatcacctc ccgctgatgg tggctcacca cctcctccag ctgatggtgg atctcctcct 360

gccgatggtg gctctccacc tcctccatcc ggtcactaa 399

<210> 12

<211> 492

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgggacatt tgcgtaacat ttcgcttgtt cttgctatat catttgcaat tctacattta 60

tcacatgctc acgaaacgta cggggagcca ggaaacacac cagatgacta cgttcatgcc 120

cataactgta tccgaagagt gttaggtatg aaacctttgt gttgggacga tgaattggct 180

aaagttgcac aagcttgggc cgaagcaagg acggccgatt gcagtctcgt tcattctgac 240

aggtgcggtg agaatatggc acaaggagcc atcaacggtt cgatggcagt ccaattgtgg 300

cttgatgaga gactcgacta tgattacaac gaaaacaaat gcattaagat gtgtggtcac 360

tatactcaaa ttgtttgggc aaactctgaa cgcgttggat gtggtagggc tttatgtagc 420

aacggctggg cttatattat tgtttgcaat tacgaccctc ccggtaacgt tgttggtcag 480

aaaccttact ag 492

<210> 13

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggcaatga aaatgatgaa gtttttttgt gctatggtag tttgcatggt gctatcatcc 60

tcatatgcag aagctcttac gtgtagtgat gtgtcaaata agataacgcc atgcctaaac 120

tacttgaagc aaggtggtga agtgccagca gattgttgcg ctggtgttaa aggactgaac 180

gatgctgcca aaacgacccc tgaccgccag acagcttgta attgtctgaa gacctccttt 240

aaatctaaca aggatctcaa atccgacttt gccgctagtc ttcctagcaa gtgtggtgta 300

aatataccat acaagatcag cttggaaact gattgcaaca aggtgaaata a 351

<210> 14

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgtcgtggc aaacttacgt tgatgaccat ttgatgtgtg atattgaggg cactggtcag 60

catctcaccg ctgccgctat tcttggccta gatggtaccg tttgggctaa gagtgataag 120

tttcctgagt ttaaagcaga ggagatgaaa ggcattatta atgaattcaa tgaagtaggt 180

accctcgccc ctacgggttt attccttggg ggtgcaaagt acatggtact ccaaggagag 240

gccggagctg tcatccgtgg aaagaaggga gctggaggaa tatgcatcaa gaaaactggt 300

caggccatgg tgatgggtat ctatgatgag ccggtagctc ctggacaatg caacatgatt 360

gtcgagaggt tgggtgatta tctcgttgat cagaacatgt ag 402

<210> 15

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggctgatg aagacaaggc agaatgtgat cgcatctttg gtgcatttga taaaaatgga 60

gatggtaaga tctctgcagc tgagcttgga gaatctttga tgaagctcgg ctccgtgtca 120

cctgaagagg tccaaactat gatggatgaa cttgataccg atggagatgg gtacatttct 180

tatgatgagt tcgctgaatt tttcaacgca aaccggggct taatgaagga cgttggcaaa 240

atcttctaa 249

<210> 16

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atggaaatac attattttgt catattgttc accgcagcgt ttgttttcgt tggtgcagct 60

gctcgggctg acattggtga tgagctcgta gcggctcaat tgaattcaac aaggaggggc 120

ttacacgaat catgtgcagc acataacata atagataagt gttggaggtg cagagctgat 180

tgggaaaaaa accgacaagc attagccaaa tgcgcacaag gttttgcaaa gggaacaact 240

ggcggattgg gtggggaaat ctacgtggtg actgattgtt cagatgacaa tgctgcaaat 300

atggaaatac attattttgt catattgttc accgcagcgt ttgttttcgt tggtgcagct 360

gctcgggctg acattggtga tgagctcgta gcggctcaat tgaattcaac aaggaggggc 420

ttacacgaat catgtgcagc acataacata atagataagt gttggaggtg cagagctgat 480

tgggaaaaaa accgacaagc attagccaaa tgcgcacaag gttttgcaaa gggaacaact 540

ggcggattgg gtggggaaat ctacgtggtg actgattgtt cagatgacaa tgctgcaaat 600

ccaaagccag ggacacttcg ttgtgctgtc acccaagata aaccgctgtg gatcatcttt 660

aagaaagata tggtcataaa acttaaacac gagctcgtga taaacaaaga caagacaatt 720

gatggaagag gtgcaaatgt tgagatcact tgtggcggtc tcaccattca caacgtttgc 780

aatgtgatca ttcataacat tcacatacat gatattaaag taacggaagg tggaattatt 840

aaggcaacgg acggtaaacc aggacataga cataagagcg acggagatgg tatttgtgtt 900

gctggttctt caaagatatg gatcgatcat tgcacactta gtcatggtcc agatggcctc 960

attgatgtca cgttgggtag cacagccgtt accatttcca actgcaaatt tagccatcac 1020

caaaaaattc tattactcgg agcagacaat tcacatgtag acgataaaaa aatgcatgtc 1080

acagtcgcat tcaacaggtt cgcagaagca tgtgatcaaa gaatgccacg atgtcgattt 1140

ggatttttcc aagttgttaa caacgactac accagctggg gaacgtacgc cattggtggt 1200

agtgccaatc ctactatcct tagccaaggc aaccgattcc atgctcccaa tgacccaatg 1260

aaaaaaaatg tgttggtgag ggctgatgca ccacatgcag agtcaatgaa gtggaactgg 1320

agatctgaga aagacttact agaaaatgga gctatatttg tagcatccgg gtgcgacccg 1380

catctaaccc ctgaacaaaa aagccatttg attccagctg aaccaggatc agcagttctt 1440

caactcaccg gttgtgctgg cacactcaaa tgcgttcctg gaaaaccttg ctaa 1494

<210> 17

<211> 1788

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atggcttcat caattaaaac agtcatcctt ttccttctcc ctctattgct tgcatattct 60

atccttgctg ccccagatat aaccgatggt gcaggtgaca aaccagggcc ccaagtcgat 120

gatggtggtg gtgacaaacc tgtacccgga aacaacgatg gtgcatctga ttatgcaaag 180

ccagcaatcg agtctgaatt tatgggtcaa tgggtaattg acaatcctaa cgctggtgtt 240

gctgccatgc aactccagtt gatgcctaat gatcagatcg tatggtttga taccacgtca 300

cttggggctt cgggatataa attacctgag ggaactcctt gccctattaa cccagatgca 360

aataaccagc ctgattgtta tgttcatggc atcgcttatg actggaagac ctcaaaatac 420

aggccgctta cgttacaagg tgatgcatgg tgctcgtcag gaaacttgtg gccaaatggt 480

aacctaatgg ctacgggagg taccttcagt ggtgataaag ctattcgagt gatccctaac 540

gatgatccta atggagactt taccaccaaa attggtgctc ttgctgatac aagatggtat 600

tcatctaacc aggtcttgcc agacggaagt tcagtcgtgt tgggaggcag ggattcctac 660

agctacgaaa tcgtaccacc acaaatggaa ttcaaaccca agagatttga tctcccgttc 720

atgcaacaaa caactgaacc tcctttagga ccaggaagac cggtcgagaa caacctgtac 780

ccgttccttt tcctccttcc tgatggaaac attttcctct ttgctaacaa tcgtgccatc 840

accttcgaac cagctacagg aaaaaccgtt aaggagttcc ccgtgttacc tggtggctct 900

cgcaactatc caccttcagg atcggcagct cttttcccat tgaagctcac ggctgataat 960

gccccggtcg ttcctgagat tgtaatttgc ggtggtaacc aaccaaatgc atatgaactc 1020

gttgacgcaa ggcatgtcac cgaaaagcag ttcctgcctg ccctccaaga ttgtaataga 1080

atcaaaccca tggcagctga tgcagcgtgg atccccgaac aaaacatgcc atcaccaaga 1140

accatgggtg atttgataca tcttgccaat ggtgatatgt tgatgcttaa tggtgcgaaa 1200

aaaggtactt caggttggga agatgcgaca gagcctaacc taacacctgt tttatataca 1260

ccatacaaac ctatgggaca aagatttaaa gaactgagac caacaacaat tgctagaatg 1320

tatcattctt gctcggcttt attgcccgac actagagtct tggtcgcggg tagcaacatg 1380

caccagttct atacgtttga cactgagttt cctacagaat tgagggttga gaaattctca 1440

ccaccttact tggacccagc cctagaactg gaaagatccc agatcgatcc agctaatacg 1500

gatgttgtct taaagtacgg aaaaccattt aagattacag ctggtcttat ggaaaaacaa 1560

cccctggtgc ttggtgaggt taaggtaacc ttgctatatc caccattcac cactcatggt 1620

ttctctcaaa accaaaggat gattgttccg gcaataacca gtgttgagaa tggtgtaatc 1680

acagccattg cacctccttc tggagagatt gctccaccag gatactacat tatgtttgtg 1740

agtcacctcg gtattcctgg tgcgggtatt tgggttcaca tcgactaa 1788

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 18

Glu Ala Gly Lys Glu Ser Cys Phe Cys Tyr Phe Asp Cys Ser Lys

1 5 10 15

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 19

Glu Ser Cys Phe Cys Tyr Phe Asp Cys Ser Lys

1 5 10

<210> 20

<211> 14

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 20

Gln Gly Gly Glu Val Pro Ala Asp Cys Cys Ala Gly Val Lys

1 5 10

<210> 21

<211> 13

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 21

Tyr Met Val Ile Gln Gly Glu Ala Gly Ala Val Ile Arg

1 5 10

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 22

Ser Ala Ser Phe Pro Glu Phe Lys Pro Asn Glu Ile Asp Ala Ile Ile

1 5 10 15

Lys

<210> 23

<211> 19

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 23

Glu Phe Asn Glu Ala Gly Gln Leu Ala Pro Thr Gly Leu Phe Leu Gly

1 5 10 15

Gly Ala Lys

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 24

Ala Asp Ala Pro His Ala Glu Ser Met Lys

1 5 10

<210> 25

<211> 23

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 25

Ser His Leu Ile Pro Ala Glu Pro Gly Ser Ala Val Leu Gln Leu Thr

1 5 10 15

Gly Cys Ala Gly Thr Leu Lys

20

Claims (14)

1.一种大籽蒿花粉变应原浸提物，其特征在于，其含有大籽蒿花粉变应原蛋白Art Si1’、Art Si 3’、Art Si 4、Art Si 5、Art Si6和Art Si7；其中，所述Art Si 1’含有如SEQID NO.4所示的氨基酸序列，所述Art Si 3’含有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，所述Art Si 4含有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，所述Art Si 5含有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，所述Art Si6含有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，所述Art Si7含有如SEQID NO.10所示的氨基酸序列。

2.一种的大籽蒿花粉变应原浸液，其特征在于，所述变应原浸液中含如权利要求1所述的大籽蒿花粉变应原浸提物、体积比为0.2～0.4％的苯酚、体积比为45～55％的甘油和4.5～5.5g/L的NaCl，其pH值为6.0～8.0。

3.根据权利要求2所述的大籽蒿花粉变应原浸液，其特征在于，所述大籽蒿花粉变应原的活性浓度为50000～200000BAU/ml。

4.根据权利要求2所述的大籽蒿花粉变应原浸液，其特征在于，所述大籽蒿花粉变应原浸液的总蛋白浓度0.47～0.70mg/ml。

5.根据权利要求2所述的大籽蒿花粉变应原浸液，其特征在于，通过SDS-PAGE和Western Blotting检测，所述大籽蒿花粉变应原浸提物蛋白分布在10kDa、12kDa、14kDa、15.3kDa、20kDa、24kDa、28kDa、44kDa、62kDa、94kDa、117kDa。

6.根据权利要求2所述的大籽蒿花粉变应原浸液，其特征在于，通过全蛋白质谱检测，所述大籽蒿花粉变应原浸提物主要包含且不限于如SEQ ID NO.18-SEQ ID NO.25所示的特征性肽段。

7.一种根据权利要求2-6中任一项所述大籽蒿花粉变应原浸液的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1、采集大籽蒿花粉，常温干燥或真空干燥或流化床干燥；

S2、对干燥后的花粉脱脂、干燥；

S3、将脱脂干燥后的大籽蒿花粉按重量g体积ml比1:50～1:10加入pH为7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，搅拌速度为150～300rpm条件下2-8℃浸提22～26h；

S4、取步骤S3后的浸提液，离心取上清液；将上清液过滤及除菌过滤；

S5、将过滤后的上清液进行超滤浓缩，获得超滤浓缩液；

S6、将所述超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，真空冻干获得大籽蒿花粉变应原冻干品；

S7、将所述大籽蒿花粉变应原冻干品用pH 6.5～7.5磷酸盐—盐水缓冲液复溶配置为大籽蒿花粉变应原原液，2～8℃放置，与等体积灭菌的甘油混匀，调节溶液pH值至6.0～8.0。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述花粉脱脂采用花粉与丙酮以1：5～1:1的重量g体积ml比进行脱脂处理，重复脱脂至上层液体澄清。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，所述离心的条件为8000～12000g，离心温度2～8℃，时间为15～20min；所述过滤及除菌过滤为先用4000目滤布过滤后，再通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述超滤浓缩用3KD、1KD超滤膜超滤，当超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml，停止超滤；当超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，更换超滤膜之后对超滤透过液重复超滤，直至超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml为止；

在步骤S6中，所述真空冻干的条件为-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％。

11.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1还包括对原料大籽蒿花粉进行镜检鉴别和/或DNA鉴定的步骤，其中DNA鉴定方法为，以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2为引物，对鉴别大籽蒿花粉原料进行PCR扩增，并检测扩增产物。

12.一种大籽蒿花粉变应原浸提物冻干品，其特征在于，其由包括大籽蒿花粉收集-干燥-脱脂-提取-超滤浓缩-冻干的步骤制得：

(1)收集：用自然脱落法收集大籽蒿花粉；

(2)干燥：常温干燥或真空干燥或流化床干燥，直至花粉不再粘附，将干燥后的花粉过150～250目分样筛；

(3)脱脂：将(2)所得到的花粉与丙酮分别按g与ml计，以1：5～1:1的重量体积比进行脱脂处理，搅拌或振荡脱脂30分钟后，静置分层，倒出上层液，加入新的丙酮，重复脱脂至上层液体澄清，将脱脂后的花粉均匀摊开，室温或采用真空干燥或流化床干燥干燥48小时至72小时；

(4)提取：将脱脂干燥后的大籽蒿大籽蒿花粉按重量体积比1:50～1:10加入10L，pH7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2-8℃搅拌22～26h进行浸提；取提取后的浸提液，在离心力8000～12000g，离心温度2～8℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清；先用4000目滤布过滤后，将滤液依次通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；

(5)超滤浓缩：将过滤后的浸提液，用3KD超滤膜超滤，取样超滤浓缩液、超滤透过液，检测其总蛋白含量；其中，当超滤透过液中总蛋白含量≤0.02mg/ml，则直接排弃透过液；超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，则对超滤膜进行完整性测试，超滤膜未破损，则排弃透过液；若超滤膜破损，则更换超滤膜之后对透过液重复超滤；

(6)冻干：将超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，按照冻干工艺条件：-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％，获得大籽蒿花粉变应原冻干品。

13.根据权利要求1项所述大籽蒿花粉变应原浸提物、权利要求2-5中任一项所述大籽蒿花粉变应原浸液及权利要求12所述的大籽蒿花粉变应原浸提物冻干品的应用，用于在制备诊断变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗制剂中的应用，所述诊断变态反应疾病包括过敏性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和慢性荨麻疹。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述大籽蒿花粉变应原浸提物冻干品用于制备成片剂、口崩片，所述大籽蒿花粉变应原浸液用于制备注射液、舌下滴剂、变应原斑贴剂、变应原浸液稀释液。