KR101629439B1 - 비침습적 샘플채취 방법을 이용한 아토피 피부염 환자의 피부장벽 단백질 일라이저 진단키트 - Google Patents

비침습적 샘플채취 방법을 이용한 아토피 피부염 환자의 피부장벽 단백질 일라이저 진단키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비침습적 샘플채취 방법을 이용한 아토피 피부염 환자의 피부장벽 단백질 ELISA 진단키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 피부장벽 단백질 채취용 패치, 단백질 용해액, 샘플채취한 패치보관함 및 ELISA 키트를 포함하는 비침습적 방법을 이용한 아토피 피부염 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명의 피부염 진단 키트는 (1) 피부단백질 채취 가능한 패치 선정, (2) 피부단백질 채취 부위의 선정, (3) 피부단백질 추출을 위한 용해액 선정을 통하여 비침습적 방법을 이용한 피부단백질의 채취를 가능하게 하고, 아울러, (4) 피부장벽 재조합 단백질의 제조 (5) 피부장벽 단백질에 대한 항체생산 (6) 시작품 ELISA 키트 개발을 통하여 피부장벽단백질 측정 ELISA 키트 개발을 가능하게 한다.

Description

비침습적 샘플채취 방법을 이용한 아토피 피부염 환자의 피부장벽 단백질 일라이저 진단키트{Skin Barrier Protein ELISA Kit of Atopic Dermatitis Patient Using Non-invasive Sample Extraction Method}
본 발명은 비침습적 방법을 이용한 아토피 피부염 진단 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 비침습적 샘플채취 방법을 이용한 아토피 피부염 환자의 피부장벽 단백질 ELISA 진단키트에 관한 것이다.
알러지 질환은 과민성 면역질환으로 폐, 피부, 코와 같은 기관의 이상에 따라서 천식, 아토피 피부염, 알러지 비염으로 분류된다. 알러지 질환을 지닌 환자는 지속적으로 증가하고 있으며, 2010년의 초등학생과 중학생의 유병률도 크게 높은 것으로 나타났다 (한국 어린이, 청소년의 알레르기 질환 유병률 조사 (2010)) (도 1).
아토피 피부염은 2008년부터 2012년까지 연평균 104만명이 진료를 받았고, 이 중 남성은 49 만명, 여성은 55만명으로 향후 계속해서 증가할 것으로 예상된다 (국민건강보험 '아토피 피부염(L20)' 질환의 건강보험 진료비 지급자료를 분석한 결과 (2014)) (표 1).
Figure 112014060248212-pat00001
일반적인 피부에서의 유전자와 단백질 검사는 세포 또는 혈액의 채취와 같은 환자에게 고통을 주는 침습적인 방법이다. 따라서 새로운 패치(patch)를 이용한 환자에게 고통을 가하지 않는 비침습적인 방법으로 피부의 단백질을 검출할 필요가 있다.
아토피 피부염 환자의 발병원인은 다양하며, 필라그린(filaggrin), 로리크린(loricrin), 인볼루크린(involucrin)과 같은 피부장벽 단백질의 발현량의 감소가 중요한 원인이며(도 2 및 도 3), 따라서, 피부장벽을 구성하고 있는 단백질 중 아토피 피부염 환자에서 발현양이 변화하는 특정 단백질의 선정할 수 있다.
피부장벽 단백질의 유전자 돌연변이나 다형성(polymorphism)을 측정할 수 있으나, 직접적인 아토피 피부염의 원인은 단백질 양의 감소이다. 따라서, 정량적인 단백질 발현양을 검출하기 위하여 관련 단백질의 항체를 생산하고, 이를 샌드위치 ELISA 측정기술과 접목할 수 있다(도 4).
아토피 피부염과 관련된 진단키트는 매우 부족한 실정으로 산업적 가치를 파악하기 어려우나 다른 시장에서 잠재적 시장규모를 예측할 수 있다. 아토피 피부염 관련 시장 중 국내 아토피 피부염의 화장품 시장 규모는 2000년 200억원 대에서 2001년 400억대로 성장하였으며, 2008년에는 전문의약품과 화장품을 포함하여 1200억원대를 형성하여, 앞으로는 더 크게 성장할 것으로 추정된다(한국기술거래소 의약뉴스 2008) (도 5).
최근 정확하면서 손쉽고 빠르게 사용할 수 있는 진단키트 개발에 대한 관심이 증가하고 있는 추세이지만, 세계적으로 약 280억 달러에 달하는 진단키트 시장의 71%를 북미와 유럽 등에서 점유하고 있다.
국내 진단키트 시장은 연간 1,300억원 규모로 추정되며, 대표적으로 임신, 당뇨, 갑상선 질환, 암, 조류독감 등에 대한 진단키트는 최소 5분에서 20분 이내에 결과를 확인할 수 있는 수준으로 개발이 이루어지고 있지만, 아토피 피부염 진단키트에 대한 개발은 부족한 실정이다.
국내에서 체외진단 제품의 80% 이상이 수입에 의존하고 있어 국내 체외진단키트 제품을 본격적으로 관리하여 국내 시장 점유율 및 해외 수출율도 더 증가하기 위한 방안으로 2011년 1월에 체외진단기업협의회가 출범되었으며, 현재 협의회에 약 51개사의 대기업 및 벤처기업이 가입된 상태로 중소기업의 해외수입업체에 대한 경쟁력은 산학연 체계를 통한 핵심기술 개발 및 이전이 요구된다(뉴스토마토, 2011).
아토피 피부염 치료제의 국외 연구는 신약개발 연구가 주를 이루고 있으며, 국내에서는 신약개발 이외에도 한의학적 접근을 통한 의약품 및 화장품 개발에 치중하고 있고, 효과적인 맞춤형 화장품 또는 치료제 개발을 위해서는 정확한 원인을 규명하여 진단할 수 있는 진단키트 개발이 필요하다.
아토피 피부염의 주요 증상의 원인인 피부장벽 단백질의 결핍을 진단하여 필라그린 재생 화장품과 같은 적절한 보습 및 치료제를 선택함으로써 환자의 빠른 쾌유와 불편을 감소시킬 수 있다.
일차적으로 증가되는 국민 보건건강의 중요성과 이에 따른 산업의 수요 증가, FTA에 따른 의료시장 개방 등에 따라 증가하는 아토피 피부염 관련 산업을 효율적으로 지원하기 위한 표준화된 진단검사 시스템이 필요하다.
국가적으로 개개인에 대한 개인별 맞춤 의료 적용으로 불필요한 의료예산 축소가 요구되고, 질병의 원인을 예측하고 예방 및 치료에 개인별 맞춤형 의료서비스의 활성화가 시작되었으며, 이용하기 쉽고 정확한 원인을 규명하는 진단키트의 개발로 맞춤의료, 질병 예방 및 완치율의 증대가 예상된다.
국내 중소기업은 아토피 피부염에 관여하는 바이오마커 개발에 치중해 있으나 아직까지 괄목한 만한 성과는 이루지 못하고 있다. 주로 분석의 대상이 혈액과 DNA에 치중해 있으며, 피부에서의 비침습적인 방법을 통한 단백질 분석은 전무하다. 구체적으로, 국내에서는 내인성 아토피 피부염 진단용 마커 및 그의 용도, 아토피 피부염 발병관련 SNP 마커의 분석기술, 아토피피부염을 포함한 알러지 질환 진단을 위한 흡입성 알러젠 진단키트 개발 등이 있다. CuDerm에서 채취용 패치가 연구용으로 사용되어 있으나, 피부장벽 단백질의 분석을 위한 패치로서는 흡착력, 단백질 용해를 위한 재질의 업그레이드가 필요하다(도 6).
해외에서는 필라그린의 유전자 변이를 분석하여 아토피피부염을 진단하는 ProGenotyperTM 제품과 Filaggrin Genetic Test 제품 2가지가 상품(IBT laboratory)으로 판매되고 있으며, 유전자 분석 기술이 확립되어 있다.
그러나, 피부 패치 테스트를 통해 아토피 피부염을 진단하는 방법은 없으며, 혈청 전체 IgE나 알러젠 특이 IgE의 진단 키트로 대부분 Phadia회사 제품이 진단에 사용되고(도 7), 아토피 피부염 진단 키트로 손쉽게 이용하는 피부반응검사키트(Chemotechnique diagnostics, Sweden 등)가 있으나, 위양성 및 위음성의 결과가 잘 나타난다(도 8).
이에, 본 발명자들은 아토피 피부염 진단키트를 개발하고자 노력하던 중, 피부장벽 단백질 채취용 패치, 패치보관함, 단백질 용해액, ELISA 키트(표준정량 단백질, 항체 코팅된 웰 플레이트, 포획항체, HRP-연결 항체, 및 기질액)로 구성된 피부장벽 단백질을 비침습적으로 진단하는 아토피 피부염 진단 키트를 완성하였다.
1) 한국공개특허공보 제10-2011-0034297호 2) 한국등록특허공보 제10-1257307호 3) 한국등록특허공보 제10-1334401호
본 발명의 목적은 비침습적 샘플채취 방법을 이용한 아토피 피부염 환자의 피부장벽 단백질 ELISA 진단키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피부장벽 단백질 채취용 패치, 단백질 용해액, 샘플채취한 패치보관함 및 ELISA 키트를 포함하는 비침습적 방법을 이용한 아토피 피부염 진단 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 비침습적 방법을 이용한 아토피 피부염 진단 키트에 있어서, 상기 피부장벽 단백질은 필라그린(filaggrin), 로리크린(loricrin) 및 인볼루크린(involucrin)으로 구성된 군중에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하고, 상기 피부장벽 단백질은 필라그린(filaggrin) 및/또는 인볼루크린(involucrin)인 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명의 비침습적 방법을 이용한 아토피 피부염 진단 키트에 있어서, 상기 패치는 Cuderm, 스카치테이프 및 AriNO 패치로 구성된 군중에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하고, 상기 단백질 용해액은 Tris-HCl, Tween-20, Triton X-100 및 KOH를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 비침습적 방법을 이용한 아토피 피부염 진단 키트에 있어서, ELISA 키트는 표준정량 단백질, 항체-코팅된 웰 플레이트, 포획 항체, HRP-연결 항체, 기질액 및 반응 정지액을 포함하는 것이 바람직하고, 상기 ELISA 키트는 1) 항체흡착 플레이트, 2) 표준액, 3) 접합체액, 4) 농축 세척액, 5) 기질액 및 6) 반응 정지액으로 구성되는 Involucrin ELISA 키트이거나 1) 항체흡착 플레이트, 2) 표준액, 3) 1차 접합체액, 2차 접합체액, 4) 농축 세척액, 5) 기질액 및 6) 반응 정지액으로 구성되는 Filaggrin ELISA 키트인 것이 보다 바람직하다.
그 결과, 본 발명은 1) 비침습적인 방법을 통한 피부에서의 샘플채취 방법 구축, 2) 아토피 피부염의 환자에서 변화되는 피부장벽 단백질의 선정, 3) 피부장벽 단백질을 정량적으로 측정할 수 있는 ELISA 키트개발, 4) 피부장벽 단백질 측정에 관여하는 피부 각질세포 채취 패치, 각질세포 단백질 용해액, ELISA 키트 (ELISA 분석용 표준 단백질 및 각종 시약)의 진단 세트 개발 등을 제공한다.
본 발명자들은 피부에서의 단백질 샘플 채취 및 용해를 위한 패치 및 피부단백질 용해방법을 개발하였다. 또한, 정상인과 아토피 피부염 환자의 ELISA 결과를 통하여, 구체적인 피부장벽 단백질을 선정하였다. 이를 활용하여, filaggrin, loricrin의 피부장벽 단백질을 재조합 기술을 이용하여 인간 피부장벽단백질 제조하였다. 아울러, 세포융합, 상기 피부장벽 단백질에 대한 항체를 생산하였다. 최종적으로, 상기 피부장벽 단백질에 대한 ELISA 키트를 개발하였다. 그 결과 최종적으로, Involucrin ELISA 키트와 Filaggrin ELISA 키트를 제작하였다.
상기와 같이 구성되는 본 발명은 (1) 피부단백질 채취 가능한 패치 선정, (2) 피부단백질 채취 부위의 선정, (3) 피부단백질 추출을 위한 용해액 선정을 통하여 비침습적 방법을 이용한 피부단백질의 채취를 가능하게 한다.
또한, 본 발명은 (1) 피부장벽 재조합 단백질의 제조 (2) 피부장벽 단백질에 대한 항체생산 (3) 시작품 ELISA 키트 개발을 통하여 피부장벽단백질 측정 ELISA 키트 개발을 가능하게 한다.
도 1은 알러지 질환 유병률 변화 및 발생률을 나타낸 그래프이다.
도 2는 피부장벽 단백질의 종류 및 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 아토피 피부염 환자의 피부장벽 단백질의 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 ELISA 원리를 나타낸 것이다.
도 5는 아토피 피부염의 화장품 및 전문의약품 시장을 나타낸 그래프이다.
도 6은 피부장벽 채취용 패치 (CuDerm 제품)를 나타낸 사진이다.
도 7은 Phadia의 알러지 질환 관련 항체 검출 기기 및 진단키트를 나타낸 것이다.
도 8은 ATP를 이용한 피부반응검사키트를 나타낸 것이다.
도 9는 패치별 단백질 획득 수율 비교한 것으로, 패치별 단백질 수율량 (㎍)을 나타낸 것이다.
도 10은 패치별 단백질 획득 수율 비교한 것으로, 패치별 단백질 수율정도를 나타낸 것이다.
도 11은 패치의 크기별 단백질 획득 수율 비교한 것으로, 패치별 단백질 수율량 (㎍)을 나타낸 것이다.
도 12는 패치의 크기별 단백질 획득 수율 비교한 것으로, 패치별 단백질 수율정도 (%)를 나타낸 것이다.
도 13은 단백질 용해별 단백질 획득 수율 비교한 것으로, 단백질 용해액별 단백질 수율량 (㎍)을 나타낸 것이다.
도 14는 단백질 용해별 단백질 획득 수율 비교한 것으로, 단백질 용해액별 단백질 수율정도 (%)를 나타낸 것이다.
도 15는 채위 부위별 단백질 획득 수율 비교한 것으로, 부위별 단백질 수율량 (㎍)을 나타낸 것이다.
도 16은 채위 부위별 단백질 획득 수율 비교한 것으로, 부위별 단백질 수율정도 (%)를 나타낸 것이다.
도 17은 단백질 분리 방법별 단백질 획득 수율 비교한 것으로, 분리방법별 단백질 수율량 (㎍)을 나타낸 것이다.
도 18은 단백질 분리 방법별 단백질 획득 수율 비교한 것으로, 분리방법별 단백질 수율정도 (%)를 나타낸 것이다.
도 19는 ELISA 방법을 이용한 피부장벽 단백질의 발현 분석을 나타낸 그래프이다.
도 20은 Western blotting을 이용한 정상인의 filaggrin 단백질의 발현을 측정한 것이다.
도 21은 표적 단백질 재조합 발현 벡터로 사용된 filaggrin (FLG) 발변벡터의 유전자 지도이다.
도 22는 표적 단백질 재조합 발현 벡터로 사용된 involucrin (IVL) 발현벡터의 유전자 지도이다.
도 23은 재조합 표적 단백질의 발현, 분리, 정제를 나타낸 것으로 재조합 filaggrin (FLG)(좌측) 및 재조합 involucrin (IVL)(우측)을 나타낸 것이다.
도 24는 Involucrin에 대한 단일클론 항체의 반응성 시험을 나타낸 그래프이다.
도 25는 Filaggrin에 대한 단일클론 항체의 반응성 시험을 나타낸 그래프이다.
도 26은 4가지 pair에 대한 standard를 측정하여 r값을 구한 결과를 나타낸 것이다((a) pair 1(r=0.9989), (b) pair 2(r=0.9991), (c) pair 3(r=0.9999), (d) pair 4(r=0.9997)).
도 27은 Filaggrin standard를 측정하여 r값을 구한 결과를 나타낸 것이다(r=0.99869).
이하, 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 더욱 구체적으로 제시하여 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 이하의 실시예는 이 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 본 발명이 충분히 이해되도록 제공되는 것으로서 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 상기와 같은 실시예들에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 피부에서의 단백질 샘플 채취 및 용해
먼저, 패치 및 피부단백질 용해방법을 개발하였다.
피부에서 사용할 수 있는 패치로서 AriNo [(주)덕성]과 외국회사 브랜드인 CuDerm 제품을 이용하여 정상인의 피부(팔)에서 샘플을 채취한 후 단백질 용해액으로 단백질을 획득, 단백질 용해물(lysate)을 Lowry법으로 단백질을 정량하였다. 그 결과 CuDerm보다 AriNO 패치로 획득한 단백질의 양이 40% 높은 것을 확인하였다. 25 cm2 (5 cm ㅧ 5 cm)의 면적을 사용하였을 때 약 4 - 10 배, 단백질 용해용액을 0.1 % Triton X-100을 사용하면 2배, 손목보다 팔꿈치 접히는 안쪽부위에서 피부단백질의 획득 수율이 높았다.
<1-1> 유형별 패치를 이용한 정상인의 피부에서의 샘플 채취
기본 방법은 ① 막(Membrane) 부착 부위에 테이프를 1번 부착시켜 먼지 및 피부부유물 제거하였다. ② 막 [25 cm2 (5 cm ㅧ 5 cm)]을 피부에 부착시킨 다음 일정한 힘을 가하였다. ③ 부착 1분 후 막을 떼어내 실험 전 까지 실온 또는 냉장 보관하였다. ④ 용해액(0.1 M Tris-HCl)을 막이 잠길 만큼 (8~10 ml) 첨가하여 용해시켰다 (Shaking, 초음파) ⑤ 단백질 정량을 통한 총 단백질의 양 측정하였다.
패치 유형으로 AriNo 패치, Cuderm 패치, 스카치테이프를 사용하였다.
Cuderm을 대조군으로 하여 스카치테이프와 AriNo 패치의 단백질 수율을 비교하였다. 그 결과, AriNO 패치가 스카치테이프와 Cuderm과 비교하여 더 많은 단백질 채취할 수 있었다(도 9, 도 10, 표 2). 또한, 패치별 단백질의 수율은 AriNO > 스카치테이프 > Cuderm 패치 순으로 효과가 있었다.
패치별 단백질 수율
패치 (patch) 단백질 수율량 (㎍) 단백질 수율정도 (%)
Cuderm 180.8 100.0
스카치테이프 250.7 138.7
AriNO 패치 368.9 204.0
<1-2> 크기별 패치를 이용한 정상인의 피부에서 샘플 채취
면적 및 크기는 1.69 cm2 (1.3 cm x 1.3 cm), 25 cm2 (5 cm x 5 cm)이고, 용해액으로 0.1 M Tris-HCl을 사용하였고, AriNo 패치의 크기별 단백질 채취 수율을 Cuderm과 스카치테이프와 비교하였다.
그 결과, 1.69 cm2의 면적의 패치보다 25 cm2 의 패치가 단백질을 효과적으로 채취할 수 있었다 (도 11, 도 12, 표 3). 또한, 패치별 단백질의 수율은 25 cm2의 패치가 1.69 ㎠의 패치보다 약 4~10배 정도의 획득 수율을 보였다.
면적별 패치의 단백질 수율
패치 (patch) 크기 단백질 수율량 (㎍) 단백질 수율정도 (%)
Cuderm 1.69 cm2 (1.3 cm x 1.3 cm) 37.4 100.0
25 cm2 (5 cm × 5 cm) 153.0 409.1
스카치테이프 1.69 cm2 (1.3 cm x 1.3 cm) 38.5 102.9
25 cm2 (5 cm × 5 cm) 291.4 779.1
AriNO 패치 1.69 cm2 (1.3 cm x 1.3 cm) 42.3 113.1
25 cm2 (5 cm × 5 cm) 396.2 1059.4
<1-3> 단백질 용해액에 따른 패치의 피부 단백질 획득의 차이
단백질 용해액으로 0.1 M Tris-HCl, 0.1% Tween-20, 0.1% Triton X-100, 5 mM KOH를 사용하였으며, 0.1 M Tris-HCl 단백질 용해액을 대조군으로 하여 AriNO 패치, Cuderm, 스카치테이프[25 cm2 (5 cm x 5 cm)]의 용액별 단백질 채취 수율을 비교하였다. 그 결과, 0.1% Triton X-100의 단백질 용해액을 사용한 것이 다른 용해액보다 약 2배 정도의 단백질을 효과적으로 채취할 수 있었다(도 13, 도 14, 표 4). 또한, 단백질 용해액별 단백질의 수율은 0.1% Triton X-100 > 0.1% Tween-20 > 5 mM KOH > 0.1 M Tris-HCl 순으로 나타났다.
단백질 용해액별 단백질 수율
패치 (patch) 단백질 용해액 단백질 수율량 (㎍) 단백질 수율정도 (%)
Cuderm 0.1 M Tris-HCl 149.5 100.0
0.1% Tween-20 188.5 126.1
0.1% Triton X-100 209.0 139.8
5 mM KOH 164.9 110.3
스카치테이프 0.1 M Tris-HCl 167.8 112.2
0.1% Tween-20 222.5 148.8
0.1% Triton X-100 239.1 159.9
5 mM KOH 190.7 127.6
AriNO 패치 0.1 M Tris-HCl 163.1 109.1
0.1% Tween-20 291.7 195.1
0.1% Triton X-100 373.0 249.5
5 mM KOH 168.1 112.4
<1-4> 단백질 채취 부위별, 단백질 분리 방법별 패치에서의 단백질 획득 차이
대상 부위는 손목, 팔꿈치 접히는 안쪽 부위를, 단백질 분리방법으로 shaking (2시간), shaking (2시간)+ 초음파 (2분)를 사용하였다.
손목과 팔꿈치의 접히는 안쪽 부위를 대상으로 AriNO 패치 [25 cm2 (5 cm ㅧ 5 cm)]를 붙인 후 0.1% Triton X-100 단백질 용해액을 이용하여 단백질 채취 수율을 비교하였다. 그 결과, 손목보다는 비교적 표면적이 넓은 팔꿈치 안쪽 부위가 약 50%의 피부단백질 채취 수율을 나타내었다 (도 15, 도 16, 표 5).
부위별 단백질 수율
부위 단백질 수율량 (㎍) 단백질 수율정도 (%)
손목 213.0 100.0
팔꿈치 안쪽 318.5 149.5
단백질 분리방법으로 shaking(2시간)과 shaking(2시간)+초음파(2분)를 사용하여 단백질 채취 수율을 비교하였다. 그 결과, shaking(2시간)+초음파(2분)를 혼합하여 사용한 방법보다는 shaking(2시간)을 사용하는 방법이 약 20% 정도 높은 피부단백질 채취 수율을 나타내었다(도 17, 도 18, 표 6).
단백질 분리 방법별 단백질 수율
단백질 분리 방법 단백질 수율량 (㎍) 단백질 수율정도 (%)
shaking (2시간) 318.5 100.0
shaking (2시간)+ 초음파 (2분) 386.3 121.3
<1-5> 피부단백질 채취 및 분리 방법의 최적화
단백질 채취 및 분리 분석 결과, AriNO 패치가 Cuderm보다 단백질을 더 많이 추출할 수 있었다 (스카치테이프는 AriNO 패치보다 비슷하거나 수율이 높은 경우도 있으나, 착용감과 당기는 느낌 등 인체에 사용하기에는 부적절하였다. 이하에서는 대조군 성격으로 사용하였다).
패치별 단백질의 수율은 AriNo > Cuderm > 스카치테이프 순으로 단백질 추출에 효과적이었다. 패치의 면적은 1.69 cm2 (1.3 cm x1.3 cm)의 면적의 패치보다 25 cm2 (5ㅧ5)의 패치가 약 4~10배 이상의 단백질 획득 수율을 나타내어 효과적으로 표본을 채취할 수 있었다. 단백질 용해액의 단백질 획득 수율은 0.1% Triton X-100 > 0.1% tween-20 > 5 mM KOH > 0.1 M Tris-HCl 순으로 나타났다.
0.1% Triton X-100이 다른 용해액보다 약 2배 정도의 단백질을 효과적으로 분리하는 것으로 나타났다. 단백질 채취 부위로 손목보다는 비교적 표면적이 넓은 팔꿈치 접히는 안쪽 부위가 약 50%의 피부단백질 채취 수율을 나타내었다. 분리방법으로 shaking (2시간)+ 초음파 (2분)를 혼합하여 사용한 방법보다는 shaking (2시간)을 사용하는 방법이 약 20% 정도 높은 피부단백질 채취 수율을 나타내고 있으나, 진단에는 크게 영향이 없을 것으로 판단되었다.
피부장벽 단백질의 발현양 분석을 위한 패치의 흡착방법, 적합한 면적, 특성에 관한 내용을 습득하였다.
그 결과, 최적의 샘플채취 방법은 팔꿈치 안쪽 부위에 막(membrane) 25 cm2 (5 cm x 5 cm)를 가볍게 부착시켜 먼지 및 피부 부유물 제거하고, 막 25 cm2 (5 cm x 5 cm)을 피부에 부착시킨 다음 일정한 힘을 가하며, 부착 1분 후 막을 떼어내 밀폐된 용기에 보관하며 (실온 또는 냉장), 0.1% Triton X-100 용해액을 막이 잠길 만큼 (8~10 ml) 첨가하여 용해시키고, 단백질 정량을 통한 총 단백질의 양을 측정하는 순서로 이루어진다.
AriNO 패치의 특징은 두께감이 있어서 샘플채취는 용이하고, 접착력이 기존 제품보다 강하여 단백질 채취 양이 증가하는 장점이 있는 반면, 불투명한 배경으로 인해 구분이 안가며, 용해 후 불순물이 생기고, 용해액 첨가시 막 자체가 흡수되는 단점이 있다.
< 실시예 2> 피부장벽 단백질의 선정 : 정상인과 아토피 피부염 환자의 ELISA 결과
정상인과 아토피 피부염환자의 피부장벽 단백질(filaggrin)의 발현 비교하기 위하여, 정상인(Normal)과 아토피피부염 환자(AD)의 피부(팔)에서 샘플을 채취한 후 단백질을 추출한 다음 피부장벽단백질인 filaggrin의 발현을 ELISA (기존 상용화된 항체를 이용)로 측정하였다.
구체적으로, 항체 코팅된 플레이트를 이용하여 ELISA를 실시하였고, 그 결과 도 19의 (A)에서와 같이 단백질 10 ug에 들어있는 filaggrin의 양은 정상인(n=10)이 평균 177.4 pg/ml(143.7 ~ 234.8)이고 아토피 피부염 환자(n=5)는 평균 121.1 pg/ml(101.9 ~139.6 )로서 아토피 피부염 환자의 filaggrin이 적은 것으로 나타났으나 단백질 10 ug 정량으로 한 값이 더 유의한 것으로 판단된다.
또한, 도 19의 (B)에서와 같이 단백질 10 ug에 들어있는 involucrin의 양은 정상인(n=10)이 평균 561.4 pg/ml(109.3~1493.2)이고 아토피 피부염 환자(n=5)는 평균 632.0 pg/ml(407.2~1176.5 )로서 정상인과 아토피 피부염 환자의 involucrin은 차이가 없으나 filaggrin 측정에 대한 대조 피부장벽단백질로서 의미가 있는 것으로 판단된다.
또한, 정상인의 피부장벽 단백질(filaggrin)의 발현에 대한 웨스턴 블럿 결과, 채취방법 등의 과정을 수정하여 정상인 10명에게서 filaggrin의 발현 및 일정함을 확인하였다(도 20).
< 실시예 3> 피부장벽 재조합 단백질 제조
재조합 피부장벽 단백질(filaggrin, loricrin, involucrin)을 제조하기 위하여, 재조합 기술을 이용한 인간 피부장벽단백질 제조하였다. 구체적으로, NCBI에서 제공하는 유전자 지도를 바탕으로 프라이머를 제작하여 재조합하였다 (표 7).
피부단백질 유전자의 재조합용 프라이머
표적 단백질 primer 비 고
filaggrin F : 5'-ttccatatg catgaacagtctgagtccgc-3'
R : 5'-ccgctcgag taagatcctgaatgtccagacg-3'		 NM_002016.1, 7297~8247
involucrin F : 5'-ttccatatg atgtcccagcaacacacact-3'
R : 5'-ccgctcgag ttatagctgctgatccctttgtg-3'		 NM_005547.2, 47~404
pET-벡터를 이용하여 각각의 표적 단백질을 발현하도록 벡터를 제작하고 발현시켰다 (도 21 및 도 22). 발현 후 affinity 컬럼을 이용하여 재조합 단백질을 순수 분리 정제하였다 (도 23). 그 결과, filaggrine은 약 40 kDa의 크기의 단백질로 발현, 순수 분리/정제하였다. involucrin은 약 20 kDa의 크기의 단백질로 발현, 순수 분리/정제하였다.
< 실시예 4> 피부장벽 단백질에 대한 항체생산
<4-1> 피부장벽 단백질( Involucrin , Filaggrin )에 특이적인 항체 개발
<4-1-1> 면역
먼저 면역 (Immunization)을 실시하였다. 구체적으로, 면역 전에 생후 6주령의 Balb/c 마우스의 피를 안와채혈로 채취하였다. 준비된 재조합 involucrin, filaggrin (50 ㎍)에 동부피의 프로이드 완전 아쥬번트 (Freund's complete adjuvant)에 혼합하여 현탁액을 만든 후, 현탁액 200 ㎕를 마우스에 복강 투여하여 면역시켰다. 첫 번째 면역한 날부터 14일 후 2차 면역하고, 14일 후 3차 면역하고 7일 후 안와채혈하였다.
마우스에서 채혈한 혈청은 하기와 같이 시험하여 항체 역가를 측정하였다. 항원 (1 ㎍/㎖, PBS)을 희석한 후에 96-웰 플레이트에 4℃, 하룻밤 동안 코팅하였다. Stabilcoat 100 ㎕를 추가로 각 웰에 넣은 후에 2시간 블록킹하였다. 마우스에서 채혈한 혈청을 시료 희석 완충액 (1% BSA-PBS-0.1% Tween 20)을 사용하여 희석하였다. 희석된 시료를 100 ㎕씩 동일한 방식으로 플레이트 웰에 가하고 1시간 동안 실온에서 놓아두었다. 플레이트 웰을 3차례 세척 완충액으로 세척한 다음, 적절하게 시료 희석 완충액으로 희석된 항마우스 면역글로불린 항체-HRP (horseradish peroxidase)를 100 ㎕씩 웰에 첨가하였다. 1시간 동안 실온에서 반응킨 후, 3차례 세척 완충액으로 세척하고, 기질용액(TMB)을 첨가하고, 10~30분 동안 반응시킨 후 1 N HCl 용액으로 중단시키고 Microtiter Plate Reader로 OD를 450 nm에서 측정하였다.
희석한 혈청 항체 역가가 OD450 > 1.0에 이를 때까지 면역을 되풀이하였다. 마지막 면역 후 안와채혈하여 항체 역가를 시험한 후 세포융합에 적당한 항체 역각가 있는지를 결정하였다. 결정이 긍정적 (> 0.8 OD450 값)이면 비장을 적출하여 세포융합 절차를 시작하였다.
<4-1-2> 세포융합 ( Cell fusion )
먼저, 마우스 비장 세포를 준비하였다. 최종 주사 3일 후에 마우스를 질식사를 시키고 복부를 절개 및 박리를 하여 비장을 겸자(forcep)로 적출하여 가위로 주변에 붙은 지질을 제거하였다. 비장을 집어서 DMEM으로 세척한 후 60-mesh 스크린 위에 놓았다. DMEM을 2-3 방울 비장 위에 떨어뜨린 후, forcep으로 비장을 누르면서 그 위에 DMEM을 한 방울씩, 총 10 ㎖을 적하하면서 비장 세포를 추출하였다. 튜브를 흔들어 세포를 세척액에 현탁시킨 후, 우태아혈청-튜브 내의 혈청 위에 천천히 얹었고, 이 상태로 10분 동안 실온에 놓아두면 불순물이 튜브 밑에 침전되었다. 불순물이 침전된 후, 불순물만 제외한 모든 용액을 새로운 우태아혈청-튜브에 옮긴 다음, 원심분리기에 넣고 10분간, 1200 rpm 속도로 원심분리 하였다.
튜브를 꺼내어 밑에 가라앉은 펠렛만 남기고 상층액을 조심스럽게 제거한 다음, 튜브 내에 남은 펠릿에 3-5 ㎖ 0.83% NH4Cl을 가하였다. 펠렛을 NH4Cl에 현탁시킨 후 3분간 실온에 놓아두고, 위에서 현탁된 세포를 전부 새로운 우태아혈청-튜브에 옮기고 1200 rpm 속도로 10분간 원심분리하였다. 이어, 펠렛만 남기고 상층액을 제거한 후, DMEM을 14 ㎖ 가하여 세포를 현탁시키고 위와 같은 조건으로 원심분리 하였다. 위와 같은 조건으로 DMEM을 사용하여 2회 더 세척하였다. 마지막으로, 100 ㎕ 세포 현탁액에 5 ㎖ DMEM을 가하여 희석 (약 50배)한 다음 세포수를 측정하였다.
다음에는 Sp2/0 세포를 준비하였다. RPMI HT 배지에 부유된 Sp2/0 세포를 1200 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리한 상층액은 다른 튜브에 모아서 나중에 배지로 제한희석 및 클로닝에 사용하고, Sp2/0 AG-14 세포를 10 ㎖ RPMI HT 배지에 부유시켰다. Sp2/0 AG-14 세포 부유액을 10배 희석시키고 세포수를 측정하였다.
그리고 나서, 배지에 부유된 Sp2/0과 비장 세포를 다음과 같이 혼합하였다. 세포수 측정을 기준으로, Sp2/0과 비장 세포가 1:5의 비율이 되도록 튜브에 넣고 튜브를 가볍게 돌리며 혼합하였다. 세포 혼합액를 원심분리하여 상층액을 제거하고 DMEM을 가하여 부유시킨 다음 원심분리하고, 이와 같은 조건으로 DMEM을 사용하여 2회 더 세척하였다. 동시에, PEG(polyethylene glycol)를 30분 동안 수욕에 넣어 미리 37℃로 승온시켰다.
PEG 용액을 1ㅧ108 비장 세포 당 1 ㎖ 로 계산하여 상기 혼합세포에 가하고, 천천히 튜브를 돌리며 혼합한 후, DMEM 1 ㎖을 한 방울씩 1분에 걸쳐 가해주고 계속해서 30초 동안 튜브를 천천히 돌리며 혼합하였다. 그런 다음, DMEM 2 ㎖을 튜브를 천천히 돌리면서 1분에 걸쳐 가하고 8 ㎖을 30초에 걸쳐 같은 동작으로 가하고 10 ㎖ 더 30초에 걸쳐 같은 동작으로 가한 다음 원심분리하였다. 그 동안, HAT 배지 (200 uM 하이포크산틴, 800 nM 아미노프테린, 32 uM 티미딘, 10% 우태아혈청, DMEM)를 10분 동안 수욕에 미리 넣어 37℃로 승온시켰다. 상기 원심분리한 튜브에서 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 40 ㎖ HAT 배지에 부유시킨 후 96-웰 플레이트 각 웰당 200 ㎕씩 분주하고, 2주 동안 37℃에서 배양하였다.
<4-1-3> 융합세포 검색, 제한희석 ( limiting dilution ) 및 클로닝
융합을 시작한 다음날 융합세포 액 10 ㎖을 반-고체 HAT 하이브리도만 선택 배지 90 ㎖과 섞어준 후에 거품이 없어지도록 상온에서 15분간 방치하였다. 페트리 플레이트에 10 ㎖씩 넣어준 후에 CO2 배양기에서 37℃, 5% CO2 조건으로 10~14일간 배양하였다.
10~14일 째, 페트리 플레이트에서 1,000개 정도의 콜로니를 피펫을 사용하여 회수하였다. 하이브리도만 성장 배지가 200 ㎕ 씩 들어있는 96-웰 플레이트의 각 웰에 각각 넣어준 후에 CO2 배양기에서 37℃, 5% CO2 조건으로 1~4일간 배양한 후 배양 상층액을 회수하여 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)로 테스트하였다.
<4-1-4> Involucrin 단일클론 항체 반응성
Involucrin 재조합단백질을 10 mM 탄산염 완충액에 1 ㎍/㎖ 이 되도록 희석한 후, 96-웰 플레이트에 4℃, 하룻밤 동안 코팅하였다. Stabilcoat 100 ㎕를 추가로 각 웰에 넣은 후에 2시간 블록킹하였다. 융합세포가 성장하고 있는 웰로부터 배양 상층액을 50 ㎕씩 취하여 항원이 코팅된 미세역가 플레이트 웰에 가하고 1시간 동안 실온처리한 후, 플레이트 웰을 3차례 세척 완충액으로 세척한 다음, 적절하게 시료 희석 완충액으로 희석된 항마우스 면역글로불린 항체-HRP (horseradish peroxidase)를 100 ㎕씩 웰에 첨가하였다. 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 3차례 세척 완충액으로 세척하고, 기질용액(TMB)을 첨가하고, 10~30분 동안 반응시킨 후 1 N HCl 용액으로 중단시켰다. Microtiter Plate Reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 가장 높은 결과가 나오는 웰에 함유한 항체를 생산한 융합세포군을 선택하였다.
이렇게 일차적으로 선별된 양성 융합세포군을 6 웰 플레이트와 25T 플라스크에서 배양하면서 항원과의 반응성이 계속 유지되는 융합세포 후보군을 선별하였다. 그 후보군 중에서 동기준(isotyping)을 실시하여 융합세포군이 생산하는 항체의 type을 확인하였다.
그 결과 도 24에서와 같이 involucrin에 대해 좋은 반응성을 보이는 8종의 융합세포군을 얻을 수 있었으며, 동기준을 실시하여 표 8과 같이 IgM 유형의 항체들을 제외하고, 4종의 항체(3-1 #86(IgG1), 4-2 #50(IgG2b), 4-3 #6(IgG1), 5-1 #26(IgG1))를 생산하는 융합세포군을 선별하였다.
각 항체들의 동기준 결과
　 1-3 #25 2-1 #58 3-1 #86 4-2 #50 4-3 #6 5-1 #26 8-2 #87 10-1#28
Isotype IgM IgM IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 IgM IgM
<4-1-5> Filaggrin 단일클론 항체 반응성
Filaggrin 재조합단백질을 10 mM 탄산염 완충액에 1 ㎍/㎖ 이 되도록 희석한 후, 96-웰 플레이트에 4℃, 하룻밤 동안 코팅하였다. Stabilcoat 100 ㎕를 추가로 각 웰에 넣은 후에 2시간 블록킹하였다. 융합세포가 성장하고 있는 웰로부터 배양 상층액을 50 ㎕씩 취하여 항원이 코팅된 미세역가 플레이트 웰에 가하고 1시간 동안 실온처리한 후, 플레이트 웰을 3차례 세척 완충액으로 세척한 다음, 적절하게 시료 희석 완충액으로 희석된 항마우스 면역글로불린 항체-HRP (horseradish peroxidase)를 100 ㎕씩 웰에 첨가하였다. 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 3차례 세척 완충액으로 세척하고, 기질용액(TMB)을 첨가하고, 10~30분 동안 반응시킨 후 1 N HCl 용액으로 중단시켰다. Microtiter Plate Reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 가장 높은 결과가 나오는 웰에 함유한 항체를 생산한 융합세포군을 선택하였다.
이렇게 일차적으로 선별된 양성 융합세포군을 6 웰 플레이트와 25T 플라스크에서 배양하면서 항원과의 반응성이 계속 유지되는 융합세포 후보군을 선별하였다. 그 후보군 중에서 동기준을 실시하여 융합세포군이 생산하는 항체의 유형을 확인하였다.
그 결과 도 25에서처럼 filaggrin에 대해 좋은 반응성을 보이는 4종의 융합세포군을 얻을 수 있었으며, 표 9와 같이 동기준을 실시하였으나 4-1 #6(IgG1)을 제외하고 나머지 항체는 IgM 유형의 항체들을 생산하는 융합세포군이 얻어져서 IgM 유형의 항체를 생산하는 융합세포군도 후보군에 넣어 최종적으로 신호를 비교하기로 하였다.
각 항체들의 동기준 결과
　 2-2 #27 3-1 #87 4-1 #6 5-2 #26
Isotype IgM IgM IgG1 IgM
<4-2> 항체의 생산 및 분리정제
<4-2-1> 마우스를 이용한 in vivo 생산
구체적으로, 선별된 항체를 생산하는 융합세포를 75T 플라스크 내의 DMEM HT 배지에서 배양한 후 8 주령 이상의 Balb/c 마우스 복강에 주입하였다. 이에 앞서 대량의 복수액을 확보하기 위해서 융합세포 주입 7일전에 프리스테인(Prestane)을 미리 주입하였다. 10~14일이 경과된 후 쥐의 복강으로부터 복수를 채취하고 원심분리를 통해 세포 조각, 적혈구 및 지질을 제거하였다. 이렇게 얻은 상층액에 포화암모늄설페이트 용액을 최종농도가 45%가 되도록 처리하였다. 원심분리 후 상층액은 버리고 침전물을 인산완충용액을 넣어서 다시 용해시키고 투석과정을 통해서 남아있는 암모늄설페이트 용액을 완전히 제거하였다. 인산완충용액으로 투석시킨 용액을 0.45 ㎛의 여과기로 여과시키고 친화성 크로마토그래피인 단백질 G-세파로스 컬럼(IgM 항체인 경우에는 항-마우스 항체 컬럼)을 사용하여 정제하였다. UV 측정기를 이용하여 정제되어 나오는 항체의 분액을 모으고 즉시 중성 pH으로 중화시킨 후 인산완충용액으로 투석시켰다.
<4-2-2> 마우스를 이용하지 않는 in vitro 생산
선별된 항체를 생산하는 융합세포를 25T 플라스크 내의 DMEM HT 배지에서 배양한 후 CELLine CL 1000 키트에 넣고 배양하였다. CELLine 키트의 배지 구획 부위에 DMEM 배지 50mL를 넣고 미리 평형상태를 유지시켜 준 후 25T 플라스크에서 건강하게 자라고 있는 융합세포를 원심분리를 통하여 확보하여 이것을 DMEM 배지로 재현탁시키고 배지 1mL 당 1.5 x 106 세포가 되도록 세포수를 조정하여 CELLine 키트의 세포 구획 부위에 총 15mL를 넣었다. 이후 배지 구획 부위에 DMEM 배지를 950mL를 더 넣어서 2주일 동안 배양하였다. 세포 구획 부위에서 세포배양액 15mL를 회수하여 원심분리를 통하여 상층액을 모았다. 이 상층액을 0.45 ㎛의 여과기로 여과시키고 친화성 크로마토그래피인 단백질 G-세파로스 컬럼 (IgM 항체인 경우에는 항-마우스 항체 컬럼)을 사용하여 정제하였다. UV 측정기를 이용하여 정제되어 나오는 항체의 분액을 모으고 즉시 중성 pH으로 중화시킨 후 인산완충용액으로 투석시켰다.
< 실시예 5> Involucrin ELISA 키트 개발 : Involucrin 항체쌍 테스트
<5-1> 항체고정 플레이트 준비
4 종의 involucrin을 인식하는 항체(3-1 #86, 4-2 #50, 4-3 #6, 5-1 #26; 1 ㎍/㎖, 10 mM 탄산염 완충액)를 희석한 후에 96-웰 플레이트에 각각 100 ㎕ 씩 분주한 후 4℃, 하룻밤 동안 코팅하고, stabilcoat 100 ㎕를 추가로 각 웰에 넣은 후에 2시간 블록킹하여 항체고정 플레이트를 준비하였다.
<5-2> 항체- HRP 연결체 준비
4 종의 involucrin을 인식하는 항체(3-1 #86, 4-2 #50, 4-3 #6, 5-1 #26)를 활성화된 HRP와 각각 섞어주어서 항체-HRP 연결체를 제조하였다. 제조한 각각의 항체-HRP 연결체는 연결체 희석 완충액 (1% BSA-Tris-0.1% Tween 20)을 사용하여 2,500배로 희석하여 준비하였다.
ㅇ<5-3> 항체쌍 테스트
각각의 항체가 고정화된 96웰 플레이트에 2 ㎍/㎖부터 0.0001 ㎍/㎖까지 희석한 involucrin 항원을 100 ㎕씩 플레이트 웰에 가하고 1시간 동안 실온에서 놓아두었다. 플레이트 웰을 3차례 세척 완충액으로 세척한 다음, 적절하게 연결체 희석 완충액으로 희석된 4종의 항체-HRP (horseradish peroxidase)를 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하였다. 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 3차례 세척 완충액으로 세척하고, 기질용액(TMB)을 첨가하고, 10분 동안 반응시킨 후 1 N HCl 용액으로 중단시키고 Microtiter Plate Reader로 OD를 450 nm에서 측정하였다.
그 결과, 3-1 #86 항체가 고정화 항체로 사용된 경우에는 하기 표 10과 같이 항체(5-1 #26) - HRP 연결체와의 조합에서 좋은 결과를 얻을 수 있었으나 다른 항체 - HRP 연결체와는 반응성이 나타나지 않았다.
3-1 #86 항체가 고정화 항체로 사용된 경우의 쌍 테스트
고정화 항체 3-1 #86 (1ug/ml)
항체-HRP conjugate 3-1 #86 4-2 #50 4-3 #6 5-1 #26
Involucrin
(ug/ml)		 0 0.056 0.063 0.050 0.058
2 0.079 0.077 0.056 3.512
1 0.064 0.070 0.060 3.410
0.5 0.060 0.064 0.061 2.632
0.1 0.054 0.064 0.058 0.772
0.01 0.056 0.066 0.061 0.126
0.001 0.054 0.078 0.057 0.083
0.0001 0.065 0.063 0.062 0.069
또한, 4-2 #50 항체가 고정화 항체로 사용된 경우에는 하기 표 11과 같이 항체(5-1 #26) - HRP 연결체와의 조합에서 좋은 결과를 얻을 수 있었으나 다른 항체 - HRP 연결체와는 반응성이 나타나지 않았다.
4-2 #50 항체가 고정화 항체로 사용된 경우의 쌍 테스트
고정화 항체 4-2 #50 (1ug/ml)
항체-HRPconjugate 3-1 #86 4-2 #50 4-3 #6 5-1 #26
Involucrin
(ug/ml)		 0 0.055 0.053 0.056 0.069
2 0.184 0.189 0.076 3.420
1 0.149 0.132 0.068 3.325
0.5 0.116 0.104 0.064 2.619
0.1 0.068 0.078 0.059 0.855
0.01 0.069 0.063 0.062 0.141
0.001 0.068 0.060 0.060 0.084
0.0001 0.069 0.062 0.059 0.085
4-3 #6 항체가 고정화 항체로 사용된 경우에는 표 12와 같이 항체(5-1 #26) - HRP 연결체와의 조합에서 involucrin의 농도 증가에 따라 흡광도가 증가하기는 하나 비교적 신호가 낮았으며 다른 항체 - HRP 연결체와는 반응성이 나타나지 않았다.
4-3 #6 항체가 고정화 항체로 사용된 경우의 쌍 테스트
고정화 항체 4-3 #6 (1ug/ml)
항체-HRPconjugate 3-1 #86 4-2 #50 4-3 #6 5-1 #26
Involucrin
(ug/ml)		 0 0.064 0.059 0.060 0.061
2 0.146 0.156 0.077 0.848
1 0.139 0.152 0.076 0.816
0.5 0.119 0.145 0.072 0.593
0.1 0.082 0.095 0.063 0.274
0.01 0.080 0.092 0.073 0.100
0.001 0.065 0.073 0.060 0.077
0.0001 0.061 0.074 0.067 0.070
5-1 #26 항체가 고정화 항체로 사용된 경우에는 표 13과 같이 항체(3-1 #86) - HRP 연결체와 항체(4-2 #50) - HRP 연결체의 두 조합에서 involucrin의 농도 증가에 따라 흡광도가 유의성 있게 증가하였으며 다른 항체 - HRP 연결체와는 반응성이 나타나지 않았다.
5-1 #26 항체가 고정화 항체로 사용된 경우의 쌍 테스트
고정화 항체 5-1 #26 (1ug/ml)
항체-HRPconjugate 3-1 #86 4-2 #50 4-3 #6 5-1 #26
Involucrin
(ug/ml)		 0 0.059 0.068 0.059 0.065
2 2.896 2.769 0.763 0.125
1 2.631 2.572 0.655 0.115
0.5 2.291 2.273 0.507 0.081
0.1 0.971 0.953 0.187 0.096
0.01 0.164 0.193 0.075 0.091
0.001 0.070 0.082 0.060 0.131
0.0001 0.064 0.084 0.058 0.132
위의 쌍 실험에서 가장 좋은 결과가 나온 4 종의 쌍(표 14)에 대해서 r값을 비교해보았다.
Involucrin 쌍 선정
번호 포획 HRP 연결체
1 3-1 #86 5-1 #26
2 4-2 #50 5-1 #26
3 5-1 #26 3-1 #86
4 5-1 #26 4-2 #50
그 결과, 도 26과 같이 대부분 쌍에서 높은 r값을 보여주었으며, 그 중에서 가장 높은 값을 보여준 쌍 3을 사용하여 추가의 실험을 진행하였다.
그 결과, 최종 키트는 (1) 피부장벽 단백질 채취용 패치 (2) 단백질 용해액 (0.1% Triton X-100) (3) 샘플채취한 패치보관함 (4) ELISA 키트 : 표준정량 단백질, 항체-코팅된 96 웰 플레이트, 포획 항체, HRP-연결 항체 (7) 기질액 (TMB 용액) (8) 반응 정지액으로 구성되었다.
그 결과, 본 발명은 기술적으로는 피부샘플 채취 및 용해방법 개발, 피부장벽 단백질에 대한 재조합단백질 생산, 피부장벽 단백질에 대한 항체생산 및 피부장벽단백질 측정을 위한 ELISA 키트를 제공한다.
아울러, 경제적으로는 기업의 매출수익의 증대, 진단법 개발을 활용한 기업의 기술향상 및 제품개발을 통한 수익의 증대 및 맞춤형 진단 및 치료로 인한 의료경비 절감을 제공한다.
또한, 사회적으로는 ELISA 키트판매를 통한 기업의 일자리 창출, 피부장벽단백질 부재에 대한 맞춤형 치료로 아토피피부염 환자의 생활면에서 질적 향상 및 환자의 사회 및 복지 측면에서의 문제성 완화를 제공한다.
아울러, 본 발명은 1) 피부장벽 단백질 이상 관련 아토피피부염 환자의 진단에 적용, 2) 피부장벽 단백질 이상에 의한 아토피 피부염의 맞춤형 치료에 적용, 3) 피부장벽 단백질의 이상과 관련된 DNA 동질이상(polymorphism) 진단법 개발, 4) 피부장벽 단백질의 발현을 증가시키는 화장품 및 치료용 소재 개발 등에 활용 가능하다.
그 결과, 본 발명의 비침습적 방법을 이용한 아토피 피부염 진단 키트는 (1) 피부장벽 단백질 채취용 패치 (2) 단백질 용해액 (0.1% Triton X-100) (3) 샘플채취한 패치보관함 및 (4) ELISA 키트로 구성된다.
구체적으로, Involucrin ELISA 키트는 하기 표 15와 같이 구성되도록 제조하였다.
1. 항체흡착 플레이트 12스트립ⅹ8웰
(96웰)		 12마이크로웰 스트립이 스트립홀더에 삽입되어 있음. 단일클론 항Involucrin항체가 고정되어 있음
2. 표준액 표준액 범위 (0~200 ng/ml)
3. 접합체액 15mlⅹ1병 단일클론 항Involucrin - 산화효소 접합액
4. 농축 세척액 50ml ⅹ1bottle 25배 농축액
5. 기질액 15mlⅹ1bottle TMB substrate
(Tetramethylbenzidine)
6. 반응 정지액 15mlⅹ1bottle ELISA 반응정지액: 1N HCl
또한, Filaggrin ELISA 키트는 하기 표 16과 같이 구성되도록 제조하였다.
1. 항체흡착 플레이트 12스트립ⅹ8웰
(96웰)		 12마이크로웰 스트립이 스트립홀더에 삽입되어 있음. 단일클론 항Filaggrin항체가 고정되어 있음
2. 표준액
표준액 범위 (0~20 ng/ml)
3. 1차 접합체액 15mlⅹ1병 단일클론 항Filaggrin - 바이오틴 접합체
3. 2차 접합체액 15mlⅹ1병 스트렙트아비딘- 산화효소 접합액
4. 농축 세척액 50ml ⅹ1bottle 25배 농축액
5. 기질액 15mlⅹ1bottle TMB substrate (Tetramethylbenzidine)
6. 반응 정지액 15mlⅹ1bottle ELISA 반응정지액: 1N HCl
이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.

Claims (8)

  1. 피부장벽 단백질 채취용 패치, 단백질 용해액, 샘플채취한 패치보관함 및 ELISA 키트를 포함하고,
    이때, 상기 피부장벽 단백질은 필라그린(filaggrin), 로리크린(loricrin) 및 인볼루크린(involucrin)으로 구성된 군중에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 패치는 Cuderm, 스카치테이프 및 AriNO 패치로 구성된 군중에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 단백질 용해액은 Tris-HCl, Tween-20, Triton X-100 및 KOH를 포함하는 것을 특징으로 하는 비침습적 방법을 이용한 아토피 피부염 진단 키트.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 피부장벽 단백질은 필라그린(filaggrin) 및/또는 인볼루크린(involucrin)인 것을 특징으로 하는 비침습적 방법을 이용한 아토피 피부염 진단 키트.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, ELISA 키트는 표준정량 단백질, 항체-코팅된 웰 플레이트, 포획 항체, HRP-연결 항체, 기질액 및 반응 정지액을 포함하는 것을 특징으로 하는 비침습적 방법을 이용한 아토피 피부염 진단 키트.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 ELISA 키트는 1) 항체흡착 플레이트, 2) 표준액, 3) 접합체액, 4) 농축 세척액, 5) 기질액 및 6) 반응 정지액으로 구성되는 Involucrin ELISA 키트인 것을 특징으로 하는 비침습적 방법을 이용한 아토피 피부염 진단 키트.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 ELISA 키트는 1) 항체흡착 플레이트, 2) 표준액, 3) 1차 접합체액, 2차 접합체액, 4) 농축 세척액, 5) 기질액 및 6) 반응 정지액으로 구성되는 Filaggrin ELISA 키트인 것을 특징으로 하는 비침습적 방법을 이용한 아토피 피부염 진단 키트.
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