KR101257307B1

KR101257307B1 - 인간 혈청 프로테옴에서 발굴한 아토피 피부 질환의 기전을모니터링 할 수 있는 아토피 피부 질환의 진단 또는치료용 마커 단백질

Info

Publication number: KR101257307B1
Application number: KR1020060045875A
Authority: KR
Inventors: 이상철; 류성언; 윤태성; 조현주; 황향란; 김원곤; 류수인; 문정희; 김태윤; 유혜영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-05-22
Filing date: 2006-05-22
Publication date: 2013-04-23
Also published as: KR20070112671A

Abstract

본 발명은 아토피 피부 면역 질환 (Atopic dermatitis, AD)기전을 모니터링 할 수 있는 마커 단백질 및 이를 이용하여 진단 및 치료에 이용할 수 있는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 병의 진단과 예후 판정을 위해 질환의 발생, 진행 및 악성화와 함께 나타나는 총체적인 혈청 프로테옴 분석방법을 이용한다. 아토피성 피부염 환자와 정상인의 혈청에서 상업적 키트를 사용하여 혈청 내에 다량으로 존재하는 단백질들을 약 85%-88% 정도 제거한 후, 정상적인 개체 및 질환을 가진 개체를 서로 비교하는 것이다.

아토피 피부 면역 질환, 프로테옴, 혈청, 마커 단백질

Description

인간 혈청 프로테옴에서 발굴한 아토피 피부 질환의 기전을 모니터링 할 수 있는 아토피 피부 질환의 진단 또는 치료용 마커 단백질 {Marker proteins for the diagnosis, therapy and monitoring of Atopic dermatitis from human plasma}

도 1은 아토피 피부염 환자 및 정상인의 혈청을 Pierce사의 키트를 사용하여 혈청 내에 다량으로 존재하는 단백질 (알부민과 면역글로불린G)을 제거한 후 나머지 단백질들을 pH5 내지 8의 조건에서 이차원적 전기영동 하여 나타나는 이차원 전기영동 이미지이다.

도 2는 아토피 피부염 환자 및 정상인의 혈청을 Pierce사의 상업적인 키트를 사용하여 혈청내에 다량으로 존재하는 단백질 (알부민과 면역글로불린G)을 제거한 후 나머지 단백질들을 비교하였을 때, 발현이 2배 이상 증가하거나 2배 이상 감소한 단백질을 pH5 내지 8의 조건에서 이차원적 전기영동 하여 나타나는 이차원 전기영동 이미지이다.

도 3은 아토피 피부염 환자 및 정상인의 혈청을 Agilent사의 키트를 사용하여 혈청 내에 다량으로 존재하는 6개의 단백질 (알부민, 면역글로불린G, 알파원안티트립신, 면역글로불린A, 트란스페린, 합토글로빈)을 제거한 후 나머지 단백질들을 pH4 내지 7의 조건에서 이차원적 전기영동 하여 나타나는 이차원 전기영동 이미 지이다.

도 4는 아토피 피부염 환자의 혈청과 정상인의 혈청을 Agilent사의 키트를 사용하여 혈청 내에 다량으로 존재하는 6개의 단백질 (알부민, 면역글로불린G, 알파원안티트립신, 면역글로불린A, 트란스페린, 합토글로빈)을 제거한 후 나머지 단백질들을 비교하였을 때, 발현이 2배 이상 증가하거나 2배 이상 감소한 단백질을 pH4 내지 7의 조건에서 이차원적 전기영동 하여 나타나는 이차원 전기영동 이미지이다.

본 발명은 아토피성 피부염 환자와 정상인의 혈청에서 상업적인 키트를 이용하여 혈청에 다량 존재하는 약 85%-88%의 단백질을 제거하고, 이를 프로테옴 기법을 이용하여 분석함으로써 질병의 바이오 마커가 될 수 있는 단백질을 발굴하고, 이러한 단백질을 이용하여 아토피 피부 질환의 진단과 치료에 이용하는 방법에 관한 것이다.

혈청단백질은 박테리아 감염, 암, 알츠하이머 등의 질병에서 특이적인 생리학적 상태에 혈류로 배어 나오고 방출되기 때문에 진단 분석을 위한 많은 샘플을 공급할 수 있다. 그러므로 질병의 특이적인 바이오 마커를 동정하기 위하여 사람의 혈청을 프로테옴 하는 것은 질병의 진행과 예후와 같은 발병을 정의하는데 있어서 강력한 진단 수단이 될 수 있다.

그런데 많은 혈청 단백질들은 서로 분자량이 유사하고 전체적으로 전하를 띄고 있어 그 분리가 어렵다. 그러므로 질병의 바이오 마커는 상대적으로 혈청에 극히 낮은 농도로 존재하며, 따라서 이들은 유사한 생물학적 특성을 가진 고농도의 단백질들에 의해 숨겨져 있을 것이다. 따라서, 혈청의 가능한 프로테옴의 특성화와 이를 이용한 바이오 마커의 확인은 혈청 프로테옴의 복잡성을 감소시킴으로써 극적으로 개선될 수 있다. 알부민은 전체 인간 혈청 단백질의 55%에서 75%을 구성하고 있고, 이것은 분리와 검출 분석에 있어서 굉장한 신호이다. 비록 알부민을 제거했다 하여도 여전히 5개의 다른 높은 농도의 단백질이 혈청에 포함되어 있다. 이들 단백질은 면역 글로불린 G(IgG), 면역 글로불린 A(IgA), 트랜스페린(transferrin), 합토글로빈(haptoglobin), 그리고 안티트립신(antitrypsin)이다. 이러한 여섯 가지 고농도 단백질들은 인간 혈청 프로테옴의 85% 이상을 차지하고 있다. 그러므로, 이들 단백질의 제거는 혈청 단백질의 특성화를 근본적으로 개선시킨다.

한편 아토피성 피부염은 아토피 알레르기를 가진 사람에게서 나타나는 대표적인 만성 피부질환으로서, 만 5세 이하에서 주로 발병하는 재발성 염증질환이다. 아토피성 피부염의 원인은 잘 알려져 있지 않으나, 대개의 병인은 유전자와 환경적인 요소들의 복잡한 상호작용으로 이루어지므로, 이의 진단과 예후 판정을 위해서는 혈청 프로테옴 분석을 이용함이 필요하다. 질환의 발생, 진행 및 악성화와 함께 나타나는 혈청은, 1~2 종류의 세포나 조직이 아닌 여러 장기의 기능과 프로세스에 의해 발현되므로, 아토피 피부 질환에서 나타나는 프로테옴 변화를 가장 민감하게 반영할 수 있는 생체 시료라고 할 수 있다. 그러므로 혈청 프로테옴 분석을 이용한 아토피 피부 질환 연구는 아토피 질환의 마커 단백질을 발굴하고 이를 이용한 진단과 치료방법으로 자리 잡게 될 것이다.

이에, 본 발명자는 단백질의 대량 발굴 탐색(High-throughput screening)이 가능한 이차원(2-D) 전기영동과, 펩타이드와 아미노산 수준에서의 정확한 질량분석이 가능한 MALDI-TOF/MS(Matriz-Assisted Lazer Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectometry) 단백질 질량분석 등 각종 프로테오믹스 분석기술을 이용하여 실험을 수행하였다. 상기 분석기술을 기반으로, 아토피 피부염 환자와 정상인의 혈청에서 발현하는 단백질의 양상의 변화를 정확하게 관측하여 아토피 피부염 환자-작용 표적 단백질을 규명하였다. 이와 같이, 아토피 피부염 환자의 혈청에서 발현이 증가 또는 감소되는 단백질의 아토피 피부염 질병 검출을 위한 마커로서의 이용을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아토피 피부염 환자 및 정상인에서 발현 차이를 보이는 혈청 단백질을 동정하고, 이들 단백질들을 이용하여 아토피성 피부염 질병을 진단, 분류, 확인하는 방법을 제공하는 것이다. 또한 이들 단백질들의 증감을 조절하거나, 단백질의 기능을 조절하는 방법을 통하여 치료방법을 찾아내는 방법을 제공하 는 것이다.

본 발명은 아토피성 피부염의 진단 마커 단백질을 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서 아토피성 피부염 질병의 진단 마커로 사용될 수 있는 단백질을 찾아내기 위하여, 혈청 중 6개의 높은 농도의 단백질을 제거한 후 나타나는 낮은 농도의 혈청 단백질의 동정 실험을 실시하였다.

구체적으로, 아토피성 피부염 환자의 혈청과 정상인의 혈청에서 Pierce사 및 Agilent사의 상업적인 키트를 이용함으로써 혈청 단백질의 85% 이상을 차지하는 6개의 단백질인 면역 글로불린 G(IgG), 면역 글로불린 A(IgA), 트랜스페린(transferrin), 합토글로빈(haptoglobin), 그리고 안티트립신(antitrypsin)을 제거한다. 상기 6개의 고농도 단백질이 제거된 단백질 시료를 드라이스트립(drystrip)에 로딩(loading)하여 일차원 전기영동(Isoelectrofocusing, IEF)을 실시하고, 일차원 전기영동이 끝난 스트립에 다시 이차원 전기영동(SDS-PAGE)을 실시하였다. 전기영동으로 얻어진 젤은 염색, 스캐닝 과정을 거쳐 젤 분석 전용 프로그램인 Nonlinear사의 Phoretix 2D expression. version 2005로 단백질 발현의 차이를 분석하였다.

본 발명자들은 이미지 분석 프로그램으로부터 발현 차이를 나타내는단백질 스팟(spot)을 찾아내고, 이에 해당하는 트립신효소 분해 펩타이드의 질량을 질량분석기(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-TOF MS)로 알아내었다. 이를 바탕으로 NCBI 데이터베이스에서 상기 단백질을 동정하였다(표 1 및 2 참조).

그 결과, 아토피성 피부염 환자의 혈청에서 증가하거나 감소함을 보이는 단백질들은 다음과 같았다(도 2 및 4 참조).

구체적으로, 각각의 아토피 환자에서 발현이 증가되거나 감소되는 것으로 나타난 스팟을 동정한 결과 증가한 것으로 나타나는 8개의 스팟은 각각 Transthyretin(스팟 No. 2), C4A protein(스팟 No. 7), Alpha-1-B -glycoprotein (스팟 No. 8), X-Ray Crystal Structure Of C3d: A C3 Fragment And Ligand For Complement Receptor 2(스팟 No. 10), Chain A, Cr2-C3d Complex Structure(스팟 No. 11), Zinc finger protein 211 isoform 2 variant(스팟 No. 12), Complement component 4A(스팟 No. 13), Immunoglobulin heavy chain variable region(스팟 No. 17)으로 확인 되었다. 여기서 확인된 단백질 중 Transthyretin은 신경변성 (Neurodegener ation)의 바이오 마커로 쓰이며, Alpha-1-B -glycoprotein은 면역 글로불린 상과(superfamily)에 속하는 혈장 단백질로 기능은 밝혀지지 않았다. X-Ray Crystal Structure Of C3d: A C3 Fragment And Ligand For Complement Receptor 2는 보체(complement)의 활성에서 어느 부분으로 작용하는 것이 아니라 면역반응을 자극시키는 CR2 리간드로서 중요한 역할을 한다. Chain A, Cr2-C3d Complex Structure(스팟 No. 11)는 C3 수용기(receptor)로서 CR2는 T-dependent Ags에 반응하는 체액의 면역반응에서 중요한 역할을 하며 선천적, 후천적 면역성을 중개하는 역할을 한다. Zinc finger protein 211 isoform 2 variant(스팟 No. 12)는 항체를 분비하는 혈장 세포( antibody-secreting plasma cells)에서 B 임파구(lymphocytes)의 성숙분열을 유발하기에 충분한 포유동물의 면역 시스템(mammalian immune system)에서 처음으로 발견되었다. Complement component 4A는 30개 이상의 단백질로 구성된 보체 시스템(complement system)의 초기 면역 시스템의 중요한 구성요소이고 병원균에 대항하는 호스트 방어로서 중요한 역할을 한다. 하지만 강화된 보체(complement ) 활성은 조직의 손상과 염증을 유발한다. 따라서, 조절되지 못한 보체 시스템(complement system)은 감염과 자가면역질환의 증가와 연관이 있다.

또한 아토피 환자에서 발현이 감소되는 것으로 나타난 7개의 스팟은 각각 CD5 antigen-like (scavenger receptor cysteine rich family)(스팟 No. 1), Chain B, Tertiary Structures Of Three Amyloidogenic Transthyretin Variants And Implications For Amyloid Fibril Formation(스팟 No. 3,4), PRO2044(스팟 No. 5), Immunoglobulin lambda light chain C3 region(스팟 No. 6), Chain F, Crystal Structure Of Fragment D Of Gammae132a Fibrinogen With The Peptide Ligand Gly-His-Arg-Pro-Amide(스팟 No. 9), Kininogen 1 (스팟 No. 14), Proapolipoprotein(스팟 No. 15,16)이다. 확인된 단백질 중 CD5 antigen-like (scavenger receptor cysteine rich family)는 면역 세포의 운명에 영향을 주며 PRO2044는 간암 및 전립선암의 바이오 마커로 쓰인다.

상기에서 언급한 바와 같이, 혈청은 질환의 발생, 진행 및 악성화와 함께 나타나고, 1~2 종류의 세포나 조직이 아니라 여러 장기의 기능과 피로세스에 의해 발현되는 아토피 피부 질환에서 나타나는 프로테옴 변화를 가장 민감하게 반영할 수 있는 생체 시료라 할 수 있다. 따라서, 아토피성 피부염 환자와 정상인 사이에서 발현 차이를 나타내는 상기 단백질들은 이러한 아토피성 피부 질환에 대한 가장 민감한 생체 시료인 혈청에서의 변화를 나타낸다는 점에 의의가 있으며 또한, 환자 혈청에서 단백질의 발현 차이를 확인함으로써 아토피성 피부염을 간편하게 진단할 수 있게 한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 시료준비( sample preparation )

<1-1> ProteoSeek Albumin/IgG removal kit (Pierce)

두 종류의 상업적인 키트를 이용하여 아토피성 피부염 환자 및 정상인의 혈청에 포함되어 있는 과량의 단백질을 제거하여 전기영동을 실시하기 위한 시료를 준비하였다. 먼저, ProteoSeek Albumin/IgG removal kit (Pierce)을 이용하여 70%이상을 차지하는 과량 단백질인 알부민과 면역글로불린G(IgG)을 제거하였다.

ProteoSeek Albumin/IgG removal kit (Pierce)는 cibacron blue/Protein A gel을 기초로 한 방법으로, cibacron blue/Protein A gel slurry를 키트에 주어진 카트리지(cartridge) 컬럼(column)에 쌓고, 한번에 0.6 mg에 해당하는 전체 혈청을 30분간 실온에서 결합시켰다. 결합되지 않은 혈청 단백질을 분리하기 위해 1000xg에서 수 초간 원심분리 하였고, 다시 키트에 주어진 결합/세척 완충용액(binding/wash buffer)을 카트리지( cartridge)에 첨가하여 반응시킨 후 원심분리하여 여분의 결합되지 않은 혈청 단백질을 분리하였다. Cibacron blue/Protein A gel에는 알부민과 면역글로불린G(IgG) 등의 혈청 과량 단백질이 결합되어 있으며, 이것은 재사용하지 않았다. 젤(Gel)에 결합되지 않은 혈청 단백질을 회수하여 단백질 함량을 Bradford 방법 (Bradford, 1976)에 의해 정량하였다.

<1-2>Agilent Multiple Affinity Removal System (Agilent Technologies)

환자와 정상인으로부터 얻은 혈청에 포함되어 있는 과량의 단백질을 제거하기 위해 Agilent Multiple Affinity Removal System (Agilent Technologies)을 이용하였다.

Agilent Muliple Affinity Removal System 은 항원항체 상호작용을 원리로 하여 80~85%을 차지하는 과량 단백질인 알부민, 면역 글로불린 G(IgG), 면역 글로불린 A(IgA), 트랜스페린(transferrin), 합토글로빈(haptoglobin), 그리고 안티트립신(antitrypsin)을 제거하는 것으로 Agilent Technologies사에서 제시하였다. 주어진 스핀 카트리지(spin cartridge)에 0.6 ㎎에 해당하는 전체 혈청 샘플을 주어진 A 완충용액(buffer)과 함께 섞고, 보관 과정에서 혈청의 특성으로 인하여 생긴 응집물 등을 제거하기 위하여 0.22 ㎛의 주사기 필터로 혈청을 여과하였다. 여과한 혈청 샘플을 카트리지(cartridge)에 로딩(loading) 하고, 100xg에서 1 분간 원심분리 하였다. 여기에 다시 A buffer를 loading하고, 100xg에서 2 분간 원심분리하여 카트리지-젤(cartridge-gel)에 결합하지 않은 혈청 단백질을 분리하였다. 키트에 주어진 B 완충용액(buffer)을 이용하여 젤(gel)에 결합한 알부민 등의 과량 단백질을 분리하였고, 젤(gel)에 다시 A 완충용액(buffer)를 흘려주어 안정화시켰다. 카트리지-젤(Cartridge-gel)에 결합하지 않은 혈청 단백질을 회수하고 단백질 함량을 Bradford 방법 (Bradford, 1976)에 의해 정량하였다.

< 실시예 2> 이차원 전기영동

<2-1> 단백질 침전

<실시예 1>에서 준비한 시료로 등전점 전기영동(Isoelectrofocusing, IEF)을 실시하기 위해 아세톤 침전법으로 단백질의 염을 제거하고 농축시켰다. 구체적으로, <실시예 1>에서 확보한 각각의 환자로부터 얻은 혈청과 정상인의 혈청에 시료량의 3배 이상의 아세톤을 처리한 후 -20℃에서 2시간 이상 반응시키고, 4℃, 13000rpm에서 30분 동안 원심분리 하여 상등액을 제거하고, 여분의 아세톤을 완전히 제거하기 위해 진공 원심분리기(speed-vac)를 이용하여 30분간 건조하였다. 침전된 단백질은 80% 아세톤을 사용하여 한 번 더 세척해 준 후 진공 원심분리기(speed-vac)를 이용하여 완전히 건조 시킨다.

<2-2> 등전점 전기영동 (isoelectric focusing, IEF) 전개

<2-1>에서 준비한 단백질 시료로 등전점 전기영동(Isoelectrofocusing, IEF)을 하였다. 구체적으로, 등전점 전기영동 (Isoelectric focusing, IEF)을 하기 위해 사용된 드라이스트립(dry strip)은 17 ㎝ 스트립 pH4 내지 7(narrow ranged ReadyStrip pH 4-7 (Bio-Rad, Hercules, CA)) 및 17 ㎝ 스트립 pH5 내지 8(narrow ranged ReadyStrip pH 5-8 (Bio-Rad, Hercules, CA))을 이용하였다. 완전히 건조된 혈청 단백질 침전물에 재수화(rehydration) 완충용액(7 M urea, 2 M thiourea, 2 % CHAPS, 0.002 % bromophenol blue, 2.8 ㎎/㎖ DTT, 2 % IPG buffer (pH 4-7))을 첨가하고 각각의 드라이스트립(dry strip)에 로딩(loading)한 후 14 시간 이상 실온에 방치하였다. 초점형성(Focusing)을 위해 초점형성 트레이 용기(focusing tray holder)에 단백질 침전물과 함께 수화(rehydration)된 드라이스트립(dry strip)을 올려놓고, 기기의 온도를 20℃로 설정하였다.

각 단계별 전하 조건은 다음과 같다.

1) 조건형성(conditioning)단계-과잉된 염을 제거하기 위해 낮은 전압을 걸어주는 단계-는 300V/2㎃/5W로 1vhr 설정, 2) 전압 경사형성(voltage ramping)단계-적정 전압까지 올라가는 단계-는 3500V/2㎃/5W로 5250vhr의 전하를 흐르게하였다. 3)최종 단계인 초점(focusing) 단계는 드라이스트립(dry strip)의 길이, pH 영역의 조건에 따라 다른 전압을 설정하게 되며 3500V/2㎃/5W로 최종 63000 Vhr되도록 전하를 흘려 주었다.

<2-3> 이차원적 전기영동

초점 형성(Focusing)이 끝난 후 12% 아크릴 아마이드 젤을 이용하여 이차원적 전기영동을 수행하였다. 구체적으로 초점 형성(Focusing)이 끝난 각각의 드라이스트립(dry strip)을 평형화 완충용액 Ⅰ (6 M urea, 50 mM tris, 2% SDS, 30% glycerol, 0.002% bromophenol blue, 65 mM DTT)으로 20분간 평형 시킨 후, 평형화 완충용액 Ⅱ (6 M urea, 50 mM tris, 2% SDS, 30% glycerol, 0.002% bromophenol blue, 135 mM iodoacetamide)에 20 분간 방치하였다. 이후, 평형화(equilibration) 완충용액 III (6 M urea, 50 mM tris, 2% SDS, 30% glycerol, 0.002% bromophenol blue)로 5 분간 세척하였다. 이차원 전기영동에 사용된 SDS-PAGE의 아크릴 아마이드(acrylamide) 농도는 Laemmli 방법에 따라 running젤의 경우 12%로, stacking젤은 4%로 하였다. 등전점 전기영동(IEF)이 끝난 드라이스트립(dry strip)을 stacking 젤 위에 놓고 전기영동용 완충용액 (192 mM glycine, 25 mM tris base, 0.1% SDS)에 녹인 0.5% 아가로스(agarose) 용액으로 덮어 고정시킨 후, 일정하게 110V로 전기영동하였다.

<2-4> 2D-Gel 상의 단백질 염색 및 이미지 분석(Image analysis)

전기영동 후 젤에 남아 있는 SDS를 제거하기 위하여 3차 증류수로 15 분씩 4번 세척하여 완전히 제거한 후, Bio Safe Coomassie^TM G250 stain (Bio-Rad, Hercules CA) 액으로 12시간 이상 염색하였다. 반응이 끝난 젤을 다시 3차 증류수로 세척하고 스캐닝(scannig)한 후, 이차원 전기영동 젤 분석 프로그램인 Nonlinear사의 Phoretix 2D expression. version 2005 소프트웨어를 이용하여 아토피 환자와 정상인의 혈청 단백질 발현 양상을 비교 분석하였다(도 2). 분석한 젤에서 변화된 스팟(spot)들은 잘라서 1.5㎖ 마이크로 튜브(micro tube)에 보관하였다.

< 실시예 3> 질량분석( Mass Analysis )

<3-1> 단백질 스팟(spot)의 효소절단반응(Enzymatic Digestion)

이미지 분석 프로그램으로부터 얻어진 스팟(spot)에 해당하는 단백질을 동정하였다.

구체적으로, 분석 후 잘라놓은 스팟(spot)은 젤 내의 단백질을 얻기 위해 단백질의 특이 부분만을 절단하는 트립신 효소절단반응(enzymatic digestion)을 수행하여 펩타이드(peptide)로 분해시켰으며, Coomassie 염색은 30% 메탄올(Methanol)로, 은(silver) 염색은 100 mM 티오황산나트륨(sodium thiosulfate)과 20mM 칼륨페리시안 화합물(potassium ferricyanide)을 1:1(v/v)로 섞은 용액으로 교반하면서 젤 속의 염색을 제거하고, 100% 아세토니트릴(acetonitrile (ACN; Burdick&Jackson))을 100 ㎕ 넣은 후 실온에서 10분 방치한 후, 진공 원심분리기(speed-vac)에서 완전히 건조시켰다. 50 mM 암모늄 중탄산염(ammonium bicarbonate), 5 mM 염화 칼슘(Calcium chloride)이 포함된 트립신 절단 완충용액(trypsin digestion buffer)을 20 ㎕ 첨가한 후, 트립신(Sequencing Grade Modified Trypsin (Promega)) 2 ㎕(0.2㎍)를 넣고 37℃ 항온 수조(water bath)에서 14 내지 16시간 정도 정치 후 절단(digestion)한다. 절단 후 상층액을 새로운 1.5 ㎖ 마이크로 튜브에 옮긴 후 100% ACN을 100 ㎕ 첨가하여 37℃ 항온수조(water bath)에서 10분 동안 정치한 후 진공 원심분리기(speed-vac)에서 완전히 마를 때까지 건조시킨다. 젤 조각은 50 mM 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate) 100 ㎕를 첨가하여 37℃ 항온수조(water bath)에서 1시간 동안 정치시켰다. 질량 분광계(Mass spectrometry)를 실시할 시료의 염을 제거하기 위해 ZipTipC-18 (Millipore)을 이용하여 시료의 염 제거와 동시에 농축을 실시하였다. 건조된 시료에 0.1 % 트리플로로아세트산 (triflouroacetic acid, TFA)의 결합 완충용액(binding buffer), 1.0 % TFA, 5 % 메탄올의 세척 완충용액(washing buffer), 0.1 % TFA, 50 % ACN의 용리완충용액(elution buffer)을 이용하여 각각의 과정을 수행하였으며, 정제된 펩타이드(peptide)는 진공원심분리기(speed-vac)에서 완전히 건조시켰다.

<3-2> 질량 분석

MALDI-TOF/MS 질량분석기(Matrix Assisted Laser Desorption

/Inoization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI - TOF / MS)에 실시 예 <3-1>에서 준비한 시료를 넣고 질량 분석을 실시하였다. 또한 더 나아가 MALDI-TOF/TOF 질량분석기 (Matrix-Assisted Laser-Desorption /Ionization Time-of-Flight/Time-of-Flight Mass Spectrometery, MALDI - TOF / TOF MS))을 이용함으로써 MS장비에서 확인 되지 않는 단백질을 확인하였다.

구체적으로, 매트릭스(matrix)로 사용되는 알파-시아노-4-하이드록시사이남 산(α-Cyno-4-hyroxycinnamic acid)을 50 % ACN, 0.5 % TFA에 녹여 원심분리 하여 상층액만을 수거하였다. 매트릭스에 내부 보정(internal calibration)을 위한 표준 용액을 1/4000 정도 희석시켜 그 중 1 ㎕를 시료에 넣고 녹인 후, 상기 시료를 분석용 판에 떨어뜨려 시료가 완전히 마르면 질량분석기에 판을 넣어 분석을 실시한다. 질량분석기는 MALDI-TOF/MS 장비인 AXIMA-CER ⁺PLUS, Version 2.4 (SHIMAZU)와 MALDI-TOF/TOF MS 장비인 Ultraflex TOF/TOF(Bruker)를 사용하였다. 질량분석기로 얻어진 펩타이드의 질량을 마스코트 검색 프로그램 (MASCOT,http://www.matrixscience.com)과 NCBI 데이터베이스를 사용하여 분석하였으며, 질량 허용오차(Mass Tolerance)를 100ppm으로 고정시킨 후 단백질의 분자량과 등전점을 보정하였다.

그 결과, 정상인에 비해 아토피성 피부염 환자의 혈장에서 증가 또는 감소하는 단백질들이 다음과 같이 동정되었다.

Pierce사의 키트를 이용하여 아토피 피부염 환자의 혈청과 정상인의 혈청에서 분리한 단백질을 비교하였을 때, 아토피성 피부염 환자에서 발현양이 증가하는 단백질

스팟	분자량(Da/pI)	단백질
2	39603/5.28	Transthyretin
7	23679/8.52	C4A protein

Pierce사의 키트를 이용하여 아토피 피부염 환자의 혈청과 정상인의 혈청에서 분리한 단백질을 비교하였을 때, 아토피성 피부염 환자에서 발현양이 감소하는 단백질

스팟	분자량(Da/pI)	단백질
1	39603/5.28	CD5 antigen-like (scavenger receptor cysteine rich family)
3	13840/5.35	Chain B, Tertiary Structures Of Three Amyloidogenic Transthyretin Variants And Implications For Amyloid Fibril Formation
4	13886/5.35	Chain B, Tertiary Structures Of Three Amyloidogenic Transthyretin Variants And Implications For Amyloid Fibril Formation
5	30084/6.97	PRO2044
6	11245/7.19	Immunoglobulin lambda light chain C3 region

Agilent사의 키트를 이용하여 아토피 피부염 환자의 혈청과 정상인의 혈청에서 분리한 단백질을 비교하였을 때, 아토피성 피부염 환자에서 발현양이 증가하는 단백질

스팟	분자량(Da/pI)	단백질
8	52479/5.65	Alpha-1-B-glycoprotein
10	33087/6.34	X-Ray Crystal Structure Of C3d: A C3 Fragment And Ligand For Complement Receptor 2
11	34679/5.68	Chain A, Cr2-C3d Complex Structure
12	66818/8.7	Zinc finger protein 211 isoform 2 variant
13	30226/6.27	Complement component 4A
17	13072/7.96	Immunoglobulin heavy chain variable region

Agilent사의 키트를 이용하여 아토피 피부염 환자의 혈청과 정상인의 혈청에서 분리한 단백질을 비교하였을 때, 아토피성 피부염 환자에서 발현양이 감소하는 단백질

스팟	분자량(Da/pI)	단백질
9	35097/6	Chain F, Crystal Structure Of Fragment D Of Gammae132a Fibrinogen With The Peptide Ligand Gly-His-Arg-Pro-Amide
14	48906/6.29	Kininogen 1
15	28944/5.45	Proapolipoprotein
16	28944/5.45	Proapolipoprotein

상기에서 살펴본 바와 같이, 아토피 피부염 환자의 혈청과 정상인의 혈청의 단백질 발현을 비교했을 때, 발현이 증가하거나 감소하는 단백질은 아토피 피부염을 진단하는 마커 단백질이 될 수 있으며, 상기 마커 단백질을 기초로 제조된 단일클론항체는 면역반응을 이용한 단백질 칩 및 진단키트 개발에 유용하다. 또한 상기 단백질의 증감을 조절하거나, 단백질의 기능을 조절하는 방법은 아토피 피부질환을 치료하는 방법으로 유용하게 이용 될 수 있다.

Claims

Transthyretin(스팟 No. 2) 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 아토피성 피부염 진단용 조성물.
제1항에 있어서, C4A protein(스팟 No. 7), Alpha-1-B -glycoprotein (스팟 No. 8), X-Ray Crystal Structure Of C3d: A C3 Fragment And Ligand For Complement Receptor 2(스팟 No. 10), Chain A, Cr2-C3d Complex Structure(스팟 No. 11), Zinc finger protein 211 isoform 2 variant(스팟 No. 12), Complement component 4A(스팟 No. 13), Immunoglobulin heavy chain variable region(스팟 No. 17), CD5 antigen-like (scavenger receptor cysteine rich family)(스팟 No. 1), Chain B, Tertiary Structures Of Three Amyloidogenic Transthyretin Variants And Implications For Amyloid Fibril Formation(스팟 No. 3,4), PRO2044(스팟 No. 5), Immunoglobulin lambda light chain C3 region(스팟 No. 6), Chain F, Crystal Structure Of Fragment D Of Gammae132a Fibrinogen With The Peptide Ligand Gly-His-Arg-Pro-Amide(스팟 No. 9), Kininogen 1 (스팟 No. 14) 및 Proapolipoprotein (스팟 No. 15,16)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질의 수준을 측정하는 제제는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 아토피성 피부염 진단 키트.
Transthyretin(스팟 No. 2) 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 아토피성 피부염 의심 환자의 혈청과 접촉시켜 단백질 수준을 확인하는 단계; 및 상기 단백질 수준을 정상 대조구 혈청의 단백질 수준과 비교하여 아토피성 피부염을 판단하는 단계를 포함하는 아토피성 피부염 진단을 위한 정보 제공 방법.
제5항에 있어서, 상기 단백질 수준을 확인하는 단계 및 비교하는 단계는 C4A protein(스팟 No. 7), Alpha-1-B -glycoprotein (스팟 No. 8), X-Ray Crystal Structure Of C3d: A C3 Fragment And Ligand For Complement Receptor 2(스팟 No. 10), Chain A, Cr2-C3d Complex Structure(스팟 No. 11), Zinc finger protein 211 isoform 2 variant(스팟 No. 12), Complement component 4A(스팟 No. 13), Immunoglobulin heavy chain variable region(스팟 No. 17), CD5 antigen-like (scavenger receptor cysteine rich family)(스팟 No. 1), Chain B, Tertiary Structures Of Three Amyloidogenic Transthyretin Variants And Implications For Amyloid Fibril Formation(스팟 No. 3,4), PRO2044(스팟 No. 5), Immunoglobulin lambda light chain C3 region(스팟 No. 6), Chain F, Crystal Structure Of Fragment D Of Gammae132a Fibrinogen With The Peptide Ligand Gly-His-Arg-Pro-Amide(스팟 No. 9), Kininogen 1 (스팟 No. 14) 및 Proapolipoprotein (스팟 No. 15,16)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 수준을 추가로 확인 및 비교하여 판단하는 단계를 포함하는 아토피성 피부염 진단을 위한 정보 제공 방법.