ES2350164T3 - Método para distinguir entre accidente cerebrovascular isquémico y hemorrágico. - Google Patents
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Abstract
Método de diagnóstico de accidente cerebrovascular o la posibilidad del mismo en un sujeto del que se sospecha que padece de accidente cerebrovascular, que comprende determinar la concentración de Apo C-III en una muestra de líquido corporal extraída del sujeto.
Description
Método para distinguir entre accidente
cerebrovascular isquémico y hemorrágico.
Esta invención se refiere a un método de
diagnóstico de accidente cerebrovascular.
El accidente cerebrovascular tiene la tercera
tasa de mortalidad más alta en los países industriales. Está
provocado o bien por una hemorragia en el cerebro de un vaso
sanguíneo roto (accidente cerebrovascular hemorrágico) o bien por
una obstrucción de un vaso sanguíneo en el cerebro (accidente
cerebrovascular trombótico o isquémico). El accidente
cerebrovascular resulta de una reducción o bien permanente o bien
transitoria del flujo sanguíneo cerebral. En la mayoría de los
casos, esta reducción de flujo está provocada por la oclusión
arterial debido a o bien un émbolo o bien una trombosis local.
Dependiendo de la ubicación de la lesión cerebral y la intensidad
de neuronas necrosadas, los síntomas del accidente cerebrovascular
pueden convertirse en una minusvalía de por vida para los pacientes
y la tasa de mortalidad debida a acontecimientos de accidentes
cerebrovasculares se aproxima al 30%.
Recientemente, se describió S100B como un
marcador bioquímico potencial para el diagnóstico de accidente
cerebrovascular, véase U. Missler et al., "S100 protein
and neuron-specific enolase concentrations in blood
as indicators of infarct volume and prognosis in acute ischemia
stroke", Stroke 1997; 28: 1956-60. Sin embargo,
también se ha notificado S100B como un marcador útil para la
detección temprana de metástasis de melanoma y complicaciones
cerebrales debidas a una lesión en la cabeza y cirugía cardiaca. Por
tanto, la sensibilidad y la especificidad de la prueba de S100B se
limitaron al 44% y al 67%, respectivamente, véase M. Takahashi et
al., "Rapid and sensitive inmunoassay for the measurement of
serum S100B using isoform-specific monoclonal
antibody", Clin. Chem. 1999; 45: 1307-11. El
desarrollo de nuevos marcadores de accidente cerebrovascular ayudará
a los médicos a establecer un diagnóstico temprano.
El documento WO 01/42793 se refiere a un ensayo
de diagnóstico para accidente cerebrovascular en el que se determina
la concentración de proteína de unión a ácidos grasos de corazón o
cerebro (H-FABP o B-FABP) en una
muestra de líquido corporal.
El documento
US-A-6225047 describe el uso de
cromatografía de retención para generar mapas de diferencia, y en
particular un método de identificación de analitos que están
presentes diferencialmente entre dos muestras. Un método específico
descrito en el mismo es la espectrometría de masas con desorción por
láser.
El documento WO 01/25791 describe un método para
ayudar a un diagnóstico de cáncer de próstata, que comprende
determinar una cantidad de prueba de un marcador polipeptídico, que
está presente diferencialmente en muestras de un paciente con
cáncer de próstata y un sujeto que no tiene cáncer de próstata. El
marcador puede determinarse usando espectrometría de masas, y
preferiblemente espectrometría de masas con desorción por láser.
Altes et al, Acta Haematologica, vol. 94,
n.º 1, 1995, páginas 10-15, se refieren a la
identificación de patrones anómalos de coagulación en accidente
cerebrovascular isquémico establecido. Se tratan niveles de
antitrombina III.
Kawamoto et al, Japanese Journal of
Geriatrics 1985, vol. 22, n.º 6, 1985, páginas
550-557, en su resumen en inglés, se refieren a
factores de riesgo para cardiopatía isquémica y trombosis cerebral.
Entre los factores de riesgo mencionados están diversas
lipoproteínas séricas, incluyendo Apo C-III.
El documento WO 01/64008 se refiere a terapias
con vacunas para enfermedades ateroscleróticas, y da a conocer un
inmunógeno que comprende una apolipoproteína, preferiblemente Apo
C-III.
El documento US 4801531 se refiere a
polimorfismos de Apo A-I y C-III que
son predictivos de aterosclerosis.
El documento WO 96/00903 da a conocer
anticuerpos monoclonales dirigidos frente a diversas
apolipoproteínas, incluyendo Apo C-III,
inmovilizados en materiales en fase sólida.
El documento WO 01/71360 se refiere a marcadores
para cáncer de próstata.
El desarrollo de nuevos marcadores de accidente
cerebrovascular no invasivos para líquidos corporales y nuevos
métodos de determinación de los marcadores ayudará a los médicos a
establecer un diagnóstico temprano. Ahora la presente invención ha
solucionado este problema.
Nuestra solicitud anterior PCT/EP03/01462
(documento WO 03/069346) da a conocer un método de diagnóstico de
accidente cerebrovascular o la posibilidad del mismo en un sujeto
del que se sospecha que padece de accidente cerebrovascular, que
comprende someter una muestra de líquido corporal extraída del
sujeto a espectrometría de masas, para determinar de ese modo una
cantidad de prueba de un polipéptido en la muestra, en el que el
polipéptido está contenido diferencialmente en el líquido corporal
de sujetos afectados por accidente cerebrovascular y sujetos no
afectados por accidente cerebrovascular, y tiene un peso molecular
en el intervalo de desde 3000 hasta 30000; y determinar si la
cantidad de prueba concuerda con un diagnóstico de accidente
cerebrovascular. En una realización preferida la espectrometría de
masas implica desorción/ionización por láser mejorada en superficie
(SELDI).
Se han investigado adicionalmente los picos de
espectrometría de masas (SELDI) en nuestra solicitud anterior,
mediante los procedimientos descritos en los ejemplos
4-9 a continuación, que se refieren a la
identificación e inmunovalidación de marcadores de accidente
cerebrovascular. Como resultado, se ha encontrado que ciertos
polipéptidos son marcadores útiles en el diagnóstico de accidente
cerebrovascular y daño cerebral.
El nuevo marcador Apo C-III
usado en la presente invención y otros marcadores que se han
encontrado son tal como sigue:
Apolipoproteína C-III
(denominada a continuación en el presente documento Apo
C-III). Ésta es una candidata para el pico de SELDI
de 11,7 kDa (como forma glicosilada). Tiene el número de registro de
Swiss-Prot P02656, una longitud de 79 aa, un peso
molecular de 8765 Da y la siguiente secuencia:
Proteína amiloide A sérica (SAA). Ésta es una
proteína candidata para los picos de SELDI por SAX2 de 11,5 y 11,7
kDa. Tiene el número de registro de Swiss-Prot
P02735, una longitud de 103 aa, un peso molecular de 11682 Da y la
siguiente secuencia:
Apolipoproteína C-I (denominada
a continuación en el presente documento Apo C-I).
Ésta es una proteína candidata para los picos de SELDI por SAX2 de
6,44 y 6,64 kDa. Tiene el número de registro de
Swiss-Prot P02654, una longitud de 57 aa, un peso
molecular de 6631 Da y la siguiente secuencia:
Antitrombina III (fragmento). Ésta es una
proteína candidata para los picos de SELDI por SAX2 de 4,47, 4,63 y
4,80. Tiene el número de registro de Swiss-Prot
P01008, una longitud de 38 aa, un peso molecular de 4473 Da y la
siguiente secuencia:
Apolipoproteína A-I (denominada
a continuación en el presente documento Apo A-I).
Ésta es una proteína candidata para el pico de SELDI por SAX2 de 28
kDa. Tiene el número de registro de Swiss-Prot
P02647, una longitud de 244 aa, un peso molecular de 28079 Da y la
siguiente secuencia:
La presente invención proporciona un método de
diagnóstico de accidente cerebrovascular o la posibilidad del mismo
en un sujeto del que se sospecha que padece de accidente
cerebrovascular, que comprende determinar la concentración de Apo
C-III en una muestra de líquido corporal extraída
del sujeto. Otros aspectos de la invención se definen en las
reivindicaciones adjuntas.
La figura 1 (A y B) es una vista espectral del
plasma de cuatro pacientes con accidente cerebrovascular hemorrágico
(H 1-4) y cuatro muestras control (CTRL
1-4) usando espectrometría de masas con
desorción/ionización por láser, en el intervalo de peso molecular de
3750 a 4750 Da;
la figura 2 (A y B) es una vista que corresponde
a la figura 1, pero en el intervalo de peso molecular de 5000 a
11000 Da;
la figura 3 (A y B) es una vista que corresponde
a la figura 1, pero en el intervalo de peso molecular de 12000 a
30000 Da;
la figura 4 (A y B) es una vista espectral del
plasma de cuatro pacientes con accidente cerebrovascular isquémico
(I 1-4) y cuatro muestras control (CTRL
1-4) usando espectrometría de masas con
desorción/ionización por láser, en el intervalo de peso molecular de
3750 a 4750 Da;
la figura 5 (A y B) es una vista que corresponde
a la figura 4, pero en el intervalo de peso molecular de 5000 a
11000 Da;
la figura 6 (A y B) es una vista que corresponde
a la figura 4, pero en el intervalo de peso molecular de 12000 a
30000 Da;
la figura 7 (A, B y C) es una vista espectral
del plasma de cuatro pacientes con accidente cerebrovascular
(identificados como 155 stroke, 184 stroke, 194 stroke y 195 stroke)
y cuatro muestras control (identificadas como 380 neg, 386 neg, 387
neg y 390 neg) usando espectrometría de masas con
desorción/ionización por láser, en el intervalo de peso molecular de
aproximadamente 4300 a 5000 Da;
la figura 8 (A, B y C) es una vista que
corresponde a la figura 7, pero en el intervalo de peso molecular de
aproximadamente 5000 a 8000 Da;
la figura 9 (A, B y C) es una vista que
corresponde a la figura 7, pero en el intervalo de peso molecular de
10000 a 16000 Da;
la figura 10 muestra los resultados de la
determinación de los niveles de Apo C-III en 14
muestras de plasma de accidente cerebrovascular hemorrágico y 13 de
isquémico en comparación con 30 controles negativos usando pruebas
de Daiichi (aparato Cobas Mira plus automático); y
la figura 11 es una vista espectral del plasma
de dos pacientes con accidente cerebrovascular (identificados como
155 stroke y 195 stroke) y dos muestras control (identificadas como
380 neg y 387 neg) usando espectrometría de masas con
desorción/ionización por láser, en el intervalo de peso molecular de
aproximadamente 25000 a 32000 Da.
En las figuras 1 a 9 y 11, el eje horizontal
representa el peso molecular en Da (razón m/z), y el eje vertical
representa la intensidad de señal, es decir la cantidad de material
que tiene el peso molecular dado.
La invención proporciona un método de
diagnóstico de accidente cerebrovascular o la posibilidad del mismo
en un sujeto del que se sospecha que padece de accidente
cerebrovascular, y también un método de discriminación entre
accidente cerebrovascular hemorrágico y accidente cerebrovascular
isquémico. Cuando exista una referencia en el presente documento a
diagnóstico de accidente cerebrovascular o aplicaciones de
diagnóstico en relación con accidente cerebrovascular, debe
entenderse que también se incluye la discriminación entre accidente
cerebrovascular hemorrágico y accidente cerebrovascular isquémico.
Además de accidente cerebrovascular, pueden diagnosticarse otros
trastornos de daño cerebral. Se determina el marcador polipeptídico
específico Apo C-III, y opcionalmente también uno o
más de amiloide A sérico, Apo C-I, fragmento de
antitrombina III y Apo A-I en una muestra de
líquido corporal, por ejemplo usando un anticuerpo frente al mismo.
El marcador se mide preferiblemente mediante un inmunoensayo,
usando un anticuerpo específico frente al polipéptido y midiendo el
grado de la interacción antígeno (polipéptido)/anticuerpo. El
anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo
diseñado por ingeniería (quimérico). Se conocen anticuerpos frente
a los polipéptidos y están disponibles comercialmente. Además,
puede usarse el método de Köhler-Milstein habitual
para obtener anticuerpos. Menos preferiblemente, el anticuerpo
puede ser policlonal. En el contexto de la presente invención, el
término "anticuerpos" incluye fragmentos de unión de
anticuerpos, tales como fragmentos Fab o de una sola cadena.
Puede usarse cualquier método conocido de
inmunoensayo. En un ensayo de tipo sándwich un anticuerpo (por
ejemplo policlonal) frente al polipéptido se une a la fase sólida
tal como un pocillo de una placa de microtitulación de plástico, y
se incuba con la muestra y con un segundo anticuerpo marcado
específico frente al polipéptido que va a detectarse.
Alternativamente, puede usarse un ensayo de captura de anticuerpo
(también denominado "inmunoensayo indirecto"). En el presente
documento, se permite que la muestra de prueba se una a una fase
sólida, y entonces se añade el anticuerpo
anti-polipéptido (policlonal o monoclonal) y se
permite que se una. Si se usa un anticuerpo policlonal en este
contexto, debe ser de manera deseable uno que presente una baja
reactividad cruzada con otras formas de polipéptido. Tras eliminar
por lavado el material no unido, se determina la cantidad de
anticuerpo unido a la fase sólida usando un segundo anticuerpo
marcado, contra el primero.
Puede realizarse un ensayo directo usando un
anticuerpo anti-polipéptido marcado. Se permite que
la muestra de prueba se una a la fase sólida y se añade el
anticuerpo anti-polipéptido. Tras eliminar por
lavado el material no unido, se determina la cantidad de anticuerpo
unido a la fase sólida. El anticuerpo puede marcarse directamente en
vez de por medio de un segundo anticuerpo.
En otra realización, puede realizarse un ensayo
de competición entre la muestra y un polipéptido marcado o un
péptido derivado del mismo, compitiendo estos dos antígenos por una
cantidad limitada de anticuerpo anti-polipéptido
unido a un soporte sólido. El polipéptido o péptido marcado puede
incubarse previamente con el anticuerpo en la fase sólida, mediante
lo cual el polipéptido en la muestra desplaza parte del polipéptido
o péptido del mismo unido al anticuerpo.
En todavía otra realización, se permite que los
dos antígenos compitan en una única incubación conjunta con el
anticuerpo. Tras la eliminación del antígeno no unido del soporte
mediante lavado, se determina la cantidad de etiqueta unida al
soporte y se mide la cantidad de proteína en la muestra en
referencia a curvas de titulación patrón establecidas
previamente.
En todo momento, la etiqueta es preferiblemente
una enzima. El sustrato para la enzima puede ser formador de color,
fluorescente o quimioluminiscente. Alternativamente, la etiqueta
puede ser un radioisótopo o fluorescente, por ejemplo usando
fluoresceína conjugada.
Por ejemplo, la enzima puede ser fosfatasa
alcalina o peroxidasa del rábano y convenientemente puede usarse
colorimétricamente, por ejemplo usando fosfato de
p-nitrofenilo como sustrato formador de color
amarillo con fosfatasa alcalina.
Para un ensayo quimioluminiscente, puede
marcarse el anticuerpo con un éster de acridinio o peroxidasa del
rábano. La última se usa en ensayo quimioluminiscente mejorado
(ECL). En el presente documento, el anticuerpo, marcado con
peroxidasa del rábano, participa en una reacción quimioluminiscente
con luminol, un sustrato de peróxido y un compuesto que potencia la
intensidad y duración de la luz emitida, habitualmente
4-yodofenol o ácido
4-hidroxicinámico.
Puede usarse un inmunoensayo amplificado tal
como inmuno-PCR. En esta técnica, el anticuerpo se
une covalentemente a una molécula de ADN arbitrario que comprende
cebadores de PCR, mediante lo cual se amplifica el ADN con el
anticuerpo unido al mismo mediante la reacción en cadena de la
polimerasa. Véase E. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids
Research 1995; 23, 522-529 (1995) o T. Sano et
al., en "Molecular Biology and Biotechnology" ed. Robert A.
Meyers, VCH Publishers, Inc. (1995), páginas 458 - 460. La señal se
lee tal como anteriormente.
En un procedimiento, puede usarse un ensayo de
inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) para detectar el
polipéptido.
El uso de un inmunoensayo turbidimétrico
potenciado con micropartículas rápido, desarrollado para
H-FABP en el caso de AMI, M. Robers et al.,
"Development of a rapid microparticle-enhanced
turbidimetric inmunoassay for plasma fatty
acid-binding protein, an early marker of acute
myocardial infarction", Clin. Chem. 1998; 44:
1564-1567, disminuye significativamente el tiempo
del ensayo. Por tanto, debe ser posible la automatización completa
en un analizador de química clínica usado ampliamente tal como el
sistema COBAS^{TM} MIRA Plus de Hoffmann-La
Roche, descrito por M. Robers et al. citado anteriormente, o
el sistema AxSYM^{TM} de Abbott Laboratories, y aplicarse para el
diagnóstico clínico de rutina de accidente cerebrovascular.
Las concentraciones de polipéptido pueden
medirse mediante medios diferentes del inmunoensayo. Por ejemplo,
la muestra puede someterse a electroforesis en gel 2D y estimarse la
cantidad del polipéptido mediante barrido densitométrico del gel o
de una transferencia desde el mismo. Sin embargo, es deseable llevar
a cabo el ensayo de manera rápida, de manera que pueda tratarse
prontamente al paciente.
El polipéptido también puede determinarse
mediante espectrometría de masas, tal como se describió en nuestra
solicitud anterior PCT/EP03/01462 (documento WO 03/069346). Se
somete una muestra de líquido corporal extraída del sujeto a
espectrometría de masas, para determinar la presencia o ausencia en
la muestra de un marcador polipeptídico que está contenido
diferencialmente en el líquido corporal de sujetos afectados por
accidente cerebrovascular y sujetos no afectados. El marcador
polipeptídico tiene un peso molecular en el intervalo de desde 3000
hasta 30000, preferiblemente desde 3900 hasta 29000, y la presencia
o ausencia del marcador es indicativa de accidente cerebrovascular.
Una característica particular de la invención es que la presencia o
ausencia de ciertos marcadores puede usarse para determinar si un
accidente cerebrovascular diagnosticado es del tipo isquémico o
hemorrágico.
El término polipéptido incluye proteínas y
fragmentos de proteínas, así como péptidos modificados por la
adición de residuos no peptídicos, por ejemplo hidratos de carbono,
fosfatos, sulfatos o cualquier otra modificación
postranscripcional.
La muestra puede adsorberse en una sonda en
condiciones que permitan la unión entre el polipéptido y material
adsorbente en la sonda. El material adsorbente preferiblemente
comprende un grupo quelante de metales complejado con un ión
metálico, y un metal preferido es cobre. Antes de detectar el
polipéptido, pueden retirarse materiales no unidos o unidos
débilmente en la sonda con una solución de lavado, enriqueciendo de
ese modo el polipéptido en la muestra. La muestra se adsorbe
preferiblemente en una sonda que tiene una superficie de intercambio
aniónico fuerte (SAX) o de captura por afinidad con metales
inmovilizados (IMAC) que puede unirse al polipéptido. La muestra
también puede adsorberse en una sonda que tiene superficies de
intercambio catiónico débil o aniónico fuerte, hidrófobas en
condiciones que permitan la unión de los polipéptidos. La sonda
puede consistir en una tira que tiene diversos pocillos
adsorbentes, e insertarse en el espectrómetro, después puede moverse
en el mismo de manera que a su vez el medio ionizante (por ejemplo
láser) penetre en cada pocillo para proporcionar una lectura
espectrométrica. El polipéptido se determina preferiblemente
mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo
(EM-TOF) y desorción/ionización por láser mejorada
en superficie (SELDI).
En principio, puede usarse cualquier líquido
corporal para proporcionar una muestra para diagnóstico, pero
preferiblemente el líquido corporal es líquido cefalorraquídeo
(CSF), plasma, suero, sangre, orina o lágrimas.
Pueden determinarse uno o más polipéptidos que
tienen un peso molecular respectivo de aproximadamente 3900,
aproximadamente 3970, aproximadamente 3990, aproximadamente 6945,
aproximadamente 10070, aproximadamente 14040 y/o aproximadamente
28000, y un aumento o una reducción, en relación con un control, de
los picos que corresponden a tales polipéptidos es indicativo de
accidente cerebrovascular. El pico en 3900 es en su mayoría superior
a los picos en 3970 y 3990 en muestras de plasma de accidente
cerebrovascular.
Pueden determinarse uno o más polipéptidos que
tienen un peso molecular respectivo de aproximadamente 5920,
aproximadamente 6660 y/o aproximadamente 7770, y un aumento o una
reducción, en relación con un control, de los picos que corresponden
a tales polipéptidos es indicativo de accidente cerebrovascular.
Pueden determinarse uno o más polipéptidos que
tienen un peso molecular respectivo de aproximadamente 3900,
aproximadamente 3970, aproximadamente 3990, aproximadamente 14040
y/o aproximadamente 28000, y un aumento o una reducción, en
relación con un control, de los picos que corresponden a tales
polipéptidos se usa para indicar si un accidente cerebrovascular
diagnosticado es del tipo isquémico o hemorrágico.
Generalmente, las siguientes observaciones, por
separado o en cualquier combinación, son características de
accidente cerebrovascular isquémico (cuando se comparan con un
control): un pico en aproximadamente 3970 mayor que un pico en
aproximadamente 3990, pero ambos inferiores a un pico en
aproximadamente 3900; disminución de un pico en aproximadamente
5920 y/o aproximadamente 10070; aumento de un pico en
aproximadamente 7770; y ninguna disminución de picos en
aproximadamente 14040 y/o aproximadamente 28000.
Pueden determinarse uno o más polipéptidos que
tienen un peso molecular respectivo de aproximadamente 4475,
aproximadamente 4634 y/o aproximadamente 4797, y una reducción, en
relación con un control, de los picos que corresponden a tales
polipéptidos es indicativa de accidente cerebrovascular.
Pueden determinarse uno o más polipéptidos que
tienen un peso molecular respectivo de aproximadamente 6441 y/o
aproximadamente 6643, y un aumento, en relación con un control, de
los picos que corresponden a tales polipéptidos es indicativo de
accidente cerebrovascular.
Pueden determinarse uno o más polipéptidos que
tienen un peso molecular respectivo de aproximadamente 11530 y/o
aproximadamente 11712, y una reducción, en relación con un control,
de los picos que corresponden a tales polipéptidos es indicativa de
accidente cerebrovascular.
Puede determinarse un polipéptido que tiene un
peso molecular de aproximadamente 28130, y un aumento, en relación
con un control, de un pico que corresponde a tal polipéptido es
indicativo de accidente cerebrovascular.
Según la invención, puede realizarse un
diagnóstico de accidente cerebrovascular a partir de la
determinación de Apo C-III o cualquier combinación
de dos o más de los polipéptidos mencionados anteriormente
incluyendo Apo-C-III.
La medición del peso molecular del polipéptido o
polipéptidos se efectúa en el espectrómetro de masas. Los pesos
moleculares citados anteriormente pueden medirse con una exactitud
mejor que el 1%, y preferiblemente hasta dentro de aproximadamente
el 0,1%. Por tanto, el término "aproximadamente" en relación
con pesos moleculares significa dentro de una variación de
aproximadamente el 1%, preferiblemente dentro de aproximadamente el
0,1%, por encima o por debajo del valor citado.
La invención puede implicar la preparación y/o
el uso de un material que reconoce, se une a o tiene cierta
afinidad por el polipéptido mencionado anteriormente. Ejemplos de
tales materiales son anticuerpos y chips de anticuerpos. El término
"anticuerpo" tal como se usa en el presente documento incluye
antisuero policlonal, anticuerpos monoclonales, fragmentos de
anticuerpos tales como Fab, y anticuerpos diseñados por ingeniería
genética. Los anticuerpos pueden ser quiméricos o de una sola
especie.
La metodología de está invención puede aplicarse
al diagnóstico de cualquier tipo de accidente cerebrovascular. Se
preparan muestras de líquido corporal a partir de sujetos afectados
por accidente cerebrovascular y no afectados por accidente
cerebrovascular. Las muestras se aplican a una sonda que tiene una
superficie tratada con una variedad de medios adsorbentes, para la
retención diferencial de péptidos en la muestra, opcionalmente
usando líquidos de lavado para eliminar materiales no unidos o
unidos débilmente. Si es apropiado, también puede aplicarse
material de absorción de energía. Entonces se inserta la sonda en un
espectrómetro de masas, y se toman lecturas para las diversas
combinaciones de muestra/adsorbente usando una variedad de
parámetros espectrométricos. La comparación de las muestras
afectadas y no afectadas en un conjunto dado de condiciones revela
uno o más polipéptidos que se expresan diferencialmente en las
muestras afectadas y no afectadas. Entonces puede usarse la
presencia o ausencia de estos polipéptidos en las pruebas de una
muestra de líquido de un sujeto en las mismas condiciones
(adsorbente, parámetros espectrométricos, etc.) para determinar si
el sujeto está o no afectado. Además, comparando, por un lado,
muestras de accidente cerebrovascular hemorrágico con un control,
y, por otro lado, muestras de accidente cerebrovascular isquémico
con un control, es posible discriminar entre la posibilidad de
accidente cerebrovascular hemorrágico o accidente cerebrovascular
isquémico sometiendo a prueba una muestra de líquido corporal de un
paciente en las mismas condiciones.
La referencia anterior a "presencia o
ausencia" de un polipéptido debe entenderse que significa
simplemente que existe una diferencia significativa en la cantidad
de un polipéptido que se detecta en la muestra afectada y no
afectada. Por tanto, la "ausencia" de un polipéptido en una
muestra de prueba puede incluir la posibilidad de que el
polipéptido esté en realidad presente, pero en una cantidad
significativamente inferior a la de en una muestra de prueba
comparativa. Según la invención, puede realizarse un diagnóstico en
base a la presencia o ausencia de un polipéptido, y esto incluye la
presencia de un polipéptido en una cantidad significativamente
inferior o significativamente superior con referencia a una muestra
de prueba comparativa.
Pueden usarse kits y dispositivos de ensayo en
el diagnóstico de accidente cerebrovascular. Éstos pueden incluir
uno o más anticuerpos frente a un polipéptido seleccionado de Apo
C-III, amiloide A sérico, Apo C-I,
fragmento de antitrombina III y Apo A-I. Los
anticuerpos se unirán a los polipéptidos apropiados en una muestra
de fluido extraída de un paciente. Los anticuerpos pueden
inmovilizarse en un soporte sólido. Preferiblemente, se coloca cada
anticuerpo en una ubicación única a la que puede dirigirse, para
permitir de ese modo una lectura de ensayo separada para cada
polipéptido individual en la muestra, así como lecturas para
cualquier combinación seleccionada de polipéptidos.
Se han descrito previamente kits para el ensayo
de Apo C-III, amiloide A sérico, Apo
C-I, fragmento de antitrombina III y Apo
A-I. Sin embargo, el uso de un kit para Apo
C-III para el diagnóstico de accidente
cerebrovascular es novedoso y se describe por primera vez en la
presente memoria descriptiva. Ejemplos de tales kits son los
siguientes:
Instruchemie proporciona kits de Daiichi Pure
Chemicals Co., Ltd. (Tokio, Japón) para la detección de ApoCIII
(método turbidimétrico y/o nefelométrico, ref. 241871, kit que se
usó) y ApoAI (método turbidimétrico y/o nefelométrico, ref
2611).
El Kit LINCOplex para apolipoproteínas humanas,
(http://www.
lincoresearch.com/products/apo-62k.html) n.º de
catálogo APO-62K es un kit de ensayo multiplex
fabricado por LINCO Research, Inc. y puede usarse para la
cuantificación simultánea de las siguientes seis apolipoproteínas en
cualquier combinación: Apo AI, Apo AII, Apo B, Apo CII, Apo CIII y
Apo E. Este kit puede usarse para el análisis de las
apolipoproteínas anteriores en suero, plasma, extracto tisular,
otros líquidos biológicos o muestras de cultivo tisular.
Con respecto a la determinación de SAA, Dade
Behring (www.dadebehring.com) proporciona reactivos de diagnóstico
in vitro para la determinación cuantitativa de amiloide A
sérico (SAA) en suero humano así como plasma heparinizado y con
EDTA por medio de inmunonefelometría potenciada por partículas
usando los sistemas BN: N-látex SAA - catálogo
OQMP11. Un kit de diagnóstico también está disponible comercialmente
de Dade Behring para la detección de ApoAI.
Existen muchos kits para la detección de
antitrombina III total, y para la determinación de la actividad de
antitrombina III. Dade Behring proporciona un kit para reactivos de
diagnóstico in vitro para la determinación cuantitativa de
antitrombina III en plasma humano con los sistemas BN:
N-antisuero frente a antitrombina III humana,
catálogo OSAY09.
Con respecto a ApoCI, muchos anticuerpos mono y
policlonales están disponibles comercialmente.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo del presente estudio era detectar
polipéptidos específicos en líquidos corporales (líquido
cefalorraquídeo, plasma y otros) de pacientes afectados por
accidente cerebrovascular. Las muestras se analizaron mediante la
tecnología de espectroscopía de masas (EM) con
desorción-ionización por láser mejorada en
superficie (SELDI). Esta tecnología abarca la captura por afinidad
a microescala de proteínas usando diferentes tipos de cromatografía
de retención y después análisis mediante espectrometría de masas de
tiempo de vuelo. Por tanto, se generan mapas de diferencia que
corresponden cada uno a un perfil de proteína típico de muestras
dadas que se analizaron con un espectrómetro de masas PBS II de
Ciphergen Biosystem (Freemont, CA, EE.UU.). Se identificaron picos
expresados diferenciales cuando se compararon espectros generados en
un grupo de muestras de plasma de pacientes afectados por accidente
cerebrovascular con un grupo control de pacientes no afectados.
El análisis por SELDI se realizó usando 2 \mul
de muestras de plasma humano bruto con el fin de detectar
polipéptidos específicos con afinidad por metales. Se empleó una
matriz de afinidad con cobre inmovilizado
(IMAC-Cu^{++}) en este enfoque para capturar
proteínas con afinidad por el cobre para seleccionar un subconjunto
específico de proteínas de las muestras. Se detectaron directamente
las proteínas capturadas usando el lector PBSII Protein Chip Array
(Ciphergen Biosystems, Freemont, CA, EE.UU.).
Se usó el siguiente protocolo para el
procesamiento y análisis de matrices ProteinChip usando una matriz
adsorbente con TED-Cu(II) cromatográfica. TED
es un adsorbente de (tris
(carboximetil)etilendiamina-Cu) revestido en
un sustrato de acero inoxidable revestido con óxido de silicio.
- \bullet
- En primer lugar, se cargó la superficie con 10 \mul de sulfato de cobre 100 mM para cada punto y se incubó durante 15 minutos en una cámara húmeda.
- \bullet
- Después de eso, se lavó el chip mediante dos enjuagues rápidos con agua desionizada durante aproximadamente 10 segundos para eliminar el exceso de cobre no unido.
- \bullet
- Antes de cargar las muestras, se equilibró la matriz I-MAC 3 una vez con 5 \mul de PBS-NaCl 0,5 M durante 5 minutos.
- \bullet
- Tras eliminar el tampón de equilibrio, se añadieron 3 \mul del mismo tampón antes de aplicar 2 \mul de plasma. Se incubó el chip durante 20 minutos en una cámara húmeda.
- \bullet
- Después de eso, se eliminaron las muestras y se lavó la superficie tres veces con el tampón de equilibrio (5 minutos cada una).
- \bullet
- Se realizaron dos enjuagues finales rápidos con agua.
- \bullet
- Se permitió que se secara al aire la superficie, seguido por la adición de 0,5 \mul de ácido sinapínico saturado (SPA, Ciphergen Biosystem) preparado en acetonitrilo al 50%, ácido trifluoroacético al 0,5%.
- \bullet
- De nuevo, se secó al aire el chip antes del análisis de la proteína retenida en cada punto con espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser.
- \bullet
- Se insertó la matriz de chips de proteína en el instrumento y se analizó una vez que se habían establecido la sensibilidad del detector apropiada y la energía del láser para automatizar la recogida de datos.
- \bullet
- Se analizaron los espectros obtenidos con el software Biomark Wizard (Ciphergen Biosystems, Freemont, CA, EE.UU.) que se ejecutó en un PC Dell Dimension 4100. Genera conjuntos de picos concordantes a través de múltiples espectros.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de las pruebas anteriores en
cuatro muestras de plasma de pacientes con accidente cerebrovascular
hemorrágico (plasma H 1-4) y cuatro muestras de
plasma de sujetos no afectados (plasma CTRL 1-4) se
muestran en las figuras 1 a 3. La figura 1 muestra la fuerte
disminución de un pico alrededor de 3970 Da en muestras de
accidente cerebrovascular hemorrágico en comparación con las sanas.
En las muestras control, forma una pareja con un pico en
aproximadamente 3990, pero en las muestras de accidente
cerebrovascular hemorrágico la pareja casi ha desaparecido detrás
del pico en aproximadamente 3900, que se ha aumentado fuertemente.
La figura 2 destaca la disminución de dos picos alrededor de 5920 y
10070 en muestras de accidente cerebrovascular hemorrágico en
comparación con las sanas. La figura 2 también muestra el aumento de
picos a aproximadamente 6660, 6945 y 7770 Da en muestras de
accidente cerebrovascular hemorrágico en comparación con las sanas.
La figura 3 muestra una intensidad disminuida de los picos en
aproximadamente 14040 y 28000 Da en muestras de accidente
cerebrovascular hemorrágico en comparación con las sanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repite el procedimiento del ejemplo 1 en
cuatro muestras de plasma de pacientes con accidente cerebrovascular
isquémico (plasma I 1-4) y cuatro muestras de
plasma de sujetos no afectados (plasma CTRL 1-4). Se
muestran los resultados en las figuras 4 a 6. La figura 4 muestra
para las muestras de accidente cerebrovascular isquémico una pareja
de picos en 3970 y 3990, en los que el pico en 3970 es superior al
pico en 3990, pero de una intensidad inferior al pico en 3900, en
contraste con las muestras control. La figura 5 destaca la
disminución de dos picos alrededor de 5920 y 10070 en muestras de
accidente cerebrovascular isquémico en comparación con las sanas.
La figura 5 también muestra el pico en 7770 aumentado en muestras de
accidente cerebrovascular isquémico, pero en menor medida que en
las muestras de accidente cerebrovascular hemorrágico. La figura 6
no muestra ninguna disminución de picos alrededor de 14040 y 28000
Da entre muestras de accidente cerebrovascular isquémico y muestras
sanas, en contraste con las diferencias mostradas para las muestras
de accidente cerebrovascular hemorrágico en la figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo una investigación comparativa
entre muestras de plasma procedentes de 21 pacientes con accidente
cerebrovascular (incluyendo 10 de tipo hemorrágico, 10 de tipo
isquémico y 1 de tipo desconocido) y 21 pacientes sanos usando la
tecnología SELDI, de manera similar al procedimiento de los ejemplos
1 y 2 excepto por las variaciones mencionadas a continuación en el
presente documento. Se retuvieron SAX ProteinChips (Ciphergen) y
una matriz de SPA (Ciphergen) para el estudio. Se proporciona un
ejemplo de 4 espectros de accidente cerebrovascular y 4 espectros
de pacientes sanos de entre los 42 sometidos a prueba en las figuras
7 a 9. Usando el software Biomarker Wizard (análisis estadístico de
Mann y Whitney), aparecieron siete picos expresados diferencialmente
entre pacientes con accidente cerebrovascular y controles sanos:
una disminución de la señal de los picos en 4475 Da, 4634 Da y 4797
Da es indicativa de accidente cerebrovascular con valores de p de
0,000138, 0,00224 y 0,0132 respectivamente. Un aumento de los picos
en 6443 Da y 6641 Da es indicativo de accidente cerebrovascular con
valores de p de 0,08950 y 0,02134. Y una disminución de los picos en
11530 Da y 11712 Da, respecto a un control, es indicativa de
accidente cerebrovascular con valores de p de 0,00634 y 0,04034
respectivamente.
Se proporciona un ejemplo adicional de 2
espectros de accidente cerebrovascular y 2 espectros de pacientes
sanos en la figura 11. Un pico alrededor de 28130 Da apareció
expresado diferencialmente entre pacientes con accidente
cerebrovascular y controles sanos: un aumento de la señal del pico
alrededor de 28130 Da es indicativo de accidente
cerebrovascular.
Se usó el siguiente protocolo para el
procesamiento y análisis de los SAX ProteinChips:
- 1.
- Rodear cada punto usando un rotulador hidrófobo. Permitir que se seque al aire.
- 2.
- Aplicar 10 \mul de tampón de unión (Tris 20 mM - NaCl 5 mM pH 9,0) a cada punto e incubar en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 5 minutos. No permitir que los puntos se sequen.
- 3.
- Eliminar el exceso de tampón de los puntos sin tocar la superficie activa. Repetir las etapas 2 y 3 dos veces más.
- 4.
- Cargar 1 \mul de muestra de plasma bruto + 2 \mul de tampón de unión (Tris 20 mM - NaCl 5 mM pH 9,0).
- 5.
- Incubar en una cámara de humedad durante 30 minutos.
- 6.
- Lavar cada punto con 5 \mul de tampón de unión (Tris 20 mM - NaCl 5 mM pH 9,0) 5 veces, seguido por dos lavados rápidos con agua (5 \mul por lavado).
- 7.
- Secar con una toallita alrededor de los puntos. Aplicar 0,5 \mul de matriz saturada de SPA (Ciphergen) a cada punto mientras todavía está mojada, pero no húmeda. Secar al aire. Aplicar por segunda vez 0,5 \mul de matriz saturada de SPA (Ciphergen) y secar al aire de nuevo antes del análisis de la proteína retenida en cada punto con espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser.
- 8.
- Se insertó la matriz de chips de proteína en el instrumento y se analizó una vez que se habían establecido la sensibilidad del detector apropiada y la energía del láser para automatizar la recogida de datos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cargaron chips de SELDI de SAX con o bien
muestras control negativas o bien de plasma de accidente
cerebrovascular (8 pocillos cada uno) y se separaron usando el
tampón Laemmli. Se cargaron las proteínas separadas en un gel de
SDS-PAGE 1-DE tal como se describe a
continuación.
Geles de tris-glicina: se
mezclaron 10 \mul de las muestras separadas anteriormente con 10
\mul de tampón Laemmli de desnaturalización [1]. Se calentaron
las muestras hasta 95ºC durante 5 min., y se cargaron en un gel de
SDS-poliacrilamida con el 15% de T según el método
de Laemmli. Se tiñeron los geles en una disolución que contenía
azul brillante de Coomassie R-250 (0,1% p/v) y
metanol (50% v/v) durante 30 min. Se realizó el desteñido en una
disolución que contenía metanol (40% v/v) y ácido acético (10%
v/v).
Geles de tris-tricina: se
realizó la electroforesis SDS-PAGE con
tris-tricina según Schagger y Von Jagow [2] usando
geles con el 16,5% de T precolados (Bio-Rad,
Hercules, CA). El tampón del ánodo consistía en
Tris-HCl 0,2 M, pH 8,9 y el tampón del cátodo
consistía en Tris-HCl 0,1 M, tricina 0,1 M, SDS al
0,1%, pH 8,25. Se mezclaron 10 \mul de cada una de las muestras
separadas anteriormente con 10 \mul de Tris-HCl 50
mM, SDS al 4% (p/v), sacarosa al 12% (p/v),
\beta-mercaptoetanol al 5% (v/v) y una traza de
azul de bromofenol pH 6,8. Tras la desnaturalización a 95ºC durante
5 min., se cargaron muestras sobre el gel. Se corrieron los geles a
80 V durante 3 horas. Tras la electroforesis, se fijaron los geles
en metanol al 40%, ácido acético al 10% durante 30 min. Después se
tiñeron los geles con azul de Coomassie coloidal G250 durante la
noche y se destiñeron en metanol al 30%. Se cortaron inmediatamente
las bandas que iban a identificarse, se colocaron en un tubo
Eppendorf y se mantuvieron a 4ºC hasta un análisis adicional. Se
determinaron las masas moleculares aparentes corriendo patrones de
peso molecular de polipéptidos: triosafosfato isomerasa PM 26.625;
mioglobina PM 16.950; \beta-lactalbúmina PM
14.437; aprotinina PM 6.512; cadena \beta de insulina, oxidada PM
3.496 y bacitracina PM 1.423 (Bio-Rad).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cortaron núcleos de geles que contenían
proteínas de interés para la digestión de proteínas con tripsina
usando procedimientos publicados previamente [3] y se modificaron
tal como se describe a continuación. En primer lugar, se destiñó el
trozo de gel con 100 \mul de bicarbonato de amonio 50 mM,
acetonitrilo al 30% (v/v) durante 15 min. a temperatura ambiente.
Se retiró la disolución de desteñido y se sustituyó por 25 \mul
de 1,4-ditioeritritol 10 mM en bicarbonato de amonio
50 mM y se incubó 35 min. a 56ºC. Después se sustituyó la
disolución de 1,4-ditioeritritol por 25 \mul de
yodoacetamida 55 mM en bicarbonato de amonio 50 mM y se incubó
durante 45 min. a temperatura ambiente en la oscuridad. Se lavaron
los trozos de gel durante 10 min. con 100 \mul de bicarbonato de
amonio 50 mM y durante 10 min. con 100 \mul de bicarbonato de
amonio 50 mM y acetonitrilo al 30% (v/v). Entonces se secaron los
trozos de gel durante 30 min. en una centrífuga de vacío Hetovac
(HETO, Allerod, Dinamarca). Se rehidrataron los trozos secados de
gel durante 45 min. a 4ºC en 5-20 \mul de una
disolución de bicarbonato de amonio 50 mM que contenía tripsina a
6,25 ng/\mul. Tras la incubación durante la noche a 37ºC, se
secaron los trozos de gel en una centrífuga de alto vacío antes de
rehidratarse por la adición de 20 \mul de agua destilada y
finalmente se secaron de nuevo en un aparato
speed-vac durante 30 min. Se realizó la extracción
de los péptidos con 20 \mul de ácido trifluoroacético (TFA) al
0,1% (v/v) durante 20 min. a temperatura ambiente con agitación
ocasional. Se transfirió la disolución de TFA que contenía los
péptidos a un tubo de polipropileno. Se realizó una segunda elución
con 20 \mul de TFA al 0,1% (v/v) en acetonitrilo al 50% (v/v)
durante 20 min. a temperatura ambiente con agitación ocasional. Se
reunió la segunda disolución de TFA con la primera. Se redujo el
volumen de los extractos reunidos hasta 1-2 \mul
mediante evaporación a vacío. Se realizaron extracciones control
(núcleos blancos) usando trozos de geles desprovistos de proteínas
teñidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se colocaron 1,5 \mul de muestra en una placa
objetivo de 100 pocillos para MALDI. Se añadieron volúmenes
idénticos de la matriz (ácido
\Box-ciano-4-hidroxicinámico
10 mg/ml en acetonitrilo al 50% (v/v), TFA al 0,1% (v/v)) al
digesto cargado previamente. Se secaron las muestras lo más
rápidamente posible usando un recipiente a vacío. Se realizaron
mediciones de masa de la disolución líquida con un espectrómetro de
masas de MALDI-TOF Voyager^{TM} Elite y super STR
(Applied Biosystems, Framingham, MA, EE.UU.) equipado con un láser
de nitrógeno de 337 nm. Se usó el analizador en el modo reflectrón
a un voltaje de aceleración de 20 kV, un parámetro de extracción
retardado de 100-140 ns y una puerta de masa baja de
850 Da. Se estableció la potencia del láser ligeramente por encima
del umbral (un 10-15% superior al umbral) para
producción de iones moleculares. Se obtuvieron espectros mediante
la suma de 10 a 256 disparos de láser consecutivos. Se extrajeron
las masas de los 60 picos más altos de los espectros y se usaron
para la identificación de proteínas usando la herramienta de huella
peptídica SmartIdent [4]. Se realizó la investigación con las bases
de datos SWISS-PROT y TrEMBL. Se restringió la
consulta a proteínas humanas, el número mínimo de masas coincidentes
era de 4, la tolerancia máxima para masas era de 50 ppm tras una
calibración interna usando producto de autolisis de tripsina, como
máximo se permitió una escisión perdida para péptidos trípticos, y
las modificaciones aceptadas eran carboximetilación con
yodoacetamida de cisteínas y oxidación artefactual de
metioninas.
\vskip1.000000\baselineskip
Q-TOF: Antes de la
separación por nano-LC, se ajustaron los volúmenes
de disoluciones que contenían péptidos hasta 7 \mul mediante
adición de una disolución de ácido fórmico al 0,1% (v/v). Se
depositaron las muestras en un inyector automático Triathlon
(Spack, Emmen, Holanda). Para cada experimento, se inyectaron 5
\mul de disolución que contenía péptidos en una columna de fase
inversa C18 de 75 \mum de diámetro interno
(YMS-ODS-AQ200, Michrom
Bioresource, Auburn, CA). Se eluyeron los péptidos con un gradiente
de acetonitrilo en presencia de ácido fórmico al 0,1% (v/v), usando
bombas SunFlow (SunChrom, Friedrichsdorf, Alemania). Se usó un
separador de flujo con el fin de disminuir la velocidad de flujo
tras las bombas desde 200 hasta 0,4 \mul/min. Se analizaron los
péptidos con un espectrómetro de masas Q-TOF
(Micromass, Wythenshawe, Inglaterra). Se aplicó una tensión de 2700
V en el capilar de nano-electrospray (New Objective,
Woburn, MA, EE.UU.). Se usó argón como gas de colisión. Se fijó la
energía de colisión en función de la masa de iones precursora. Se
obtuvieron espectros de EM/EM mediante cambio automático entre el
modo EM y EM/EM. Se convirtieron los datos de EM/EM obtenidos en un
formato compatible (archivos DTA) mediante el software ProteinLynx
(Micromass, Wythenshawe, Inglaterra) y se analizaron usando el
motor de búsqueda MASCOT (http://www.matrixscience.com) con las
bases de datos SWISS-PROT, TrEMBL, NCBInr y EST. En
casos de interpretación manual de los datos de EM/EM, se realizó la
identificación mediante búsqueda de sólo secuencias usando el motor
de búsqueda ProteinInfo de PROWL (http://prowl.rockefeller.edu).
MALDI-TOF/TOF: también se
realizaron análisis de EM y EM/EM en la estación de trabajo Voyager
TOF/TOF^{TM} de Applied Biosystems, que usa un láser Nd:YAG de
200 Hz que funciona a 355 nm. Durante el análisis de EM/EM, se usó
aire como gas de colisión. Se obtuvieron espectros mediante
acumulación de 200 a 2000 disparos de láser consecutivos. Se
realizó la recogida de picos automáticamente usando el software Data
Explorer. Se calculó la resolución de pico usando el software Data
Explorer, aplicándose sólo una corrección de referencia a los datos
sin procesar. Se realizó la consulta para la especie bovina con un
número mínimo de masas coincidentes establecido como 4. La
tolerancia máxima para masas era de 50 ppm tras una calibración
interna usando productos de autolisis de tripsina, como máximo se
permitió una escisión perdida para péptidos trípticos, y las
modificaciones aceptadas eran
carbamidometil-cisteínas y oxidación artefactual de
metioninas. Se usaron las bases de datos SWISS-PROT
y TrEMBL para la búsqueda. Se llevaron a cabo los barridos de EM/EM,
con los mismos parámetros que se describieron previamente para la
investigación PMF, usando las herramientas de EM-TAG
o patrones de EM (http://prospector.ucsf.edu/) dependiendo del tipo
de barrido. Se estableció el error de pico precursor como
50-100 ppm y se definió la tolerancia de fragmentos
como 500-1500 ppm. No se completó la calibración
interna de los datos de EM/EM.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando el aparato COBAS MIRA plus automático, se
realizó la cuantificación de ApoC-III (kit de
N-Daiichi Auto para Apo C-III
(Instruchemie)). Se sometieron a prueba 30 muestras control y 29 de
plasma de accidente cerebrovascular (incluyendo 14 de tipo
hemorrágico, 13 de tipo isquémico y 2 de tipo desconocido). Los
resultados se muestran en la figura 10. La prueba de la t de
Student estadística no discriminó muestras de plasma de accidente
cerebrovascular frente a controles. Sin embargo, comparando la
cantidad de ApoC-III en las 14 de tipo hemorrágico y
las 13 de tipo isquémico, el valor de p de 0,0342 indicó una
expresión diferencial significativa de ApoC-III
entre las poblaciones. Por encima de 6,5 mg/dl (valor de corte), es
posible diagnosticar un accidente cerebrovascular isquémico con una
sensibilidad del 92,3% y una especificidad del 71,4%.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de realizar un análisis cuantitativo
de niveles plasmáticos de SAA en muestras control y de accidente
cerebrovascular, se usó un kit inmunonefelométrico
(N-látex SAA, Dade Behring). Se realizó la prueba en
un sistema de inmunoquímica IMMAGE®. Se realizó el análisis en 25
muestras de plasma de accidente cerebrovascular y 25 muestras
control sanas. El nivel plasmático de SAA es superior globalmente en
la población control (valor medio = 32,66 mg/l) en relación con la
población con accidente cerebrovascular (valor medio = 21,79
mg/l).
\vskip1.000000\baselineskip
[1] Laemmli, R.U., Nature
1970, 227, 680-5.
[2] Schagger, H. y Von Jagow, G.,
Anal. Biochem. 1987, 166, 368-79.
[3] Bienvenut, W. V., Sánchez, J.
C., Karmime, A., Rouge, V., Rose, K., et
al., Anal. Chem. 1999, 71, 4800-7.
[4] Gras, R., Muller, M.,
Gasteiger, E., Gay, S., Binz, P. A., et al.,
Electrophoresis 1999, 20, 3535-50.
Claims (10)
1. Método de diagnóstico de accidente
cerebrovascular o la posibilidad del mismo en un sujeto del que se
sospecha que padece de accidente cerebrovascular, que comprende
determinar la concentración de Apo C-III en una
muestra de líquido corporal extraída del sujeto.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la Apo C-III está contenida diferencialmente en el
líquido corporal de sujetos afectados por accidente cerebrovascular
y sujetos no afectados por accidente cerebrovascular, y el método
incluye determinar si la concentración de Apo C-III
en la muestra concuerda con un diagnóstico de accidente
cerebrovascular.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que se usa un anticuerpo frente a la Apo C-III en la
determinación de la concentración.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el líquido corporal es líquido
cefalorraquídeo, plasma, suero, sangre, lágrimas u orina.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la determinación de la
concentración de la Apo C-III se usa para determinar
si un accidente cerebrovascular diagnosticado es del tipo isquémico
o hemorrágico.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que comprende someter una muestra de líquido
corporal extraída del sujeto a espectrometría de masas, para
determinar de ese modo una cantidad de prueba de la Apo
C-III en la muestra, en la que la Apo
C-III está contenida diferencialmente en el líquido
corporal de sujetos afectados por accidente cerebrovascular y
sujetos no afectados por accidente cerebrovascular; y determinar si
la cantidad de prueba concuerda con un diagnóstico de accidente
cerebrovascular.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
la espectrometría de masas es espectrometría de masas con
desorción/ionización por láser.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 7, en el que se adsorbe la muestra en una sonda
que tiene una superficie de intercambio catiónico débil o aniónico
fuerte, hidrófoba, de captura por afinidad con metales inmovilizados
(IMAC) que puede unirse a la Apo C-III.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que se determina la Apo
C-III mediante espectrometría de masas de tiempo de
vuelo (EM-TOF) y desorción/ionización por láser
mejorada en superficie (SELDI).
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que se determina adicionalmente al
menos un polipéptido seleccionado de amiloide A sérico, Apo
C-I, fragmento de antitrombina III y Apo
A-I en la muestra.
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