JPH08178923A - リポタンパク質又はアポリポタンパク質の免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 リポタンパク質又はアポリポタンパク質の免
疫学的測定方法において、リポタンパク質又はアポリポ
タンパク質を含む被検試料をハロゲン化物を含む稀釈液
で稀釈したのち測定するリポタンパク質又はアポリポタ
ンパク質の免疫学的測定方法。 【効果】 通常の測定操作を変更することなく、高感度
かつ高精度で血清等のリポタンパク質又はアポリポタン
パク質を測定できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、動脈硬化等の臨床検査
上有用なリポタンパク質又はアポリポタンパク質の免疫
学的測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】リポタンパク質は、リン脂質、コレステ
ロール、トリグリセリド、遊離脂肪酸等の脂質と蛋白質
とからなる会合体であり、比重の低いものから順に、カ
イロミクロン、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、
低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク
質（ＨＤＬ）、超高比重リポタンパク質（ＶＨＤＬ）に
分けられている。

【０００３】一方、アポリポタンパク質はリポタンパク
質中の蛋白成分を指し、アポＡＩ、アポＡＩＩ、アポ
Ｂ、アポＣＩ、アポＣＩＩ、アポＣＩＩＩ、アポＥ、ア
ポ（ａ）、血清アミロイドＡ等が知られている。これら
のアポリポタンパク質は、コレステロールの代謝への関
与や実測データ等から、動脈硬化の成因に関わると考え
られているもの［ＡＩ、ＡＩＩ、Ｂ、ＣＩ、ＣＩＩ、
Ｅ、Ｌｐ（ａ）等］、機能は不明であるが炎症にともな
い急激に血中濃度の高まるもの（血清アミロイドＡ）、
アルツハイマー病への関与が考えられているもの（Ｅ
等）などの様々な機能を示す。したがってその定量は、
動脈硬化や糖尿病等の成人病の診断、炎症のモニタリン
グ等の臨床検査上有用である。

【０００４】このようなアポリポタンパク質の定量方法
としては、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、免疫比濁
法等の免疫学的測定法が考えられるが、これらの方法は
種々の問題点を有している。アポリポタンパク質は脂質
成分と会合し、リポタンパク質として存在している場合
が多く、抗原決定基はリポタンパク質の内部の外界と接
触していない部分に隠されており、そのままでは抗体と
反応できないことがある。特に、モノクロナール抗体や
抗ペプチド抗体を用いた場合は、その抗原決定部位が限
定されてしまうため、この傾向がより顕著になる。した
がって、アポリポタンパク質の種類や用いる抗体の種類
によっては、免疫学的測定に際して、隠れた抗原決定基
を露出させるための被検試料の前処理が必要となること
が多く、それについても種々の検討がなされている。

【０００５】例えば、通常ＨＤＬと会合した状態で存在
するアポリポタンパク質である血清アミロイドＡ（ＳＡ
Ａ）に免疫学的測定法を適用する場合には、熱処理、酸
又はアルカリ変性処理、疎水性溶媒による脱脂処理、塩
酸グアニジンや尿素等のタンパク質変性剤による処理、
界面活性剤処理等の前処理法が適用される［例えば、R.
Saile 等のClinical Chemistry,34 巻,9号,p1767-1771
(1988) 及びM.MarhaugのScandinavian Journal of Immu
nology,18 巻,p329-338(1983) 参照］。

【０００６】しかし、このような前処理法を適用して測
定する場合、通常の処理工程に前処理工程が付加される
ため工程が煩雑となり、しかもＳＡＡの定量が不完全な
場合がある。更に、他のリポタンパク質について上記し
た前処理方法を適用した場合には、タンパク質部分に不
可逆的な変性を生じさせ、測定精度を低下させることが
ある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、リポタンパ
ク質又はアポリポタンパク質の測定に際し、煩雑な前処
理工程を必要とせず、通常の免疫学的測定法をそのまま
適用することができ、しかも高感度かつ高精度で測定で
きる、リポタンパク質又はアポリポタンパク質の免疫学
的測定方法を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、免疫学的測定方法の一工程である稀釈工程におけ
る稀釈液の成分としてハロゲン化物を加え、更にその最
適濃度を設定することにより、前処理を不要とすること
ができ、しかも高感度かつ高精度でリポタンパク質又は
アポリポタンパク質を測定できることを見出し、本発明
を完成した。

【０００９】すなわち本発明は、リポタンパク質又はア
ポリポタンパク質の免疫学的測定方法において、リポタ
ンパク質又はアポリポタンパク質を含む被検試料をハロ
ゲン化物を含む稀釈液で稀釈したのち測定することを特
徴とするリポタンパク質又はアポリポタンパク質の免疫
学的測定方法を提供する。

【００１０】本発明の免疫学的測定方法に用いる稀釈液
は、ハロゲン化物を含むものであり、その他にも通常の
免疫学的測定方法における稀釈液成分、例えば、水、炭
酸ナトリウム、牛血清アルブミン、リン酸等の緩衝液等
を含むことができる。

【００１１】ハロゲン化物としては、臭化物及び沃化物
がより好ましく、さらにアルカリ金属臭化物及びアルカ
リ金属沃化物が特に好ましく、これらに該当するものと
しては、臭化カリウム、臭化ナトリウム、沃化カリウ
ム、沃化ナトリウム等を挙げることができる。

【００１２】稀釈液中におけるハロゲン化物の濃度はそ
の種類により異なる。例えば、臭化カリウムの場合に
は、好ましくは０．２〜１．５Ｍ、より好ましくは０．
５〜１．５Ｍ、更に好ましくは０．７５〜１．２Ｍであ
り；臭化ナトリウムの場合には、好ましくは１．０〜
６．０Ｍ、より好ましくは２．０〜５．５Ｍ、更に好ま
しくは４．０〜５．０Ｍであり；沃化カリウムの場合に
は、好ましくは０．２〜４．０Ｍ、より好ましくは１．
０〜３．０Ｍである。

【００１３】本発明の免疫学的測定法としては、放射免
疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラテ
ックス凝集法（ＬＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテッ
クス免疫比濁法（Ｌ−ＴＩＡ）等を挙げることができ、
これらの測定に際して用いることができる抗体として
は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等を挙げ
ることができ、更にＦａｂ等の抗体断片も用いることが
できる。なお、測定に際しては、被検試料を前記稀釈液
により１０倍以上に稀釈することが好ましい。本発明に
おける測定法は、被検試料の稀釈をハロゲン化物を含む
稀釈液を用いて行う以外は前記各免疫学的測定法の通常
の測定手順に従って行えばよい。

【００１４】測定可能な被検試料としては、全血、血
清、血漿、関節液、尿、胸水、腹水、骨髄、臓器抽出
液、細胞培養液等を挙げることができる。また、測定対
象のリポタンパク質としては、カイロミクロン、ＶＬＤ
Ｌ、ＬＤＬ、ＨＤＬ、ＶＨＤＬ、Ｌｐ（ａ）等を挙げる
ことができ、アポリポタンパク質としては、アポＡＩ、
アポＡＩＩ、アポＢ、アポＣＩ、アポＣＩＩ、アポＣＩ
ＩＩ、アポＥ、アポ（ａ）、血清アミロイドＡ等を挙げ
ることができる。

【００１５】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれらにより限定されるものではな
い。

【００１６】実施例１（ＳＡＡの分離精製） ＳＡＡは、ヒトプール血清を原料として、疎水クロマト
グラフィー（オクチルセファロースを使用）及びゲル濾
過クロマトグラフィーを用い、以下の方法により精製し
た。まず、オクチルセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマ
シア社製）約１００mlを詰めたカラム（直径２６mm×４
０cm）を、オクチルセファロースＣＬ−４Ｂの約２倍体
積のＰＢＳ［１５０mM ＮａＣｌ／１０mM リン酸緩衝
水溶液(pH7.2) ］により平衡化した。これに原料である
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）値１０mg／dl以上のヒト
プール血清５０mlを添加し、０．５Ｍ塩酸グアニジン／
３０％エチレングリコール／ＰＢＳ約３００mlを流して
不要な成分を除去した。その後、２．０Ｍ塩酸グアニジ
ン／３０％エチレングリコール／ＰＢＳを約３００ml流
して溶出させ、ピークの画分を回収し、この画分を以下
の精製処理に供した。なお、以上のカラム操作における
流速はすべて１．０ml／min であった。また、以上の操
作は室温で行い、以下の操作は４℃で行った。

【００１７】次に、前記画分約１００mlは、３リットル
の５mM炭酸アンモニウム水溶液を外液として透析し（外
液は５回交換）、塩酸グアニジン、エチレングリコール
及びＰＢＳを除去した。これをアミコン（グレースジャ
パン社製，ＴＹ膜使用）を用い、窒素ガスで１．７５気
圧かける限外濾過法で１．５mlに濃縮した。次に、この
試料に対し尿素を８Ｍになるように添加し、予め４００
mlの８Ｍ尿素／ＰＢＳで平衡化したセファクリルＳ−１
００ＨＲ（ファルマシア社製）を詰めたカラム（直径１
６mm×１００cm；ゲル充填量約１７０ml）にかけ、２５
０mlの８Ｍ尿素／ＰＢＳで溶出させ、ＳＡＡの分子量に
相当する画分を回収した。なお、以上のカラム操作にお
ける流速はすべて０．５ml／min であった。

【００１８】このようにして回収した画分約１５mlは、
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液３リットルを外液と
して透析し（外液は５回交換）、前記と同様の限外濾過
法で２mlまで濃縮し、精製ＳＡＡとした。この精製品
は、ＳＤＳ−１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけ、分子量マーカーを指標にして分子量約１２，００
０のバンドを確認した。一方、ＳＤＳ−１５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動後、ウエスタンブロットを行
い、ＳＡＡ蛋白を認識する抗アミロイドＡ蛋白質（Ａ
Ａ）モノクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製）により、ＳＡ
Ａの分子量に相当する位置に検出されるバンドを確認し
た。なお、ＡＡは、ＳＡＡのＮ末端側７６アミノ酸長の
配列と同一の配列からなるため、この抗体は、ＡＡ及び
ＳＡＡの両蛋白を認識することが判っている。更に、上
記電気泳動ゲルのクマシーブリリアントブルー染色品を
デンシトメーターにかけ、既知濃度の精製ＳＡＡの染色
度との比から、純度が９５％以上であることを確認し
た。

【００１９】実施例２（ＨＤＬ−ＳＡＡの調製） ＣＲＰ値１０mg／dl以上のヒトプール血清３５mlを原料
として、ＫＢｒによって密度調整した超遠心法（「血漿
リポタンパク」講談社，ｐ３４７−３７４，１９８３年
参照）を用い、密度１．１２５〜１．２１の画分を分離
回収した。この画分を、１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）／１mMＥＤＴＡ／０．０２％ＮａＮ₃ 水溶液１
リットルを外液として透析し（外液は４回交換）、セン
トリコン（グレースジャパン社製）で１．６mlに濃縮
し、ＨＤＬ−ＳＡＡとした。

【００２０】ＨＤＬ−ＳＡＡ中のＳＡＡの定量は、Gode
nir らの方法［Journal of Immunological Methods,83
巻、217-225(1985)］に基づいて次のようにして行った。
まず、ＨＤＬ−ＳＡＡと濃度既知の精製ＳＡＡ（タンパ
ク質濃度は牛血清アルブミンを標準として、ピアス社製
のＢＣＡキットにより定量）を同時にＳＤＳ−１５％ポ
リアクリルアミド電気泳動にかけ、生成したゲルをクマ
シーブリリアントブルーで染色した。次に、このゲルを
デンシトメーターにかけ、ＨＤＬ−ＳＡＡ中のＳＡＡに
相当するバンドの染色度と精製ＳＡＡの染色度の比か
ら、ＨＤＬ−ＳＡＡ中のＳＡＡ濃度を求めた。その結
果、ＨＤＬ−ＳＡＡ中のＳＡＡ濃度は３．０mg／mlであ
った。

【００２１】実施例３（抗ＳＡＡモノクローナル抗体の
作製） 精製ＳＡＡを免疫したマウスの脾臓細胞とマウスミエロ
ーマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４株とを細胞融合し、限界
稀釈法によるクローニングを繰り返し、精製ＳＡＡに特
異的な抗ＳＡＡモノクローナル抗体産生株ＳＡＡ０２−
１株とＳＡＡ０３−６株を樹立した。樹立した細胞株は
マウスの腹腔内で培養し、その腹水からプロテインＧ
（ファルマシア社製）を用い、モノクローナル抗体を精
製した。得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ
は、ＳＡＡ０２−１株由来のものはＩｇＧ２ａ，κ鎖、
ＳＡＡ０３−６株由来のものはＩｇＧ２ａ，λ鎖であっ
た。なお、免疫方法、細胞融合方法、クローニング方法
及び融合細胞の培養方法は、すべて「組織細胞化学」
（日本組織細胞化学会編，学際企画出版，１９８６年）
に記載の方法に従った。また、プロテインＧによる精製
は、ファルマシア社製の試薬に添付された方法に従っ
た。

【００２２】実施例４［エンザイムリンクドイムノソル
ベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）の稀釈測定曲線の作製］ ＥＬＩＳＡに用いる９６穴プレートは、実施例３で作製
した抗ＳＡＡモノクローナル抗体（５μｇ／ml；ＳＡＡ
０２−１株由来）を９６穴マイクロタイタープレートに
１穴当たり５０μｌずつ添加し、固相化したのち、４倍
稀釈のブロックエース（雪印乳業社製）でブロッキング
することにより作製した。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキ
シダーゼ，シグマ社製．タイプXII）標識抗体は、固相
化した抗体とは抗原認識部位の異なるモノクロナール抗
体（ＳＡＡ０３−６株由来）に対して、マレイミド法に
より作製した（「酵素免疫測定法」石川栄治ら編，第３
版，医学書院出版，１９８７年参照）。

【００２３】次に、精製ＳＡＡ、ＨＤＬ−ＳＡＡ及びＣ
ＲＰ高値血清を、稀釈液として１．０Ｍ ＫＢｒ／１％
ＢＳＡ／０．１Ｍ Ｎａ₂ ＣＯ₃ 水溶液を用いて、それ
ぞれ２倍ずつ段階稀釈した。これらの稀釈液を、前記方
法で作製した抗ＳＡＡ抗体固相プレートに、１穴当たり
５０μｌずつ添加し、室温で振とうしながら２時間反応
させた。ＰＢＳで洗浄後、１０倍稀釈したブロックエー
スで希釈したＨＲＰ標識抗体（稀釈倍率は製造ロットご
とに異なるが、この場合は２００倍稀釈とした）を５０
μｌずつ添加し、室温で振とうしながら１時間反応させ
た。ＰＢＳで洗浄後、５mg／ml ｏ−フェニレンジアミ
ン／０．０２％ Ｈ₂ Ｏ₂ ／０．１Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ４．５）を５０μｌずつ添加し、室温で１５分間
静置したのち、１Ｎ硫酸で反応を停止させ、波長４９２
nmの吸光度を測定した。この測定結果を図１に示す。ま
た、精製ＳＡＡ、ＨＤＬ−ＳＡＡ及びＣＲＰ高値血清を
１％ＢＳＡ／０．１Ｍ Ｎａ₂ ＣＯ₃ 水溶液で希釈した
ものについても同様に処理して、その吸光度を測定し
た。これらの測定結果を図２に示す。

【００２４】図１から明らかなとおり、各試料をＫＢｒ
を含む稀釈液で希釈した場合には、すべての試料が同等
の測定感度を示し、稀釈測定曲線の形状も一致してい
た。これは高濃度のＫＢｒを含む稀釈液で希釈した場合
には、ＨＤＬと会合したＳＡＡの液中における存在状態
が変化し、抗体との反応性が精製ＳＡＡに近づくことを
示している。これに対して図２から明らかなとおり、各
試料をＫＢｒを含まない稀釈液で稀釈した場合には、精
製ＳＡＡの稀釈測定曲線の吸光度が高い（高感度であ
る）のに比べ、ＨＤＬ−ＳＡＡ及びＣＲＰ高値血清の稀
釈測定曲線の吸光度は低かった。また、ＨＤＬ−ＳＡＡ
とＣＲＰ高値血清の稀釈測定曲線の形状は一致していた
が、精製ＳＡＡのそれとは明らかに異なっていた。これ
は、精製ＳＡＡとＨＤＬ−ＳＡＡ及びＣＲＰ高値血清と
では、抗原抗体反応の反応性が異なっていることを示し
ている。以上の結果から、ＫＢｒを含む稀釈液を用いた
本発明の測定方法がＨＤＬ−ＳＡＡの免疫学的測定法に
有効であることが確認できた。

【００２５】実施例５（稀釈液中のハロゲン化物濃度の
変化） ＫＢｒ濃度が、それぞれ０（対照）、０．２５、０．
５、０．７５、１．０及び１．５Ｍになるように調整し
たＫＢｒと１％ＢＳＡ／０．１Ｍ Ｎａ₂ ＣＯ₃とから
なる各稀釈液を用い、ＨＤＬ−ＳＡＡを希釈してＥＬＩ
ＳＡを行った。なお、測定試料の調製方法及びＥＬＩＳ
Ａの測定方法は実施例４と同様にして行った。測定結果
を図３に示す。

【００２６】図３から明らかなとおり、ＫＢｒ濃度と吸
光度の間には明らかな相関関係が認められた。ＫＢｒの
添加効果は、ＫＢｒ濃度が０．２〜１．５Ｍの範囲で確
認され、特に０．５〜１．５Ｍの範囲で、更に０．７５
〜１．２Ｍの範囲でより顕著であった。

【００２７】実施例６（稀釈液中に含有させるＫＢｒ以
外のハロゲン化物の効果） ＫＢｒに代えてＮａＢｒ又はＫＩを用い、実施例５と同
様にしてＥＬＩＳＡを行った。なお、濃度は０（対
照）、０．５、１．０、２．０、３．０及び４．０Ｍと
した。結果を図４（ＮａＢｒ）及び図５（ＫＩ）に示
す。

【００２８】図４及び図５から明らかなとおり、ＮａＢ
ｒ又はＫＩを含む稀釈液で希釈した場合は、対照と比べ
ると吸光度が高く、ＨＤＬ−ＳＡＡの測定に有効である
ことが確認できた。ＮａＢｒ又はＫＩの添加効果は、Ｎ
ａＢｒの場合は１．０〜６．０Ｍの範囲で確認され、特
に２．０〜５．５Ｍの範囲で、更に４．０〜５．０Ｍの
範囲で顕著であり、ＫＩの場合は０．２〜４．０Ｍの範
囲で、特に１．０〜３．０Ｍの範囲で顕著であった。

【００２９】実施例７（ＥＬＩＳＡにおける添加回収試
験） 添加回収試験用の試料としては、ＨＤＬ−ＳＡＡ（ＳＡ
Ａ濃度１mg／ml）１容をベース血清（健常人血清）９容
に添加したＳＡＡ添加血清を用いた。また、１０mMトリ
ス−ＨＣｌ（pH７．５）／１mM ＥＤＴＡ／０．０２％
ＮａＮ₃水溶液１容をベース血清９容に添加した試料を
対照用試料１とし、ＨＤＬ−ＳＡＡ（ＳＡＡ濃度１mg／
ml）１容を１０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．５）／１mM
ＥＤＴＡ／０．０２％ＮａＮ₃水溶液９容に添加した試
料を対照用試料２とした。標準抗原としては、ＨＤＬ−
ＳＡＡを１％ＢＳＡ／５０mMリン酸ナトリウム緩衝水溶
液でＳＡＡ濃度が３００μｇ／mlになるように希釈した
のち、更に同緩衝水溶液で２倍ずつ段階稀釈したものを
用いた。その後、これらの試料及び標準抗原は、１．２
Ｍ ＫＢｒ／１％ＢＳＡ／５０mMリン酸ナトリウム緩衝
水溶液で５０倍稀釈し、更に同緩衝水溶液で２００倍稀
釈し、試験に供した。なお、１．２Ｍ ＫＢｒ／１％Ｂ
ＳＡ／０．１Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃水溶液の効果を確認するた
め、標準抗原用の稀釈液に１％ＢＳＡ／０．１Ｍ Ｎａ
₂ＣＯ₃水溶液を用いたものを比較例とした。これらの各
試料について、実施例４と同様の方法で測定を行った。
それらのうち、標準抗原についての測定結果を図６に示
す。

【００３０】次に、図６を検量線として、各試料の吸光
度からそれらのＳＡＡ濃度を換算し、更に添加回収率を
算出した。なお、検量線は各稀釈液に対応するものをそ
れぞれ用い、添加回収率は次式から求めた。

【００３１】

【数１】

【００３２】ＳＡＡ添加血清、対照用試料１及び対照用
試料２についてのＳＡＡ濃度及び添加回収率を表１に示
す。

【００３３】

【表１】

【００３４】図６から明らかなとおり、１．２Ｍ ＫＢ
ｒ／１％ＢＳＡ／０．１Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃水溶液を稀釈液
とした場合には、検量線は設定した標準抗原である３０
０μｇ／mlまで吸光度が段階的に上昇しており、その値
も１％ＢＳＡ／５０mMリン酸ナトリウム緩衝水溶液を稀
釈液とした場合に比べてはるかに高かった。また、表１
から明らかなとおり、回収率も１００％以上と優れてい
た。これに対して、１％ＢＳＡ／５０mMリン酸ナトリウ
ム緩衝水溶液を稀釈液とした場合の検量線は、ＳＡＡ濃
度が４０μｇ／mlが検出の限界であり、それ以上抗原の
濃度を高くしても吸光度の上昇はほとんど見られなかっ
た。また、１％ＢＳＡ／５０mMリン酸ナトリウム緩衝水
溶液を稀釈液とした場合には、添加したＨＤＬ−ＳＡＡ
は４３％しか回収されていなかった。以上の結果から、
稀釈液としてＫＢｒを含む水溶液を用いることにより、
ＳＡＡが高感度かつ高精度で測定できることが確認でき
た。

【００３５】実施例８［ラテックス凝集法（ＬＡ法）に
おける効果］ 感作ラテックスは、実施例３で得られた２種のモノクロ
ナール抗体について、それぞれ別々に以下のようにして
作製した。まず、平均粒径０．２２μｍの１０％ラテッ
クス浮遊液（積水化学社製）の最終濃度が１％となり、
精製抗体の最終濃度が１mg／mlとなり、全体の容量が１
mlとなるように、１０mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）／１５０mM ＮａＣｌ水溶液で調整した。この溶液
を一晩振とう後、遠心分離（１８０００ＸＧ，１５分
間，４℃）してラテックスを沈殿させ、１mlの１％ＢＳ
Ａ／１０mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１５０mM
ＮａＣｌ水溶液で再懸濁し、３７℃で２時間振とうし
ブロッキングした。再度前記と同条件で遠心分離したの
ち、１mlの０．２％ＢＳＡ／１０mM トリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）／１５０mM ＮａＣｌ水溶液で懸濁し、
洗浄した。この洗浄を２回行ったのち、１mlの０．２％
ＢＳＡ／１０mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１５
０mM ＮａＣｌ水溶液で懸濁し、ブランソン社製の超音
波破砕装置ソニファイヤー２５０を用い、サイクル１
０、出力コントロール２で５分間超音波処理し、ラテッ
クスを分散させ、感作ラテックス試薬とした。測定試料
は、ＳＡＡ濃度が５００μｇ／mlのＨＤＬ−ＳＡＡ／Ｐ
ＢＳを１．２Ｍ ＫＢｒ／１％ＢＳＡ／０．１Ｍ Ｎａ
₂ＣＯ₃水溶液で倍々希釈して調製した。また、対照とし
て、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで同様に希釈したものを用意し
た。ＬＡ法は、凝集板（フナコシ社製）上に、２種の感
作ラテックスと稀釈試料をそれぞれ１０μｌずつ取り、
混ぜ合わせて、板をゆっくり振とうさせながら、凝集状
態を観察することにより行った。

【００３６】その結果、稀釈液として１．２Ｍ ＫＢｒ
／１％ＢＳＡ／０．１Ｍ Ｎａ₂ ＣＯ₃ 水溶液を用いた
場合は、７．８μｇ／mlまで凝集が認められた。これに
対して、稀釈液として１％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いた場合
は、１５．６μｇ／mlまでしか凝集が認められなかっ
た。この結果から、本発明の測定方法は、ＬＡ法におい
ても有効であることが示された。

【００３７】実施例９［Ｌｐ（ａ）の測定系における効
果］ Ｌｐ（ａ）の測定は、ティントエリーゼ（バイオプール
社製，コスモバイオ社販売）を用いて、試料の稀釈液の
み、１．０Ｍ ＫＢｒ／１％ＢＳＡ／０．１ＭＮａ₂ Ｃ
Ｏ₃ 水溶液及び１％ＢＳＡ／０．１Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃水溶
液の各稀釈液をキット添付の稀釈液と置き換えて行っ
た。測定試料は、健常人血清（検体１、検体２）、Ｌｐ
（ａ）高値血清（検体３）を用い、試薬に添付された方
法に従って以下のようにして測定を行った。

【００３８】ヤギ抗アポ（ａ）抗体結合プレートの各穴
に各稀釈液１００μｌを入れたのち、各稀釈液で希釈し
た稀釈標準抗原及び稀釈検体２０μｌを加え、振とうし
ながら２時間反応させた。洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ア
ポ（ａ）抗体１２５μｌを加え、１時間反応させた。洗
浄後、発色試薬２００μｌを加え、１５分間反応させた
のち、更に５０μｌの反応停止薬を加え、吸光度を測定
した。結果を表２に示す。

【００３９】

【表２】

【００４０】表２から明らかなとおり、本発明の測定方
法は、Ｌｐ（ａ）の測定においても有効であることが示
された。

【００４１】

【発明の効果】本発明の免疫学的測定方法によれば、高
感度かつ高精度でリポタンパク質又はアポリポタンパク
質を測定することができる。また、本発明の免疫学的測
定方法によれば、通常の測定操作をそのまま適用するこ
とができ、測定操作の手順を変える必要もなく、煩雑な
前処理も不要となるため、操作が簡便で測定に要する労
力を軽減できる。本発明の免疫学的測定方法は、臨床検
査等の分野における分析手段として非常に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＫＢｒを含む稀釈液で希釈した各試料のＥＬＩ
ＳＡによる測定曲線を示す図である。

【図２】ＫＢｒを含まない稀釈液で希釈した各試料のＥ
ＬＩＳＡによる測定曲線を示す図である。

【図３】稀釈液中のＫＢｒ濃度を変化させた場合のＨＤ
Ｌ−ＳＡＡの測定値に及ぼす影響を示す図である。

【図４】稀釈液中のＮａＢｒ濃度を変化させた場合のＨ
ＤＬ−ＳＡＡの測定値に及ぼす影響を示す図である。

【図５】稀釈液中のＫＩ濃度を変化させた場合のＨＤＬ
−ＳＡＡの測定値に及ぼす影響を示す図である。

【図６】ＫＢｒを含む稀釈液で希釈した場合のＥＬＩＳ
Ａの検量線を示す図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リポタンパク質又はアポリポタンパク質
   の免疫学的測定方法において、リポタンパク質又はアポ
   リポタンパク質を含む被検試料をハロゲン化物を含む稀
   釈液で稀釈したのち測定することを特徴とするリポタン
   パク質又はアポリポタンパク質の免疫学的測定方法。
2. 【請求項２】 ハロゲン化物が、アルカリ金属臭化物又
   はアルカリ金属沃化物である請求項１記載のリポタンパ
   ク質又はアポリポタンパク質の免疫学的測定方法。