JPH08178921A - 血清アミロイドａの免疫学的測定方法 - Google Patents
血清アミロイドａの免疫学的測定方法Info
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- JPH08178921A JPH08178921A JP31813094A JP31813094A JPH08178921A JP H08178921 A JPH08178921 A JP H08178921A JP 31813094 A JP31813094 A JP 31813094A JP 31813094 A JP31813094 A JP 31813094A JP H08178921 A JPH08178921 A JP H08178921A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 血清アミロイドＡの免疫学的測定方法におい
て、血清アミロイドＡを含む被検試料を親水性アルコー
ルを含む稀釈液で稀釈したのち測定する血清アミロイド
Ａの免疫学的測定方法。 【効果】 通常の測定操作を変更することなく、高感度
かつ高精度で血清等の血清アミロイドＡを測定できる。
て、血清アミロイドＡを含む被検試料を親水性アルコー
ルを含む稀釈液で稀釈したのち測定する血清アミロイド
Ａの免疫学的測定方法。 【効果】 通常の測定操作を変更することなく、高感度
かつ高精度で血清等の血清アミロイドＡを測定できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、炎症等の臨床検査上有
用な血清アミロイドＡの免疫学的測定方法に関する。
用な血清アミロイドＡの免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）は、分子量
約１１，６００の非常に疎水性の高いタンパク質で、ア
ミノ酸配列の違いから、ＳＡＡ１、ＳＡＡ１desArg、Ｓ
ＡＡ２α、ＳＡＡ２αdesArg、ＳＡＡ２β、ＳＡＡ２β
desArg、ＳＡＡ３、ＳＡＡ４と様々なタイプのものが存
在している。
約１１，６００の非常に疎水性の高いタンパク質で、ア
ミノ酸配列の違いから、ＳＡＡ１、ＳＡＡ１desArg、Ｓ
ＡＡ２α、ＳＡＡ２αdesArg、ＳＡＡ２β、ＳＡＡ２β
desArg、ＳＡＡ３、ＳＡＡ４と様々なタイプのものが存
在している。
【０００３】ＳＡＡは、生体に感染、腫瘍及び外傷等の
種々のストレスが加わり、それに起因して炎症が生じた
際に、血中における濃度が鋭敏に増加するという性質を
もっている。このため、しばしば炎症の程度を知るため
の炎症マーカーとして、血中のＳＡＡ濃度が免疫学的測
定方法を用いて測定されている。
種々のストレスが加わり、それに起因して炎症が生じた
際に、血中における濃度が鋭敏に増加するという性質を
もっている。このため、しばしば炎症の程度を知るため
の炎症マーカーとして、血中のＳＡＡ濃度が免疫学的測
定方法を用いて測定されている。
【０００４】しかし、ＳＡＡは疎水性が高いためか、通
常血中ではほとんどが高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）
と会合しており、残部は他のリポタンパク質と会合した
り、他の親水性タンパク質と会合したりして存在してい
るものと示唆されている。このようにＳＡＡはリポタン
パク質と会合して存在しているため、抗原決定基はリポ
タンパク質の内部の外界と接触していない部分に隠され
ており、そのままでは抗体と反応できないことがある。
特に、モノクロナール抗体や抗ペプチド抗体を用いた場
合は、その抗原決定部位が限定されてしまうため、この
傾向がより顕著になる。したがって、用いる抗体の種類
によっては、免疫学的測定に際して、隠れた抗原決定基
を露出させるための被検試料の前処理が必要となること
が多く、それについても種々の検討がなされている。
常血中ではほとんどが高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）
と会合しており、残部は他のリポタンパク質と会合した
り、他の親水性タンパク質と会合したりして存在してい
るものと示唆されている。このようにＳＡＡはリポタン
パク質と会合して存在しているため、抗原決定基はリポ
タンパク質の内部の外界と接触していない部分に隠され
ており、そのままでは抗体と反応できないことがある。
特に、モノクロナール抗体や抗ペプチド抗体を用いた場
合は、その抗原決定部位が限定されてしまうため、この
傾向がより顕著になる。したがって、用いる抗体の種類
によっては、免疫学的測定に際して、隠れた抗原決定基
を露出させるための被検試料の前処理が必要となること
が多く、それについても種々の検討がなされている。
【０００５】例えば、通常ＨＤＬと会合した状態で存在
するＳＡＡに免疫学的測定法を適用する場合には、熱処
理、酸又はアルカリ変性処理、疎水性溶媒による脱脂処
理、塩酸グアニジンや尿素等のタンパク質変性剤による
処理、界面活性剤処理等の前処理法が適用される［例え
ば、R.Saile 等のClinical Chemistry,34 巻,9号,p1767
-1771(1988) 及びM.Marhaug のScandinavian Journal o
f Immunology,18 巻,p329-338(1983) 参照］。
するＳＡＡに免疫学的測定法を適用する場合には、熱処
理、酸又はアルカリ変性処理、疎水性溶媒による脱脂処
理、塩酸グアニジンや尿素等のタンパク質変性剤による
処理、界面活性剤処理等の前処理法が適用される［例え
ば、R.Saile 等のClinical Chemistry,34 巻,9号,p1767
-1771(1988) 及びM.Marhaug のScandinavian Journal o
f Immunology,18 巻,p329-338(1983) 参照］。
【０００６】しかし、このような前処理法を適用して測
定する場合、通常の処理工程に前処理工程が付加される
ため工程が煩雑となり、しかもＳＡＡの定量が不完全な
場合がある。
定する場合、通常の処理工程に前処理工程が付加される
ため工程が煩雑となり、しかもＳＡＡの定量が不完全な
場合がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＳＡＡの測
定に際し、煩雑な前処理工程を必要とせず、通常の免疫
学的測定法をそのまま適用することができ、しかも高感
度かつ高精度で測定できる、ＳＡＡの免疫学的測定方法
を提供することを目的とする。
定に際し、煩雑な前処理工程を必要とせず、通常の免疫
学的測定法をそのまま適用することができ、しかも高感
度かつ高精度で測定できる、ＳＡＡの免疫学的測定方法
を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、免疫学的測定方法の一工程である稀釈工程におけ
る稀釈液の成分として親水性アルコールを加え、更にそ
の最適濃度を設定することにより、前処理を不要とする
ことができ、しかも高感度かつ高精度でＳＡＡを測定で
きることを見出し、本発明を完成した。
結果、免疫学的測定方法の一工程である稀釈工程におけ
る稀釈液の成分として親水性アルコールを加え、更にそ
の最適濃度を設定することにより、前処理を不要とする
ことができ、しかも高感度かつ高精度でＳＡＡを測定で
きることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】本発明は、ＳＡＡの免疫学的測定方法にお
いて、ＳＡＡを含む被検試料を親水性アルコールを含む
稀釈液で稀釈したのち測定することを特徴とするＳＡＡ
の免疫学的測定方法を提供する。
いて、ＳＡＡを含む被検試料を親水性アルコールを含む
稀釈液で稀釈したのち測定することを特徴とするＳＡＡ
の免疫学的測定方法を提供する。
【００１０】本発明の免疫学的測定方法に用いる稀釈液
は、親水性アルコールを含むものであり、その他にも通
常の免疫学的測定方法における稀釈液成分を含むことが
できる。
は、親水性アルコールを含むものであり、その他にも通
常の免疫学的測定方法における稀釈液成分を含むことが
できる。
【００１１】親水性アルコールとしては、炭素数１〜３
の１〜３価のアルコールが好ましく、例えば、メタノー
ル、エタノール、プロパノール、グリセリン、エチレン
グリコール、プロピレングリコールを挙げることがで
き、これらの中でも１価のアルコール、特にメタノー
ル、エタノールが好ましい。これらのアルコールは１種
で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。こ
の親水性アルコールはそのまま単独で用いることもでき
るが、必要に応じて、水、リン酸等の緩衝水溶液、炭酸
ナトリウム等の塩類、牛血清アルブミンを含む水溶液と
混合して用いることもできる。
の１〜３価のアルコールが好ましく、例えば、メタノー
ル、エタノール、プロパノール、グリセリン、エチレン
グリコール、プロピレングリコールを挙げることがで
き、これらの中でも１価のアルコール、特にメタノー
ル、エタノールが好ましい。これらのアルコールは１種
で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。こ
の親水性アルコールはそのまま単独で用いることもでき
るが、必要に応じて、水、リン酸等の緩衝水溶液、炭酸
ナトリウム等の塩類、牛血清アルブミンを含む水溶液と
混合して用いることもできる。
【００１２】稀釈液中におけるこの親水性アルコールの
濃度はその種類により異なるが、通常は３０v/v ％以上
（以下における親水性アルコールの濃度はすべて「v/v
％」を示す）であることが好ましい。より具体的には、
例えばエタノールの場合には、３０％以上が好ましく、
特に好ましくは５０％以上であり、メタノールの場合に
は、５０％以上が好ましく、特に好ましくは７０％以上
である。
濃度はその種類により異なるが、通常は３０v/v ％以上
（以下における親水性アルコールの濃度はすべて「v/v
％」を示す）であることが好ましい。より具体的には、
例えばエタノールの場合には、３０％以上が好ましく、
特に好ましくは５０％以上であり、メタノールの場合に
は、５０％以上が好ましく、特に好ましくは７０％以上
である。
【００１３】本発明の免疫学的測定法としては、放射免
疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラテ
ックス凝集法（ＬＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテッ
クス免疫比濁法（Ｌ−ＴＩＡ）等を挙げることができ、
これらの測定に際して用いることができる抗体として
は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等を挙げ
ることができ、更にＦａｂ等の抗体断片も用いることが
できる。なお、測定に際しては、用いる抗体が高濃度の
親水性アルコールに耐性を有する場合には、親水性アル
コール溶液による被検試料の稀釈後、その希釈した試料
液をそのまま測定に供することができるが、耐性を有さ
ない場合には、反応系の抗体の変性を防ぐため、親水性
アルコール溶液による稀釈後、更にリン酸等の緩衝液や
炭酸水素ナトリウムのような塩類を含む水溶液で稀釈し
たのち、測定に供することが好ましい。また親水性アル
コールを含む溶液による被検試料の稀釈は通常１．４倍
以上となるように行うのが好ましい。さらに本発明の測
定法は被検試料の稀釈を親水性アルコールを含む液で行
う以外は前記各免疫学的測定法の通常の手順に従って行
えばよい。
疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラテ
ックス凝集法（ＬＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテッ
クス免疫比濁法（Ｌ−ＴＩＡ）等を挙げることができ、
これらの測定に際して用いることができる抗体として
は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等を挙げ
ることができ、更にＦａｂ等の抗体断片も用いることが
できる。なお、測定に際しては、用いる抗体が高濃度の
親水性アルコールに耐性を有する場合には、親水性アル
コール溶液による被検試料の稀釈後、その希釈した試料
液をそのまま測定に供することができるが、耐性を有さ
ない場合には、反応系の抗体の変性を防ぐため、親水性
アルコール溶液による稀釈後、更にリン酸等の緩衝液や
炭酸水素ナトリウムのような塩類を含む水溶液で稀釈し
たのち、測定に供することが好ましい。また親水性アル
コールを含む溶液による被検試料の稀釈は通常１．４倍
以上となるように行うのが好ましい。さらに本発明の測
定法は被検試料の稀釈を親水性アルコールを含む液で行
う以外は前記各免疫学的測定法の通常の手順に従って行
えばよい。
【００１４】測定可能な被検試料としては、全血、血
清、血漿、関節液、尿、胸水、腹水、骨髄、臓器抽出
液、細胞培養液等を挙げることができる。また、測定対
象のＳＡＡにはすべてのアイソタイプが含まれ、更に、
ＳＡＡは、ＳＡＡ単体、ＳＡＡ凝集体のほか、リポタン
パク質、脂質、タンパク質又は糖類と会合した状態のＳ
ＡＡも含まれる。
清、血漿、関節液、尿、胸水、腹水、骨髄、臓器抽出
液、細胞培養液等を挙げることができる。また、測定対
象のＳＡＡにはすべてのアイソタイプが含まれ、更に、
ＳＡＡは、ＳＡＡ単体、ＳＡＡ凝集体のほか、リポタン
パク質、脂質、タンパク質又は糖類と会合した状態のＳ
ＡＡも含まれる。
【００１５】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれらにより限定されるものではな
い。
するが、本発明はこれらにより限定されるものではな
い。
【００１６】実施例１（ＳＡＡの分離精製） ＳＡＡは、ヒトプール血清を原料として、疎水クロマト
グラフィー（オクチルセファロースを使用）及びゲル濾
過クロマトグラフィーを用い、以下の方法により精製し
た。まず、オクチルセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマ
シア社製）約１００mlを詰めたカラム（直径２６mm×４
０cm）を、オクチルセファロースＣＬ−４Ｂの約２倍体
積のＰＢＳ［１５０mM ＮａＣｌ／１０mM リン酸緩衝
水溶液(pH7.2) ］により平衡化した。これに原料である
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）値１０mg／dl以上のヒト
プール血清５０mlを添加し、０．５Ｍ塩酸グアニジン／
３０％エチレングリコール／ＰＢＳ約３００mlを流して
不要な成分を除去した。その後、２．０Ｍ塩酸グアニジ
ン／３０％エチレングリコール／ＰＢＳを約３００ml流
して溶出させ、ピークの画分を回収し、この画分を以下
の精製処理に供した。なお、以上のカラム操作における
流速はすべて１．０ml／min であった。また、以上の操
作は室温で行い、以下の操作は４℃で行った。
グラフィー（オクチルセファロースを使用）及びゲル濾
過クロマトグラフィーを用い、以下の方法により精製し
た。まず、オクチルセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマ
シア社製）約１００mlを詰めたカラム（直径２６mm×４
０cm）を、オクチルセファロースＣＬ−４Ｂの約２倍体
積のＰＢＳ［１５０mM ＮａＣｌ／１０mM リン酸緩衝
水溶液(pH7.2) ］により平衡化した。これに原料である
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）値１０mg／dl以上のヒト
プール血清５０mlを添加し、０．５Ｍ塩酸グアニジン／
３０％エチレングリコール／ＰＢＳ約３００mlを流して
不要な成分を除去した。その後、２．０Ｍ塩酸グアニジ
ン／３０％エチレングリコール／ＰＢＳを約３００ml流
して溶出させ、ピークの画分を回収し、この画分を以下
の精製処理に供した。なお、以上のカラム操作における
流速はすべて１．０ml／min であった。また、以上の操
作は室温で行い、以下の操作は４℃で行った。
【００１７】次に、前記画分約１００mlは、３リットル
の５mM炭酸アンモニウム水溶液を外液として透析し（外
液は５回交換）、塩酸グアニジン、エチレングリコール
及びＰＢＳを除去した。これをアミコン（グレースジャ
パン社製，ＴＹ膜使用）を用い、窒素ガスで１．７５気
圧かける限外濾過法で１．５mlに濃縮した。次に、この
試料に対し尿素を８Ｍになるように添加し、予め４００
mlの８Ｍ尿素／ＰＢＳで平衡化したセファクリルＳ−１
００ＨＲ（ファルマシア社製）を詰めたカラム（直径１
６mm×１００cm；ゲル充填量約１７０ml）にかけ、２５
０mlの８Ｍ尿素／ＰＢＳで溶出させ、ＳＡＡの分子量に
相当する画分を回収した。なお、以上のカラム操作にお
ける流速はすべて０．５ml／min であった。
の５mM炭酸アンモニウム水溶液を外液として透析し（外
液は５回交換）、塩酸グアニジン、エチレングリコール
及びＰＢＳを除去した。これをアミコン（グレースジャ
パン社製，ＴＹ膜使用）を用い、窒素ガスで１．７５気
圧かける限外濾過法で１．５mlに濃縮した。次に、この
試料に対し尿素を８Ｍになるように添加し、予め４００
mlの８Ｍ尿素／ＰＢＳで平衡化したセファクリルＳ−１
００ＨＲ（ファルマシア社製）を詰めたカラム（直径１
６mm×１００cm；ゲル充填量約１７０ml）にかけ、２５
０mlの８Ｍ尿素／ＰＢＳで溶出させ、ＳＡＡの分子量に
相当する画分を回収した。なお、以上のカラム操作にお
ける流速はすべて０．５ml／min であった。
【００１８】このようにして回収した画分約１５mlは、
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液３リットルを外液と
して透析し（外液は５回交換）、前記と同様の限外濾過
法で２mlまで濃縮し、精製ＳＡＡとした。この精製品
を、ＳＤＳ−１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけ、分子量マーカーを指標にして分子量約１２，００
０のバンドを確認した。一方、ＳＤＳ−１５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動後、ウエスタンブロットを行
い、ＳＡＡ蛋白を認識する抗アミロイドＡ蛋白質（Ａ
Ａ）モノクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製）により、ＳＡ
Ａの分子量に相当する位置に検出されるバンドを確認し
た。なお、ＡＡは、ＳＡＡのＮ末端側７６アミノ酸長の
配列と同一の配列からなるため、この抗体は、ＡＡ及び
ＳＡＡの両蛋白を認識することが判っている。更に、上
記電気泳動ゲルのクマシーブリリアントブルー染色品を
デンシトメーターにかけ、既知濃度の精製ＳＡＡの染色
度との比から、純度が９５％以上であることを確認し
た。
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液３リットルを外液と
して透析し（外液は５回交換）、前記と同様の限外濾過
法で２mlまで濃縮し、精製ＳＡＡとした。この精製品
を、ＳＤＳ−１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけ、分子量マーカーを指標にして分子量約１２，００
０のバンドを確認した。一方、ＳＤＳ−１５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動後、ウエスタンブロットを行
い、ＳＡＡ蛋白を認識する抗アミロイドＡ蛋白質（Ａ
Ａ）モノクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製）により、ＳＡ
Ａの分子量に相当する位置に検出されるバンドを確認し
た。なお、ＡＡは、ＳＡＡのＮ末端側７６アミノ酸長の
配列と同一の配列からなるため、この抗体は、ＡＡ及び
ＳＡＡの両蛋白を認識することが判っている。更に、上
記電気泳動ゲルのクマシーブリリアントブルー染色品を
デンシトメーターにかけ、既知濃度の精製ＳＡＡの染色
度との比から、純度が９５％以上であることを確認し
た。
【００１９】実施例２（ＨＤＬ−ＳＡＡの調製） ＣＲＰ値１０mg／dl以上のヒトプール血清３５mlを原料
として、ＫＢｒによって密度調整した超遠心法（「血漿
リポタンパク」講談社，ｐ３４７−３７４，１９８３年
参照）を用い、密度１．１２５〜１．２１の画分を分離
回収した。この画分を、１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）／１mMＥＤＴＡ／０．０２％ＮａＮ3 水溶液１
リットルを外液として透析し（外液は４回交換）、セン
トリコン（グレースジャパン社製）で１．６mlに濃縮
し、高密度リポタンパク質会合血清アミロイドＡ（ＨＤ
Ｌ−ＳＡＡ）とした。
として、ＫＢｒによって密度調整した超遠心法（「血漿
リポタンパク」講談社，ｐ３４７−３７４，１９８３年
参照）を用い、密度１．１２５〜１．２１の画分を分離
回収した。この画分を、１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）／１mMＥＤＴＡ／０．０２％ＮａＮ3 水溶液１
リットルを外液として透析し（外液は４回交換）、セン
トリコン（グレースジャパン社製）で１．６mlに濃縮
し、高密度リポタンパク質会合血清アミロイドＡ（ＨＤ
Ｌ−ＳＡＡ）とした。
【００２０】ＨＤＬ−ＳＡＡ中のＳＡＡの定量は、Gode
nir らの方法［Journal of Immunological Methods,83
巻、217-225(1985)］に基づいて次のようにして行った。
まず、ＨＤＬ−ＳＡＡと濃度既知の精製ＳＡＡ（タンパ
ク質濃度は牛血清アルブミンを標準として、ピアス社製
のＢＣＡキットにより定量）を同時にＳＤＳ−１５％ポ
リアクリルアミド電気泳動にかけ、生成したゲルをクマ
シーブリリアントブルーで染色した。次に、このゲルを
デンシトメーターにかけ、ＨＤＬ−ＳＡＡ中のＳＡＡに
相当するバンドの染色度と精製ＳＡＡの染色度の比か
ら、ＨＤＬ−ＳＡＡ中のＳＡＡ濃度を求めた。その結
果、ＨＤＬ−ＳＡＡ中のＳＡＡ濃度は３．０mg／mlであ
った。
nir らの方法［Journal of Immunological Methods,83
巻、217-225(1985)］に基づいて次のようにして行った。
まず、ＨＤＬ−ＳＡＡと濃度既知の精製ＳＡＡ（タンパ
ク質濃度は牛血清アルブミンを標準として、ピアス社製
のＢＣＡキットにより定量）を同時にＳＤＳ−１５％ポ
リアクリルアミド電気泳動にかけ、生成したゲルをクマ
シーブリリアントブルーで染色した。次に、このゲルを
デンシトメーターにかけ、ＨＤＬ−ＳＡＡ中のＳＡＡに
相当するバンドの染色度と精製ＳＡＡの染色度の比か
ら、ＨＤＬ−ＳＡＡ中のＳＡＡ濃度を求めた。その結
果、ＨＤＬ−ＳＡＡ中のＳＡＡ濃度は３．０mg／mlであ
った。
【００２１】実施例３（抗ＳＡＡモノクローナル抗体の
作製） 精製ＳＡＡを免疫したマウスの脾臓細胞とマウスミエロ
ーマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４株とを細胞融合し、限界
稀釈法によるクローニングを繰り返し、精製ＳＡＡに特
異的な抗ＳＡＡモノクローナル抗体産生株ＳＡＡ０２−
１株とＳＡＡ０３−６株を樹立した。樹立した細胞株は
マウスの腹腔内で培養し、その腹水からプロテインＧ
（ファルマシア社製）を用い、モノクローナル抗体を精
製した。得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ
は、ＳＡＡ０２−１株由来のものはＩｇＧ２ａ，κ鎖、
ＳＡＡ０３−６株由来のものはＩｇＧ２ａ，λ鎖であっ
た。なお、免疫方法、細胞融合方法、クローニング方法
及び融合細胞の培養方法は、すべて「組織細胞化学」
（日本組織細胞化学会編，学際企画出版，１９８６年）
に記載の方法に従った。また、プロテインＧによる精製
は、ファルマシア社製の試薬に添付された方法に従っ
た。
作製） 精製ＳＡＡを免疫したマウスの脾臓細胞とマウスミエロ
ーマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４株とを細胞融合し、限界
稀釈法によるクローニングを繰り返し、精製ＳＡＡに特
異的な抗ＳＡＡモノクローナル抗体産生株ＳＡＡ０２−
１株とＳＡＡ０３−６株を樹立した。樹立した細胞株は
マウスの腹腔内で培養し、その腹水からプロテインＧ
（ファルマシア社製）を用い、モノクローナル抗体を精
製した。得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ
は、ＳＡＡ０２−１株由来のものはＩｇＧ２ａ，κ鎖、
ＳＡＡ０３−６株由来のものはＩｇＧ２ａ，λ鎖であっ
た。なお、免疫方法、細胞融合方法、クローニング方法
及び融合細胞の培養方法は、すべて「組織細胞化学」
（日本組織細胞化学会編，学際企画出版，１９８６年）
に記載の方法に従った。また、プロテインＧによる精製
は、ファルマシア社製の試薬に添付された方法に従っ
た。
【００２２】実施例４［エンザイムリンクドイムノソル
ベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）の稀釈測定曲線の作製］ ＥＬＩＳＡに用いる９６穴プレートは、実施例３で作製
した抗ＳＡＡモノクローナル抗体（５μｇ／ml；ＳＡＡ
０２−１株由来）を９６穴マイクロタイタープレートに
１穴当たり５０μｌずつ添加し、固相化したのち、４倍
稀釈のブロックエース（雪印乳業社製）でブロッキング
することにより作製した。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキ
シダーゼ，シグマ社製．タイプXII）標識抗体は、固相
化した抗体とは抗原認識部位の異なるモノクロナール抗
体（ＳＡＡ０３−６株由来）に対して、マレイミド法に
より作製した（「酵素免疫測定法」石川栄治ら編，第３
版，医学書院出版，１９８７年参照）。
ベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）の稀釈測定曲線の作製］ ＥＬＩＳＡに用いる９６穴プレートは、実施例３で作製
した抗ＳＡＡモノクローナル抗体（５μｇ／ml；ＳＡＡ
０２−１株由来）を９６穴マイクロタイタープレートに
１穴当たり５０μｌずつ添加し、固相化したのち、４倍
稀釈のブロックエース（雪印乳業社製）でブロッキング
することにより作製した。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキ
シダーゼ，シグマ社製．タイプXII）標識抗体は、固相
化した抗体とは抗原認識部位の異なるモノクロナール抗
体（ＳＡＡ０３−６株由来）に対して、マレイミド法に
より作製した（「酵素免疫測定法」石川栄治ら編，第３
版，医学書院出版，１９８７年参照）。
【００２３】添加回収試験用の試料としては、ＨＤＬ−
ＳＡＡ（ＳＡＡ濃度１mg／ml）１容をベース血清（健常
人血清）９容に添加したＳＡＡ添加血清を用いた。ま
た、１０mM トリス−ＨＣｌ（pH７．５）／１mM ＥＤ
ＴＡ／０．０２％ ＮａＮ3水溶液１容をベース血清９
容に添加した試料を対照用試料１とし、ＨＤＬ−ＳＡＡ
（ＳＡＡ濃度１mg／ml）１容を１０mM トリス−ＨＣｌ
（pH７．５）／１mM ＥＤＴＡ／０．０２％ ＮａＮ3
水溶液９容に添加した試料を対照用試料２とした。標準
抗原としては、ＨＤＬ−ＳＡＡをＢＳ緩衝液（１％ＢＳ
Ａ／５０mMリン酸ナトリウム緩衝水溶液）でＳＡＡ濃度
が３００μｇ／mlになるように希釈したのち、更に前記
ＢＳ緩衝液で２倍ずつ段階希釈したものを用いた。その
後、これらの試料及び標準抗原は、まず第１稀釈液とし
ての８０％エタノール水溶液で５０倍に稀釈し、次に第
２稀釈液としてのＢＳ緩衝液で２００倍に稀釈した。な
お、エタノールの効果を確認するため、第１及び第２の
両稀釈液をいずれもＢＳ緩衝液としたものを比較例とし
た。
ＳＡＡ（ＳＡＡ濃度１mg／ml）１容をベース血清（健常
人血清）９容に添加したＳＡＡ添加血清を用いた。ま
た、１０mM トリス−ＨＣｌ（pH７．５）／１mM ＥＤ
ＴＡ／０．０２％ ＮａＮ3水溶液１容をベース血清９
容に添加した試料を対照用試料１とし、ＨＤＬ−ＳＡＡ
（ＳＡＡ濃度１mg／ml）１容を１０mM トリス−ＨＣｌ
（pH７．５）／１mM ＥＤＴＡ／０．０２％ ＮａＮ3
水溶液９容に添加した試料を対照用試料２とした。標準
抗原としては、ＨＤＬ−ＳＡＡをＢＳ緩衝液（１％ＢＳ
Ａ／５０mMリン酸ナトリウム緩衝水溶液）でＳＡＡ濃度
が３００μｇ／mlになるように希釈したのち、更に前記
ＢＳ緩衝液で２倍ずつ段階希釈したものを用いた。その
後、これらの試料及び標準抗原は、まず第１稀釈液とし
ての８０％エタノール水溶液で５０倍に稀釈し、次に第
２稀釈液としてのＢＳ緩衝液で２００倍に稀釈した。な
お、エタノールの効果を確認するため、第１及び第２の
両稀釈液をいずれもＢＳ緩衝液としたものを比較例とし
た。
【００２４】これらの各試料について、下記の方法で測
定を行った。各試料を前記方法で作製した抗ＳＡＡ抗体
固相化プレートに１穴当たり５０μｌずつ添加し、室温
で振とうしながら２時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、
１０倍稀釈したブロックエースで希釈したＨＲＰ標識抗
体（稀釈倍率はロットごとに異なるが、この場合は２０
０倍稀釈とした）を５０μｌずつ添加し、室温で振とう
しながら１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、５mg/ml
ｏ−フェニレンジアミン／０．０２％Ｈ2Ｏ2／０．１Ｍ
クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を５０μｌずつ添加
し、室温で１５分間静置したのち、１Ｎ硫酸で反応を停
止させ、波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。この測定
結果、即ち検量線を図１に示す。
定を行った。各試料を前記方法で作製した抗ＳＡＡ抗体
固相化プレートに１穴当たり５０μｌずつ添加し、室温
で振とうしながら２時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、
１０倍稀釈したブロックエースで希釈したＨＲＰ標識抗
体（稀釈倍率はロットごとに異なるが、この場合は２０
０倍稀釈とした）を５０μｌずつ添加し、室温で振とう
しながら１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、５mg/ml
ｏ−フェニレンジアミン／０．０２％Ｈ2Ｏ2／０．１Ｍ
クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を５０μｌずつ添加
し、室温で１５分間静置したのち、１Ｎ硫酸で反応を停
止させ、波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。この測定
結果、即ち検量線を図１に示す。
【００２５】図１から明らかなとおり、エタノールを含
む稀釈液で希釈した場合は、検量線は設定した標準抗原
である３００μｇ／mlまで吸光度が段階的に上昇してお
り、その値もＢＳ緩衝液のみの稀釈液の場合よりもはる
かに高かった。これに対して、ＢＳ緩衝液のみの稀釈液
で希釈した場合は、ＳＡＡ濃度４０μｇ／mlが検出の限
界であり、それ以上抗原の濃度を高くしても吸光度の上
昇はほとんど見られなかった。
む稀釈液で希釈した場合は、検量線は設定した標準抗原
である３００μｇ／mlまで吸光度が段階的に上昇してお
り、その値もＢＳ緩衝液のみの稀釈液の場合よりもはる
かに高かった。これに対して、ＢＳ緩衝液のみの稀釈液
で希釈した場合は、ＳＡＡ濃度４０μｇ／mlが検出の限
界であり、それ以上抗原の濃度を高くしても吸光度の上
昇はほとんど見られなかった。
【００２６】次に、図１を検量線として、各試料の吸光
度からそれらのＳＡＡ濃度を換算し、更に添加回収率を
算出した。なお、検量線は各稀釈液に対応するものをそ
れぞれ用い、添加回収率は次式から求めた。
度からそれらのＳＡＡ濃度を換算し、更に添加回収率を
算出した。なお、検量線は各稀釈液に対応するものをそ
れぞれ用い、添加回収率は次式から求めた。
【００２７】
【数１】
【００２８】ＳＡＡ添加血清、対照用試料１及び対照用
試料２についてのＳＡＡ濃度及び添加回収率を表１に示
す。
試料２についてのＳＡＡ濃度及び添加回収率を表１に示
す。
【００２９】
【表１】
【００３０】表１から明らかなとおり、エタノールを含
む稀釈液を用いた場合は、１００％以上の回収率が得ら
れた。これに対して、エタノールを含まない稀釈液を用
いた場合は、４３％しか回収されていなかった。
む稀釈液を用いた場合は、１００％以上の回収率が得ら
れた。これに対して、エタノールを含まない稀釈液を用
いた場合は、４３％しか回収されていなかった。
【００３１】以上の結果から、エタノールを含む稀釈液
を用いることにより、ＳＡＡが高感度かつ高精度で測定
できることが示された。
を用いることにより、ＳＡＡが高感度かつ高精度で測定
できることが示された。
【００３２】実施例５（ＥＬＩＳＡにおける種々の濃度
の親水性アルコール含有稀釈液の効果） 試料として、ＨＤＬ−ＳＡＡをＰＢＳでＳＡＡ濃度が１
mg／mlになるように稀釈したのち、更にＰＢＳで２倍ず
つ段階稀釈し、ＳＡＡ濃度を１０００、５００、２５
０、１２５、６３、３１、１６及び８μｇ／mlに調整し
たものを用いた。これらの試料を、第１稀釈液として、
濃度０％（対照）、３０％、５０％、７０％、８０％及
び１００％のメタノール又はエタノール水溶液（ただ
し、１００％は当然の如く水溶液ではない）を用い、第
２稀釈液として１％ＢＳＡ／５０mMリン酸ナトリウム緩
衝水溶液を用い、まず、第１稀釈液で１００倍稀釈し、
次に、第２稀釈液で更に１００倍希釈したのち、測定に
供した。測定は実施例４と同様の方法で行った。測定結
果を図２（第１稀釈液がメタノール）及び図３（第１稀
釈液がエタノール）に示す。
の親水性アルコール含有稀釈液の効果） 試料として、ＨＤＬ−ＳＡＡをＰＢＳでＳＡＡ濃度が１
mg／mlになるように稀釈したのち、更にＰＢＳで２倍ず
つ段階稀釈し、ＳＡＡ濃度を１０００、５００、２５
０、１２５、６３、３１、１６及び８μｇ／mlに調整し
たものを用いた。これらの試料を、第１稀釈液として、
濃度０％（対照）、３０％、５０％、７０％、８０％及
び１００％のメタノール又はエタノール水溶液（ただ
し、１００％は当然の如く水溶液ではない）を用い、第
２稀釈液として１％ＢＳＡ／５０mMリン酸ナトリウム緩
衝水溶液を用い、まず、第１稀釈液で１００倍稀釈し、
次に、第２稀釈液で更に１００倍希釈したのち、測定に
供した。測定は実施例４と同様の方法で行った。測定結
果を図２（第１稀釈液がメタノール）及び図３（第１稀
釈液がエタノール）に示す。
【００３３】図２及び図３から明らかなとおり、メタノ
ール濃度が０〜５０％未満の場合、エタノール濃度が０
〜３０％未満の場合は、いずれの場合も検出感度が低か
った。しかし、メタノール濃度が５０％以上、更に７０
％以上の場合及びエタノール濃度が３０％以上、更に５
０％以上の場合には、いずれの場合も検出感度が上昇し
ていた。また、メタノール、エタノールとも、濃度１０
０％の場合でも稀釈液として使用可能であった。
ール濃度が０〜５０％未満の場合、エタノール濃度が０
〜３０％未満の場合は、いずれの場合も検出感度が低か
った。しかし、メタノール濃度が５０％以上、更に７０
％以上の場合及びエタノール濃度が３０％以上、更に５
０％以上の場合には、いずれの場合も検出感度が上昇し
ていた。また、メタノール、エタノールとも、濃度１０
０％の場合でも稀釈液として使用可能であった。
【００３４】
【発明の効果】本発明の免疫学的測定方法によれば、高
感度かつ高精度でＳＡＡを測定することができる。ま
た、本発明の免疫学的測定方法によれば、通常の測定操
作をそのまま適用することができ、測定操作の手順を変
える必要もなく、煩雑な前処理も不要となるため、操作
が簡便で測定に要する労力を軽減できる。本発明の免疫
学的測定方法は、臨床検査等の分野における分析手段と
して非常に有用である。
感度かつ高精度でＳＡＡを測定することができる。ま
た、本発明の免疫学的測定方法によれば、通常の測定操
作をそのまま適用することができ、測定操作の手順を変
える必要もなく、煩雑な前処理も不要となるため、操作
が簡便で測定に要する労力を軽減できる。本発明の免疫
学的測定方法は、臨床検査等の分野における分析手段と
して非常に有用である。
【図１】８０％エタノールを含む稀釈液又は含まない稀
釈液で希釈したＳＡＡ標準抗原のＥＬＩＳＡの検量線を
示す図である。
釈液で希釈したＳＡＡ標準抗原のＥＬＩＳＡの検量線を
示す図である。
【図２】稀釈液中のメタノール濃度を変化させた時に、
ＨＤＬ−ＳＡＡの測定値に及ぼす影響を示す図である。
ＨＤＬ−ＳＡＡの測定値に及ぼす影響を示す図である。
【図３】稀釈液中のエタノール濃度を変化させた時に、
ＨＤＬ−ＳＡＡの測定値に及ぼす影響を示す図である。
ＨＤＬ−ＳＡＡの測定値に及ぼす影響を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年２月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
Claims (3)
- 【請求項１】 血清アミロイドＡの免疫学的測定方法に
おいて、血清アミロイドＡを含む被検試料を親水性アル
コールを含む稀釈液で稀釈したのち測定することを特徴
とする血清アミロイドＡの免疫学的測定方法。 - 【請求項２】 親水性アルコールが、メタノール又はエ
タノールである請求項１記載の血清アミロイドＡの免疫
学的測定方法。 - 【請求項３】 親水性アルコールの稀釈液中における濃
度が３０v/v ％以上である請求項１記載の血清アミロイ
ドＡの免疫学的測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31813094A JPH08178921A (ja) | 1994-12-21 | 1994-12-21 | 血清アミロイドａの免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31813094A JPH08178921A (ja) | 1994-12-21 | 1994-12-21 | 血清アミロイドａの免疫学的測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08178921A true JPH08178921A (ja) | 1996-07-12 |
Family
ID=18095847
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31813094A Pending JPH08178921A (ja) | 1994-12-21 | 1994-12-21 | 血清アミロイドａの免疫学的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08178921A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU711163B2 (en) * | 1995-07-21 | 1999-10-07 | Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin, The | Method for the quantitative measurement of human acute phase serum amyloid a protein; recombinant protein; specific antibody |
| WO2000007021A1 (fr) * | 1998-07-31 | 2000-02-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | Procede d'analyse d'un composant physiologiquement actif |
| WO2011040133A1 (ja) * | 2009-10-02 | 2011-04-07 | 学校法人 東京女子医科大学 | ヒト血清アミロイドａ３抗体およびその利用 |
| CN108680751A (zh) * | 2018-04-04 | 2018-10-19 | 苏州遵道生物科技有限公司 | 定量检测血清淀粉样蛋白a的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法 |
| WO2019177157A1 (ja) | 2018-03-16 | 2019-09-19 | 富士フイルム株式会社 | 試薬キット、測定キットおよび測定方法 |
| WO2020158835A1 (ja) * | 2019-01-31 | 2020-08-06 | 富士フイルム株式会社 | 試薬キット、測定キットおよび測定方法 |
| WO2020158836A1 (ja) | 2019-01-31 | 2020-08-06 | 富士フイルム株式会社 | 試薬キット、測定キットおよび測定方法 |
| CN111499727A (zh) * | 2020-06-01 | 2020-08-07 | 南京申基医药科技有限公司 | 一种稳定液体saa校准品的制备方法 |
-
1994
- 1994-12-21 JP JP31813094A patent/JPH08178921A/ja active Pending
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU711163B2 (en) * | 1995-07-21 | 1999-10-07 | Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin, The | Method for the quantitative measurement of human acute phase serum amyloid a protein; recombinant protein; specific antibody |
| WO2000007021A1 (fr) * | 1998-07-31 | 2000-02-10 | Mitsubishi Chemical Corporation | Procede d'analyse d'un composant physiologiquement actif |
| US6607891B1 (en) | 1998-07-31 | 2003-08-19 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method of assaying insulin-like growth factor |
| WO2011040133A1 (ja) * | 2009-10-02 | 2011-04-07 | 学校法人 東京女子医科大学 | ヒト血清アミロイドａ３抗体およびその利用 |
| CN102549014A (zh) * | 2009-10-02 | 2012-07-04 | 学校法人东京女子医科大学 | 人血清淀粉样蛋白a3抗体及其应用 |
| WO2019177157A1 (ja) | 2018-03-16 | 2019-09-19 | 富士フイルム株式会社 | 試薬キット、測定キットおよび測定方法 |
| CN108680751A (zh) * | 2018-04-04 | 2018-10-19 | 苏州遵道生物科技有限公司 | 定量检测血清淀粉样蛋白a的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备方法 |
| WO2020158835A1 (ja) * | 2019-01-31 | 2020-08-06 | 富士フイルム株式会社 | 試薬キット、測定キットおよび測定方法 |
| WO2020158836A1 (ja) | 2019-01-31 | 2020-08-06 | 富士フイルム株式会社 | 試薬キット、測定キットおよび測定方法 |
| JPWO2020158835A1 (ja) * | 2019-01-31 | 2021-11-04 | 富士フイルム株式会社 | 試薬キット、測定キットおよび測定方法 |
| JPWO2020158836A1 (ja) * | 2019-01-31 | 2021-11-04 | 富士フイルム株式会社 | 試薬キット、測定キットおよび測定方法 |
| CN111499727A (zh) * | 2020-06-01 | 2020-08-07 | 南京申基医药科技有限公司 | 一种稳定液体saa校准品的制备方法 |
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