WO2020158836A1 - 試薬キット、測定キットおよび測定方法 - Google Patents

試薬キット、測定キットおよび測定方法 Download PDF

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WO2020158836A1
WO2020158836A1 PCT/JP2020/003297 JP2020003297W WO2020158836A1 WO 2020158836 A1 WO2020158836 A1 WO 2020158836A1 JP 2020003297 W JP2020003297 W JP 2020003297W WO 2020158836 A1 WO2020158836 A1 WO 2020158836A1
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WO
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serum amyloid
group
optionally substituted
binding substance
particles
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PCT/JP2020/003297
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English (en)
French (fr)
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中村　和浩
亮 大内
武尊 繁村
Original Assignee
富士フイルム株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Definitions

  • the present invention relates to a reagent kit for measuring serum amyloid A, a measurement kit for serum amyloid A, and a method for measuring serum amyloid A in a biological sample.
  • Fluorescence detection method has been widely used as a highly sensitive and easy measurement method in bio measurement and the like.
  • This fluorescence detection method is the presence of the detection target substance by irradiating the sample considered to contain the detection target substance that is excited by light of a specific wavelength to emit fluorescence with the excitation light of the specific wavelength, and detecting fluorescence at that time. Is the way to check.
  • the substance to be detected is not a fluorophore
  • a substance that is labeled with a fluorescent dye and specifically binds to the substance to be detected is brought into contact with the sample, and then fluorescence is detected in the same manner as described above, thereby It is also widely made to confirm the presence of the substance to be detected.
  • Patent Document 1 a method of utilizing the effect of electric field enhancement by plasmon resonance in order to improve the sensitivity is proposed in Patent Document 1 and the like.
  • this is provided with a sensor chip in which a metal layer is provided in a predetermined region on a transparent support, and the interface between the support and the metal film is opposite to the metal layer forming surface of the support. From the surface side, excitation light is made incident at a predetermined angle equal to or more than the total reflection angle, the surface plasmon is generated in the metal layer by the irradiation of the excitation light, and the electric field enhancing action enhances fluorescence, thereby increasing signal/noise ( S/N) is improved.
  • S/N signal/noise
  • Serum Amyloid A also referred to as SAA
  • SAA Serum Amyloid A
  • SAA concentration in blood is often measured using an immunological measurement method as an inflammation marker for knowing the degree of inflammation.
  • SAA high-density lipoprotein
  • HDL high-density lipoprotein
  • the SAA antigenic determinant is hidden inside the lipoprotein in a portion that is not in contact with the outside world, and may not be able to react with the antibody as it is. Therefore, immunological measurements often require pretreatment to expose hidden antigenic determinants.
  • Patent Document 2 has found that SAA can be measured with high sensitivity and accuracy by adding a hydrophilic alcohol as a component of a diluent in a dilution step, which is one step of an immunological measurement method.
  • Patent Document 3 discloses an antibody which reacts with SAA contained in a fraction having a molecular weight of 10 to 40 kD, which can be obtained by fractionating serum containing high-density lipoprotein and SAA by gel filtration under non-denaturing conditions. Have been described.
  • Patent Document 4 describes that for this dissociated sample, replacing a part of the blocking agent on the surface of the fluorescent particles with BSA with an anti-CRP antibody that is a dummy antibody is a powerful improvement method. ..
  • Patent Document 2 when SAA is measured by adding a hydrophilic alcohol, which is described in Patent Document 2, there is a problem that the alcohol concentration easily changes due to volatilization, and SAA cannot be accurately quantified. Further, in Patent Document 3, there is a problem that a special antibody purification method is required. Although the improvement method described in Patent Document 4 is effective, there are some samples that cannot prevent deviation even with such a method, and it is desired to improve the deviation of this sample.
  • a first object of the present invention is to provide a reagent kit, a measurement kit, and a measurement method for immunologically and accurately measuring SAA without using alcohol, which is also a dangerous substance under the Fire Defense Law. That is.
  • the second problem of the present invention for a sample that greatly deviates from the measured value of the control method that cannot be solved by the conventional method, can suppress the deviation from the measured value of the control method, a reagent kit, a measurement kit, and It is to provide a measuring method.
  • first particles modified with a first binding substance having a specific binding property to serum amyloid A and having a label and at least one kind of
  • the above problems can be solved by using a nonionic surfactant having a molecular weight of 1,000 or less in combination with a buffer capable of adjusting the pH of the reaction solution to 5.5 to 7.0 or 8.5 to 9.0. They have found that they can do so and have completed the present invention.
  • a reagent kit for measuring serum amyloid A which comprises a buffer capable of adjusting the pH of the reaction solution to 5.5 to 7.0 or 8.5 to 9.0.
  • the reagent kit according to [1] wherein the surfactant is a compound having a glucamine skeleton.
  • R 1 represents an optionally substituted hydrocarbon group
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are each independently a hydrogen atom or an optionally substituted hydrocarbon. Indicates a group. However, at least three of R 2 , R 3 , R 4 , R 5, and R 6 are hydrogen atoms.
  • R 7 represents an optionally substituted hydrocarbon group.
  • R 11 is an optionally substituted alkoxy group, an optionally substituted alkenyloxy group, an optionally substituted alkynyloxy group, an optionally substituted alkylthio group, or an optionally substituted A good alkenylthio group or an optionally substituted alkynylthio group
  • R 12 , R 13 , R 14 and R 15 each independently represent a hydrogen atom or an optionally substituted hydrocarbon group. However, at least three of R 12 , R 13 , R 14 and R 15 are hydrogen atoms.
  • R 21 is an optionally substituted alkoxy group, an optionally substituted alkenyloxy group, an optionally substituted alkynyloxy group, an optionally substituted alkylthio group, or an optionally substituted A good alkenylthio group or an optionally substituted alkynylthio group, and R 22 , R 23 , R 24 , R 25 , R 26 , R 27 and R 28 are each independently a hydrogen atom or a substituted one. Represents a good hydrocarbon group. However, at least three of R 22 , R 23 , R 24 , R 25 , R 26 , R 27, and R 28 are hydrogen atoms.
  • Reagent kit. The reagent kit according to any one of [1] to [11], wherein the buffer is 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid or N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine.
  • a measurement kit for serum amyloid A comprising a substrate on which one metal film is formed.
  • a second metal film having a fourth binding substance that has no binding property with serum amyloid A and has a specific binding property with the first binding substance is further formed on the substrate.
  • a method for measuring serum amyloid A in a biological sample comprising: [16] The method for measuring serum amyloid A according to [15], wherein the concentration of the surfactant in the mixed solution is 0.01% by mass or more and 10% by mass or less. [17] The serum amyloid according to [15] or [16], wherein the mixed solution is diluted with physiological saline at a dilution ratio of 4 times or more and 100 times or less before adding the mixed solution to the inlet.
  • SAA can be accurately and highly sensitively measured immunologically.
  • FIG. 1 shows a schematic view of a sensor chip.
  • FIG. 2 shows an exploded view of the sensor chip.
  • the numerical range indicated by using “to” means a range including the numerical values before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • the reagent kit of the present invention is First particles modified with a first binding substance having a specific binding property to serum amyloid A and having a label; At least one nonionic surfactant having a molecular weight of 1000 or less, A buffer capable of adjusting the pH of the reaction solution to 5.5 to 7.0 or 8.5 to 9.0, A reagent kit for measuring serum amyloid A, which comprises and.
  • the reagent kit of the present invention contains the first particles, the nonionic surfactant, and the buffer, but the first particles, the nonionic surfactant, and the buffer are contained in the kit as a mixture. It may be contained in the kit, or may be separately contained in the kit.
  • serum amyloid A The test substance in the present invention is serum amyloid A (SAA). SAA is useful as an inflammation marker. Examples of serum amyloid A include serum amyloid A in cat serum or cat plasma.
  • the surfactant used in the present invention is a nonionic surfactant having a molecular weight of 1000 or less. If the molecular weight of the nonionic surfactant exceeds 1000, it may block the site recognized as a sample like HDL, and it may not be possible to accurately measure SAA. Use 1000 or less nonionic surfactant.
  • the lower limit of the molecular weight of the surfactant is preferably 200 or more, more preferably 300 or more.
  • the upper limit of the molecular weight of the surfactant is preferably 900 or less, more preferably 800 or less, still more preferably 700 or less, and particularly preferably 600 or less.
  • a nonionic surfactant that does not relatively affect the binding property of the binding substance is used.
  • an ionic surfactant it may affect the measurement by interacting with a charged group in a biological sample, which makes it difficult to measure SAA accurately.
  • a nonionic surfactant is used.
  • the nonionic surfactant may be referred to as a nonionic surfactant by another name.
  • the anionic surfactant may be described as an anionic surfactant
  • the cationic surfactant may be described as a cationic surfactant
  • the zwitterionic surfactant may be described as betaine.
  • a nonionic surfactant that is, a nonionic surfactant is used.
  • a surfactant selected from ester type, ether type, ester ether type or alkanolamide type is preferable, and ether type or alkanolamide type is more preferable.
  • a compound having a glucamine skeleton particularly an alkanolamide type surfactant having a glucamine skeleton is more preferable.
  • a preferable example of the alkanolamide type nonionic surfactant having a glucamine skeleton is a compound represented by the following formula (1).
  • R 1 represents an optionally substituted hydrocarbon group
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are each independently a hydrogen atom or an optionally substituted hydrocarbon. Indicates a group. However, at least three of R 2 , R 3 , R 4 , R 5, and R 6 are hydrogen atoms.
  • R 7 represents an optionally substituted hydrocarbon group.
  • R 1 and R 7 have the same definitions as in formula (1).
  • formula (1A) or formula (1B) the following surfactants are preferably used.
  • n-Octanoyl-N-methyl-D-glucamine MEGA-8 manufactured by Dojindo Co., Ltd.
  • n-nonanoyl-N-methyl-D-glucamine MEGA-9 manufactured by Dojindo Co., Ltd.
  • a monosaccharide having a hydrophobic group or a disaccharide having a hydrophobic group is also preferable.
  • the monosaccharide having a hydrophobic group or the disaccharide having a hydrophobic group is more preferably a compound having a glucose skeleton or a maltose skeleton.
  • Examples of the compound having a glucose skeleton or a maltose skeleton include compounds represented by the following formula (2) or the following formula (3).
  • R 11 is an optionally substituted alkoxy group, an optionally substituted alkenyloxy group, an optionally substituted alkynyloxy group, an optionally substituted alkylthio group, or an optionally substituted A good alkenylthio group or an optionally substituted alkynylthio group, and R 12 , R 13 , R 14 and R 15 each independently represent a hydrogen atom or an optionally substituted hydrocarbon group. However, at least three of R 12 , R 13 , R 14 and R 15 are hydrogen atoms.
  • R 21 is an optionally substituted alkoxy group, an optionally substituted alkenyloxy group, an optionally substituted alkynyloxy group, an optionally substituted alkylthio group, or an optionally substituted A good alkenylthio group or an optionally substituted alkynylthio group, and R 22 , R 23 , R 24 , R 25 , R 26 , R 27 and R 28 are each independently a hydrogen atom or a substituted one. Represents a good hydrocarbon group. However, at least three of R 22 , R 23 , R 24 , R 25 , R 26 , R 27, and R 28 are hydrogen atoms.
  • R 11 and R 21 have the same definitions as in formulas (2) and (3).
  • n-octyl- ⁇ -D-glucoside O001 manufactured by Dojindo
  • R 11 in formula (2A) is an octyloxy group.
  • n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (D316 manufactured by Dojindo Co., Ltd.)
  • n-decyl- ⁇ -D-maltoside (D382 manufactured by Dojindo)
  • the hydrocarbon group, the alkoxy group, the alkenyloxy group, the alkynyloxy group, the alkylthio group, the alkenylthio group and the alkynylthio group may be each substituted, but the substituent is the substituent described in the following Substituent group A. Groups.
  • the substituent of the substituent group A may be further substituted with the substituent of the substituent group A.
  • Substituent group A Sulfamoyl group, cyano group, isocyano group, thiocyanato group, isothiocyanato group, nitro group, nitrosyl group, halogen atom, hydroxy group, amino group, mercapto group, amide group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, arylthio group, carbamoyl group Group, acyl group, aldehyde group, carbonyl group, aryl group, alkyl group, alkyl group substituted with a halogen atom, ethenyl group, ethynyl group, silyl group, and trialkylsilyl group (trimethylsilyl group etc.).
  • Examples of the hydrocarbon group may include an alkyl group, an alkenyl group and an alkynyl group.
  • the carbon number of the hydrocarbon group is not particularly limited, it is generally 1 to 20, preferably 1 to 16, and more preferably 1 to 12.
  • the number of carbon atoms of the alkoxy group, alkenyloxy group, alkynyloxy group, alkylthio group, alkenylthio group and alkynylthio group is not particularly limited, but is generally 1 to 20, preferably 1 to 16, and more preferably Is 1 to 12.
  • the pH of the reaction solution is adjusted to 5.5 to 7.0 or 8.5 to improve the dissociation of the dissociation sample which is not improved only by the second particles of the present invention. It is characterized by using a buffer adjustable to 9.0. It is considered that the difference between the measured value of the present invention and the control method is caused by various contaminants in the antigen-antibody reaction, and the mechanism thereof is also different. Therefore, for example, based on the idea that the reactivity with contaminants changes depending on the pH of the reaction solution, the present object was achieved by adjusting the pH so as not to affect the antigen-antibody reaction.
  • MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid
  • ADA N-(2-acetamido)iminodiacetic acid
  • PIPES piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)sesquisodium salt monohydrate
  • ACES N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid
  • Bis-Tris bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane
  • MOPSO (2-hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid
  • BES N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid
  • MOPS (3-morpholinopropanesulfonic acid),
  • the pH of the reaction solution can be adjusted to 8.5 to 9.0, POPSO (piperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonic acid) dihydrate), HEPPSO (2-hydroxy-3-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonic acid) monohydrate), EPPS (3-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonic acid), Tricine (N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycine), Bicine (N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine), TAPS (N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid) CHES (N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid) Is preferred, and Bicine can be used particularly preferably.
  • the first binding substance used in the present invention is a substance having a specific binding property to serum amyloid A.
  • An antibody can be used as the first binding substance, but is not limited thereto.
  • the first binding substance is an antibody.
  • an antiserum prepared from the serum of an animal immunized with serum amyloid A or purified from the antiserum is used.
  • Immunoglobulin fraction a monoclonal antibody obtained by cell fusion using spleen cells of an animal immunized with serum amyloid A, or a fragment thereof [eg, F(ab′)2, Fab, Fab′, or Fv] Etc.
  • the preparation of these antibodies can be performed by a conventional method.
  • the antibody may be a modified antibody such as a chimeric antibody, or a commercially available antibody or an antibody prepared from animal serum or culture supernatant by a known method can be used.
  • Antibodies can be used regardless of the animal species or subclass.
  • an antibody that can be used in the present invention is an antibody derived from an organism in which an immune reaction can occur, such as mouse, rat, hamster, goat, rabbit, sheep, cow, chicken, specifically mouse IgG, mouse IgM. , Rat IgG, rat IgM, hamster IgG, hamster IgM, rabbit IgG, rabbit IgM, goat IgG, goat IgM, sheep IgG, sheep IgM, bovine IgG, bovine IgM, avian IgY, etc., either polyclonal or monoclonal are used. It is possible.
  • an antiserum amyloid A antibody is preferably used as the first binding substance having a specific binding property to serum amyloid A by electrostatic interaction.
  • the first particles used in the present invention are particles modified with the above-mentioned first binding substance and having a label.
  • the first particles are preferably dry particles, but are not particularly limited.
  • polymer particles such as polystyrene beads and glass particles such as glass beads can be used as particles that can be usually used for immunoassay.
  • Specific examples of the material of the first particles include styrene, methacrylic acid, glycidyl (meth)acrylate, butadiene, vinyl chloride, vinyl acetate acrylate, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, phenyl methacrylate, and butyl methacrylate.
  • the material of the latex include polystyrene, styrene-acrylic acid copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth)acrylate copolymer, styrene-styrene sulfonic acid.
  • examples thereof include salt copolymers, methacrylic acid polymers, acrylic acid polymers, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymers, vinyl chloride-acrylic acid ester copolymers and polyvinyl acetate acrylate.
  • the latex a copolymer containing at least styrene as a monomer is preferable, and a copolymer of styrene and acrylic acid or methacrylic acid is particularly preferable.
  • the method for producing the latex is not particularly limited, and the latex can be produced by any polymerization method.
  • immobilization of an antibody becomes difficult when a surfactant is present during antibody labeling, and thus emulsion-free emulsion polymerization, that is, emulsion polymerization that does not use an emulsifier such as a surfactant, is preferable for the production of a latex.
  • the first particle has a label.
  • the label preferably fluoresces.
  • the latex obtained by the polymerization itself is fluorescent, it can be directly used as fluorescent latex particles.
  • fluorescent latex particles can be prepared by adding a fluorescent substance (fluorescent dye or the like) to the latex. That is, the fluorescent latex particles can be produced by impregnating the latex particles with the fluorescent dye, such as by adding the fluorescent dye to a solution of the latex particles containing water and a water-soluble organic solvent and stirring. is there.
  • a liposome or a microcapsule containing a fluorescent dye can be used as the fluorescent particle.
  • the fluorescent color is not particularly limited as long as it is emitted when it absorbs ultraviolet light or the like and is excited to return to the ground state. For example, yellow-green (excitation wavelength 505 nm/emission wavelength 515 nm, the same applies hereinafter.
  • fluorescent fluorescent particles are available from, for example, Invitrogen, and are commercially available under the trade name of FluoSpheres (registered trademark).
  • the particle size of the first particle with the label is defined as the average particle size.
  • the average particle size of the first particles is not particularly limited, and a preferable range is preferably 70 nm or more and 500 nm or less, although it varies depending on the material of the particles, the concentration range for quantifying serum amyloid A, the measuring device, and the like. It is more preferably 300 nm or less and more preferably 80 nm or more and 250 nm or less, and particularly preferably 90 nm or more and 200 nm or less.
  • the average particle size of the particles used in the present invention can be measured with a commercially available particle size distribution meter or the like.
  • the particle size distribution can be measured by optical microscopy, confocal laser microscopy, electron microscopy, atomic force microscopy, static light scattering, laser diffraction, dynamic light scattering, centrifugal sedimentation, electric pulse. Measurement methods, chromatography methods, ultrasonic attenuation methods, etc. are known, and devices corresponding to each principle are commercially available. Among these measurement methods, dynamic light scattering method can be used for measurement.
  • the average particle diameter is a median diameter (50% diameter, d50) measured under the conditions of a viscosity of 0.8872CP (0.8872 mPa ⁇ s) and a water refractive index of 1.330 at 25°C. Shall seek.
  • the first particles used in the present invention are modified with the above-mentioned first binding substance.
  • the method for binding the first binding substance to the first particles having a label is not particularly limited. For example, it is described in JP 2000-206115 A, the protocol attached to Molecular Probes Inc. FluoSpheres (registered trademark) polystyrene microsphere F8813, and any known method for preparing a reagent for immunoaggregation reaction can be used. is there. Further, as a method of immobilizing a binding substance such as an antibody on the particles, any of a method using physical adsorption and a method using chemical bond by covalent bond can be adopted.
  • BSA bovine serum albumin
  • skim milk casein
  • soybean-derived components and fish-derived substances are used as blocking agents for covering the surface of particles not coated with the binding substance after the binding substance such as an antibody is immobilized on the particles.
  • These blocking agents may be subjected to a pretreatment such as partial modification with heat, acid, alkali, etc., if necessary.
  • the reagent kit of the present invention may further include second particles which are modified with a second binding substance having no specific binding property to serum amyloid A and have no label. Not only a positive test sample containing serum amyloid A but also a positive test sample that reacts with a negative test sample containing no serum amyloid A exists, and it is a problem to solve false positives. Is recognized as The cause of such false positives has not been clarified, but it is considered to be one of the causes that the presence of some factor contained in serum causes a nonspecific reaction. In the present invention, it is preferable to solve such a problem by using a second particle which is modified with a second binding substance having no specific binding property with serum amyloid A and has no label in combination. ..
  • the second binding substance a substance that does not have a specific binding property to serum amyloid A can be used, and a substance that may bind to the above-mentioned false-positive causative substance should be used. Is preferable, and it is preferable to use a compound having no affinity for the first binding substance.
  • an antibody or a protein (Protein A, Protein G) or the like that binds to the antibody can be used, and the antibody is preferable.
  • the second binding substance is an antibody
  • an antiserum prepared from the serum of an animal immunized with the antigen an immunoglobulin fraction purified from the antiserum, or an animal immunized with serum amyloid A
  • a monoclonal antibody obtained by cell fusion using spleen cells or a fragment thereof [for example, F(ab′)2, Fab, Fab′, or Fv].
  • the preparation of these antibodies can be performed by a conventional method.
  • the antibody may be a modified antibody such as in the case of a chimeric antibody, or a commercially available antibody or an antibody prepared from animal serum or culture supernatant by a known method can be used.
  • an anti-CRP antibody is used as the second binding substance is preferable.
  • the second particle has no label.
  • the second particles are preferably dry particles, but are not particularly limited.
  • polymer particles such as polystyrene beads and glass particles such as glass beads can be used as particles that can be usually used for immunoassay.
  • Specific examples of the material of the second particles include styrene, methacrylic acid, glycidyl (meth)acrylate, butadiene, vinyl chloride, vinyl acetate acrylate, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, phenyl methacrylate, and butyl methacrylate.
  • the material of the latex include polystyrene, styrene-acrylic acid copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth)acrylate copolymer, styrene-styrene sulfonic acid.
  • examples thereof include salt copolymers, methacrylic acid polymers, acrylic acid polymers, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymers, vinyl chloride-acrylic acid ester copolymers and polyvinyl acetate acrylate.
  • the latex a copolymer containing at least styrene as a monomer is preferable, and a copolymer of styrene and acrylic acid or methacrylic acid is particularly preferable.
  • the method for producing the latex is not particularly limited, and the latex can be produced by any polymerization method.
  • immobilization of an antibody becomes difficult when a surfactant is present during antibody labeling, and thus emulsion-free emulsion polymerization, that is, emulsion polymerization that does not use an emulsifier such as a surfactant, is preferable for the production of a latex.
  • the particle size of the second particles bound with the second binding substance is defined as the average particle size.
  • the average particle size of the second particles is preferably 70 nm or more and 500 nm or less, more preferably 100 nm or more and 200 nm or less, although it varies depending on the material of the particles, the concentration range for quantifying serum amyloid A, the measuring instrument, and the like. It is more preferably 120 nm or more and 180 nm or less, and particularly preferably 130 nm or more and 170 nm or less.
  • the mass ratio of the second particles to the first particles is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 6, and 2 to 6 Is more preferable.
  • the assay kit of the present invention comprises a reagent kit of the present invention as described above, and a third binding substance having specific binding properties to serum amyloid A or the first binding substance (ie, specific binding to serum amyloid A). And a substrate on which a first metal film having a third binding substance having a property, or a third binding substance having a specific binding property with the first binding substance) is fixed is formed. Even if the substrate is further formed with a second metal film on which a fourth binding substance having no binding property to serum amyloid A and having a specific binding property to the first binding substance is immobilized. Good.
  • the third binding substance is not particularly limited as long as it is a substance having a specific binding property to serum amyloid A or the first binding substance, but preferable examples include an antigen, an antibody, or a complex thereof. It is preferable to use an antibody.
  • an antibody as an antibody having specificity for serum amyloid A, for example, an antiserum prepared from the serum of an animal immunized with serum amyloid A, an immunity purified from the antiserum is used.
  • Globulin fraction monoclonal antibody obtained by cell fusion using spleen cells of animals immunized with serum amyloid A, or fragments thereof [eg, F(ab′)2, Fab, Fab′, or Fv] Can be used.
  • the preparation of these antibodies can be performed by a conventional method.
  • the antibody may be a modified antibody such as a chimeric antibody, or a commercially available antibody or an antibody prepared from animal serum or culture supernatant by a known method can be used.
  • Antibodies can be used regardless of the animal species or subclass.
  • an antibody that can be used in the present invention is an antibody derived from an organism in which an immune reaction can occur, such as mouse, rat, hamster, goat, rabbit, sheep, cow, chicken, specifically mouse IgG, mouse IgM. , Rat IgG, rat IgM, hamster IgG, hamster IgM, rabbit IgG, rabbit IgM, goat IgG, goat IgM, sheep IgG, sheep IgM, bovine IgG, bovine IgM, avian IgY, etc., either polyclonal or monoclonal are used. It is possible.
  • a fragmented antibody is a molecule derived from a complete antibody having at least one antigen-binding site, and is specifically Fab, F(ab')2 or the like. These fragmented antibodies are molecules obtained by enzymatic or chemical treatment, or using genetic engineering techniques.
  • the third binding substance having a specific binding property with the first binding substance is not particularly limited, but preferable examples include an antigen, an antibody, or a complex thereof.
  • the method for preparing the antibody and the type of antibody are the same as those described above.
  • the fourth binding substance is a substance that has no binding property with serum amyloid A and has a specific binding property with the first binding substance.
  • an antibody to the first binding substance (antibody), a protein (Protein A, Protein G) that binds to the binding substance (antibody), or the like is used. It is preferable to use a compound having a property, and more preferably, an antibody can be used.
  • the method for preparing the antibody and the type of antibody are the same as those described for the third binding substance.
  • a compound in which a part of the first binding substance bound to the labeled first particle has a ligand-non-ligand relationship with the fourth binding substance can be preferably used.
  • a method of immobilizing a third binding substance such as an antibody and a fourth binding substance on a substrate is described in, for example, Tech Notes Vol. 2-12, etc., any known method for preparing a general ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) reagent can be used. Surface modification may be performed by disposing a self-assembled monolayer (SAM) or the like on the substrate.
  • SAM self-assembled monolayer
  • BSA bovine serum albumin
  • skim milk casein
  • soybean-derived component soybean-derived component
  • polyethylene glycol polyethylene glycol
  • a commercially available blocking agent for immune reaction containing these substances or substances having the same properties as these substances can be used.
  • These blocking agents may be subjected to a pretreatment such as partial modification with heat, acid, alkali, etc., if necessary.
  • the substrate used in the present invention is a substrate on which a metal film is formed, and its form is not particularly limited, but in the case of performing a fluorescence detection method (SPF method) by surface plasmon excitation described below, a channel described below, and It is preferable to use a substrate having a metal film which is a reaction site on the surface.
  • a substance that can cause surface plasmon resonance can be used as the metal forming the metal film.
  • metals such as gold, silver, copper, aluminum and platinum, with gold being particularly preferred.
  • the above metals can be used alone or in combination.
  • an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal in consideration of the adhesion to the substrate.
  • the thickness of the metal film is not particularly limited, but is preferably 0.1 nm or more and 500 nm or less, more preferably 1 nm or more and 200 nm or less, and particularly preferably 1 nm or more and 100 nm or less. If it exceeds 500 nm, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected.
  • the thickness of the intervening layer is preferably 0.1 nm or more and 10 nm or less.
  • the metal film may be formed by a conventional method, for example, a sputtering method, a magnetron sputtering method, a vapor deposition method, an ion plating method, an electroplating method, an electroless plating method, or the like. It is preferable to form a metal film by a sputtering method in order to realize good adhesion of
  • the metal film is preferably arranged on the substrate.
  • “disposed on the substrate” means that the metal film is disposed so as to be in direct contact with the substrate, and that the metal film is not directly in contact with the substrate and is interposed through another layer. Including the case of being arranged.
  • the substrate that can be used in the present invention include optical glass such as BK7 (borosilicate glass), which is a type of general optical glass, or synthetic resin, specifically, polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, polycarbonate, A material made of a material transparent to laser light, such as a cycloolefin polymer, can be used.
  • Such a substrate is preferably a material that does not exhibit anisotropy to polarized light and has excellent processability.
  • a substrate for detecting fluorescence by the SPF method a substrate in which a gold film is formed on polymethylmethacrylate by a sputtering method can be cited.
  • the method for measuring serum amyloid A in a biological sample comprises: A biological sample containing serum amyloid A, first particles modified with a first binding substance having a specific binding property to serum amyloid A and having a label, and at least one nonionic interface having a molecular weight of 1000 or less.
  • the biological sample is not particularly limited as long as it is a sample that may contain serum amyloid A that is a test substance, and examples thereof include biological samples, particularly animals (especially cats, dogs, or Human body fluids (eg, blood, serum, plasma, spinal fluid, tears, sweat, urine, pus, nasal discharge, or sputum) or excrements (eg, feces), organs, tissues, mucous membranes, skin, etc. You can
  • Nonionic surfactants are used for pretreatment of biological samples containing SAA.
  • the pretreatment liquid prepare a liquid containing a surfactant in advance, and use it by mixing it with the sample liquid, or by adding the dried solid surfactant to the biological sample liquid itself, It is used by dissolving it in a liquid.
  • the concentration of the surfactant in the mixed liquid obtained by mixing the biological sample liquid and the surfactant is preferably 0.01% by mass or more and 10% by mass or less, and more preferably 0.05% by mass or more and 5% by mass or less. It is more preferably 0.1% by mass or more and 3% by mass or less, and particularly preferably 0.1% by mass or more and 2% by mass or less.
  • the concentration is 0.01% by mass or more, SAA can be effectively separated from HDL, and when the concentration is 10% by mass or less, the SAA can be effectively separated from the HDL by the presence of the label. It becomes possible for the first binding substance on one particle or the third binding substance fixed on the first metal film on the substrate to react with SAA.
  • the mixed solution may further contain second particles modified with a second binding substance that does not specifically bind to serum amyloid A. Further, in the method for measuring serum amyloid A according to the present invention, the above-mentioned mixed solution does not have a binding property with serum amyloid A, and a fourth binding substance having a binding property with respect to the first binding substance is immobilized. From the first metal film using the signal detected from the second metal film, the step of contacting the second metal film, the step of detecting the signal corresponding to the label from the second metal film The method may further include the step of correcting the detected signal.
  • the measurement method of the present invention is construed as the broadest concept including detection of the presence or absence of serum amyloid A, measurement (that is, quantification) of the amount of serum amyloid A, and the like.
  • Specific examples of the measuring method of the present invention include a sandwich method and a competitive method, and the sandwich method is preferable.
  • serum amyloid A can be measured by the following procedure, for example. First, a first binding substance having a specific binding property to serum amyloid A and a third binding substance having a specific binding property to serum amyloid A are prepared in advance. The first binding substance is bound to the first particle having the label to prepare the first particle modified with the first binding substance having the specific binding property to serum amyloid A. Next, a third binding substance is prepared and fixed on the substrate to form a reaction site (test area). Further, a fourth binding substance is prepared and fixed on the substrate to form a control area.
  • a second binding substance having no specific binding property to serum amyloid A is prepared and bound to the second particle having no label, and a second binding substance having no specific binding property to serum amyloid A is prepared.
  • a second particle is created that does not have a label modified with the second binding agent.
  • the first particles and the second particles are mixed, housed in a container, and dried.
  • a test sample (or an extract thereof) that may contain serum amyloid A, a mixture of the first particles and the second particles, and a surfactant were mixed, and the mixed solution was applied to a substrate. , Is developed on the flow path on the substrate and brought into contact with the reaction site.
  • serum amyloid A When serum amyloid A is present in the test sample, serum amyloid A and the first binding substance bound to the first particles at the reaction site, and serum amyloid A and the first binding substance on the reaction site at the reaction site.
  • a reaction in the case of using an antigen and an antibody, an antigen-antibody reaction
  • the sandwich method after the reaction between the third binding substance immobilized on the reaction site and serum amyloid A and the reaction between serum amyloid A and the first binding substance bound to the first particles are completed.
  • cleaning can be performed for the purpose of removing the first particles that have not bound in the test area and control area on the substrate. Then, by detecting the signal intensity from the first particles bound to the reaction site, the accurate concentration of serum amyloid A can be measured.
  • the fluorescence intensity and the concentration of serum amyloid A have a positive correlation.
  • the competitive method is not particularly limited, but serum amyloid A can be measured by the following procedure, for example.
  • the competitive method is well known in the art as a method for detecting an antigen of a low molecular compound that cannot be assayed by the sandwich method. First, a first binding substance having a specific binding property to serum amyloid A and a second binding substance having no specific binding property to serum amyloid A are prepared in advance. The first binding substance is then bound to the first particles and the second binding substance is bound to the second particles.
  • serum amyloid A itself having a binding property to the first binding substance or a compound having a site similar to serum amyloid A and having an epitope for the first binding substance similar to serum amyloid A on a substrate Fix and use as reaction site.
  • the first particles and the second particles are mixed, housed in a container, and dried.
  • a test sample (or an extract thereof) that may contain serum amyloid A, a mixture of the first particles and the second particles, and a surfactant are mixed, and the mixture is developed on the flow path on the substrate and reacted. Contact the site.
  • serum amyloid A When serum amyloid A is not present in the test sample, serum amyloid A having binding properties to the first binding substance bound to the first particles and the first binding substance immobilized on the reaction site A reaction occurs on the substrate by itself or by a similar compound having an epitope for the first binding substance antibody similar to serum amyloid A.
  • serum amyloid A when serum amyloid A is present, since serum amyloid A binds to the first binding substance, it has a binding property to the first binding substance and is similar to serum amyloid A itself or serum amyloid A. That the reaction with a compound having a different site and having an epitope for the first binding substance antibody similar to that of serum amyloid A is inhibited, and the first particle having a label is immobilized on the reaction site.
  • a plurality of samples in which the amount of serum amyloid A having different serum amyloid A concentrations is known are prepared in advance, and the samples and the binding substance-labeled fluorescent particles are brought into contact with each other while the fluorescence from the reaction site is increased. Measure the signal at different times. From each of the plurality of measurement results, the temporal change (slope) of the fluorescence amount is obtained at each serum amyloid A concentration. This time change is plotted on the Y-axis and the serum amyloid A concentration is plotted on the X-axis, and a calibration curve of the serum amyloid A concentration with respect to the time change of the fluorescence amount is obtained by using a fitting method such as the least squares method that is suitable. Based on the calibration curve thus obtained, the amount of serum amyloid A contained in the test sample can be quantified from the result of the time-dependent change in the fluorescence amount using the target test sample.
  • a test sample (or an extract thereof) that may contain serum amyloid A, a first particle having a label, a surfactant, and optionally a second particle are included.
  • a mixture This mixture can be applied on a substrate and spread in a flow path.
  • the flow channel is not particularly limited as long as it is a passage through which the test sample and the first particle (and optionally the second particle) having the label flow down to the reaction site.
  • a spotting port for spotting a test sample solution containing a first particle (and optionally a second particle) having a label, and a reaction site on which a third binding substance is immobilized
  • a suction port can be provided on the side of the metal thin film opposite to the spotting port.
  • a signal corresponding to the label is detected.
  • the label preferably emits fluorescence, and in this case, by detecting fluorescence, a signal corresponding to the label can be detected.
  • a method of detecting fluorescence for example, a device capable of detecting fluorescence intensity, specifically, a microplate reader, or a biosensor for performing a fluorescence detection method (SPF method) by surface plasmon excitation is used. It is preferable to detect the fluorescence intensity.
  • the detection of the fluorescence intensity is usually completed after a fixed time, for example, several minutes to several hours after the antigen-antibody reaction.
  • the concentration of serum amyloid A can be quantified from the relationship between the fluorescence intensity and the concentration of serum amyloid A.
  • the form of fluorescence measurement may be plate reader measurement or flow measurement.
  • the SPF method can measure with higher sensitivity than the fluorescence detection method by epi-excitation excitation (epi-fluorescence method).
  • the surface plasmon fluorescence (SPF) biosensor for example, an optical waveguide formed of a material that transmits excitation light having a predetermined wavelength as described in JP 2008-249361 A and one of the optical waveguides is disclosed.
  • a fluorescence detecting means for detecting fluorescence generated by being excited by the evanescent wave enhanced by the surface plasmon can be used.
  • serum amyloid A can be quantified by the following method. Specifically, a sample containing serum amyloid A having a known concentration is prepared, and the fluorescence signal from the fluorescence detection site is measured at a plurality of different times while flowing down the site where fluorescence is detected. From each of the plurality of measurement results, the temporal change (slope) of the fluorescence amount is obtained at each serum amyloid A concentration.
  • This time change is plotted on the Y-axis and the serum amyloid A concentration is plotted on the X-axis, and a calibration curve of the serum amyloid A concentration with respect to the time change of the fluorescence amount is obtained by using an appropriate fitting method such as the least square method.
  • the optical signal system the amount of serum amyloid A in a target test sample can be specified based on a calibration curve corresponding to each serum amyloid A.
  • the fluorescence detection (SPF) system by surface plasmon excitation in the present invention is an assay method for detecting fluorescence from a fluorescent substance depending on the amount of serum amyloid A immobilized on a metal thin film on a substrate, and in a solution.
  • This is a method different from the so-called latex agglutination method in which the change in optical transparency due to the progress of the reaction is detected as, for example, turbidity.
  • the antibody-sensitized latex in the latex reagent and the antigen in the sample are bound and agglutinated by the antibody reaction.
  • the latex agglutination method is a method of quantifying the antigen concentration from the change in absorbance per unit time obtained by irradiating the aggregate with near infrared light.
  • the present invention can provide a very simple method for detecting serum amyloid A as compared with the latex agglutination method.
  • D316 n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (manufactured by Dojindo Chemical Co., Ltd.), a compound in which R is a dodecyloxy group in the following formula (A)
  • D382 n-decyl- ⁇ -D-maltoside (manufactured by Dojindo Chemical Co., Ltd.), A compound in which R is a decyloxy group in the following formula (A)
  • MEGA-9 n-nonanoyl-N-methyl-D-glucamine (manufactured by Dojindo Co., Ltd.)
  • Laureth 9 POE (9) lauryl ether (EMALEX (registered trademark) 709 manufactured by Nippon Emulsion Co., Ltd.)
  • Laureth 15 POE (15) lauryl ether (EMALEX (registered trademark) 715 manufactured by Nippon Emulsion Co., Ltd.)
  • SDS sodium dodecyl sulfate (ionic surfactant, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Dimethyl distearyl ammonium chloride ⁇ ionic surfactant, FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries> Laureth 20: POE (20) lauryl ether (EMALEX (registered trademark) 720 manufactured by Nippon Emulsion Co., Ltd.)
  • Example 1 Production of latex particles having an average particle size of 150 nm 30 g (288 mmol) of styrene (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries) and 3 g (42 mmol) of acrylic acid (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries) were suspended in 440 mL of ultrapure water. The temperature was raised to 95° C., an aqueous solution prepared by dissolving 1 g of potassium persulfate (KPS) (manufactured by FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 10 mL of ultrapure water was added, and the mixture was stirred at 95° C. and 250 rpm for 6 hours.
  • KPS potassium persulfate
  • the organic solvent was distilled off under reduced pressure with an evaporator, and then centrifugation and redispersion in a phosphate buffered saline (PBS) aqueous solution were repeated 3 times to carry out purification to prepare fluorescent latex particles.
  • PBS phosphate buffered saline
  • spleen cells were seeded in a 96-well plate at 0.5 to 1.0 ⁇ 10 5 cells/well.
  • the medium used was RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium), 10% FBS (fetal bovine serum), and HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine mixed medium), hypoxanthine-amine-amin. Used as appropriate.
  • the finally expanded fused cells (hybridomas) were injected into the abdominal cavity of mice, and ascites was taken out after a lapse of a certain period of time, and those obtained through centrifugation and purification steps were collected as anti-SAA monoclonal antibody (Anti-SAA). did.
  • an anti-CRP monoclonal antibody (MM50175) was prepared using CRP (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) purified from a culture solution of E. coli in the same manner as the preparation of the anti-SAA monoclonal antibody.
  • Fluorescent particles modified with anti-SAA antibody were prepared as follows. 88% of a 50 mmol/L MES (2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid) buffer (pH 6.6) solution was added to 275 ⁇ L of 2% by mass (solid content concentration) fluorescent latex particle aqueous solution (average particle size 150 nm), and 5 mg/L 176 ⁇ L of anti-SAA monoclonal antibody (Anti-SAA) of mL was added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes.
  • MES (2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid) buffer (pH 6.6) solution was added to 275 ⁇ L of 2% by mass (solid content concentration) fluorescent latex particle aqueous solution (average particle size 150 nm), and 5 mg/L 176 ⁇ L of anti-SAA monoclonal antibody (Anti-SAA) of mL was added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes.
  • Latex Particles Modified with Anti-CRP Antibody without Fluorescence Labeling 2% by mass (solid content) Latex particle aqueous solution (average particle size 150 nm) 300 ⁇ L, 250 mmol/L MES buffer (pH 5.6) solution 96 ⁇ L Then, 25 mL of ultrapure water was added, and 182 ⁇ L of 5 mg/mL anti-CRP monoclonal antibody (MM50175) was added. The resulting mixture was stirred at room temperature for 15 minutes.
  • a test area and a control area each have a width of 4 mm and a thickness of 36 nm.
  • a gold film used for the test area and a gold film used for the control area next to it were formed by magnetron sputtering.
  • This substrate was cut into a width of 5 mm to prepare a substrate.
  • a liquid containing anti-SAA monoclonal antibody (concentration: 10 ⁇ g/mL in 150 mmol NaCl) was spotted on the gold film in the test area of this substrate, incubated at 25° C. for 1 hour, and physically adsorbed for immobilization. went.
  • a cleaning solution prepared in advance (0.05 mass% Tween (registered trademark) 20 (polyoxyethylene (20)
  • FIGS. 1 and 2 A schematic diagram thereof is shown in FIGS. 1 and 2.
  • FIG. 1 is a schematic view of the sensor chip 1
  • FIG. 2 is an exploded view of the sensor chip 1.
  • the sensor chip 1 is composed of an upper member 2, an intermediate member 3 and a substrate 4.
  • the upper member 2 is provided with a first container 5 and a second container 6.
  • the first container 5 and the second container 6 are collectively referred to as a container group 7.
  • a flow path 10 is formed in the substrate 4, and a detection area 8 and a reference area 9 are formed on the flow path 10.
  • test sample As the cat serum, a test sample (specimen) No. different in the concentration of serum amyloid A, which is a test substance, was used, using the serum of a hybrid strain purchased from Kitayama Labes. 1 and No. I prepared 2.
  • the mixed solution 1 was allowed to flow down the flow channel at a rate of 10 ⁇ L/min while performing pump suction, and the fluorescence intensity on the gold film surface on which the SAA antibody was immobilized was continuously measured for 1.5 minutes.
  • the rate of increase of the fluorescence signal value per unit time of the fluorescence intensity obtained on each substrate was measured as the test sample No. 1 and No. 2 was measured respectively.
  • the ratio of the signal value after the measurement was continued for 1.5 minutes to the signal value at the start of measurement was measured as the signal slope, and No. 1 and No. No. 2 for the SAA concentration difference of No. 2 1 and No. It was determined as the difference between the signal slopes of 2.
  • Example 2 To the latex particles modified with the anti-SAA antibody used in Example 1, latex particles modified with an anti-CRP antibody not fluorescently labeled were added in a mass ratio of 5 times to prepare dry particles. In the same manner as in Example 1 except that it was used, the rate of increase of the fluorescence signal value was measured with the sample No. 1 and No. 2 was measured respectively. The ratio of the signal value after the measurement was continued for 1.5 minutes to the signal value at the start of measurement was measured as the signal slope, and No. 1 and No. No. 2 for the SAA concentration difference of No. 2 1 and No. It was determined as the difference between the signal slopes of 2.
  • Examples 3 to 9> In the same manner as in Example 1 except that the surfactant and the concentration shown in Table 1 were changed in place of the surfactant D316, the increase rate of the fluorescence signal value was measured in the same manner as in the sample No. 1 and No. 2 was obtained respectively. The ratio of the signal value after the measurement was continued for 1.5 minutes to the signal value at the start of measurement was measured as the signal slope, and No. 1 and No. No. 2 for the SAA concentration difference of No. 2 1 and No. It was determined as the difference between the signal slopes of 2.
  • test samples (specimen) Nos. 3 to 7 with different concentrations of the test substance.
  • SAA concentration was measured using the control kit described in (11) above, it was 0.5 ⁇ g/mL, 5.5 ⁇ g/mL, 60.8 ⁇ g/mL, 111.0 ⁇ g/mL, 159.1 ⁇ g/mL, respectively. there were.
  • the signals of the test sample (specimen) Nos. 3 to 7 were measured using the kits of Examples 1, 10 to 13 and Comparative Examples 5 and 6, and the samples of Examples 1, 10 to 13 and Comparative Example 5, A calibration curve was prepared for each of the 6 kits.

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Abstract

本発明の課題は、消防法上の危険物でもあるアルコールを使用することなく、ＳＡＡを正確かつ高感度に免疫学的に測定するための試薬キット、測定キットおよび測定方法を提供することである。本発明によれば、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤と、反応液のｐＨを５．５～７．０または８．５～９．０に調整可能なバッファーとを含む、血清アミロイドＡの測定のための試薬キットが提供される。

Description

試薬キット、測定キットおよび測定方法
　本発明は、血清アミロイドＡの測定のための試薬キット、血清アミロイドＡのための測定キットおよび生体試料中の血清アミロイドＡの測定方法に関する。
　従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する検出対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって検出対象物質の存在を確認する方法である。また、検出対象物質が蛍光体ではない場合、蛍光色素で標識されて検出対象物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち検出対象物質の存在を確認することも広くなされている。
　また、このような蛍光検出法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献１などに提案されている。これは、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属層を設けたセンサチップを備え、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属層形成面と反対の面側から、全反射角以上の所定の角度で励起光を入射させ、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光を増強させることによりシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）を向上させるものである。
　血清アミロイドＡ（Ｓｅｒｕｍ　Ａｍｙｌｏｉｄ　Ａ：ＳＡＡとも表記する）は、分子量約１１，６００の非常に疎水性の高いタンパク質で、生体に感染、腫瘍および外傷等の種々のストレスが加わり、それに起因して炎症が生じた際に、血中における濃度が鋭敏に増加するという性質をもっている。このため、しばしば炎症の程度を知るための炎症マーカーとして、血中のＳＡＡ濃度が免疫学的測定方法を用いて測定されている。
　しかし、ＳＡＡは疎水性が高いためか、通常血中ではほとんどが高比重リポタンパク質（ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＨＤＬ）と会合していることが知られている。ＳＡＡの抗原決定基はリポタンパク質の内部の外界と接触していない部分に隠されており、そのままでは抗体と反応できないことがある。したがって、免疫学的な測定に際して、隠れた抗原決定基を露出させるための前処理が必要となることが多い。例えば、特許文献２では免疫学的測定法の一工程である希釈工程における希釈液の成分として親水性アルコールを加えることで、高感度かつ高精度でＳＡＡを測定することを見出している。また、特許文献３には、高比重リポ蛋白質とＳＡＡを含む血清を非変性条件下でゲルろ過により分画して得ることができる分子量１０～４０ｋＤの分画に含まれるＳＡＡに反応する抗体が記載されている。
　また、一般的に抗原抗体反応に基づく定量測定法においては、極まれに対照法による定量値から大きく外れた測定値を示す検体（以下、乖離検体）が存在することがしばしば問題となる。解離する原因は個々の乖離検体によって別であったり同じであったりする。一例として、特許文献４の段落００６３には、テストエリア上にブロッキング剤として結合させたＢＳＡと蛍光粒子側に結合させたＢＳＡとの間を非特異反応的に架橋する抗ＢＳＡ抗体のような物質が原因で、対照法からの乖離が発生することが記載されている。特許文献４には、この乖離検体に対しては、蛍光粒子の表面のブロッキング剤の一部をＢＳＡからダミー抗体である抗ＣＲＰ抗体に置き換えることが有力な改善方法であることが記載されている。
特開２０１０－１９０８８０号公報 特開平８－１７８９２１号公報 特開平９－１０４６９９号公報 国際公開ＷＯ２０１７／１５０５１８号
　しかしながら、特許文献２に記載された、親水性アルコールを加えることでＳＡＡを測定する場合には、揮発によりアルコール濃度が容易に変化し、ＳＡＡを正確に定量することができないという問題がある。また、特許文献３においては、特殊な抗体の精製方法が必要という問題がある。特許文献４に記載されている改善方法は有効であるが、このような方法でも乖離を防止することができない検体が存在し、この検体の乖離を改善することが望まれている。
　本発明の第一の課題は、消防法上の危険物でもあるアルコールを使用することなく、ＳＡＡを正確かつ高感度に免疫学的に測定するための試薬キット、測定キットおよび測定方法を提供することである。
　本発明の第二の課題は、従来の方法では解決できない対照法の測定値から大きく乖離する検体に対して、対照法の測定値との乖離を抑制することができる、試薬キット、測定キットおよび測定方法を提供することである。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤と、反応液のｐＨを５．５～７．０または８．５～９．０に調整可能なバッファーとを組み合わせて使用することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］　血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、
少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤と、
反応液のｐＨを５．５～７．０または８．５～９．０に調整可能なバッファー
とを含む、血清アミロイドＡの測定のための試薬キット。
［２］　上記界面活性剤が、グルカミン骨格を有する化合物である、［１］に記載の試薬キット。
［３］　上記界面活性剤が、下記式（１）で表される化合物である、［１］または［２］に記載の試薬キット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうち少なくとも３つは水素原子である。Ｒ７は、置換されていてもよい炭化水素基を示す。
［４］　上記界面活性剤が、疎水性基を有する単糖類または疎水性基を有する二糖類である、［１］に記載の試薬キット。
［５］　上記界面活性剤が、グルコース骨格またはマルトース骨格を有する化合物である、［４］に記載の試薬キット。
［６］　上記界面活性剤が、下記式（２）または下記式（３）で表される化合物である、［１］、［４］および［５］の何れか一に記載の試薬キット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 式中、Ｒ１１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５のうち少なくとも３つは水素原子である。
式中、Ｒ２１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８のうち少なくとも３つは水素原子である。
［７］　上記第一の粒子が、ラテックス粒子である、［１］から［６］のいずれか一に記載の試薬キット。
［８］　上記第一の粒子の平均粒径が７０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、［１］から［７］のいずれか一に記載の試薬キット。
［９］　上記標識が蛍光色素を含む、［１］から［８］のいずれか一に記載の試薬キット。
［１０］　上記第一の結合物質が抗体である、［１］から［９］のいずれか一に記載の試薬キット。
［１１］　血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子をさらに含む、［１］から［１０］のいずれか一に記載の試薬キット。
［１２］　上記バッファーが、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸またはＮ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシンである、［１］から［１１］の何れか一に記載の試薬キット。
［１３］　［１］から［１２］のいずれか一に記載の試薬キットと、血清アミロイドＡまたは上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板とを含む、血清アミロイドＡのための測定キット。
［１４］　上記基板に、血清アミロイドＡと結合性を有さず、上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されている、［１３］に記載の測定キット。
［１５］　血清アミロイドＡを含む生体試料と、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤と、反応液のｐＨを５．５～７．０または８．５～９．０に調整可能なバッファーとを含む混合液を調製する工程；
血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板の一端の注入口に、上記混合液を添加する工程；
上記混合液を上記基板上に流下させる工程；および、
上記第一の金属膜上の標識の情報を取得する工程、
を含む、生体試料中の血清アミロイドＡの測定方法。
［１６］　上記混合液中の上記界面活性剤の濃度が０．０１質量％以上１０質量％以下である、［１５］に記載の血清アミロイドＡの測定方法。
［１７］　上記混合液を上記注入口に添加する前に、上記混合液が生理食塩水によって４倍以上１００倍以下の希釈倍率で希釈される、［１５］または［１６］に記載の血清アミロイドＡの測定方法。
　本発明による試薬キット、測定キットおよび測定方法によれば、ＳＡＡを正確かつ高感度に免疫学的に測定することができる。
図１は、センサチップの概略図を示す。 図２は、センサチップの分解図を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。
［試薬キット］
  本発明の試薬キットは、
血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、
少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤と、
反応液のｐＨを５．５～７．０または８．５～９．０に調整可能なバッファー、
とを含む、血清アミロイドＡの測定のための試薬キットである。
　本発明の試薬キットは、上記の通り、第一の粒子と、非イオン性界面活性剤と、バッファーとを含むが、第一の粒子と非イオン性界面活性剤とバッファーとは混合物としてキットに含まれていてもよいし、別々にキットに含まれていてもよい。
（血清アミロイドＡ）
  本発明における被検物質は、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）である。ＳＡＡは炎症マーカーとして有用である。血清アミロイドＡとしては、例えば、ネコ血清またはネコ血漿中の血清アミロイドＡを挙げることができる。
（界面活性剤）
　血清中ではＳＡＡの大部分が高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）と会合した状態で存在していることが知られている。そのため、血清アミロイドＡと結合性を有する第一の結合物質および第三の結合物質に対する血清アミロイドＡの認識部位がＨＤＬに遮蔽されており、第一の結合物質および第三の結合物質が血清アミロイドＡに結合できないという問題がある。本発明は、このような現象を解決するために、界面活性剤を用いて血清アミロイドＡをＨＤＬから解離させることにより、正確に血清中のＳＡＡを定量することが可能になる。
　本発明において使用する界面活性剤は、分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤の分子量が１０００を超えると、ＨＤＬと同じように検体として認識される部位を遮蔽してしまう場合があり、正確にＳＡＡの測定ができなくなる場合があることから、分子量が１０００以下の非イオン性界面活性剤を使用する。界面活性剤の分子量の下限は、好ましくは２００以上であり、より好ましくは３００以上である。界面活性剤の分子量の上限は、好ましくは９００以下であり、より好ましくは８００以下であり、さらに好ましくは７００以下であり、特に好ましくは６００以下である。
　本発明においては、結合物質の結合性に比較的影響を及ぼさない非イオン性界面活性剤を用いる。イオン性界面活性剤の場合には、生体試料中の電荷を有する基と相互作用することにより測定に影響を及ぼす場合があり、ＳＡＡを正確に測定することが難しくなることから、本発明においては非イオン性界面活性剤を用いる。非イオン性界面活性剤は、別の呼称として、ノニオン性界面活性剤と表記される場合がある。陰イオン系の界面活性剤はアニオン性界面活性剤、陽イオン系の界面活性剤はカチオン性界面活性剤、両性イオン系の界面活性剤はベタインと記載されることがある。本発明では、ノニオン性、即ち、非イオン性界面活性剤が用いられる。具体的な非イオン性界面活性剤としては、エステル型、エーテル型、エステルエーテル型またはアルカノールアミド型から選ばれる界面活性剤が好ましく、エーテル型またはアルカノールアミド型がより好ましい。
　界面活性剤としては、グルカミン骨格を有する化合物、特にはグルカミン骨格を有するアルカノールアミド型の界面活性剤が更に好ましい。グルカミン骨格を有するアルカノールアミド型の非イオン性界面活性剤の好ましい例としては、下記式（１）で表される化合物を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうち少なくとも３つは水素原子である。Ｒ７は、置換されていてもよい炭化水素基を示す。
　式（１）で表される化合物のさらに好ましい例としては、さらに下記式（１Ａ）または下記式（１Ｂ）で表される化合物を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
式中、Ｒ１およびＲ７は、式（１）における定義と同義である。
　式（１）、式（１Ａ）または式（１Ｂ）で表される化合物としては、以下の界面活性剤を使用することが好ましい。
ｎ－オクタノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン（同仁化学社製ＭＥＧＡ－８）
ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン（同仁化学社製ＭＥＧＡ－９）
　界面活性剤としては、疎水性基を有する単糖類または疎水性基を有する二糖類も好ましい。疎水性基を有する単糖類または疎水性基を有する二糖類としては、より好ましくは、グルコース骨格またはマルトース骨格を有する化合物である。グルコース骨格またはマルトース骨格を有する化合物としては、下記式（２）または下記式（３）で表される化合物を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 式中、Ｒ１１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５のうち少なくとも３つは水素原子である。
式中、Ｒ２１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８のうち少なくとも３つは水素原子である。
　式（２）または式（３）で表される化合物のさらに好ましい例としては、さらに下記式（２Ａ）または下記式（３Ａ）で表される化合物を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 式中、Ｒ１１およびＲ２１は、式（２）および式（３）における定義と同義である。
　式（２Ａ）で表される化合物としては、以下の界面活性剤を使用することが好ましい。
ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシド（同仁化学社製Ｏ００１）。式（２Ａ）におけるＲ１１がオクチルオキシ基である化合物。
　式（３Ａ）で表される化合物としては、以下の界面活性剤を使用することが好ましい。
ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学社製Ｄ３１６）
ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学社製Ｄ３８２）
　炭化水素基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アルキルチオ基、アルケニルチオ基およびアルキニルチオ基はそれぞれ置換されていてもよいが、置換基としては、下記の置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。置換基群Ａの置換基は、置換基群Ａの置換基によりさらに置換されていてもよい。
置換基群Ａ：
スルファモイル基、シアノ基、イソシアノ基、チオシアナト基、イソチオシアナト基、ニトロ基、ニトロシル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、アミド基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、カルバモイル基、アシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アリール基、アルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基、エテニル基、エチニル基、シリル基、およびトリアルキルシリル基（トリメチルシリル基等）。
　炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を挙げることができる。炭化水素基の炭素数は特に限定されないが、一般的には１～２０であり、好ましくは１～１６であり、より好ましくは１～１２である。
　アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アルキルチオ基、アルケニルチオ基およびアルキニルチオ基の炭素数は特に限定されないが、一般的には１～２０であり、好ましくは１～１６であり、より好ましくは１～１２である。
（バッファー(緩衝液)）
　本発明では、乖離検体のなかで本発明の第二の粒子だけでは乖離が改善しないものに対して乖離を改善するために、反応液のｐＨを５．５～７．０または８．５～９．０に調整可能なバッファーを用いることを特徴とする。本発明の測定値の対照法との乖離は抗原抗体反応における様々な夾雑物質によって起こっていると考えられ、そのメカニズムも個々に異なる。従って、例えば夾雑物質との反応性が反応液のｐＨによって変化するとの考えに基づき、抗原抗体反応に影響を及ぼさなくなるようにｐＨを調整することで本課題を達成した。
　本発明に用いるバッファーとしては、グッドバッファーが好ましく、反応液のｐＨを５．５～７．０、または８．５～９．０に調整可能なものが好ましく用いられる。反応液のｐＨを５．５～７．０に調整可能なものとしては、
ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、
ＡＤＡ（Ｎ－（２－アセトアミド）イミノジ酢酸）、
ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）セスキナトリウム塩一水和物）、
ＡＣＥＳ（Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸）、
Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン）、
ＭＯＰＳＯ（２－ヒドロキシ－３－モルホリノプロパンスルホン酸）、
ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸）、
ＭＯＰＳ（３－モルホリノプロパンスルホン酸）、
ＴＥＳ（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸）、
ＨＥＰＥＳ（２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸）
が好ましく、ＭＥＳが特に好ましく用いることができる。
　反応液のｐＨを８．５～９．０に調整可能なものとしては、
ＰＯＰＳＯ（ピペラジン－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸）二水和物）、
ＨＥＰＰＳＯ（２－ヒドロキシ－３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸）一水和物）、
ＥＰＰＳ（３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸）、
Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン）、
Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン）、
ＴＡＰＳ（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸）
ＣＨＥＳ（Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸）
が好ましく、Ｂｉｃｉｎｅが特に好ましく用いることができる。
（第一の結合物質）
  本発明で用いる第一の結合物質は、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する物質である。第一の結合物質としては、抗体を使用できるが、これに限定されるものではない。好ましくは、第一の結合物質は抗体である。第一の結合物質が抗体である場合は、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する抗体として、例えば、血清アミロイドＡによって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、血清アミロイドＡによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
  抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ハムスターＩｇＭ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルのどちらも使用可能である。
  特に、静電相互作用により血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質としては、抗血清アミロイドＡ抗体が好ましく用いられる。本発明ではサンドイッチ方式を選択することが好ましく、この場合には、ペアとなる抗体を基板に被覆する必要があるが、基板および第一の粒子上の両方に、これらの抗ＳＡＡモノクローナル抗体を用いることが可能である。
（第一の粒子）
  本発明で用いる第一の粒子は、上記した第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する粒子である。
　第一の粒子は、乾燥粒子であることが好ましいが、特に限定はされない。第一の粒子としては、免疫測定に通常用いられ得る粒子として、例えば、ポリスチレンビーズなどの高分子粒子、ガラスビーズ等のガラス粒子を用いることができる。第一の粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、または２つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。
  ラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン－アクリル酸共重合体、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸またはメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、抗体標識の際に界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合が好ましい。
  第一の粒子は標識を有する。標識は、蛍光を発することが好ましい。重合により得られたラテックス自体が蛍光性である場合には、そのまま蛍光ラテックス粒子として使用することができる。重合により得られたラテックスが非蛍光性の場合には、ラテックスに蛍光物質（蛍光色素など）を添加することによって、蛍光ラテックス粒子を作製することができる。即ち、蛍光ラテックス粒子は、水および水溶性有機溶剤を含むラテックス粒子の溶液に蛍光色素を添加して攪拌することなどにより、蛍光色素をラテックス粒子の内部に含浸させることにより製造することが可能である。
  標識を有する第一の粒子としては、蛍光色素を含有したリポゾ－ムやマイクロカプセル等を蛍光粒子として使用することもできる。蛍光発色は、紫外光等を吸収して励起し、基底状態に戻る際に放出されるものであれば特に制限されるものではなく、例えば、黄緑（励起波長５０５ｎｍ／放出波長５１５ｎｍ、以下同じ）、青（３５０～３５６ｎｍ／４１５～４４０ｎｍ）、赤（５３５～５８０ｎｍ／５７５～６０５ｎｍ）、オレンジ（５４０ｎｍ／５６０ｎｍ）、レッド・オレンジ（５６５ｎｍ／５８０ｎｍ）、クリムゾン（６２５ｎｍ／６４５ｎｍ）、ダークレッド（６６０ｎｍ／６８０ｎｍ）などの蛍光発色が用いられ得る。これらの蛍光を発する蛍光粒子は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能であり、同社においてＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）の商品名で市販されている。
  標識を有する第一の粒子の粒径は、平均粒径として定義される。第一の粒子の平均粒径は、特に限定されず、好ましい範囲は、粒子の材質や血清アミロイドＡを定量する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、７０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが好ましく、７０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることがより好ましく、８０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下であることがさらに好ましく、９０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが特に好ましい。
  本発明に用いられる粒子の平均粒径は、市販の粒度分布計等で計測することが可能である。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されているが、これらの測定法の中で、動的光散乱法で計測することが好ましく、本発明では、平均粒径は、２５℃にて、粘度０．８８７２ＣＰ（０．８８７２ｍＰａ・ｓ）、水の屈折率１．３３０の条件で測定したメジアン径（５０％径、ｄ５０）として求めるものとする。
　本発明で用いる第一の粒子は、上記した第一の結合物質により修飾されている。標識を有する第一の粒子に、第一の結合物質を結合するための方法は特に限定されない。例えば、特開２０００－２０６１１５号公報やモレキュラープローブ社ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアＦ８８１３に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、抗体などの結合物質を粒子に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、および共有結合による化学結合を用いた方法、のいずれの方法も採用可能である。抗体などの結合物質を粒子に固定させた後に結合物質が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
（第二の結合物質）
  本発明の試薬キットはさらに、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子を含んでいてもよい。
  血清アミロイドＡを含む陽性となる被検試料だけでなく、血清アミロイドＡを含まない陰性の被検試料に対しても反応して陽性となる被検試料が存在しており、擬陽性の解決が課題として認識されている。このような擬陽性を示す原因は明確にはなっていないが、血清中に含まれる何らかの因子が存在して非特異反応を起こすことが原因の一つではないかと考えられている。本発明では、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子を併用することで、このような問題を解決することが好ましい。
  第二の結合物質としては、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有さない物質を使用することができ、上記したような擬陽性を示す原因物質に結合する可能性のある物質を使用することが好ましく、さらに第一の結合物質に対して親和性を有しない化合物を使用することが好ましい。第二の結合物質としては、抗体、あるいは抗体に対して結合するタンパク質（Protein A、Protein G）などを使用することができ、抗体が好ましい。例えば、第二の結合物質が抗体である場合には、その抗原によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、血清アミロイドＡによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］などを用いることが可能である。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体も使用可能である。本発明では、第二の結合物質として、特に抗ＣＲＰ抗体を使用する態様が好ましい。
（第二の粒子）
  第二の粒子は、標識を有しない。また第二の粒子は乾燥粒子であることが好ましいが、特に限定されない。
  第二の粒子としては、免疫測定に通常用いられ得る粒子として、例えば、ポリスチレンビーズなどの高分子粒子、ガラスビーズ等のガラス粒子を用いることができる。第二の粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、または２つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。
  ラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン－アクリル酸共重合体、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸またはメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、抗体標識の際に界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合が好ましい。
  第二の結合物質で結合された第二の粒子の粒径は、平均粒径として定義される。第二の粒子の平均粒径は、粒子の材質や血清アミロイドＡを定量する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、７０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることがより好ましく、１２０ｎｍ以上１８０ｎｍ以下であることがさらに好ましく、１３０ｎｍ以上１７０ｎｍ以下であることが特に好ましい。
  第一の粒子と第二の粒子の使用比率については、第一の粒子に対する第二の粒子の質量比が１～１０であることが好ましく、１～６であることがより好ましく、２～６であることが更に好ましい。
［測定キット］
  本発明の測定キットは、上記した本発明の試薬キットと、血清アミロイドＡまたは上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質（即ち、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質、または上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質）が固定されている第一の金属膜が形成された基板とを含む。上記基板には、血清アミロイドＡと結合性を有さず、第一の結合物質と特異的な結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されていてもよい。
（第三の結合物質）
  第三の結合物質は、血清アミロイドＡまたは第一の結合物質と特異的な結合性を有する物質である限り特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体が挙げられ、抗体を用いることが好ましい。第三の結合物質が抗体である場合は、血清アミロイドＡに対して特異性を有する抗体として、例えば、血清アミロイドＡによって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、血清アミロイドＡによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
  抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ハムスターＩｇＭ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルのどちらも使用可能である。断片化抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。
　第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質としては、特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体が挙げられる。抗体の調製方法および抗体の種類は、上記した内容と同様である。
（第四の結合物質）
  第四の結合物質は、血清アミロイドＡと結合性を有さず、第一の結合物質と特異的な結合性を有する物質である。第四の結合物質としては、例えば、第一の結合物質（抗体）に対する抗体、結合物質（抗体）に対して結合するタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ）など、第一の結合物質に対して親和性を持つ化合物を使用することが好ましく、中でも更に好ましくは、抗体を使用することができる。抗体の調製方法および抗体の種類は、第三の結合物質について記載した内容と同様である。また、標識を有する第一の粒子に結合した第一の結合物質の一部が、第四の結合物質とリガンド－非リガンドの関係となる化合物を好ましく用いることができる。
（結合物質を基板に固定化する方法）
  抗体などの第三の結合物質および第四の結合物質を基板に固定化する方法は、例えば、Ｎｕｎｃ社の提供するＴｅｃｈ  Ｎｏｔｅｓ  Ｖｏｌ．２－１２などに記載されており、一般的なＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）などを配することによる表面修飾を施しても良く、結合物質としての抗体を基板に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、および共有結合による化学結合を用いた方法のいずれの方法も採用可能である。抗体を基板に固定させた後に抗体が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
（基板）
  本発明で用いる基板は、金属膜が形成された基板であり、その形態は特に限定されないが、後述する表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）を行う場合には、後述する流路、および表面に反応部位である金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るような物質を用いることができる。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の金属が挙げられ、特に金が好ましい。上記の金属は単独または組み合わせて使用することも可能である。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は特に制限はないが、例えば、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるものが好ましく、更には、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるものが好ましく、特に１ｎｍ以上１００ｎｍ以下であるものが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
  金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタリング法、マグネトロンスパッタリング法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができるが、基板への金属膜の良好な付着性を実現するために、スパッタリング法により金属膜を形成することが好ましい。
  金属膜は、好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置されている」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む。本発明で使用することができる基板としては例えば、一般的な光学ガラスの一種であるＢＫ７（ホウ珪酸ガラス）等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。ＳＰＦ法による蛍光検出のための基板の一例としては、ポリメチルメタクリレート上に、金膜をスパッタリング法で作製した基板などを挙げることができる。
［血清アミロイドＡの測定方法］
  本発明による生体試料中の血清アミロイドＡの測定方法は、
血清アミロイドＡを含む生体試料と、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤、反応液のｐＨを５．５～７．０または８．５～９．０に調整可能なバッファーとを含む混合液を調製する工程；
血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板の一端の注入口に、上記混合液を添加する工程；
上記混合液を上記基板上に流下させる工程；および、
上記第一の金属膜上の標識の情報を取得する工程、
を含む。
  生体試料としては、被検物質である血清アミロイドＡを含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特に、ネコ、イヌ、またはヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、または喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚などを挙げることができる。
　非イオン性界面活性剤は、ＳＡＡを含む生体試料の前処理に使用される。前処理液としては、事前に界面活性剤を含む液を準備し、検体液に混合して使用する使用方法や、生体試料液そのものに、乾燥した固形分の界面活性剤を添加して、検体液に溶かしこむ使用方法が用いられる。この場合、生体試料液と界面活性剤を混合した混合液中の界面活性剤の濃度としては、０．０１質量％以上１０質量％以下が好ましく、０．０５質量％以上５質量％以下がより好ましく、０．１質量％以上３質量％以下が更に好ましく、０．１質量％以上２質量％以下が特に好ましい。濃度が、０．０１質量％以上であると有効にＳＡＡをＨＤＬから分離することが可能となり、濃度が１０質量％以下であると、界面活性剤の影響を受けにくい状態で、標識を有する第一の粒子上の第一の結合物質や、あるいは基板上の第一の金属膜上に固定された第三の結合物質と、ＳＡＡとが反応することが可能となる。
  上記混合液は、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾された第二の粒子をさらに含んでいてもよい。
  また本発明による血清アミロイドＡの測定方法は、上記混合液を、血清アミロイドＡと結合性を有さず、上記第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜に接触させる工程と、上記第二の金属膜から上記標識に応じたシグナルを検出する工程と、上記第二の金属膜から検出したシグナルを用いて上記第一の金属膜から検出したシグナルを補正する工程とをさらに含んでいてもよい。
（測定方法）
  本発明の測定方法は、血清アミロイドＡの存在の有無の検出や血清アミロイドＡの量の測定（すなわち、定量）などを含む、最も広い概念として解釈される。本発明の測定方法の具体的な実施態様としてはサンドイッチ法または競合法が挙げられ、サンドイッチ法が好ましい。
＜サンドイッチ法＞
  サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により血清アミロイドＡを測定することができる。まず、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質、および血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質を予め用意しておく。第一の結合物質を、標識を有する第一の粒子に結合させて、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された第一の粒子を作製する。次いで第三の結合物質を用意し、基板上に固定して反応部位（テストエリア）とする。また、第四の結合物質を用意し、基板上に固定してコントロールエリアとする。別途、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質を用意し、標識を有さない第二の粒子に結合させて、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された標識を有しない第二の粒子を作製する。上記の第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。血清アミロイドＡを含む可能性のある被検試料（またはその抽出液）と、第一の粒子と第二の粒子の混合物と、界面活性剤とを混合し、この混合した液を基板に適用し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に血清アミロイドＡが存在する場合には、反応部位で、血清アミロイドＡと、第一の粒子に結合した第一の結合物質との間、および血清アミロイドＡと反応部位上の第三の結合物質との間で反応（抗原および抗体を用いた場合には、抗原抗体反応）が起こり、血清アミロイドＡの量に応じた第一の粒子が反応部位上に固定される。サンドイッチ法では、反応部位上に固定した第三の結合物質と、血清アミロイドＡとの反応、および血清アミロイドＡと第一の粒子に結合している第一の結合物質との反応が終了した後、基板上のテストエリアおよびコントロールエリアで結合しなかった第一の粒子を除去する目的で、洗浄を行うこともできる。次いで反応部位に結合した第一の粒子からのシグナル強度を検出することで、正確な血清アミロイドＡの濃度を測定することができる。なお、蛍光強度と血清アミロイドＡの濃度は、正の相関関係がある。
＜競合法＞ 
　競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により血清アミロイドＡを測定することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として当業界においてよく知られている。まず、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質と、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質を予め調製する。次いで第一の結合物質を第一の粒子に結合させ、第二の結合物質を第二の粒子に結合させる。また、第一の結合物質に対して結合性を有する、血清アミロイドＡそのもの、または血清アミロイドＡと類似な部位を持ち血清アミロイドＡと同様の第一の結合物質に対するエピトープを持つ化合物を基板上に固定し反応部位とする。次に、第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。血清アミロイドＡを含む可能性のある被検試料（またはその抽出液）と、第一の粒子と第二の粒子の混合物と、界面活性剤を混合し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に血清アミロイドＡが存在しない場合には、第一の粒子に結合した第一の結合物質と、反応部位上に固定した第一の結合物質に対して結合性を有する血清アミロイドＡそのものまたは血清アミロイドＡと同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ類似化合物とにより、基板上で反応が起こる。一方、血清アミロイドＡが存在する場合には、第一の結合物質に血清アミロイドＡが結合するため、第一の結合物質に対して結合性を有する、血清アミロイドＡそのもの、または血清アミロイドＡと類似な部位を持ち血清アミロイドＡと同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ化合物との、反応部位上における反応が阻害され、標識を有する第一の粒子が反応部位上へ固定されることが阻害される。競合法では、予め、血清アミロイドＡの濃度が異なる血清アミロイドＡの量が既知である試料を複数用意し、この試料および結合物質標識蛍光粒子を反応部位上に接触させつつ、反応部位からの蛍光シグナルを異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各血清アミロイドＡ濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、血清アミロイドＡ濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する血清アミロイドＡの濃度の検量線を取得する。このように取得した検量線に基づき、目的とする被検試料を用いた蛍光量の時間変化の結果から、被検試料に含まれる血清アミロイドＡの量を定量することができる。
（流路）
  本発明の好ましい態様においては、血清アミロイドＡを含む可能性のある被検試料（またはその抽出液）と、標識を有する第一の粒子と、界面活性剤と、さらに所望により第二の粒子とを混合した混合物を調製する。この混合物を基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、被検試料と、標識を有する第一の粒子（および所望により第二の粒子）とを反応部位まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、標識を有する第一の粒子（および所望により第二の粒子）を含む被検試料液を点着する点着口、第三の結合物質が固定化された反応部位としての金属薄膜、および金属薄膜を越えて流路が存在し、被検試料が、金属薄膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属薄膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
（標識に応じたシグナルを検出する方法）
  本発明においては、標識に応じたシグナルを検出する。上記の通り標識は蛍光を発することが好ましく、この場合には、蛍光を検出することにより、標識に応じたシグナルを検出することができる。蛍光の検出方法としては、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、または表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。蛍光強度の検出は、通常、抗原抗体反応後一定時間、例えば、数分～数時間後に終了する。免疫複合体の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、蛍光強度と血清アミロイドＡの濃度の関係から、血清アミロイドＡの濃度を定量することができる。なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。なお、ＳＰＦ法は、落射励起による蛍光検出法（落射蛍光法）よりも高感度に測定することができる。
  表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）バイオセンサーとしては、例えば、特開２００８－２４９３６１号公報に記載されているような、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを光導波路に通し、上記光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、上記表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されたことによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたセンサーを用いることができる。
（血清アミロイドＡの量の測定方法）
  本発明におけるＳＰＦ法での血清アミロイドＡの定量方法の一例としては、以下の方法により血清アミロイドＡを定量することができる。具体的には、各濃度既知の血清アミロイドＡを含む試料を準備し、蛍光を検出する部位を流下させつつ、蛍光検出部位からの蛍光シグナルを異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各血清アミロイドＡ濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、血清アミロイドＡ濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する血清アミロイドＡ濃度の検量線を取得する。光シグナルシステムとしては、血清アミロイドＡごとに対応する検量線に基づき、目的とする被検試料の血清アミロイドＡ量を特定することができる。
  本発明における表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）系は、基板上の金属薄膜上に固定化された血清アミロイドＡの量に依存した蛍光物質からの蛍光を検出するアッセイ方法であり、溶液中での反応の進行により、光学的な透明度の変化を、例えば濁度として検出する、いわゆるラテックス凝集法とは異なる方法である。ラテックス凝集法では、ラテックス試薬中の抗体感作ラテックスと検体中の抗原が、抗体反応により結合し、凝集する。この凝集塊は時間と共に増大し、この凝集塊に近赤外光を照射して得られた単位時間当たりの吸光度変化から、抗原濃度を定量化する方式が、ラテックス凝集法である。本発明では、ラテックス凝集法に比べて、非常に簡便な血清アミロイドＡの検出方法を提供できる。
　以下に、本発明の実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例に示される材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。以下の化学式においてＥｔはエチルを示す。
　以下の界面活性剤を使用した。
Ｄ３１６：ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学社製）、下記式（Ａ）においてＲがドデシルオキシ基である化合物
Ｄ３８２：ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学社製）、下記式（Ａ）においてＲがデシルオキシ基である化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
ＭＥＧＡ－９：ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン（同仁化学社製）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Ｏ００１：ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド（同仁化学社製）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
ラウレス９：ＰＯＥ（９）ラウリルエーテル（日本エマルジョン社製ＥＭＡＬＥＸ（登録商標）７０９）
ラウレス１５：ＰＯＥ（１５）ラウリルエーテル（日本エマルジョン社製ＥＭＡＬＥＸ（登録商標）７１５）
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（イオン性界面活性剤、富士フイルム和光純薬製）
ジメチルジステアリルアンモニウムクロリド〈イオン性界面活性剤、富士フイルム和光純薬製〉
ラウレス２０：ＰＯＥ（２０）ラウリルエーテル（日本エマルジョン社製ＥＭＡＬＥＸ（登録商標）７２０）
＜実施例１＞
（１）平均粒子径１５０ｎｍラテックス粒子の製造
　スチレン（富士フイルム和光純薬社製）３０ｇ（２８８ｍｍｏｌ）とアクリル酸（富士フイルム和光純薬社製）３ｇ（４２ｍｍｏｌ）を超純水４４０ｍＬに懸濁させ、９５℃に昇温し、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）（富士フイルム和光純薬社製）１ｇを超純水１０ｍＬに溶解させた水溶液を添加し、９５℃、２５０ｒｐｍで６時間攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍで６時間遠心分離を３回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が１質量％となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーＦＰＡＲ－１０００（大塚電子（株））を用いて、温度２５℃で測定したメジアン径（ｄ＝５０）として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は１５０ｎｍであった。
（２）蛍光ラテックス粒子の作製
　上記のように作製した平均粒子径１５０ｎｍのラテックス粒子の固形分濃度２質量％の水分散液１００ｍＬにメタノール１００ｍＬを加え、１０分間、室温で攪拌した。一方、別途用意したＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍＬ、ＣＨＣｌ３　９ｍＬおよびエタノール１６ｍＬに溶解させた蛍光色素（ＮＫ１３６、林原生物化学研究所製）１２ｍｇを６０分間かけてゆっくりラテックス溶液に滴下した。滴下完了後、エパポレーターで有機溶媒を減圧留去した後、遠心分離とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）水溶液への再分散を３回繰り返し、精製を行うことで、蛍光ラテックス粒子を調製した。
（３）モノクローナル抗体の作製
　抗ＳＡＡモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ－ＳＡＡ）および抗ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）モノクローナル抗体（ＭＭ５０１７５）は、マウス腹水法を用いて、以下のように作製した。
　Ｈｙｔｅｓｔ社より購入したＳＡＡを用いて、マウスに免疫した後に脾臓細胞を抽出し、ミエローマ（製品名Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８－Ｕ１、コスボバイオ社製）と混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法にて細胞融合を実施した。使用細胞としては、最終免疫してから３日後に採取した脾臓細胞を使用した。細胞比は、脾臓細胞：ミエローマ＝１０：１とした。細胞播種は、脾臓細胞として０．５～１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種した。使用した培地は、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｍｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清：Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ）、およびＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン混合培地、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｍｅｄｉｕｍ）を適宜使用した。最終的に増殖した融合細胞（ハイブリドーマ）をマウス腹腔内に注射し、一定期間の経時後に腹水を取り出し、遠心分離、精製工程を経て得られたものを抗ＳＡＡモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ－ＳＡＡ）として採取した。また、抗ＳＡＡモノクローナル抗体の作製と同様にして、大腸菌の培養液から精製したＣＲＰ（オリエンタル酵母工業（株）社製）を用いて、抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＭ５０１７５）を作製した。
（４）抗ＳＡＡ抗体で修飾した蛍光ラテックス粒子の調製
　抗ＳＡＡ抗体で修飾した蛍光粒子を、以下の通り調製した。
　２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（平均粒子径１５０ｎｍ）２７５μＬに、５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（２－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）バッファー（ｐＨ６．６）溶液８８μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗ＳＡＡモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ－ＳＡＡ）１７６μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、富士フイルム和光純薬社製）水溶液を５μＬ加え、室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（富士フイルム和光純薬社製）水溶液を８．８μＬ添加して１５分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を５００μＬ加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液５００μＬを加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗ＳＡＡ抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。
（５）蛍光標識をしない抗ＣＲＰ抗体で修飾したラテックス粒子の作製
　２質量％（固形分濃度）ラテックス粒子水溶液（平均粒子径１５０ｎｍ）３００μＬに、２５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳバッファー（ｐＨ５．６）溶液９６μＬおよび超純水２５ｍＬを加え、さらに５ｍｇ／ｍＬの抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＭ５０１７５）１８２μＬを添加した。得られた混合物を室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（Ｎ－ｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）水溶液９．６μＬを加え、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／Ｌのグリシン（富士フイルム和光純薬社製）水溶液を３０μＬ添加して、得られた混合物を３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、ラテックス粒子を沈降させた。上清を取り除き、沈殿物にＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を６００μＬ加え、超音波洗浄機によりラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、沈殿物に１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液６００μＬを加えて、ラテックス粒子を再分散させた。このようにして抗ＣＲＰ抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。
（６）乾燥粒子の作製
　超純水２４０μＬ、２０質量％スクロース水溶液４１７μＬ、２０質量％ＢＳＡ水溶液２２９μＬ、１質量％抗ＳＡＡ抗体修飾蛍光ラテックス粒子（平均粒子径１５０ｎｍ）１２５μＬ、０．８ｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝６．５）８９９μＬを混合した。ポリプロピレン（プライムポリマー社製、プライムポリプロ　ランダムＰＰグレード）を基体としたカップを準備し、上記混合液４０μＬをカップ内に点着した。その後、スーパードライ乾燥機（ＴＯＹＯリビング社、ウルトラスーパードライ００シリーズ）を用いて、２４時間かけて含水量を１２％以下となるまで乾燥させ、その後、２５℃５０％ＲＨ（相対湿度）の環境で１５日間保存することで、表１に示す実験水準１に示した乾燥粒子を作製した。また、下記の実施例２、比較例４に使用した乾燥粒子の作製においては、上記で調製した、蛍光標識をしない抗ＣＲＰ抗体で修飾したラテックス粒子を、抗ＳＡＡ抗体修飾蛍光ラテックス粒子の質量に対して５倍量混合し、他は同様に乾燥粒子を調製した。
（７）基板の作製
　ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ、三菱レイヨン社製、アクリペットＶＨ－００１）を基体とした基板の片面に、テストエリアおよびコントロールエリア共に幅４ｍｍ、厚さが３６ｎｍとなるように、テストエリアに用いる金膜と、その隣に、コントロールエリアに用いる金膜とを、マグネトロンスパッタリング法により作製した。この基板を幅５ｍｍとなるように裁断して基板を作製した。この基板のテストエリアの金膜上には、抗ＳＡＡモノクローナル抗体を含む液（濃度：１０μｇ／ｍＬ　ｉｎ１５０ｍｍｏｌ　ＮａＣｌ）を点着し、１時間、２５℃にてインキュベートし、物理吸着させて固定化を行った。
（８）基板の洗浄およびブロッキング
　このように調製した基板をセンサチップの流路に取り付ける前に、予め調製した洗浄用溶液（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、富士フイルム和光純薬社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４））を３００μＬ用いて３回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金膜上の抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、１質量％カゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を３００μＬ添加し、１時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ（ＡＢＩ社製）３００μＬを添加し、室温で３０分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除いた。
（９）センサチップの作製　
　特開２０１０－１９０８８０号公報の第２の実施形態の構成となるように、作製した基板を流路に封入し、流路型センサチップを作製した。その概略図を図１および図２に示した。図１は、センサチップ１の概略図であり、図２は、センサチップ１の分解図である。センサチップ１は、上部部材２、中間部材３および基板４から構成されている。上部部材２には、第一の容器５および第二の容器６が設けられている。なお、第一の容器５および第二の容器６を併せて、容器群７と称する。基板４には、流路１０が形成されており、流路１０の上には、検出領域８および参照領域９が形成されている。
（１０）被検試料の準備
　ネコの血清は、北山ラベスから購入した交雑種の血清を使用し、被検物質である血清アミロイドＡの濃度が異なる被検試料（検体）Ｎｏ．１およびＮｏ．２を用意した。
（１１）対照キットによる測定
　免疫測定で、当業者により使用されているＥＬＩＳＡキット（Ｐｈａｓｅ　ＳＡＡ　Ａｓｓａｙ（７ｃａｔ．ｎｏ．ＴＰ－８０２）：Ｔｒｉｄｅｌｔａ社製対照キット）を用い、取り扱い説明書に従い、被検試料中の血清アミロイドＡの測定を行い被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２のＳＡＡ濃度を測定した。被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２のＳＡＡ濃度は、４３．８μｇ／ｍＬと４．１μｇ／ｍＬであった。
（１２）蛍光粒子を用いたＳＡＡの免疫測定
　（１０）で準備した被検試料（ネコの血清）１０μＬと、非イオン性界面活性剤であるＤ３１６（同仁化学製）の生理食塩水溶液９０μＬを充分に混合して、被検試料の混合液１を作製した。この混合液の界面活性剤Ｄ３１６の濃度は、０．２５質量％であった。次に、（４）で調製した、抗ＳＡＡ抗体標識蛍光粒子を点着し乾燥させたカップに、作製した混合液１を添加し、１０分間、十分に攪拌した。次に、上記で作製した基板を封入した流路型センサチップの注入口に蛍光粒子と混合した混合液１を点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液１を１０μＬ／ｍｉｎの速度で流路を流下させ、ＳＡＡ抗体を固定した金膜面上の蛍光強度を１．５分間継続して測定した。各基板において得られた蛍光強度の単位時間における蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２に対してそれぞれ測定した。測定開始のシグナル値に対する１．５分間測定を継続した後のシグナル値の比をシグナル傾きとして測定し、Ｎｏ．１とＮｏ．２のＳＡＡ濃度差に対するＮｏ．１とＮｏ．２のシグナル傾きの差として求めた。
＜実施例２＞
　実施例１で使用した抗ＳＡＡ抗体で修飾した蛍光ラテックス粒子に対して、蛍光標識をしない抗ＣＲＰ抗体で修飾したラテックス粒子を、質量比で５倍量、追加で加えた乾燥粒子を調製し、使用したこと以外は、実施例１と同様にして、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２に対してそれぞれ測定した。測定開始のシグナル値に対する１．５分間測定を継続した後のシグナル値の比をシグナル傾きとして測定し、Ｎｏ．１とＮｏ．２のＳＡＡ濃度差に対するＮｏ．１とＮｏ．２のシグナル傾きの差として求めた。
＜実施例３～９＞
　実施例１において、界面活性剤Ｄ３１６の代わりに、表１に示した界面活性剤および濃度に変更したこと以外は実施例１と同様にして、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２に対してそれぞれ求めた。測定開始のシグナル値に対する１．５分間測定を継続した後のシグナル値の比をシグナル傾きとして測定し、Ｎｏ．１とＮｏ．２のＳＡＡ濃度差に対するＮｏ．１とＮｏ．２のシグナル傾きの差として求めた。
＜比較例１～３＞
　界面活性剤を実施例１のものから以下の表に記載したものに変更すること以外の作業は実施例１と同様に行い、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２に対してそれぞれ求めた。測定開始のシグナル値に対する１．５分間測定を継続した後のシグナル値の比をシグナル傾きとして測定し、Ｎｏ．１とＮｏ．２のＳＡＡ濃度差に対するＮｏ．１とＮｏ．２のシグナル傾きの差として求めた。
＜比較例４＞
　比較例３において使用した抗ＳＡＡ抗体で修飾した蛍光ラテックス粒子に対して、蛍光標識をしない抗ＣＲＰ抗体で修飾したラテックス粒子を、質量比で５倍量、追加で加えた乾燥粒子を調製し、使用したこと以外は、比較例３と同様にして、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２に対してそれぞれ求めた。測定開始のシグナル値に対する１．５分間測定を継続した後のシグナル値の比をシグナル傾きとして測定し、Ｎｏ．１とＮｏ．２のＳＡＡ濃度差に対するＮｏ．１とＮｏ．２のシグナル傾きの差として求めた。
　結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表１から、非イオン性界面活性剤で分子量１０００以下の界面活性剤および反応液のｐＨを５．５～７．０または８．５～９．０に調整可能なバッファーを用いることで、高感度にＳＡＡを測定することが可能になることが確認できた。シグナル傾きが、２．０以上であれば、被検試料中のＳＡＡ濃度を実用的に検出することが可能であり、９．５以上であれば、より精度良く検出することが可能となり、本発明の効果が確認された。
（実施例１０～１３、および比較例５、６）
　０．８ｍｏｌ／ＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ＝６．５）８９９μＬの代わりに、水酸化ナトリウム量を調整して、表２に記載のｐＨとなるようにそれぞれバッファーを調製した。それ以外は実施例１と同様に行い、実施例１０～１３、および比較例５、６のサンプルを作製した。
　続いて、北山ラベスから購入した交雑種の血清を使用し、被検物質の濃度が異なる被検試料（検体）Ｎｏ. ３～７を用意した。上記（１１）に記載の対照キットを用いてＳＡＡ濃度を測定したところ、それぞれ０．５μｇ／ｍＬ、５．５μｇ／ｍＬ、６０．８μｇ／ｍＬ、１１１．０μｇ／ｍＬ、１５９．１μｇ／ｍＬであった。続いて実施例１、１０～１３、および比較例５、６のキットを用いて被検試料（検体）Ｎｏ. ３～７のシグナルを測定し、実施例１、１０～１３、比較例５、６のキットそれぞれに対して検量線を作成した。次に、動物病院にて採血された様々な種類のネコ血清５００検体について比較例５のキットの測定値から検量線を用いて濃度を計算した値と対照キットとで測定した値が最も大きく乖離していた検体を用いて、実施例１、１０～１３、および比較例５、６のキットを用いてシグナルを測定し、検量線からＳＡＡ濃度を算出した測定値を表２に示した。表２には、対照キットによる測定値も示した（対照法の欄）。測定した値に対して、下記に示した評価基準で評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
評価基準
Ａ：非常に好ましい（０μｇ／ｍＬ≦測定値≦５μｇ／ｍＬ）
Ｂ：やや高値に乖離しているが許容内（５μｇ／ｍＬ＜測定値≦２０μｇ／ｍＬ）
Ｃ：許容外（２０μｇ／ｍＬ＜測定値）
　表２から、ネコにおけるＳＡＡの基準範囲を２０μｇ/ｍＬと仮定した時の高値乖離検体（対照法＝１μｇ/ｍＬであり、概ねゼロの検体が実施例１では５μｇ/ｍＬの値となった）における目標値（＝２０μｇ/ｍＬ以下）に対し、本発明のバッファーｐＨ領域で本発明の効果、すなわち高値乖離が目標範囲に改善されることが確認できた。
１　センサチップ
２　上部部材
３　中間部材
４　基板
５　第一の容器
６　第二の容器
７　容器群
８　検出領域
９　参照領域
１０　流路
 

Claims (17)

  1. 血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、
    少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤と、
    反応液のｐＨを５．５～７．０または８．５～９．０に調整可能なバッファー
    とを含む、血清アミロイドＡの測定のための試薬キット。
  2. 前記界面活性剤が、グルカミン骨格を有する化合物である、請求項１に記載の試薬キット。
  3. 前記界面活性剤が、下記式（１）で表される化合物である、請求項１または２に記載の試薬キット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうち少なくとも３つは水素原子である。Ｒ７は、置換されていてもよい炭化水素基を示す。
  4. 前記界面活性剤が、疎水性基を有する単糖類または疎水性基を有する二糖類である、請求項１に記載の試薬キット。
  5. 前記界面活性剤が、グルコース骨格またはマルトース骨格を有する化合物である、請求項４に記載の試薬キット。
  6. 前記界面活性剤が、下記式（２）または下記式（３）で表される化合物である、請求項１、４および５の何れか一項に記載の試薬キット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     式中、Ｒ１１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５のうち少なくとも３つは水素原子である。
    式中、Ｒ２１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８のうち少なくとも３つは水素原子である。
  7. 前記第一の粒子が、ラテックス粒子である、請求項１から６のいずれか一項に記載の試薬キット。
  8. 前記第一の粒子の平均粒径が７０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、請求項１から７のいずれか一項に記載の試薬キット。
  9. 前記標識が蛍光色素を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の試薬キット。
  10. 前記第一の結合物質が抗体である、請求項１から９のいずれか一項に記載の試薬キット。
  11. 血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子をさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の試薬キット。
  12. 前記バッファーが、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸またはＮ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシンである、請求項１から１１の何れか一項に記載の試薬キット。
  13. 請求項１から１２のいずれか一項に記載の試薬キットと、血清アミロイドＡまたは前記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板とを含む、血清アミロイドＡのための測定キット。
  14. 前記基板に、血清アミロイドＡと結合性を有さず、前記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されている、請求項１３に記載の測定キット。
  15. 血清アミロイドＡを含む生体試料と、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤と、反応液のｐＨを５．５～７．０または８．５～９．０に調整可能なバッファーとを含む混合液を調製する工程；
    血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板の一端の注入口に、前記混合液を添加する工程；
    前記混合液を前記基板上に流下させる工程；および、
    前記第一の金属膜上の標識の情報を取得する工程、
    を含む、生体試料中の血清アミロイドＡの測定方法。
  16. 前記混合液中の前記界面活性剤の濃度が０．０１質量％以上１０質量％以下である、請求項１５に記載の血清アミロイドＡの測定方法。
  17. 前記混合液を前記注入口に添加する前に、前記混合液が生理食塩水によって４倍以上１００倍以下の希釈倍率で希釈される、請求項１５または１６に記載の血清アミロイドＡの測定方法。
     
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