JPH09500271A

JPH09500271A - 卵黄免疫グロブリン（ｉｇｙ）に対するモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH09500271A
Application number: JP7504251A
Authority: JP
Inventors: ジャコウスキ，ジョージ; タカハシ，ミコヨ
Original assignee: SPECTRAL DIAGNOSTICS, INC.
Current assignee: SPECTRAL DIAGNOSTICS, INC.
Priority date: 1993-03-03
Filing date: 1993-07-14
Publication date: 1997-01-14
Also published as: EP0710252A1; AU4553993A; WO1995002612A1; ZA944547B

Abstract

(57)【要約】ニワトリ抗体は哺乳類抗体より優れているので、イムノアッセイに使用するために増殖させた。ニワトリ卵黄由来の精製IgGを使用して一連のマウスモノクローナル抗休が開発され、ELISAおよびイムノブロッティング技術により性質を調べた。得られたモノクローナル抗体はニワトリIgG特にIgG重鎖に高い親和性を有している。ヒト、マウス、ヤギあるいはウサギIgGとは交叉反応性がないことが観察された。これらのモノクローナル抗体はレポーター抗体として使用され、またニワトリIgGに対し特異性、親和性の明らかな損失なしに西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した。

Description

【発明の詳細な説明】卵黄免疫グロブリン(IGY)に対するモノクローナル抗体本件は、１９９１年５月３日出願の米国特願No.０７／６９５,３８１の部分継続出願に代わる、１９９３年３月３日出願の米国特願No.０８／０２６,４５３の部分継続出願である。発明の分野本発明はニワトリ卵黄免疫グロブリンに対するモノクローナル抗体（以下ＩｇＹと称する）およびイムノアッセイにおけるその使用に関する。更に本発明はリポーター抗体としてのニワトリＩｇＹに対するモノクローナル抗体を使用した診断システムに関する。関連技術の背景および説明イムノアッセイはｉｎｖｉｔｒｏで抗体と抗原間の関係を利用した物質の存在を測定する技術である。この中にはエンザイムイムノアッセイ(EIA)に対する抗体／抗原複合体の単純沈降が含まれる。今日、EIAは特別な技術として使用されている。およそ２０年前に開発されたハイブリドーマ技術の導入以来、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は広くＥＩＡに使用されてきた。MAbの優れた点は：それらの限定された抗原特異性、制限のない供給可能性、一定の活性（即ち変化しない）および一度同定されれば容易に調製できること、にある。EIAに要求される最も重要な優れたMAbは測定方法、特異性および感受性の標準化を可能にすることである。 MAbの人気にも係わらず、ヤギ、ウサギおよびその他の哺乳動物からのポリクローナル抗体が未だにイムノアッセイに使用されている。哺乳動物から得られるポリクローナル抗体の限度は：複雑な免疫調節機構によるロット間の変化、非常に経費のかかる維持、およびしばしば困難か長期間を要する免疫測定法である。最近、鳥類の抗体の使用がイムノアッセイでの使用に流行を博している。この人気の理由は、ニワトリのものが哺乳類のものを超えたいくつかの進歩によるものである。哺乳類のタンパクは系統発生的に隔たりのあるニワトリにおいて通常より免疫原性がある。一例として、ヒトインシュリンレセプターに対する高親和性抗体は、ウサギにおいていく度もの失敗を重ねた後、ニワトリの卵から得られたことがあげられる（シー・エー・スチュアート等、アナリティカル・ビオケミストリー、C.A.Stuart et al.,Anal.Biochem.,173,142,1988）。他の利点は調製が単純であることである。抗原による免疫に続いて特異抗体を高レベルで生成し、そしてこれら大量の抗体を産卵鶏の血清から未受精卵の卵黄に移植するニワトリの能力により、研究者は、侵襲的な技術を必要とせずに、その代わりとして卵を単に集めるだけによって、抗体を得ることが可能となったのである。簡単で連続性のある試料の採取という進歩に加えて、卵黄の抗体は４℃で保存するとき長期間安定であり(ジェー・シー・ジェンセニウス等、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド、J.C.Jensenius et al.,J.Immunol.Method,46,63,1981)、および血清からの大量生産より以上に卵黄から大量の抗体を得ることができる（エム・ガスマン等、Ｍ．Gassmann et al.,FABES J.,4,2528,1990）。トリのイムノグロブリン、IgYの性質は哺乳動物IgGとは異なっていることが示されている（ジー・エー・レスリーおよびエル・ダブリュー・クレム、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン、G.A.Leslie and L.W.Clem, J.Exp.Med.,130,1337,1969）。IgYは哺乳動物のFcレセプター、哺乳動物の補体、ブドウ球菌タンパクAあるいはブドウ球菌タンパクGとは反応しない（ジェー・シー・ジェンセニウス等、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド、J.C. Jensenius et al.,J.Immunol.Method,46,63,1981）。より最近の重要な発見は、ニワトリIgYは、多くの免疫測定法において偽陽性の主要原因である、リュウマチ因子（RF）とは反応しないことである（エー・ラーソン等、クリニカル・ケミストリー、A.Larsson et al.,Clin.Chem.,37,411,1991）。多くの臨床検査における分析体がEIAにより検出されている。臨床サンプル（即ち、血漿、血清あるいは全血）は、しばしば偽陽性の結果となる、イムノグロブリンやRFのような物質を含んでいる。上記したようなIgYの性質は、このイムノグロブリンのユニークな応用を可能ならしめ、それにより哺乳動物抗体間あるいはRFと哺乳動物抗体との反応の非特異作用による、偽陽性結果を防止することができる。 EIAにおけるIgYの応用の例は、しばしばサンドイッチアッセイと呼ばれている２部位アッセイである。哺乳類の、捕捉抗体を適当な支持体に結合させ、試料中の抗原と反応させた後に酵素標識検出IgY抗体を加える、それによって、先ず結合がおこり、続いて抗原の存在が同定される。測定を単純にするために酵素標識検出抗体を使用することが一般的に云って最良であるが、検出抗体に特異的なリポーター抗体を使用することは、モニターすべき酵素標識検出試薬の数を減らせることになる。現在まで、卵黄中の力価またはニワトリイムノグロブリン（IgY）の存在は、ニワトリIgYに対するウサギポリクローナル抗体を使用してモニターされていた。諸著者により以前に挙げられた全ての実験では、IgYに対するウサギで高められたポリクローナル抗体をリポーター抗体として使い、そしてアルカリ性ホスファターゼと結合させるか、あるいは¹²⁵Iで標識していた。ペルオキシダーゼ複合ウサギポリクローナル抗IgYは市販されている。これらのウサギポリクローナル抗体はイムノアッセイで高いバックグランド値を示す。これは、反応性と非反応性検定の間の識別がきわどいようなin vitro診断において問題である。本発明のモノクローナル抗体は、卵黄IgG（IgY）について開発されたものであり、それはトリIgYを使用するイムノアッセイのための試薬の連続的な供給源として使用することができる。これらのモノクローナル抗体は、公知のウサギポリクローナル抗体の欠点を克服するものである。発明の要約ニワトリ抗体は量を増した状態でイムノアッセイにおいて使用される。ニワト IgYに対する新しいモノクローナル抗体は酵素結合イムノソルベントアッセイ（イライザ、ELISA）において、捕捉抗体として、あるいはIgYsに対する検出抗体として使用することができる。本発明において記載されているモノクローナル抗体とは、IgYの重鎖に特異的であり、ヒトIgG、ヤギIgG、ウサギIgGまたはヒツジ IgGのようなEIAsにおいて通常使用される抗体と殆どか全く交叉反応を示さないものである。検出体としてニワトリIgYsが使用されるサンドイッチアッセイにおいては、検出IgYは直接標識することができる。同様に、単一酵素結合第２抗体（レコーダー抗体）は多くの異なった測定に使用することができる。それで個々の検出ニワトリIgY抗体と標識酵素の結合に多くの労力を使わないですむのである。更に、第２抗体は増幅検出系を形成するために使用することができる。本発明によれば、ニワトリ卵黄イムノグロブリン(IgY)に対して開発されたモノクローナル抗体が提供される。本発明の一具体例において、ハイブリドーマ細胞系統２Ｙ-１１４、１Ｙ-１６１、１Ｙ-１６２および１Ｙ-２６３が提供される。これらは各々ATCC寄託番号、、、に相当する。更に本発明によれば、上記した細胞系統から製造されるモノクローナル抗体が提供される。更に本発明の別の具体例によれば、イムノアッセイにおいてレポーター抗体としてのニワトリ卵黄イムノグロブリンに対して開発されたモノクローナル抗体の使用方法が提供される。それによると、該イムノアッセイは以下のものより構成されている：捕捉抗体；該捕捉抗体に相当する試験試料中の抗原；試験試料中の被験抗原に相当するニワトリ卵黄検出抗体；およびニワトリ卵黄イムノグロブリンに対し開発された標識モノクローナルレポーター抗体。本発明は、また、少なくとも、第１、第２および第３抗体からなる診断検定システムを目指している、それは：該第１抗体は試験試料中の試験抗原に相当する捕捉抗体であり；該第２抗体は該試験試料中の該試験抗原に相当するニワトリ卵黄検出抗体であり；そして該第３の抗体はニワトリ卵黄イムノグロブリンに対し開発された標識モノクローナル抗体である。図面の簡単な説明第１図は直接-（第１Ａ図）および間接-（第１Ｂ図）サンドイッチELISAの概要図を示す。第２図は抗IgYモノクローナル抗体と哺乳類IgGsの交叉反応性を示す。第３図はペルオキシダーゼ結合ウサギポリクローナル抗IgYと哺乳類IgGsの交叉反応性を示す。第４図は本発明のレポーター抗体としてMAb 1Y263-HRPとウサギポリクローナル抗IgY-HRPの感度をミオシン重鎖のイムノアッセイにおいてMAb捕捉抗体およびニワトリIgY検出体を用いて比較したもの。第５図は、第４図に記した抗体の比較を描く。但しイムノアッセイはトロポニンIに対するものである。第６図は、第４図に記した抗体の比較の結果を示す。但しイムノアッセイはミオシン軽鎖に対するものである。好適な具体例の詳細な説明本発明において使用される抗原および抗体は公知の標準的な方法により調製される。捕捉抗体として実施例中で使用される抗体はウサギ、ウマ、ヒツジあるいはヤギのような哺乳類の血清から調製することができる。二部位アッセイ（サンドイッチ法）においては、捕捉抗体は個相支持体に結合される。RIA（ラジオイムノアッセイ）またはELISA（酵素結合イムノソーベントアッセイ）に使用される固体支持体は例えば以下のものを含んでいる；プラスチック試験管、微量定量プレート（マイクロタイタープレート）、ディスク、フィルターまたはビーズ；ガラス繊維フィルター；ペーパーディスクまたはフィルター、セファロース（Sepharos c）ビーズ、ポリアクリルアミドゲル、およびブドウ球菌タンパクA。捕捉抗体は次いで、相当する抗原の存在をテストするために、試料と反応される。ここで、「相当する」という表現は公知例でよく知られており、抗原または抗体において使用されたときは、相当する物質と共に生成する物質、免疫複合休または抗原- 抗体複合体を意味する。本発明の一具体例によれば、免疫複合体または抗原-抗体ペアが試験抗原に相当する検出ニワトリIgY抗体により検出される。イムノアッセイにおいてトリ抗体を使用することはその量の増加が得られ、そして、上述したように哺乳類抗体に比べより幾分かの進歩が認められる。IgYは直接サンドイッチELISAにおいて使用することができる（第１Ａ図を参照）。ここで、IgYは抗原の存在を同定するために適当に標識されている。通常の標識は放射性標識、酵素、発色団、蛍光体および酵素補助因子、およびエフェクターを含む。酵素標識検出抗体の使用は測定を単純化するけれども、検出抗体に対して増加するレポーター抗体の使用は、調製しそしてモニターしなければならないような標識検出試薬の数を減らすことになる（第１Ｂ図参照）。それゆえに、本発明の標識レポーター抗体の使用は、検出抗体としてニワトIgYを使用するとき、いかなる抗原-抗体複合体の検出においても使用することができる「普遍的な」試薬を提供することになる。公知の報告されている抗体はIgYに対しウサギで増殖させたポリクローナル抗体であり、例えばアルカリ性ホスファターゼで標識された酵素標識か¹²⁵Iで標識されたものである。ペルオキシダーゼ結合ウサギポリクローナル抗IgYは市販されている。本発明のモノクローナル抗体は卵黄IgGに対して開発されたものであり、トリIgYを利用するイムノアッセイの試薬の連続的な供給源として使用することができる。ニワトリIgYに対するモノクローナル抗体の調製はジー・コーラーおよびシー・ミルシュタインによって、ネーチャー（ロンドン）２５６巻、１９７５、４９５頁およびヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー、１９７６、６：５１１-５１９(G.Kohler and C.Milstein,Naturc(Londo n)Vol.256,1975,P.495、Eur.J.Immunol.1976,6:511-519)に記載されており、ここに文献としてとりあげられている。本発明のレポーター抗体は、先行技術において公知であり、簡単に上記で示したとおり、試験される抗原の存在を同定するために標識されている。先行技術において知られているように、モノクローナル抗体の製造においては、抗原に対する親和性および特異性を選抜しなければならない莫大な数のハイブリドーマが製造される。本発明においては、モノクローナル抗体の試行錯誤の製造および分析が会合率、解離率および平衡動態と化学量論に関する情報を得ることができる表面プラズモン共鳴（SPR）の使用により大きく単純化された。それゆえに、再クローニングおよび拡大のためのクローンの選択において微妙な決定を、抗体と抗原の反応の親和性、特異性および安定性を基にして、行うことができる。本発明のモノクローナル抗体とニワトリ卵黄IgG間の相互作用の速度定数および親和定数はBIAcore^TMシステムを使用して決定された。（ファルマシア・バイオセンサー・エー・ビー、ウプサラ、スエーデン、Pharmacia Bi oscnsor AB,Uppsala,Sweden）。本システムは、ガラス支持体上の薄い黄金膜の表面における光学的性質の変化を検出する、表面プラズモン共鳴を利用している。詳細な理論的背景と方法はアール・カールソン等（R.Karlsson et al.）により記載されている。（ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド、J.Immuno l.Methods,１４５、２２９、１９９１、文献としてここにとりあげられている。）本発明のモノクローナル抗体の会合速度定数は3.0×10⁴Ｍ^-1s^-1から1.0×10⁶ Ｍ-¹s^-1の範囲であり得る。上記した範囲内の会合速度定数のモノクローナル抗体は、ここに記載した診断検査システムに適当なモノクローナル抗体であることが見い出され、本発明の範囲に含まれるとみなされる。本発明の一つの具体例において、5.6×10⁴Ｍ^-1s^-1から1.0×10⁵Ｍ^-1s^-1の範囲の会合速度定数のモノクローナル抗体は非常に有用であることが見い出された。解離速度定数は4×10^-4s^-1から2×10^-2s^-1の範囲であり得る。本発明の一具体例において、ここに調製されたモノクローナル抗体の解離速度定数は1.6×10^-4s^-1 から3.2×10^-4s^-1の範囲であった。会合速度定数／解離速度定数として計算された親和定数は1.5×10⁶Ｍ^-1から2.5×10⁹Ｍ^-1の範囲であり得る。本発明の一具体例において、親和定数2×10⁸Ｍ^-1から4.1×10⁸Ｍ^-1の範囲のモノクローナル抗体が調製された。上述したような速度および親和定数の計算によって当業者に、高価で繁雑なクローニングおよび再クローニングならびにハイブリドーマ細胞系統の拡大と続く試験結果を待つことなしに、適当なモノクローナル抗体を選択する迅速で効率的な方法を提供するものである。測定系においてニワトリIgYを検出抗体として使用することによって、ニワトリIgYに対するモノクローナル抗体を使用していかなる抗原も検出することができるということは当業者に明らかであろう。本発明の一具体例において、ニワト IgYに対するモノクローナル抗体が、心タンパク質の存在を検出するための診断測定におけるレポーター抗体として使用される。本発明の一見地によれば、患者の胸痛の発症初期における心筋梗塞を検出するための診断測定法が提供される。その測定は、測定されるべき分析体（心タンパク質）を含む患者の血液、血清または血漿試料を、心タンパク質に相当する、少なくとも１つの抗体と反応させることよりなる。本発明の一見地によれば、抗体の少なくとも１つはニワトリIgY であり、従って、本発明のモノクローナルニワトリIgYはレポーター抗体として使用することができる。この具体例によれば、試験されるべき分析体は、少なくとも３種の異なった心損傷のマーカーである。更にこの測定は、心臓の特徴的な連続性を認識し、心損傷の該マーカーのいずれかに特異的な少なくとも１つの抗体からなり、該抗体の一つはニワトリIgYである。更に本試験はレポーター抗体としての本発明のモノクローナルニワトリIgYからなる。本発明の別の見地によれば、胸痛の発症から６時間以内に血中に存在する、少なくとも３種のタンパク質（分析体）の存在または不存在を決定することにより、胸痛の発症初期における患者の胸痛の原因と病期を迅速に診断する方法を提供するものである。そのタンパク質は以下のものより成り立っている：第１のタンパク質（分析体）、このものは壊死部を欠いているので無酸素性傷害ではない心筋梗塞と壊死の発症から血中に存在し、胸痛の発症から４時間ないし８時間の間に診断される第１のタンパク質、第２のタンパク質（分析体）、このものは虚血性傷害に続いて血中に現われ、胸痛発症後少なくとも２時間から診断される心臓特異的な第２のタンパク質、および第３のタンパク質（分析体）、このものは壊死部を欠いているので無酸素性傷害ではない心筋梗塞と壊死の発症から６時間後に血中に存在し、胸痛の発症から６時間後に診断される第３のタンパク質。本発明の別の具体例によれば、診断測定はイムノアッセイサンドイッチドライケミストリー方式を利用したパネルテスト形式のものである。本具体例においては、捕捉抗体はパネルテストにおいて固体支持体に固相化されている。捕捉抗体は上述した心タンパク質マーカーの一つに相当するものである。心タンパク質マーカーに相当する検出ニワトリ抗体は、存在すれは、タンパク質マーカーに結合する。本発明のニワトリ卵黄イムノグロブリンに対するモノクローナル抗体がレポーター抗体として使用される。本発明のこれらの具体例については、文献としてここに取り入れられている出願０７／６９５,３８１および０８／０２６,４５３に記載されている。本発明の本具体例においては、心マーカータンパク質はクレアチンキナーゼ（ CK-MB）、ミオグロビン、ミオシン軽鎖（MLC）、トロポニン-I、トロポニン-T、トロポミオシンおよびミオシン重鎖から選択される。この具体例の一見地によれば、少なくとも３つの心タンパク質マーカーが本診断測定において検出される。本発明のイムノアッセイは固相あるいは液相で行うことかできる。イムノケミカルアッセイは競合および非競合結合アッセイを含み、それらは科学文献および特許文献に記載されている。そしてそのような測定法の多くは市販されている。本発明に適した典型的なイムノアッセイは米国特許3,791,932;3,817,837;3,839, 153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;3,879,262;3,901,654;3,935,07 4;3,984,533;3,996,345;4,034,074および4,098,876（全て文献としてここに取り入れられている。）に記載されている。同時に多くの試料を測定できるような自動測定装置の現在入手可能ないくつかの型が知られている。これらの自動測定装置には連続／ランダムアクセス測定装置が含まれる。そのようなシステムには、１９８８年時点で、ピー・ビー・ディアグノスティック・システムズ・インク(P.B.Diagnostic Systems Inc.)のOPUS^T ^M およびイリノイ州ノースシカゴのアボット・ラボラトリーズ（Abbott Laborato ries）により導入されたIMX^TMアナライザーがある。P.B.Diagnostic Systems In c.の自動測定装置は米国特許5,138,868に記載されており、本文献は文献として本発明に取り入れられている。IMXアナライザーの記載は、フィオーレ・エム等( Fiore,Ｍ.et al.)による「アボットIMX自動化ベンチトップイムノケミストリーアナライザーシステム」、クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry）３４巻、No.９、１９８８にあり、本文献も本発明に取り入れられている。自動化分析器は、本発明の具体例に従って、サンドイッチアッセイや競合アッセイのような種々の測定を行うための固相イムノアッセイ方法と共に使用されるように開発された。そのような分析器の例は、シー・ジェイ・グランドン（C.J.Grandon）の１９９０年９月１日発行、譲受人Abbott Laboratories、米国特許4,956,148「固定棚および使い捨て試料カートリッジ」にAbbott IMX^TMシステムに関連して使用される複数の反応セルを運ぶための回転台が記載されている。更に、開発された技術としては、チャドウイック・エム・ダン等(Chadwick M.Dunn et al.)カナダ特願 2,069,531、譲受人Abott Laboratories（本文献は本発明に取り入れられている）、に記載されており、イムノケミストリーアナライザーシステムが一般に得られるような測定器を用いた一行程の内に一回で３ないし４分析までの試験能力を有している。上記したカナダ特許に記載されたシステムは、３回の別々の分析よりもむしろ３つの小さな量の一群の測定を、使用者ができるようになっている。本発明は更に以下の実施例により説明されるが、それらは本発明を制限するものではない。実施例ニワトリIgYに対するモノクローナル抗体の調製免疫法 Balb/cマウス、雌を完全フロイントアジュバントと精製ニワトリ卵黄IgG（IgY）を皮下注射して免疫した。続いての免疫は、不完全フロイントアジュバントとIgYを３-４週間の間隔で腹腔内投与して行った。免疫したマウスは最終免疫をアジュバントなしで行ってから３日後に屠殺した。ハイブリドーマおよび抗体の調製ハイブリドーマ２Ｙ-１１４、１Ｙ-２６１、１Ｙ-２６２および１Ｙ-２６３は、フラー・エス・エー、タカハシ・エムおよびハレル・ジェイ・ジー・アール（ Fuller,S.A.,Takahashi,Ｍ.,Hurrell,J.G.R.）らにより記載された方法[モノクローナル抗体の調製；アウスベル・エフ、ブレント・ビー、キングストン・アール等(Ausubcl,F.,Brent,B.,Kingston,R.,et al.）編、分子生物学における一般的方法。ニューヨーク：グリーネ出版社（GrccnePublishing Associates）、１９８７年、ユニット１１）により免疫したBalb/cマウスの脾臓から得られた免疫細胞とSp2/Oマウス骨髄腫細胞との融合により製造された。要約すると、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む選択培地中の融合細胞を支持細胞が前以て植えてある３００ないし５００穴組織培養プレート（コスターNo.３５９８、１プレート当り９６穴）に加えた。ハイブリドーマ培養体は１-３×１０⁴マウス腹腔マクロファージの支持層上に限界希釈培養法により２-３回サブクローニングした。培養上澄を、ニワトリIgYで被覆したポリスチレンプレートを用いた固相ELISAにより、抗体活性選別した。プリスタン０.５mlで前以て処理したBalb/cマウスに０.５mlのリン酸緩衝生理食塩水、pH７．４中の１-３×１０⁶ クローン化ハイブリドーマ細胞を腹腔内注射した。およそ２週間後に、腹水を集め、モノクローナル抗体をプロテインAまたはプロテインGで親和精製した。精製したモノクローナル抗体を免疫化学的試験に使用した。４種のハイブリドーマ系統の性質は下記のとおりである：（１）細胞倍加時間は１０.４時間から１２時間の範囲（２）製造された平均腹水ml量は２.５mlから５.０mlの範囲（３）腹水からとれた精製MAbの平均mg/mlは２.０mgから４.２mgの範囲（４）MAb製造に換算した細胞系統の安定性は試験した範囲でフラスコ中連続培養で１００日まで安定。Ａ.抗IgYモノクローナル抗体の物理化学的性質１．抗体のクラスとサブクラス抗体のクラスとサブクラスは市販キット（バイオラド、Bio-Rad、No.172-205 5）でELISAにより決定した。第１表に示すように、全ての４つのモノクローナル抗体はIgGl,kである。２．等電点（pI）４種のモノクローナル抗体の等電点をモデル１１１ミニIEF細胞（Bio-Rad、No .１７０２９７５）を使用して、製造者による指示に従い行った。結果は第２表に要約されている。全ての４種のモノクローナル抗体はIgYの重鎖（H-鎖）を認識するが、軽鎖(L-鎖）とは反応しない。４種のモノクローナル抗体のpI値は６. ６から７.１の範囲で変化している。３．速度定数および親和定数本発明の４種のモノクローナル抗体とIgYの間の相互作用についての速度定数および親和定数をBIAcorcシステム（Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden）を用いて決定した。このシステムはガラス支持体上の薄い黄金膜の表面における光学的性質の変化を検出する表面プラズモン共鳴を利用している。詳細な理論的背景と実際についてはR.Karlssonらにより記述されている。（J.Immunol.Method s,145,229,1991.本文献はここに取り入れられている。）速度定数は以下のようにして測定された：モノクローナル抗体、即ち１０mMグッドの緩衝液用試薬（１０mM Hepes）、０.１５M-NaCl、３.４mMエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム塩、０.０５％サーファクタント２０（HBS、pH７.４）中３０μg／mlの一定濃度の抗IgYを、ウサギ抗マウスIgG_Feを固定化したセンサー表面で作用させた。抗原、ニワトリIgY、を１.２５μg／mlから２０μg／mlの範囲の濃度で、結合モノクローナル抗体と作用させた。実験行程は２５℃、６分間５μl/分の流速（３０μl注入）で、合計２４報告点で行った。抗原の注入が完了した後、抗体から抗原の解離を全部で１８報告点で行いモニターした。実験行程の完了後、表面を１分間かけて１Ｍギ酸溶液を注入して（５μl注入）再生した。機器付属のソフトウエアーでdR_A／dtおよびR_A値の表を作成し、それは作図プログラムに直接使用することができる（マイクロソフト・エクセル）。第３表に得られた結果を示す。全ての４種のモノクローナル抗体は抗原、IgY に対し良好な親和性を有している。Ｂ．免疫性状１．抗原特異性４種のモノクローナル抗体の抗原特異性をイムノブロッティングアッセイで決定した。精製ニワトリIgYをドデシル硫酸ナトリウム中のポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）で電気泳動した、そしてニトロセルロースペーパー上に転移した。ブロット上の非特異的結合部位をツイン２０とトリス緩衝生理食塩水（TTBS緩衝液）中の５％脱脂粉乳溶液でブロックし、ついで精製モノクローナル抗IgYを含むTTBS緩衝液でインキュベーションを１時間行った。ブロットをTTBS緩衝液（ pH７.５）で洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）（Bio-Rad、No. １７０-６５１６）で標識したヤギ抗マウスIgGで、更にインキュベートした。４ -クロロ-１-ナフトールを用いて発色させた。発色を蒸留水で洗浄して止めた。第２表に要約されているように、得られた結果は全て４種のモノクローナル抗体はIgYのH鎖（重鎖）に特異的に反応することが示された。２．種特異性抗IgYモノクローナル抗体の交叉反応性をいろいろの種のIgGsに対して固相ELI SAで評価した。マイクロタイタープレート（イムロン４プレート、ダイナテック Dynatech Co.）を５０mM炭酸緩衝液、pH９.６中２μg／mlのIgG溶液（ヒツジ-、ウサギ-、ヤギ-、ヒト- およびニワトリ-IgG）１００μlでコートした、そして４℃で一夜放置した。プレートを０.０５％ツイン２０（WB）含有０.１Mリン酸緩衝生理食塩水、pH７.４（PBS）で１度洗浄し、２mg／mlウシ血清アルブミン（ BSA）含有０.１M-PBSで６０分間３７℃にてブロックした。WBで洗浄液４μg／mlから始まるモノクローナル抗体を２倍希釈で２通りのウエルに加えた。プレートを洗浄後、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG（ジャクソン・イムノ・リサーチ・ラボラトリー・インク、Jac kson Immuno Research Laboratory Inc.、No.１１５-０３５-００８）を加え、６０分間３７℃にてインキュベートした。プレートを洗浄し、OPD基質溶液を加えた。反応を、室温で暗所にて３０分後に２ＭH₂SO₄で停止した。第２図は４種のマウスモノクローナル抗体、抗IgY抗体はウサギIgG、ヤギ-IgG、ヒツジ-IgGまたはヒト-IgGと交叉しないことを示している。 ELISAの最適特性いくつかを具体化している２部位アッセイ、時にサンドイッチアッセイと称される、は、一対の抗体を使用しており、その内１つはプレートに結合し（捕捉抗体）そして他方は標識されていて（検出抗体）、最初は結合し次に分析体の存在を同定するものである。しばしば検出体に対する酵素標識第２抗体（レポーター抗体）が使用されている。本発明の抗IgYモノクローナル抗体は、種々の抗原に対するニワトリIgY検出体に対する酵素標識複合体として最も効果的に使用することができる。異った種由来の２ないし３つの抗体が使用される２部位アッセイにおいては、しばしば１つの抗体が他に反応して、偽陽性反応をおこすことがある。本発明の抗IgYモノクローナル抗体と種々の咄乳類由来のI gGsとの交叉反応がないということは、イムノアッセイにおける試薬として明らかに進歩性があるということである。第３図はウサギポリクローナル抗IgYと異なった哺乳類のIgGsとの間の交叉反応を実証した例である。マイクロタイタープレートはニワトリIgYを含む異なった種からのIgGsでコートされた。そして、マーカー酵素で標識された市販のウサギポリクローナル抗IgYを加え、次いで基質溶液を添加した。結果は第３図に示すとおりで、第２図と比較するとき、本発明のモノクローナル抗体の特異性における改善が示されている。３．「レポーター」抗体としての結合抗IgYモノクローナル抗体性能本発明の４種の抗IgY-MAbsをナカネ法（ピー・ケイ・ナカネ、エー・カワオイ、ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー、P.K. Nakane,A.Kawaoi,J.Histochcm.Cytochem.,２２、１０８４、１９７４）を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で標識した。HRP標識MAbsの品質を、固相EL ISAにおける複合体の希釈系列で抗原（ニワトリIgY）の検出性を評価した。OD₄₉ _0nm の読み１５００を与えた複合体の希釈は１／８,０００から１／１００,０００に変化した。 HRP標識抗IgYモノクローナル抗体1Y-２６３の性能を、ミオシン重鎖（MHC）、ミオシン軽鎖１（MLC１）と共に心トロポニンI（cTnI)を検出するために、モノクローナル抗体捕捉体、ニワトリIgY検出体およびレポーター抗体として１Ｙ-２６３-HRP（第１Ｂ図を模式提示のため参照のこと）を用いて、２部位ELISAで以て検討した。同様の測定において、HRP標識ウサギポリクローナル抗IgY（市販品）をレポーター抗体として評価した。イムロン（Immulon）４プレート（ダイナテック、Dynatech）を０.０５M炭酸緩衝液、pH９.６（コーティング緩衝液）中の２μg／ml抗MHC-MAb、３μg／ml抗 MLCI-MAb、または３μg／ml 抗cTnI-MAbでコーティングした。プレートはシールして使用に先立って少なくとも一夜４℃で保存した。標準曲線を各々の分析体について、０.１５％BSA、PBS 中０.０５％ツイン２０、pH７.４（希釈緩衝液）に溶解した精製MHC、cTnIまたはMLC 1のいずれかの希釈系列で作成した。標準品は３回実施し、ゼロ（希釈緩衝液のみ）は４回実行した。３７℃でインキュベーション３０分した後、プレートを洗浄し、検出IgY抗体（二重にアフィニティ精製した抗MHC、抗TnIまたは抗M LC 1）を希釈緩衝液中２μg／ml加えた。検出抗体とのインキュベーションに続いて、ウサギポリクローナル抗ニワトリIgG-HRP（Jackson,No.303-035-003）１／５０,０００または抗IgY-MAb-1Y-263-HRP１／１２,５００の複合体を加えた。この複合体とのインキュベーションの後に、OPD基質溶液を加えた。室温、暗室で３０分後に２M H₂SO₄で反応を停止した。第４図はMHCの適定曲線、第５図はcT n-Iの、第６図はMLC１の、いずれもウサギ複合体あるいはMAb複合体を使用した適定曲線を示す。分析感度、即ちウサギポリクローナルレポーター抗体を使用した測定の抗原検出レベルはMAbレポーターを使用した測定のそれに類似している。ウサギ検出体は同等の抗原濃度において高いシグナルを発生するが、同時に著しく大きな「バックグランド」ノイズを生成する（臨床的に相当する低レベルにおいてMHC測定では１.２から７.７倍、TnI測定では１.２から６.７倍、およびML C１では約３倍）。これは陽性と陰性の結果の間のOD範囲を劇的に減少させる。このことは反応性と非反応検体間の識別が臨界であるようなin vitro診断においては特に問題である。Ｃ．本発明のモノクローナルの使用例１．サンドイッチアッセイ哺乳類の心タンパク質は高度に保存されており、これらのタンパクに対する高親和性抗体を高めるのは困難である。ニワトリを使用して、本発明者らはミオシン重鎖、心筋ミオシン軽鎖１、ミオグロビン、心トロポニンIおよびその他の心タンパク質に対する独特の高親和性抗体を開発することができた。本明細書Ｂ. ３節において記載したように、検出体としてこれらニワトリの抗体そしてレポーターとしてニワトリ抗体に対するマウスモノクローナル抗体を使用して、高感度で特異的なアッセイを開発することができた。２．ドットブロット試料の異なった量をニトロセルロース膜に結合させる。検出体IgYを試料に結合させる。本発明の酵素標識MAbsは検出抗体に結合する。不溶性の基質を結合した酵素を可視化するために使用する。３．ウエスタンブロットタンパク試料を電気泳動で分離し、ニトロセルロース膜に転移する。試料を含むバンドが検出体IgYに結合する。本発明の酵素標識MAbは検出体に結合する。不溶性の基質を結合した酵素で可視化するために使用する。４．ハイブリドーマ技術によるニワトリモノクローナル抗体のスクリーニングニシナカ、S.等により示されたように、多くのニワトリB細胞系統が樹立されている(J.Immunol.Methods,139,217,1991)。これらの系統のいくつかは、ニワトリ由来の特異的イムノグロブリン分泌脾リンパ球との融合に使用することができる。抗原特異性抗体（IgT）分泌ニワトリハイブリドーマは抗原被覆プレートを使用するELISAにより選択することができる。培養上澄中の抗原特異性モノクローナルIgYは抗原に結合する。結合したモノクローナルIgYは本発明の標識MAbにより検出される。基質溶液を結合した酵素を可視化するために加える。５．BIAcorcによる分析における捕捉抗体としてのモノクローナル抗IgY 本明細書A.３.節に記載したようにBIAcoreのセンサーチップに共有結合した本発明のモノクローナル抗体を用いて特異性/同一性および動態解析のためにニワトリIgYを分析することができる。本発明のモノクローナル抗体はニワトリIgYの種々の特性のために捕捉抗体として使用することができる。本開示により、本発明の適切な具体例を記述し提示したが、本発明はこれら特定の具体例に限定されるものではないことを理解すべきである。多くの変形や修飾が当業者にとって可能であろう。本発明を定義するために、付属する請求項を参照すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者タカハシ，ミコヨカナダ国、エム２エヌ１ビイ８オンタリオ、ノースヨーク、フランクリンアベニュー 65

Claims

【特許請求の範囲】１．ニワトリ卵黄イムノグロブリンに対して開発されたモノクローナル抗体。２．モノクローナル抗体がニワトリ卵黄イムノグロブリンの重鎖に特異的である請求項１記載のモノクローナル抗体。３．モノクローナル抗体が標識されている請求項２記載のモノクローナル抗体。４．ニワトリ卵黄イムノグロブリンに対するモノクローナル抗体の親和定数が１.５×１０⁶Ｍ^-1から２.５×１０⁹Ｍ^-1の範囲である請求項２記載のモノクローナル抗体。５．ニワトリ卵黄イムノグロブリンに対するモノクローナル抗体の親和定数が２.０×１０⁸Ｍ^-1から４.１×１０⁸Ｍ^-1の範囲である請求項４記載のモノクローナル抗体。６．モノクローナル抗体が２Ｙ-１１４、１Ｙ-２６１、１Ｙ-２６２およびＩＹ-２６３からなる群より選ばれたハイブリドーマ細胞系統より調製される請求項２記載のモノクローナル抗体。７．イムノアッセイにおけるレポーター抗体として請求項１記載のモノクローナル抗体を使用する方法であって、捕捉抗体；捕捉抗体に相当する試験試料中の抗原；試験試料中の試験されるべき抗原に相当するニワトリ卵黄検出抗体；およびニワトリ卵黄イムノグロブリンに対して開発された標識モノクローナルレポーター抗体、から構成されるイムノアッセイ。８．少なくとも第１、第２および第３の抗体よりなる診断測定システムであって、該第１の抗体は試験試料中の試験抗原に相当する捕捉抗体であり；該第２の抗体は該試験試料中の該試験抗原に当するニワトリ卵黄検出抗体であり；そして該第３の抗体はニワトリ卵黄イムノグロブリンに対して開発された標識モノクローナル抗体、である診断測定システム。９．モノクローナル抗体がニワトリ卵黄イムノグロブリンの重鎖に特異的である請求項８記載のシステム。１０．モノクローナル抗体が酵素標識されている請求項９記載のシステム。１１．モノクローナル抗体が２Ｙ-１１４、１Ｙ-２６１、１Ｙ-２６２および１Ｙ-２６３からなる群より選ばれたハイブリドーマ細胞系統から製造されたものである請求項１０記載のシステム。１２．試験抗原が心タンパク質である請求項１１記載のシステム。１３．試験がミオシン重鎖、心ミオシン軽鎖、ミオグロビン、心トロポニンI、トロポニンT、トロポミオシン、ミオグロビンおよびクレアチンキナーゼ（CK-MB ）からなる群より選ばれたものである請求項１２記載のシステム。１４．ニワトリ卵黄イムノグロブリンに対して開発されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系統。１５．ハイブリドーマ細胞系統がニワトリ卵黄イムノグロブリンの重鎖に特異的である請求項１４記載のハイブリドーマ細胞系続。１６．該ハイブリドーマ細胞系統が、ニワトリ卵黄イムノグロブリンに対して試験されたとき親和定数が１.５×１０⁶Ｍ^-1から２.５×１０⁹Ｍ^-1の範囲であるニワトリ卵黄イムノグロブリンに対するモノクローナル抗体を産生する、請求項１５記載のハイブリドーマ細胞系統。１７．該ハイブリドーマ細胞系統が、ニワトリ卵黄イムノグロブリンに対して試験されたとき親和定数が２.０×１０⁸Ｍ^-1から４.１×１０⁸Ｍ^-1の範囲であるニワトリ卵黄イムノグロブリンに対するモノクローナル抗体を産生する、請求項１５記載のハイブリドーマ細胞系統。１８．２Ｙ-１１４、１Ｙ-２６１、１Ｙ-２６２および１Ｙ-２６３からなる群より選ばれた請求項１７記載のハイブリドーマ細胞系統。