SE454812B - Forfarande och komposition for uppfangande av eller detektering av immunkomplex och anvendning av fagelantikroppar herfor - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 35 4E54 8'I2 2 det molära förhållandet mellan dessa samt bildningshastig- heten för dem. Vidare kan vid vissa sjukdomstillstånd, t ex vid tumörer, närvaron av vissa immunkomplex hindra kroppens immunförsvar att själv angripa tumören. Åtskilliga metoder är publicerade för pávisande, kvantifiering och isolering/avlägsnande av immunkomplex, se bl a en översikt av R. Blackstock, In Vitro Methods for Detection of Circulating Immune Complexes, Am. Clin.

' Lab. sei., v01. 11, Na. 3, p 262-68, 1981. I denna publi- kation hänvisas även till en av WHO genomförd samman- ställning av arton olika detekteringsmetoder, varvid framhàlles att de flesta tillgängliga metoder är dels alltför ospecifika för framgångsrik klinisk användning -och dels alltför komplicerade för att kunna föras ut till mindre vàrdenheter.

Det tekniska problemet och dess lösning .Åtskilliga av de kända analysmetoderna för immun- A3 komplex bygger på deras förmåga att bindas till receptorer pà celler från däggdjur. Dessa celler, oftast s k Raji- celler, måste hållas i vävnadskultur, vilket kräver speciallaboratorier för att testerna skall kunna genom- föras. Som immunadsorbent användes också antikroppar från däggdjur. Sådana antikroppar har emellertid vissa nackdelar, nämligen dels att de själva kan aktivera komplementfaktorer från däggdjur och dels att de kan störa systemet genom att de är relativt lika de mänskliga antikropparna. Samma problem uppstår om detektorsystemet för immunkomplex utgöres av däggdjursantikroppar. Vid ” användning av däggdjursantikroppar som immunadsorbent eller immundetektor måste dessa sålunda modifieras, vilket komplicerar infângandet och detekteringen av immunkomplexen.

Med termen "immunadsorbent" avses här immunkomplex- bindande antikroppar på fast fas, exempelvis lämpliga adsorbentpartiklar eller -ytor. Med termen "immundetektor" avses här antikroppar i vätskefas för påvisande av immun- komplex. Med "immunkomplex" avses här den produkt, som 10 15 20 25 30 35 454 812 1 bildas mellan en antikropp och ett antigen, vare sig komplexet bildats in vivo eller in vitro.

Antikroppar från fågel, företrädesvis hönsantikroppar, erbjuder en enkel, snabb och pålitlig infångnings- och detekteringsmetod vid användning som immunadsorbent och/eller immundetektor. Dessa antikroppar har en annorlunda uppbyggnad än antikroppar från däggdjur och behöver således ej modifieras före användningen, då de ej stör systemet eller binder komplementfaktorer från däggdjur.

Beskrivning av uppfinningen Föreliggande uppfinning avser sålunda ett förfa- rande för in vitro uppfàngande av eller detektering av immunkomplex med en immunadsorbent och/eller immun- detektor, vilket kännetecknas av att immunkomplexen är in vivo formade immunkomplex, samt att såsom immun- adsorbent eller immundetektor användes fågelantikroppar,¿ riktade mot i komplexet ingående antigen eller antikropp eller komplementfaktorer. Härvid kan användas antikroppar producerade i fåglar och isolerade från blod eller ägg, företrädesvis hönsblod eller hönsägg.

Uppfinningen avser även en komposition innefat- tande en immunadsorbent och/eller immundetektor för uppfångande av eller detektering av immunkomplex hos exempelvis individer med sjukdomstillstånd p g a cir- kulerande immunkomplex, varvid nämnda immunadsorbent eller immundetektor utgöres av fågelantikroppar riktade mot i immunkomplexet ingående antigen, antikropp eller ” komplementfaktorer.

Slutligen avser uppfinningen användning av specifika fågelantikroppar riktade mot i ett immunkomplex ingående antigen, antikropp eller komplementfaktorer vid ett förfarande för in vitro uppfångande eller detektering av immunkomplexet i vätskor innehållande detta.

Tidigare metoder för bestämning av immunkomplex innefattade vanligtvis radioaktivt märkt antikropp eller antigen. Numera föredrages ofta detektering med den 10 15 20 25 30 35 4s4gs12 4 s k ELISA-metoden (enzyme linked immunosorbent assay), där reaktanterna märks med vissa enzymer i stället för med radioaktiva isotoper. Härvid kan antikroppar, i föreliggande fall vanligen hönsantikroppar, föreligga i fast fas, bundna till agaros-partiklar eller till plast (såsom mikrotiterplattor, ELISA-plattor). Dessa antikroppar kan sedan vid tillsats av testlösningar uppfånga däri förekommande immunkomplex, vilka därefter bindes till tillsatta enzymmärkta antikroppar eller enzymmärkt protein A från bakterien Staphylococcus aureus, varigenom de kan detekteras. Vid tidigare kända för- faranden med bindning till däggdjursantikroppar måste även dessa modifieras på grund av ovan angivna svårigheter.

En mycket lovande tillämpning av uppfinningen är användningen av hönsantikroppar vid s k extracorporeal immunadsorptionsterapi för behandling av patienter med tumörer eller med immunkomplexsjukdomar. Härvid uttagess under en viss tidrymd plasma från patienten, vílkengflasma får passera en anordning för uppfângning av immunkomplex, varefter den immunkomplexfattiga plasman återföres till patienten. Härigenom kan lindring av immunkomplexsjukdomar uppnås och även tillbakabildning av tumörer erhållas genom att skadliga immunkomplex avlägsnats, vilka hindrar kroppens förmåga att själv angripa tumören. Genom använd- ning av hönsantikroppar vid denna behandling kan en bättre selektivitet beträffande uppfángning av immun- komplex uppnås. Förutom detta aktiveras ej patientens komplementsystem och inga skadliga biologiskt aktiva ~ komponenter frigöres eller återföres till patienten.

I Genomförande av uppfinningen Förfarandet enligt uppfinningen genomföres såsom angives i patentkraven. I en föredragen, icke begränsande utföringsform kan förfarandet genomföras på följande sätt (se härvid Fig la - 1d): 1) Antikroppar l från höns (aC3, aClq på mikrotiterplattor 2 och adsorberas (se fig la). eller aC4) anbringas 2) Prov innehållande immunkomplex 3 tillsättes (se fig lb). 10 15 20 25 30 35 454 812 5 3) Ett enzymmärkt specifikt antikroppsmaterial 4 (detektor) tillsättes (se fig lc). 4) Detektering av bundet enzymmärkt material medelst färganalys, vilket ger ett mått på mängden närvarande immunkomplex, genomföres (se fig ld). Härvid tillsättes en framkallningslösning 5, varvid i fig ld ofärgade rutor indikerar delar som ej omvandlats av enzymet och fyllda rutor indikerar delar, som färgats av enzymet. Därefter kan avläsning ske med spektrofoto- meter.

Enligt en annan föredragen, icke begränsande ut- föringsform kan förfarandet genomföras på följande sätt: l) Antikroppar från höns (aC3 eller aClq) kopplas till partiklar av tvärbunden agaros. 2) Agarospartiklarna packas i en kolonn. 3) Prov innehållande immunkomplex anbringas pà kolonnen, vilken därefter tvättas. äø 4) Till antikropparna bundet immunkomplex frigöres genom eluering av kolonnen. 5) Eluerat material frystorkas och separeras medelst elektrofores pà SDS-polyakrylamidgel för detektering och karakterisering av närvarande immunkomplex.

En variant av denna utföringsform kan användas för uppfàngning av immunkomplex vid extracorporeal cirkula- tionsbehandling (se fig 2). Härvid uttages blod i led- ningen l från patienten 2. Vid 3 fränsepareras blod- kropparna till ledningen 4 och kvarvarande plasma föres i ledningen 5 till en kolonn 6, vilken är packad med t partiklar av exempelvis tvärbunden agaros, till vilka hönsantikroppar är kopplade. Den immunkomplexfattiga plasman förenas därefter med de fránskiljda blodkropparna vid 7 och föres genom ledningen 8 tillbaka till patienten.

Exempel l l) Affinitetsrenat höns-anti-human-C3-antikropp kopplas till Sepharoseæ CL-4B (Pharmacia, Uppsala, Sverige) med BrCN-metoden. 10 15 20 25 30 35 454 S812 6 2) Sepharoseæ-partiklarna packas i en kolonn och tvättas med 0,1 M HAC (ättiksyra) och bringas i jämnvikt i PBS (o,1s M Nacl; 0,02 M uanzpø4; o,o2 a; Na m3; pH=7,2). 3) Provet anbringas på kolonnen och därefter tvättas kolonnen med PBS tills allt icke bundet protein sköljts bort. 4) De proteiner, som bundits till antikropparna, frigöres genom att kolonnen elueras med 0,1 M HAc. 5) Det material, som elueras med HAc, frystorkas och separeras medelst elektrofores på SDS-polyakrylamidgel, vilken silverfärgas för identifiering av de eluerade proteinerna.

Serum har analyserats från normalindivider, patienter med primär biliär cirrhos (PBC), systemisk lupus eryte- matosus (SLE) och reumatiker (RA). Härvid skiljer sig mönstret för patienterna från det man finner hos normal- individen; Hos normalindivider hittades bara normala -3 C3-fragment, medan hos patienter med PBC en stor mängd ytterligare proteinband fanns, som ännu ej identifierats.

Exempel 2 1) Mikro-ELISA-plattor (Dynatech Ml29A) belägges med 200 pl av 20 pg affinitetsrenat höns-anti-human-Clq/ml i 0,02 M NaH2PO4; pH=7,5. Plattan inkuberas i tvâ timmar vid 37°C och tvättas därefter tre gånger med NaCl-Tween (0,9 % NaCl; 0,05 % Tween 20; 0,02 % NaN3). Därefter blockeras eventuellt överblivna platser i plattan med 0,1 mg Ovalbumin/ml i 0,02 M NaH2PO4; pH=7,5. Därefter inkuberas i tvâ timmar vid 37°C och tvättas tre gånger med NaCl-Tween. 2) 150 ul PBS tillsättes till alla brunnar. Därefter tillsättes 50 pl av serumprover eller standarder (värme- aggregerat IgG spätt i normalserum) till brunnarna.

Till brunnar innehållande enbart l50 pl PBS tillsättes ytterligare 50 pl PBS så att 200 pl erhålles i alla brunnar. Plattan inkuberas i tvâ timmar vid 37°C och tvättas därefter tre gånger med NaCl-Tween. 3) 200 ul protein A-alkalint_fosfataskonjugat, spätt ll; 10 20 25 30 454 812 7 l:200C i PBS, tillsättes till alla brunnar, plattan inkuberas i tvâ timmar vid 37°C och tvättas därefter tre gånger med NaCl-Tween. 4) 200 ul framkallningslösning tillsättes till alla brunnar (l mg S-104 (Sigma)/ml i IM dietanolamin; 0,5mM MgC12; pH=9,8) och plattan inkuberas i 30 minuter i mörker vid rumstemperatur. Framkallningen avbrytes med 50 pl 5 M NaOH och plattan avläses i en Titertek Multiskan.

I steg 1 kan höns-anti-human-C3 eller höns-anti-human- -C4 ersätta aClq-antikroppen.

I steg 3 kan även användas höns-anti-human-IgG~ alkalint fosfataskonjugat i stället för protein A-kon- jugat.

I tabell I redovisas resultat från en försöksserie enligt ovan angivna metod med Bells pares-patienter, testade med aC3-ELISA. Spalt l i tabellen avser patient- nummer, varvid A innebär akutprov (taget vid patientens*' insjuknande) och K innebär konvalescentprov (taget ett par veckor efter insjuknandet vid återbesök på sjukhuset).

Spalt 2 i tabellen avser erhållet ELISA-värde, omräknat till pg värmeaggregerat IgG, vilket användes som standard. Övre gränsen för normalvärden har satts till 2,0 pg/ml, varvid kan noteras att ingen av de friska patienterna överskred detta gränsvärde. Spalt 3 innebär en gradering av huruvida patienten hamnade över eller under 2 pg/ml.

Ovan angivna försöksserie visar att man med för- farandet enligt uppfinningen på ett snabbt och enkelt sätt kan kvalitativt och kvantitativt påvisa mycket små mängder immunkomplex i patienters blodserum, vilket är mycket värdefullt vid den fortsatta diagnosticeringen och bedömningen av sjukdomstillståndet och de åtgärder, som bör vidtagas för lindrandet och botandet av detta. 454 812 Provnummer 44A 44K 45A 46A 46K 47A 48A 48K 49A 49K 51A 51K 52A 52K 53A 54A 54K 55A 56A 56K 57A 57K 58A SBK 8 TABELL Patientmaterial Mikrogram AIGG 3,02 3,62 1,74 2,26 1,96 2,64 1,74 2,71 >50 7,12 1,96 1,66 2,49 3,32 1,05 1,58 2,79 3,47 2,42 2,42 4,08 3,40 15,7 12,8 14,6 20,3 21,7 1,65 1,32 2,35 2,05 3,28 3,69 2,35 1,32 2,87 1,84 1,84 2,35 1,54 1,44 3,59 3,39 IC-Sera l+l++++ ++|+++++++ ++++II++II +++l+|+l++ i* 59A 61A 61K 63A 69A 71A 71K 74A 74K 75K 76A 76K 78A 78K 82A 82K 83K 84A 84K 85K 86A 86K 88A 88K 89A 89K 90A 90K 93K 94A 95A 80K 1,75 0,82 6,47 II++++I I ++III++I++ II++I ll+ll 454 812 45_4 812 Provnummer I-'\Oæ\l0\U\|ßLONI-' 10 Normalmatefial Mikrogram AIGG 0,98 1,02 1,06 1,18 1,48 0,72 1,62 1,12 0,56 0,92 0,66 0,62 0,80 0,70 1,6 0,64 1,96 IC-Sera 4") n! Op

Claims (12)

10 15 25 454 812 11 PATENTKRAV

1. Förfarande för in vitro uppfángande av eller detektering av immunkomplex med en immunadsorbent och/eller immundetektor, k ä n n e t e c k n a t därav, att ímmunkomplexen är in vivo formade immun- komplex, samt att såsom immunadsorbent eller immunde- tektor användes fågelantikroppar riktade mot i komplexet ingående antigen eller antikropp eller komplementfak- torer.

2. Förfarande enligt kravet l, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fågelantikropparna utgöres av antikroppar producerade i fåglar.

3. Förfarande enligt kravet l, n a t därav, att fàgelantikropparna utgöres av ägg- k ä n n e t e c k - antikroppar från fåglar. “«

4. Förfarande enligt kraven 1 och 2, k ä n n e - t e c k n a t därav, att fàgelantikropparna utgöres av antikroppar producerade i höns.

5. Förfarande enligt kraven 1 och 3, t e c k n a t därav, att fàgelantikropparna utgöres av äggantikroppar från höns.

6. Förfarande för uppfångande av immunkomplex med k ä n n e t e c k - k ä n n e - en immunadsorbent enligt kraven l-5, n a t därav, att uppfángandet sker med hjälp av en immunadsorbent, som utgöres av fågelantikroppar på fast fas. N

7. Förfarande enligt kravet 6, k ä n n e t e c k - n a t därav, att uppfångandet av immunkomplexet med hjälp av fàgelantikroppar på fast fas sker på polymerer, såsom plaster, akrylamider och polysackarider.

8. Förfarande för detektering av immunkomplex med en immundetektor enligt kraven l-5, k ä n n e t e c k - n a t därav, att detekteringen sker med hjälp av en immundetektor, som utgöres av fågelantikroppar i vätskefas. 454 812 10 15 20 12

9. Förfarande enligt kraven 1-8, k ä n n e - t e c k n a t. därav, att uppfångandet av eller detek- teringen av immunkomplexet sker med hjälp av fågelanti- kroppar riktade mot komplementfaktorer.

10. Förfarande enligt kraven 1-9, k ä n n e - t e c k n a t därav, att uppfângandet av eller detek- teringen av immunkomplexet sker med hjälp av fågel- antikroppar riktade mot komplementfaktorerna C3, Cl eller C4.

ll. Användning av specifika fàgelantikroppar Q riktade mot i ett immunkomplex ingående antigen, anti- kropp eller komplementfaktorer vid ett förfarande för in vitro uppfàngande eller detektering av immun- komplexet i vätskor innehållande detta.

12. Komposition till användning vid ett förfarande för uppfångande av eller detektering av immunkomplex hos individer med cirkulerande immunkomplex, vilken komposition innefattar en immunadsorbent eller immun- detektor, som är förenad med lämpliga bärare i fast fas, såsom ett polymermaterial, eller i vätskefas, k ä n n e t e c k_n a d därav, att immunadsorbenten eller immundetektorn utgöres av fágelantikroppar riktade mot i immunkomplexet ingående antigen, antikropp eller komplementfaktorer. 4,9