CN114437224A - 一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法和应用。该单克隆抗体采用高纯鸡IgY作为抗原免疫小鼠制备得到，其作为标记物可以有效的解决层析实验中的HOOK现象。本发明同时对其制备方法进行了进一步的改进，通过对其制备方法改进，可以更好的得到效价更高、抗体产量更高的单克隆抗体。

Description

一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及单克隆抗体技术领域，具体涉及一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法和应用。
背景技术
IgY(immunoglobulin of yoik)是在鸟类、两栖动物和爬行动物中发现的主要免疫球蛋白。与哺乳动物IgG相比，两者均包含两条重链和两条轻链，它们由可变结构域(VH和VL)和四个恒定结构域(CH1，CH2，CH3和CH4)组成、两者均具有特征性的抗体Y形、两者都是二价的、两者都起着相似的生物学作用，是主要的免疫球蛋白，有相似的稳定性，可提供对传染源的防御作用，均在最初合成较高分子量的抗体(IgM)后高浓度出现。
这导致人们提出IgY可能是哺乳动物IgG和IgE的祖先分子，目前已在基因和结构研究中得到证实。但是，IgG和IgY又有着不同之处：IgY与哺乳动物IgG之间几乎没有免疫交叉反应；IgY由于额外的重链恒定结构域，分子量更高，据MALDL-TOF MS分子量测算，IgG分子量150kDa(轻链23kDa×2，重链50kDa×2)，而IgY分子量167kDa(轻链19kDa×2，重链65kDa×2)，SDS-PAGE法测算的IgY分子量还达180kDa左右；IgY铰链区短且不灵活，含有3对糖基，而IgG铰链区灵活，含有2对糖基；IgY重链缺少Fc结构域，因此它们不固定补体或结合蛋白A或蛋白G，所以只用抗原来纯化。
因此，鉴于这些差异和相似之处，在大多数实验应用中，包括蛋白质印迹，免疫组织化学，免疫细胞化学，ELISA和功能阻断实验，IgG和IgY都是等效的，这意味着IgY通常可用作IgG的直接替代物。
但是，现有的IgY抗体一般是羊抗鸡IgY多克隆抗体，其往往存在抗体效价低、特异性批间差异大的问题，难以满足应用要求。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体，该单克隆抗体作为标记物可以有效的解决层析实验中的HOOK现象。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：采用高纯鸡IgY作为抗原免疫小鼠制备得到。
优选地，所述鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：采用高纯鸡IgY作为抗原免疫小鼠，并检测血清效价，当抗体水平达到1:10000以上时，选取抗体水平最高的小鼠，脾脏注射高纯鸡IgY进行加强免疫，4d后取脾脏细胞制备待融合的脾淋巴细胞悬液；采用小鼠腹腔培养物制备饲养层细胞板，其中小鼠腹腔培养物中细胞的浓度为1×105个/mL～10×105个/mL；将待融合的脾淋巴细胞悬液与复苏后的小鼠骨髓瘤细胞NS1按体积比(5～10):1混合，在浓度为30～50％的PEG 1000～4000，pH为8.0～8.2的条件下融合90～150s；之后对杂交瘤细胞进行选择培养和克隆化处理，采用间接Elisa法检测筛选即得。
优选地，采用高纯鸡IgY作为抗原免疫小鼠的步骤如下：第0天，采用鸡IgY抗原和FCA佐剂进行首免；第21天，采用鸡IgY抗原和FIA佐剂进行加强免疫；第42天，采用鸡IgY抗原和FIA佐剂进行再次加强免疫；从尾巴或眼眶采血，收集血清并检测效价，第三次免疫15～20天后腹腔内注射纯抗原进行融合前的强化免疫。
优选地，小鼠免疫采用的是sigma佐剂。
优选地，脾淋巴细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞NS1的融合步骤如下：将待融合的脾淋巴细胞悬液与复苏后的小鼠骨髓瘤细胞NS1按体积比(5～10):1混合，室温下离心，弃去上清液；轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散成均匀的糊状，加入50％的PEG-3000溶液，与沉淀细胞混匀，作用时间控制在90s，同时控制pH在8.0～8.2之间；之后加入基础培养液终止促融作用，将终止反应的细胞悬液离心，弃上清，加入HAT培养液悬浮并混匀融合后的细胞。
优选地，终止促融作用的基础培养基5min内加完。
优选地，将混匀后的融合细胞加入已铺有饲养层细胞的培养板中，37℃，5％的CO2、饱和湿度的培养箱中培养，并筛选后再进行克隆化处理。
优选地，用有限稀释法对筛选后的阳性杂交瘤细胞进行克隆化处理。
本发明还提供了上述制备得到的鼠抗鸡IgY单克隆抗体在试剂盒中的应用。
本发明所提供的鼠抗鸡单克隆抗体，其作为标记物可以有效的解决层析实验中的HOOK现象。本发明同时对其制备方法进行了进一步的改进，通过对其制备方法改进，可以更好的得到效价更高、抗体产量更高的单克隆抗体。
附图说明
图1为本发明实施例1中得到的3株特异性强、效价高的细胞株的电泳图，其中泳道1为A细胞株单克隆抗体还原电泳，2为B细胞株单克隆抗体还原电泳，泳道3为C细胞株单克隆抗体还原电泳，泳道4为Marker，泳道5为A细胞株单克隆抗体非还原电泳，泳道6为B细胞株单克隆抗体非还原电泳，泳道7为C细胞株单克隆抗体非还原电泳；
图2为本发明所提供的鼠抗鸡IgY单克隆抗体在层析平台应用前后的比较图；
图3为本发明所提供的鼠抗鸡IgY单克隆抗体与抗鸡IgY多克隆抗体效价批间差的比较；
图4为本发明所提供的鼠抗鸡IgY单克隆抗体与抗鸡IgY多克隆抗体特异性效果的比较；
图5为本发明所提供的鼠抗鸡IgY单克隆抗体与抗鸡IgY多克隆抗体效价的比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
基础培养基：1640完全培养液，L-谷氨酰胺2mM，NaHCO3 2g/L，D-葡萄糖2g/L，酚红指示剂5g/L，pH 7.2-7.4；
完全培养液：1640完全培养液+20％胎牛血清；
基础培养液：1640完全培养液。
实施例1
本实施例提供一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，具体步骤如下：1.1小鼠免疫：
选择体重相近的6～8周龄的BALB/c小鼠5只，用高纯鸡IgY，按照下列程序进行免疫：
第一次免疫：第0天，向每只小鼠背部皮下多点及腹腔注射鸡IgY抗原和FCA佐剂混合液，其中混合液中鸡IgY抗原和FCA佐剂(购自sigma的体积比为1:1。
第二次免疫：第21天，向每只小鼠背部皮下多点及腹腔注射鸡IgY抗原与FIA佐剂混合液进行加强免疫，其中混合液中鸡IgY抗原和FIA佐剂(购自sigma)的体积比为1:1。
第三次免疫：第42天，向每只小鼠背部皮下多点及腹腔注射鸡IgY抗原与FIA佐剂混合液再次进行加强免疫，其中混合液中IgY抗原和FIA佐剂(购自sigma)的体积比为1:1。
在第7天、28天、56天时，从尾巴或眼眶采血，37℃1h后放4℃，4小时，收集血清，间接ELISA法检测血清效价，当抗体水平达到1:10000以上时，用于融合。融合前，选取抗体水平最高的小鼠，脾脏注射高纯鸡IgY(不加佐剂)，进行加强免疫。
本实施例采用sigma公司的佐剂进行免疫，7天、28天和56天时血清中的效价如下表1所示：
表1 5只小鼠不同免疫天数血清中的效价
Figure BDA0003453402500000051
选取第三次免疫后抗体水平较高的1#、2#、3#小鼠，第三次免疫15～20天后腹腔内注射高纯鸡IgY50μg(不加佐剂)作为融合前的强化免疫，待4d后用间接ELISA法检测血清中的效价如下表2所示：
表2
小鼠编号 间接法效价
1#小鼠 1：64000
2#小鼠 1：32000
3#小鼠 1：128000
经过三次基础免疫和一次强化免疫，小鼠的效价均达到1：32000及以上，可以进行融合。
1.2饲养层细胞板的制备：
在融合前48h制备饲养细胞，具体方法如下:
(1)用颈椎脱臼法处死8～12周龄健康的的昆白鼠2～3只；
(2)将小鼠浸泡在75％乙醇内消毒5min，随即放入超净工作台中，腹部朝上固定于解剖台板上；
(3)用镊子提起小鼠腹部皮肤，无菌条件下在小鼠腹腔剪开一个小口，注意不剪破腹膜，以免腹腔内的体液外流被污染，撕开皮肤，充分暴露腹膜；
(4)用酒精棉球擦拭腹膜消毒；
(5)从剪开的小口向腹腔内注射10mL 4℃的基础培养基，用注射器在腹腔内反复抽吸，并轻轻按摩或用镊子轻轻拍打腹部1～2min；
(6)用注射器抽回腹腔内液体，注入离心管内；
(7)1000r/min离心10min，弃上清；
(8)用5mL HAT培养液重悬沉淀的腹腔内细胞，作细胞计数，调整细胞浓度至2×105个/mL；
(9)将细胞悬液加入96孔培养板，每孔100μL，置于37℃、5％CO2孵箱中培养过夜。
1.3小鼠骨髓瘤细胞NS1的制备：
杂交瘤细胞融合前7天，复苏NS1细胞，方法如下：从液氮罐中取出装有1mL NS1细胞悬液的冻存管，迅速将冻存管浸入37℃水浴锅中并快速转动，使冷冻状态的细胞悬液迅速解冻，注意不将冻存管管口浸入温水液面以下。在超净工作台中将解冻的细胞悬液抽出，加入含有6mL基础培养液的10ml离心管中，1000r/min，5min，弃上清，用完全培养液10mL重悬NS1细胞，并加入细胞培养平皿中，置于37℃，5％的CO2孵箱中培养，细胞处于旺盛生长期时注意传代，使其浓度维持在1×105个/mL和5×105个/mL之间的对数生长期。
融合当天，用吸管将细胞从平皿中轻轻吹下，收集于离心管中，用1000r/min离心5min，弃去上清，向沉淀中加入10mL基础培养液，同上离心洗涤1次，然后将细胞重悬至10mL，混匀。
1.4免疫小鼠脾细胞悬液的制备：
选取第三次免疫后抗体水平最高的小鼠，第三次免疫15～20天后腹腔内注射高纯鸡IgY50μg(不加佐剂)作为融合前的强化免疫，待4d后取脾脏融合，方法如下：
(1)将已免疫的BALB/c小鼠，眼眶采血，血清离心取上清，-20℃冻存，供检测抗体用，同时处死小鼠，75％酒精浸泡5min，沥干酒精，放至超净台解剖板，腹部朝上，用大头针固定四肢，用灭菌剪刀剪一小口，用两把灭菌镊子将腹部皮毛拉开，用大头针固定，用酒精消毒腹膜，剪开腹腔，取出脾脏，将其放入加有2mL庆大霉素的10mL基础培养基的50mL离心管中轻轻漂洗一次，并细心剪除周围结缔组织；
(2)将脾脏移入另一盛有30mL基础培养液的平皿中的不锈钢滤网中，用无菌手术剪刀剪成小块，用无菌研磨棒磨至滤网中看不到红色为止；
(3)将脾细胞悬液移入50mL离心管中，混匀，1000r/min离心5min，弃去上清；
(4)加入基础培养液40mL，吹打悬浮均匀；
(5)取样对脾淋巴细胞计数，此即为待融合的脾淋巴细胞悬液。
1.5细胞融合：
将小鼠骨髓瘤细胞NS1和脾细胞进行融合，具体方法如下：
(1)将收集的脾淋巴细胞悬液与待融合的NS1细胞悬液按5～10:1的体积比混合，室温下以1000r/min离心5min，弃去上清液；
(2)轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散成均匀的糊状，一手均匀地转动离心管，另一手用1mL吸管吸取50％的PEG-3000溶液1mL，与沉淀细胞混匀，作用时间控制在90s，同时控制pH在8.0～8.2；
(3)在5min内将10mL基础培养液加入到离心的细胞管中，使PEG稀释，终止其促融作用。具体加法为：第1分钟加1mL，第2分钟加2mL，随后的3分钟内将剩余液体加完，注意操作应轻柔；
(4)将终止反应的细胞悬液以1000r/min离心5min，弃上清液；
(5)加入10mL的HAT培养液悬浮后，加入到HAT培养液重新悬浮并混匀融合后的细胞；
(6)将细胞悬液加入已铺有饲养层细胞的96孔培养板中(一般铺10板)，每孔0.1mL，然后将培养板置37℃，5％的CO2孵箱中培养。
1.6杂交瘤细胞的选择培养：
将融合后的细胞悬液加入已铺有饲养细胞层的96孔细胞板中，每孔100μL，置于37℃、5％的CO2、饱和湿度的培养箱中培养。融合后注意观察细胞的生长，并做记录。4～5天可见小克隆，在融合后的第6～7天用HT选择培养基进行换液，第二天用建立的竞争ELISA方法进行阳性孔筛选，对筛选阳性孔的细胞克隆后转至24孔培养板中，首次可用HT培养基扩大培养，以后逐步改用DMEM完全培养基。
竞争ELISA方法如下：采用检测血清效价的ELISA包被原进行包被，一抗换成各培养孔的上清，每孔加入50μL一抗和50μL酶标二抗(酶标二抗具体为：HRP-羊抗鼠IgG)，加底物显色。显色10分钟之后，选择阳性孔进行克隆化，设置阳性对照和阴性对照，确定好抗原的用量和酶标二抗的稀释度，筛选在1～2d完成。
进行5次融合，均铺10板，第一天培养皿铺板率为40％，第二天培养皿铺板率为90％，第三天培养皿铺板率为100％，显微镜下观察融合率均为90％以上，挑选OD600值＞1.0的阳性克隆进行下一步的克隆化。
1.7杂交瘤细胞的克隆化：
用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆化。在克隆化之前，先按照阳性孔的数目制备适量饲养细胞，方法同融合，第一次克隆化，在选择性培养末，进行了检测之后，将阳性细胞所在孔中的细胞克隆用无菌加样器头吹打成均匀的细胞悬液，进行细胞计数。根据计数结果选择适量的细胞悬液，用完全培养液稀释成1个/100μL，滴加在饲养细胞板中，第二次和第三次克隆化，分别选择上一次克隆化后检测中的阳性孔进行克隆化，尽量选择单克隆孔进行克隆化，特别是上一次克隆化后100％阳性的孔应该继续克隆化，还有细胞克隆圆润，生长迅速，细胞形态饱满、折光性好等。将克隆化的杂交瘤细胞扩大培养后，以1000r/min离心5min，收集上清液做单克隆抗体鉴定。
取细胞悬液10μL，加入到含有20X(X为细胞计数的数量)μL基础培养液的1mL离心管中混匀，取7μL加入到含有3.5mLHT培养基的离心管中。混匀后加入到96孔培养板中，100μL/孔(以下均为100μL/孔)，每孔1个细胞，细胞浓度为10个/mL，一板克隆3株细胞，克隆后于37℃，5％CO2条件下培养，1周后对亚克隆细胞进行筛选，将阳性单克隆扩大培养，按上述方法继续进行亚克隆，第二次克隆时可把HT培养液换成DMEM完全培养液。一直到连续两次亚克隆的阳性率为100％时为止，一般进行3次，对阳性孔的融合细胞，大部分转到24孔板待下次克隆阳性且细胞生长状态好即扔掉。
经过3次单克隆筛选，共筛选出3株特异性强，效价高的细胞株，具体可见图1。
将该3株单克隆抗体，经过再次大批量的制备腹水，经检测还能分泌高效价抗体，其效价能达到1:128000。
实施例2
本实施例提供一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备，具体步骤如下：
1.1小鼠免疫：小鼠的免疫方法和实施例1相同。
1.2小鼠骨髓瘤细胞NS1的制备：
杂交瘤细胞融合前7天，复苏NS1细胞，方法如下：从液氮罐中取出装有1mL NS1细胞悬液的冻存管，迅速将冻存管浸入37℃水浴锅中并快速转动，使冷冻状态的细胞悬液迅速解冻，注意不将冻存管管口浸入温水液面以下。在超净工作台中将解冻的细胞悬液抽出，加入含有6mL基础培养液的10ml离心管中，1000r/min，5min，弃上清，用完全培养液10mL重悬NS1细胞，并加入细胞培养平皿中，置于37℃，5％的CO2孵箱中培养，细胞处于旺盛生长期时注意传代，使其浓度维持在1×105/mL和5×105/mL之间的对数生长期。
融合当天，用吸管将细胞从平皿中轻轻吹下，收集于离心管中，用1000r/min离心5min，弃去上清，向沉淀中加入10mL基础培养液，同上离心洗涤1次，然后将细胞重悬至10mL，混匀。
1.4免疫小鼠脾细胞悬液的制备：
选取第三次免疫后抗体水平最高的小鼠，第三次免疫15～20天后腹腔内注射纯抗原50μg(不加佐剂)作为融合前的强化免疫，待4d后取脾脏融合，方法如下：
(1)将已免疫的BALB/c小鼠，眼眶采血，血清离心取上清，-20℃冻存，供检测抗体用，同时处死小鼠，75％酒精浸泡5min，沥干酒精，放至超净台解剖板，腹部朝上，用大头针固定四肢，用灭菌剪刀剪一小口，用两把灭菌镊子将腹部皮毛拉开，用大头针固定，用酒精消毒腹膜，剪开腹腔，取出脾脏，将其放入加有2mL庆大霉素的10mL基础培养基的50mL离心管中轻轻漂洗一次，并细心剪除周围结缔组织；
(2)将脾脏移入另一盛有30mL基础培养液的平皿中的不锈钢滤网中，用无菌手术剪刀剪成小块，用无菌研磨棒磨至滤网中看不到红色为止；
(3)将脾细胞悬液移入50mL离心管中，混匀，1000r/min离心5min，弃去上清；
(4)加入基础培养液40mL，吹打悬浮均匀；
(5)取样对脾淋巴细胞计数，此即为待融合的脾淋巴细胞悬液。
1.5细胞融合：
将小鼠骨髓瘤细胞NS1和脾细胞进行融合，具体方法如下：
(1)将收集的脾淋巴细胞悬液与待融合的NS1细胞悬液按5～10:1的体积比混合，室温下以1000r/min离心5min，弃去上清液；
(2)轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散成均匀的糊状，一手均匀地转动离心管，另一手用1mL吸管吸取50％的PEG-3000溶液1mL，与沉淀细胞混匀，作用时间控制在90s，同时控制pH在8.0～8.2；
(3)在5min内将10mL基础培养液加入到离心的细胞管中，使PEG稀释，终止其促融作用。具体加法为：第1分钟加1mL，第2分钟加2mL，随后的3分钟内将剩余液体加完，注意操作应轻柔；
(4)将终止反应的细胞悬液以1000r/min离心5min，弃上清液；
(5)加入10mL的HAT培养液悬浮后，加入到HAT培养液重新悬浮并混匀融合后的细胞；
(6)将细胞悬液加入96孔培养板中(一般铺10板)，每孔0.1mL，然后将培养板置37℃，5％的CO2孵箱中培养。
1.6杂交瘤细胞的选择培养：
将融合后的细胞悬液加入96孔细胞板中，每孔100μL，置于37℃、5％的CO2、饱和湿度的培养箱中培养。融合后注意观察细胞的生长，并做记录。4～5天可见小克隆，在融合后的第6～7天用HT选择培养基进行换液，第二天用建立的竞争ELISA方法进行阳性孔筛选，对筛选阳性孔的细胞克隆后转至24孔培养板中，首次可用HT培养基扩大培养，以后逐步改用DMEM完全培养基。
竞争ELISA方法如下：采用检测血清效价的ELISA包被原进行包被，一抗换成各培养孔的上清，每孔加入50μL一抗和50μL酶标二抗(酶标二抗具体为：HRP-羊抗鼠IgG)，加底物显色。显色10分钟之后，选择阳性孔进行克隆化，设置阳性对照和阴性对照，确定好抗原的用量和酶标二抗的稀释度，筛选在1～2d完成。
进行5次融合，均铺10板，第一天培养皿铺板率：30％，第二天培养皿铺板率：60％，第三天培养皿铺板率：90％，显微镜下观察融合率均为90％左右，挑选OD600值＞1.0的阳性克隆进行下一步的克隆化。
1.7杂交瘤细胞的克隆化：
用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆化。第一次克隆化，在选择性培养末，进行了检测之后，将阳性细胞所在孔中的细胞克隆用无菌加样器头吹打成均匀的细胞悬液，进行细胞计数。根据计数结果选择适量的细胞悬液，用完全培养液稀释成1个/100μL，滴加在细胞板中，第二次和第三次克隆化，分别选择上一次克隆化后检测中的阳性孔进行克隆化，尽量选择单克隆孔进行克隆化，特别是上一次克隆化后100％阳性的孔应该继续克隆化，还有细胞克隆圆润，生长迅速，细胞形态饱满、折光性好等。将克隆化的杂交瘤细胞扩大培养后，以1000r/min离心5min，收集上清液做单克隆抗体鉴定。
取细胞悬液10μL，加入到含有20X(X为细胞计数的数量)μL基础培养液的1mL离心管中混匀，取7μL加入到含有3.5mLHT培养基的离心管中。混匀后加入到96孔培养板中，100μL/孔(以下均为100μL/孔)，每孔1个细胞，细胞浓度为10个/mL，一板克隆3株细胞，克隆后于37℃，5％CO2条件下培养，1周后对亚克隆细胞进行筛选，将阳性单克隆扩大培养，按上述方法继续进行亚克隆，第二次克隆时可把HT培养液换成DMEM完全培养液。一直到连续两次亚克隆的阳性率为100％时为止，一般进行3次，对阳性孔的融合细胞，大部分转到24孔板待下次克隆阳性且细胞生长状态好即扔掉。
经检测发现，当不添加饲养层细胞时，克隆率较低，但仍旧能够筛选得到作为标记物可以有效的解决层析实验中的HOOK现象的单克隆抗体。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于，骨髓瘤细胞采用的是SP2/0。
实施例4
实施例4与实施例1的区别在于，PEG的分子量为3000，浓度为20％。
实施例5
实施例5与实施例1的区别在于，融合时的pH为7.2-7.4。
实施例6
实施例6与实施例1的区别在于，融合时间为10min。
结果分析：
(1)对实施例1～6中鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备过程进行比较，结果如下表3所示：
表3实施例1～6中鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备过程及结果比较
克隆率 融合率 产生抗体的量
实施例1 90％ 94％ 6.6mg/ml
实施例2 85％ 80％ 4.8mg/ml
实施例3 89％ 90％ 6mg/ml
实施例4 87％ 83％ 5.3mg/ml
实施例5 73％ 69％ 4mg/ml
实施例6 76％ 65％ 3.3mg/ml
通过上表分析可知：
通过实施例1和实施例2的对比可知，当融合前、后不添加饲养层细胞时，克隆化过程中克隆率会偏低；
通过实施例1和实施例3的对比可知，当采用其他骨髓瘤细胞进行融合时，得到的细胞株产生的抗体的量偏低；
通过实施例1和实施例4的对比可知，当PEG的浓度过低时，融合效率不高；发明人经过大量实验还发现，当PEG的分子量在1000～4000，浓度保持在30～50％时，其既能达到较高的融合率，且对细胞的毒性较低，而当PEG的浓度过低时，融合效率不高，浓度过高时，毒性较大不利于融合细胞的生长；
通过实施例1和实施例5的对比可知，当pH 7.2时，融合效率也较低。发明人经过大量实验还发现，当pH偏碱时，融合效率较高，当pH在8.0～8.2时，效果最佳。
通过实施例1和实施例6的对比可知，融合时间同样影响细胞的融合率，这可能时因为融合时间过长，导致细胞受到了损伤。
(2)杂交瘤细胞的稳定性研究
阳性杂交瘤细胞的冻存：将准备冻存的细胞收集到离心管中，细胞计数，然后1000r/min离心10min，弃上清，用细胞冻存液重新悬浮细胞，并使细胞的数量调整到1×106个/mL左右，以每个冻存管1mL分装后，标记，4℃，0.5～1小时，-20℃，1～2小时，-80℃过夜，第二天浸入液氮保存。
阳性杂交瘤细胞的复苏：从液氮中取出要复苏的细胞，迅速投入37℃水浴中，融化后于1000r/min离心10min，弃上清，用DMEM完全培养基重悬细胞，转移到25mL细胞培养皿中，置37℃、5％CO2培养箱中培养。
杂交瘤细胞稳定性测定：
连续培养杂交瘤细胞20代，每5～6代检测一次细胞培养上清，测定效价。并将杂交瘤细胞经过3次冻存与复苏，测定复苏后效价，以检测杂交瘤细胞的活性和分泌抗体的稳定性。
结果：经过检测分析发现，各实施例中筛选出的杂交瘤细胞进行传代培养后分泌的抗体效价均能达到1：10000000，较为稳定；经过冻存和复苏后，其仍旧能保持良好的细胞活性，分泌的抗体在层析实验中仍旧能够很好的解决HOOK现象。
(3)制备得到的鼠抗鸡IgY单克隆抗体在层析平台上的应用
将实施例1中制备得到的其中一株鼠抗鸡IgY单克隆抗体按照下述步骤在层析平台上进行应用：
1.1烧金工艺
表4
名称 用量
超纯化水 100ml
10％氯金酸 0.155ml
10％柠檬酸三钠 0.238ml
使用300℃煮沸，煮沸后迅速加入10％氯金酸，搅拌均匀后，迅速加入10％柠檬酸三钠，加热搅拌5min，余热搅拌10min后，至室温搅拌20min，冷却后测OD值，分别测OD540＝1.262，OD580＝0.627，OD600＝0.415。
1.2标记
表5
名称 用量 备注
金水 100ml
1.27％TRIS 0.5ml
0.2M碳酸钾 0.25ml 调节PH 7.8
HBsAg标记抗体 1mg/ml*1.0ml 标记30min
10％bsa 1.0ml 封闭30min
1.3离心离心条件：10000r/min，35min，4℃，将离心收集沉淀液后加金标稀释液待用，金标稀释液的量＝金水的量100ml÷200＝0.5ml，使用20ul原液+3ml超纯化水测下列:
OD540：1.196
OD600：0.443
真实OD540为×151＝180
1.3.1金标垫处理，使用金标垫处理液浸湿玻纤后，45℃烘干2小时。
金标垫处理液：
表6
Figure BDA0003453402500000161
1.3.2金标稀释液：
表7
Figure BDA0003453402500000171
1.3.3喷金液浓度使用金标稀释液调整到需使用的OD540＝100。
1.3.4喷金
喷量：1.5ul/cm制成金标总OD值＝150，37℃烘干2小时
2.1包被
2.1.1NC膜:CN140
2.1.2划膜稀释液
表8
Figure BDA0003453402500000172
2.1.3划膜浓度
使用划膜稀释液将划膜液浓度稀释为1.0mg/ml，划膜量为1.0ul/cm，37℃烘干2小时。
3.1样品垫
使用样品垫处理液浸湿玻纤，然后45℃烘箱，烘干2小时。
样品垫处理液：
表9
Figure BDA0003453402500000181
备注：调节ph使用0.2M的稀盐酸和0.2M的氢氧化钠
3.2组装
将划好线的大卡，贴上金标，金标搭在NC膜1-2mm处，在金标后面贴上样品垫，要搭在金标上，在另一头贴上吸水滤纸，滤纸搭在NC膜1-2mm处。
组装完成后保存在铝箔袋中待用。
对照试剂条：
表10
名称 批号
艾博 2015080022
英科新创 2016010101
4.1检验方法
直接滴加70ul左右的血清/血浆样本至样品垫或直接将试纸条插入血清/血浆样本中，阳性样本15分钟判读，康彻思坦1IU/ml HBsAg样本30分钟判读，阴性样本在15分钟至30分钟判读。阳性质控品，每个样本重复3人份，临床样本每个测试1人份，其它传染病、心肌等阳性样本每个测试1人份。
4.2稳定性实验
4.2.1原料蛋白在制成试剂条时，放置在55℃烘箱中3天，进行加速稳定性实验。
检验标准：
表11
Figure BDA0003453402500000191
4.2.2原料未制成试剂条时：将原料直接放置在-20℃冰箱和37℃烘箱中3天，分别制成试剂条，进行实验。
检验标准：
表12
Figure BDA0003453402500000192
原料制成试剂条55℃加速，结果如下表13所示：
表13
Figure BDA0003453402500000193
Figure BDA0003453402500000201
原料分别在37℃加速：37℃烘箱中3天，-20℃加速：-20℃放置3天，结果如下表14所示：
表14
检验项目 -20℃ 37℃
阴性参考品(N1-N20) 20/20阴性 20/20阴性
最低检出量 3/3阳性 3/3阳性
低滴度阳性参考品 3/3阳性 3/3阳性
中滴度阳性参考品 3/3阳性 3/3阳性
高滴度阳性参考品 3/3阳性 3/3阳性
结论：
a、本次测试样本的阳性符合率为100％，阴性符合率为100％，最低检测浓度可以达到1IU/ml；
b、原料在制成试纸条时，在55℃3天稳定性合格。
c、原料在37℃烘箱中3天和-20℃放置3天，稳定性合格。
d、外部客户评价合格。
选取浓度大于100mg/L的CRP血样倍比稀释，用标杆试剂雅培发光测CRP试剂盒赋值平行分别与自制鼠抗鸡IgY单克隆抗体(对应图2中鼠抗鸡IgY单克隆抗体应用后)和市售抗鸡IgY多克隆抗体(对应图2中鼠抗鸡IgY单克隆抗体应用前)荧光免疫层析测CRP试剂测试结果平行对比，对试剂盒HOOK性能改善提升效果进行评价。具体步骤如下：
a、C-反应蛋白单克隆抗体固定在硝酸纤维素膜上，鼠抗鸡IgY单克隆抗体固定在硝酸纤维素膜上；
b、荧光标记的C-反应蛋白单克隆抗体固定在玻璃纤维上，荧光标记的鸡IgY抗体(固定在玻璃纤维上；
c、缓冲液基质为磷酸盐缓冲液(PBS)(0.1M，pH7.0±0.2)；
d、上机检测。
结果如图2所示。由此可见，本发明制备得到的鼠抗鸡IgY单克隆抗体作为标记物能够有效解决HOOK现象，提高试剂的灵敏度和特异性，大大提高层析平台试剂的准确性。
(4)制备得到的鼠抗鸡IgY单克隆抗体与抗鸡IgY多克隆抗体的比较抗鸡IgY多克隆抗体来自于义翘神州。
两者的效价稳定性比较结果如图3所示，特异性比较结果如图4所示，抗体效价比较结果如图5所示。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用高纯鸡IgY作为抗原免疫小鼠制备得到。
2.权利要求1所述的鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用高纯鸡IgY作为抗原免疫小鼠，并检测血清效价，当抗体水平达到1:10000以上时，选取抗体水平最高的小鼠，脾脏注射高纯鸡IgY进行加强免疫，4d后取脾脏细胞制备待融合的脾淋巴细胞悬液；
采用小鼠腹腔培养物制备饲养层细胞板，其中小鼠腹腔培养物中细胞的浓度为1×105个/mL～10×105个/mL；
将待融合的脾淋巴细胞悬液与复苏后的小鼠骨髓瘤细胞NS1按体积比(5～10):1混合，在浓度为30～50％的PEG 1000～4000，pH为8.0～8.2的条件下融合90～150s；
之后对杂交瘤细胞进行选择培养和克隆化处理，采用间接Elisa法检测筛选即得。
3.根据权利要求2所述的鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，采用高纯鸡IgY作为抗原免疫小鼠的步骤如下：
第0天，采用鸡IgY抗原和FCA佐剂进行首免；
第21天，采用鸡IgY抗原和FIA佐剂进行加强免疫；
第42天，采用鸡IgY抗原和FIA佐剂进行再次加强免疫；
从尾巴或眼眶采血，收集血清并检测效价，第三次免疫15～20天后腹腔内注射纯抗原进行融合前的强化免疫。
4.根据权利要求2或3所述的鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，小鼠免疫采用的是sigma公司佐剂。
5.根据权利要求2所述的鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，脾淋巴细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞NS1的融合步骤如下：
将待融合的脾淋巴细胞悬液与复苏后的小鼠骨髓瘤细胞NS1按体积比(5～10):1混合，室温下离心，弃去上清液；
轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散成均匀的糊状，加入50％的PEG-3000溶液，与沉淀细胞混匀，作用时间控制在90s，同时控制pH在8.0～8.2之间；
之后加入基础培养液终止促融作用，将终止反应的细胞悬液离心，弃上清，加入HAT培养液悬浮并混匀融合后的细胞。
6.根据权利要求5所述的鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，终止促融作用的基础培养基5min内加完。
7.根据权利要求3所述的鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，将混匀后的融合细胞加入已铺有饲养层细胞的培养板中，37℃，5％的CO2、饱和湿度的培养箱中培养，并筛选后再进行克隆化处理。
8.根据权利要求7所述的鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，用有限稀释法对筛选后的阳性杂交瘤细胞进行克隆化处理。
9.权利要求1～8任一项制备得到的鼠抗鸡IgY单克隆抗体在试剂盒中的应用。
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