KR20090034798A - 아포지단백질 핑거프린팅 기술 - Google Patents

Abstract

본 발명은 플라즈마, 혈청 및 지단백질 분획물을 포함하는 생물학적 시료에서 아포지단백질의 변형 및 농도를 측정하는 방법에 관한 것으로서,

환자에게서 시료를 수득하는 단계, 시료에 일정 부피의 내부 표준형을 첨가하는 단계, 질량 분광법으로 시료를 분석하는 단계, 내부 표준형의 값을 사용하여 아포지단백질의 농도를 측정하는 단계, 및 당뇨병, 발작, 스트레스, 알쯔하이머 질환 및 심혈관 질환(예를 들면 지질 장애, 대사 증후군, 비만, 동맥경화증 등)을 진단하기 위한 방법으로서 사용하기 위해 아포지단백질. 이의 이소형, 아미노산 치환 및 변형 농도를 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

아포지단백질 핑거프린팅 기술{APOLIPOPROTEIN FINGERPRINTING TECHNIQUE}

본 발명은 생물학 및 임상 시료에서의 아포지단백질의 조성물, 분석 및 정량 분야에 관한 것이다. 보다 특히 본 발명은 인간 플라즈마, 혈청 및 지단백질 분획물 시료에 존재하는 아포지단백질의 핑거프린팅, 프로파일링, 측정 및/또는 정량을 위한 방법, 기술 및 프로토콜에 관한 것이다.

지단백질의 단백질 성분인 아포지단백질은 소수성 지질을 용해시키며, 세포 표적화 및 이송을 촉진시킬 수 있다. 간 및 장에서 합성되는 이러한 성분들은 지단백질 입자를 완전한 상태로 유지하기 위해 필수적이며, 지단백질 상에서 활성을 갖는 효소에 있어서의 보조 인자로서 작용하며, 지질이 순환하지 않도록 수용체-매개 상호작용을 촉진시킨다.

아포지단백질에는 몇 가지 그룹이 있다: A(Apo A), B(Apo B), C(Apo C) 및 E(Apo E). 상기 세 그룹 A, B 및 C 각각은 2개 이상의 별개의 단백질로 구성된다. Apo A에는 Apo AI, Apo AII, Apo AIV 및 AV; Apo B에는 Apo B100 및 Apo B48; 및 Apo C에는 Apo CI, Apo CII, Apo CIII 및 Apo CIV. Apo CI, CIII, CIV 및 Apo E는 각각 2개 이상의 이소형으로 구성된다. 아포지단백질은 질병 및 건강에 다양한 역할을 수행한다.

아포지단백질 CIII는 트레오닌-74에서의 글리코실화반응이 상이한 세개의 이소형으로서 인간에 존재하는 79개의 아미노산 단백질이다. CIII-0 이소형은 시알리데이스 효소 반응의 최종 생성물이며, 시알산, 갈락토스 및 갈락토스 아민 잔기가 없으며, 총 이소형의 14 %에서 확인되었다. CIII-0 이소형은 플라즈마에서 높은 트리글리세리드 지단백질의 제거에 중요한 경로인 지방 분해 자극 수용체에 결합하는 매우 저 밀도의 지단백질(VLDL)의 억제제이다. CIII-0 이소형은 VLDL에 친화도가 매우 낮다. CIII-1 이소형은 시알산 1 몰을 가지며, 총 이소형의 51 %에서 확인되었다. CIII-2 이소형은 간에서 합성 및 분비되는 CIII의 초기 형태이며, 시알산 2 몰을 가지며, 총 이소형 중 35 %에서 확인되었다. CIII-2 이소형은 VLDL 친화도가 높고, 지방 분해 자극 수용체에 결합하는 VLDL의 좋지 않은 억제제이다.

CIII 이소형을 규명하고 정량하는 현재 방법은 플라즈마로부터의 지단백질 분획물의 분리, 상기 분획물의 탈지질, 및 아포지단백질의 수용성 분획물에서의 CIII의 정제를 포함한다. 여러 가지의 정제된 이소형은 등전집속 겔 전기영동, 질량 분석법, 및 형광 및 흡수 분광법에 의해 검출할 수 있다. 이러한 현재 방법의 몇 가지 단점은 플라즈마로부터의 CIII의 분리에서의 단백질 회수율이 단지 60-80 %이며, 플라즈마에서의 CIII의 임상적 진단을 위한 현재 방법, 예컨대 ELISA 및 면역비탁 분석법만이 총 CIII를 검출할 수 있다는 것이다.

CIII 이소형은 몇 가지 이유에서 임상적으로 중요하다. 이소형의 농도는 당 뇨병 환자에서의 글루코스 제어 농도와 함께 변화한다는 것이다. 예를 들면 높은 HbA1C는 높은 CIII-0 농도와 직접적으로 관련이 있다. 고중성지방혈증 피험체는 VLDL에서 CIII-2 이소형으로서 CIII의 비율이 증가한다. CIII-2 농도는 정상적인 총 CIII 농도에도 불구하고 심한 칼로리 제한을 하는 여성에게서 증가한다. CIII-2에서의 변형은 실제적으로 VLDL 트리글리세라이드의 변화와 관련이 있으며, 반면에 CIII-1의 변형은 반대로 관련이 있다. CIII 이소형의 정확한 정량과 검출에서 현존하는 기술의 한계로 인해, 지질 대사의 이해를 위한 가장 중요하며 다양한 대사적 과정에서의 이들의 역할은 여전히 논쟁의 대상이다.

논문 또는 종래 문헌에서는 다양한 특성, 및 다양한 아포지단백질 및 질환 사이의 상관 관계를 보고하고 있다. 예를 들면 Apo D는 멀티-리간드, 멀티기능의 트랜스포터이며, 알쯔하이머 질환에서 말초 신경을 재생시키는 특이적 부위에 축적되는 것으로 알려져 있다. 또한 지금까지 Apo J는 보도에 따르면 몇몇 다양한 생리학적 과정, 예컨대 정자의 성숙, 지질 운송, 보체 억제, 조직 리모델링, 막 리사이클링, 세포-세포 및 세포-기저 상호작용, 겹침-적격 상태에서 스트레스 단백질의 안정화, 및 세포 자멸사의 촉진 또는 억제와 관련이 있다. 또한 Apo H는 음성적 전하 표면과 강하게 결합하며, 혈액 응고의 내부 경로의 활성 및 활성 혈소판의 프로트롬빈분해효소 활성을 억제하며, 상기 활성의 억제는 두개의 활성에 있어서 필수적인 음성 전하 표면을 커버링함으로써 가능해진다는 것이 공지되어 있다. Apo F는 LDL과 결합하며, 콜레스테롤 에스테르 전이 단백질(CETP) 활성을 억제하고, 콜레스테롤 운송의 중요한 조절제로서 나타난다. Apo F는 VLDL, Apo AI 및 Apo AII 와는 아주 적게 결합한다. Apo M은 지질 운송과 관련이 있는 것으로 제안되었다. Apo CIV는 CI 및 CII와 같이 동일한 유전자 좌의 14.5 kD 크기의 아포지단백질이며, 문헌에 보고된 기능은 없다.

또한 심혈관 질환과 콜레스테롤 농도 사이의 전염병적 상호관련성을 기초로 임상의들은 심장 질환 위험을 평가하기 위해서 콜레스테롤 농도를 오랫동안 측정하고, 표준화하였다. 지단백질 입자(LDL 및 HDL) 및 이와 관련된 콜레스테롤은 심혈관 위험의 평가에 사용될 수도 있다. 여러 연구 논문에서 지단백질 입자 크기 및 밀도에의 건강 효과의 관련성을 연구하고 있지만 이러한 연구 결과는 일관적이지 않다.

지난 몇 년에 결쳐 아포지단백질 농도가 다양한 조건과 관련이 있다는 상당히 많은 증거가 확인되었으며, 최근에는 질환 조절 및 예방 센터와의 최근 회의에서 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소(NHLBI)는 아포지단백질 B 측정은 가까운 미래에 표준화를 포함시킬 것을 제안했다. 아포지단백질은 심혈관 질환, 당뇨병, 발작, 비만, 알쯔하이머, HIV 및 기타 질환과 관련이 있다. 지질의 운송 및 대사에서 아포지단백질의 주요한 역할을 보면 이러한 연관성은 놀랄만한 것이 아니다. 아포지단백질의 정제, 검출 및 정량의 어려움으로 이러한 화합물의 농도와 건강 효과 사이의 연구의 실행이 용이하지 않다.

종래 문헌의 방법을 사용하면 현재 아포지단백질의 정량 및 측정은 분석적 또는 연속적인 초원심분리, 컬럼 크로마토그래피, 전기영동 또는 침전에 의해 지단백질 입자를 분리하는 단계가 요구된다. 이러한 기술은 현재 일상적인 임상적 용 도로 소비하기에는 너무 고가이며, 시간이 소요된다. 또 다른 기술은 현재 고 효능 액체 크로마토그래피이며, 이것은 신속하지만 보다 더 복잡하고 고가이다. Apo A 및 B 함유량 측정을 위한 다른 기술로는 효소 면역 측정법(ELISA), 방사성 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 방사상 면역 확산법, 네펠로법, 탁도 측정법 및 전기 면역 측정법을 포함한다. 최근에는 표면-강화 레이저 탈착 이온화 질량 분광법(SELDI 또는 SELDITOF-MS, TOF는 비행 시간을 의미하고, MS는 질량 분광법을 의미함)은 플라즈마, 혈청 및 지단백질 분획물에서 아포지단백질을 측정하는 몇가지의 새로운 선택사항을 제공한다.

따라서 아포지단백질의 분리, 규명 및 정량에 있어서의 정확하고, 신속하며, 재현가능한 분석은 항상 필요하다. 인간 플라즈마, 혈청 및 지단백질 분획물의 시료에 존재하는 아포지단백질의 핑거프린팅, 프로파일링, 측정 및/또는 정량을 위한 개선된 기술이 필요하다. 본 발명은 다른 것 중에서도 상기와 같은 필요성에 관한 것이다.

발명의 요약

간단하게 말하면 본 발명의 기술은 비분획화 플라즈마 또는 혈청, 또는 지단백질 분획물에서 직접 멀티 아포지단백질을 검출 및 측정하기 위한 표면 강화 레이저 탈착/이온화, SELDI와 면역학적 기술을 결합한 것이다. 내부 표준형의 정량을 위해서 원하는 단백질에 항체-결합 특성과 매우 유사하지만 명백하게 상이한 분자 질량을 갖는 공지된 단백질의 측정 및 검출이 요구된다. 질량 분광법에 의해 측정된 공지되지 않은 폴리펩티드의 질량은 공지된 동일성 및 농도의 참조 폴리펩티드의 질량과 비교할 수 있다.

총 플라즈마 또는 혈청의 프로파일은 정상 및 건강한 개개 시료에서의 차이를 검출하기 위한 패턴 인식 기술 및 클러스터링을 검토할 필요가 있다. SELDI 기술에서의 특수한 항체의 사용으로 보다 간단한 분석 방법이 유도된다. SELDI 기술의 또 다른 단순화 특성은 보유물 크로마토그래피이다. 원하는 단백질은 다른 분석물들은 씻어 제거하면서 특이적 표면에 상기 단백질을 결함시켜 보유한다. 흡착 및 탈착은 pH, 염 농도 또는 유기 용매를 조정하여 변형시킬 수 있다. 시나핀산(sinapinic acid) 또는 또 다른 적당한 매트릭스는 테트라플루오로아세트산과 바로 제조한 용액에서 혼합하고, 칩이라고 하는 것에 도포하고, 건조되면 매트릭스-임베디드 분석 분자는 레이저에 의해 탈착되며, 고체상으로부터 이온하되고, 완전한 분자 이온으로서 가속된다.

본 발명의 바람직한 기술의 하나의 실시양태는 플라즈마 시료로부터 직접 선택적으로 아포지단백질을 흡착하기 위해 단백질 G를 경유하여 표면-강화 칩과 결합하는 특이적인 항체를 사용한다. 단백질 G는 항체의 fc 부분에 결합하여 생물학적 시료에서 원하는 특이적 항원과 항체의 결합을 강화시킨다. 표면-강화 칩의 표면은 다른 시료 성분은 씻어 제거하면서 특이적 아포지단백질을 보유한다. EAM 용액 매트릭스는 아포지단백질의 레이저 탈착 이온화를 촉진시킨다. 이온화 아포지단백질은 이들의 비행 시간을 기본으로 약간 상이한 시간에 검출기에 도달하며, 이러한 시간의 차이는 질량으로 전환될 수 있다. 피크의 강도는 각 단백질의 양과 관련이 있다.

플라즈마 및 지단백질 분획물의 아포지단백질의 조성물, 농도 및 이소형은 심혈관 질환 및 다른 만성 질환, 예컨대 발작, 대사 증후군, 당뇨병, 알쯔하이머, 단백질 분해 효소 억제제하에서의 HIV 및 HIV 환자(고중성지방혈증 환자), 및 다양한 타입의 지단백혈증과 관련된 몇 가지의 질환 또는 상태의 결정인자이다. 따라서 본 발명과 같은, CIII 이소형에 있어서의 임상적 진단 분석으로부터 이익을 얻을 수 있는 잠재적 질환은 상기에서 언급한 것들을 포함한다. 지질-강하 약제를 사용하는 임상적 연구는 본 발명의 아포지단백질 핑거프린팅 기술로부터 이익을 얻으며, 본 발명의 기술은 어떻게 이러한 파라메터들이 여러 가지 질환 및 치료를 변화시키는지를 보여주기 위해 여러 가지 지단백질 분획물 및 플라즈마에서의 이들의 이소형 및 아포지단백질의 농도 및 분포에서 확인할 수 있다. 본 발명의 기술은 또한 노화, 영양, 환경 노출 및 생활 습관의 변화로 발생되는 아포지단백질 변형을 평가하기 위해서 및 신생아의 아포지단백질 상태를 평가하기 위해 이상적이다.

본 발명의 실례가 되는 특성은 1개 이상의 질환 또는 상태를 분류하거나, 진단에 있어서 신속하고 유용한 정량적 분석법을 개발하고, 질환 특이적인 아포지단백질 바이오마커 또는 프로파일을 규정하는 것을 포함한다. 이러한 특성, 및 본 발명의 다른 특성 및 이점은 첨부된 도면과 함께 바람직한 실시양태의 하기 상세한 설명을 읽으면 당업에 통상의 지식을 가진 자들에게 보다 명확해 질 것이다.

본 발명은 본 발명의 대표적인 이소형 표준형 및 프로파일 재현성을 설명하는 첨부된 도면을 참조하여 바람직하며 대안적인 실시양태의 상세한 설명을 참조하여 좀 더 이해할 수 있을 것이며, 참조 숫자는 유사한 구조를 나타내며, 전체의 구성 요소를 나타내며, 하기와 같다:

도 1은 상이한 CIII 이소형 표준형의 보고된 질량 스펙트럼 및 분자량을 나타낸다;

도 2는 통합 아포지단백질 CIII(CIII-0, CIII-1 및 CIII-2 이소형) 프로파일 CIPHERGEN Q10 칩을 나타낸다;

도 3은 통합 아포지단백질 CIII(CIII-0, CIII-1 및 CIII-2 이소형) 프로파일 CIPHERGEN Q10 칩을 나타낸다;

도 4는 CIII 이소형 프로파일 재현성 CIPHERGEN 항-CIII PS 20 칩을 나타낸다;

도 5는 CIII 이소형 프로파일 재현성 CIPHERGEN 항-CIII PS 20 칩을 나타낸다;

도 6은 플라즈마 CIII 이소형 프로파일 재현성을 나타낸다;

도 7은 상이한 플라즈마 희석에서의 플라즈마 CIII 이소형 프로파일을 나타낸다;

도 8은 상이한 플라즈마 희석에서의 플라즈마 CIII 이소형 프로파일을 나타낸다;

도 9는 정상 및 당뇨병 피험체 CIPHERGEN 항-CIII PS 20 칩의 CIII 이소형 프로파일의 비교를 나타낸다.

바람직한 실시양태의 상세한 설명

본 발명은 아포지단백질을 포함하는 프로파일을 사용하여 진단할 수 있는 심혈관 질환(예를 들면 지질 장애, 대사 증후군 및 죽상 동맥 경화), 알쯔하이머 질환, 스트레스, 발작, 당뇨병을 평가하기 위해 유용할 수 있는 민감하고 신속한 방법을 제공한다. 상기 프로파일은 질환의 상태와 관련이 있으며, 따라서 환자의 질병 상태를 본 발명에 따라 민감하며 신속하게 결정할 수 있다. 따라서 본 발명의 능력은 1개 이상의 질환 또는 상태를 분류하거나, 또는 진단에 있어서 신속하고 유용한 정량적 분석법을 개발하고, 아포지단백질 바이오마커 또는 프로파일에 특이적인 질환을 규정하는 것이다.

보다 특히 하나의 실례적 실시양태에서 본 발명은 피험체에서 질환 상태를 정량하는 방법을 제공하며, 하기와 같은 단계를 포함한다:

(1) 피험체에서 취한 시료에서 1개 이상의 바이오마커를 측정하는 단계(상기 바이오마커는 Apo CI, Apo CII, Apo CIII, Apo CIV, Apo AI, Apo AII, Apo AIV, Apo AV, Apo B100, Apo B48, Apo E, Apo D, Apo H, Apo G, Apo F, Apo J, Apo L, Apo M, 이들의 이소형 및 이들의 결합물로 이루어진 군으로부터 선택됨);

(2) 분광법에 의해서 10개 시료에서 1개 이상의 바이오마커를 분석 또는 정량 또는 측정하는 단계;

(3) 분석, 정량 또는 측정법을 사용하여 1개 이상의 바이오마커의 프로파일을 만드는 단계; 및

(4) 질환을 나타내는 표준형 프로파일에 1개 이상의 바이오마커를 비교하는 단계(시료 중의 1개 이상의 바이오마커의 존재 또는 부재는 질환을 나타냄).

관련된 실례의 실시양태에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 피험체에서의 질환 상태의 정량 방법을 제공한다:

(1) 피험체에서 취한 시료에서 복수의 바이오마커를 측정하는 단계(20개의 바이오마커는 Apo CI, Apo CII, Apo CIII, Apo CIV, Apo AI, Apo AII, Apo AIV, Apo AV, Apo B100, Apo B48, Apo E, Apo D, Apo H, Apo G, Apo F, Apo J, Apo L, Apo M, 이들의 이소형 및 이들의 결합물로 이루어진 군으로부터 선택됨);

(2) 분광법에 의해서 시료에서 바이오마커를 분석 또는 정량 또는 측정하는 단계;

(3) 분석, 정량 또는 측정법을 사용하여 바이오마커의 프로파일을 만드는 단계; 및

(4) 질환을 나타내는 표준형 프로파일과 바이오마커를 비교하는 단계(시료 중의 바이오마커의 존재 또는 부재는 질환 또는 질환들을 나타냄).

다른 실례의 실시양태에서 측정 단계는 시료 중의 1개 이상의 바이오마커 또는 바이오마커들의 양을 정량하는 단계를 포함한다. 추가의 실례의 실시양태에서 본 발명은 SELDI 질량 분광법의 사용을 포함하는 1개 이상의 바이오마커 또는 바이오마커들의 해상도를 포함한다.

효과적인 용도의 생물정보학 방법과 결합한 높은 처리량의 단백질 프로파일링으로 바이오마커를 스크리닝하는데 유용한 접근이 가능해진다. 본 발명에서 사용하는 시스템은 크로마토그래픽 PROTEINCHIPO 실험실 장비, 즉 SELDI를 사용하여 시료를 분석하기 위한 분자 어레이 스크리닝 및 제조를 위한 장비와 패턴의 측정과 함께, 시료의 스크리닝, 시료에서 분석물의 존재 검출, 및 시료 형태의 규명을 위한 장비를 이용하는 것이 바람직하다. 어레이와 결합한 단백질은 비행 시간 질량 분광기인 PROTEINCHIPO 어레이 판독기에 의해서 판독된다.

추가로 본 발명의 방법은 변형된 단백질(글리코실화 단백질 등) 및 분해된 단백질을 검출하기 위한 칩 능력의 이점을 취한다. 본 방법은 또한 번역 전 및/또는 번역 후 변형의 아포지단백질을 검출할 수 있는 능력의 이점을 취할 수 있다. 번역 전 변형 형태는 대립형질 변체, 슬라이스 변체 및 RNA 교정 형태를 포함한다. 번역 후 변형 형태는 절단, 단백질 분해(예를 들면 모체 단백질의 단편), 글리코실레이션, 리피데이션, 시스테인화, 글루타티온화, 인산화, 프레닐화, 아실화, 아세틸화, 메틸화, 설파화, 히드록실화, 미리스틸화, 파네실화, 산화 및 유비퀴틴화로부터 수득된 형태를 포함한다. 본 발명 자체의 임의의 바이오마커의 변형 형태도 바이오마커로 사용할 수 있다.

알 수 있는 바와 같이 프로파일은 몇 가지의 질환, 장애 또는 상태의 결정인자인 지단백질 분획물 및 플라즈마로부터 추출한 아포지단백질의 조성물, 농도 및 이소형을 포함한다. 여기에서 사용하는 것과 같이 질환이라는 용어는 장애 및 상태를 포함하며, 심혈관 질환 및 다른 만성적 질병, 예컨대 발작, 대사 증후군, 당 뇨, 알쯔하이머, HIV 및 다양한 타입의 지단백혈증과 관련된 것으로 특이적으로 사용된다. 예를 들면 질환과 결합하여 실행된 임상적 연구 및 지질 강하제를 사용하면 본 발명의 아포지단백질 핑거프린팅 기술로부터 이점을 얻을 수 있다. 또 다른 예로는 본 발명의 핑거프린팅 기술을 사용하면 아포지단백질의 농도와 분포를 알 수 있으며, 이러한 파라메터가 어떻게 여러 가지 질환 및 이들의 치료를 변화시키는지를 확인하기 위해 여러가지 지단백질 분획물 및 플라즈마에서 이들의 이소형을 알 수 있다. 또 다른 예로는 본 발명의 기술은 신생아의 아포지단백질 상태를 평가하고, 노화, 영양, 환경 노출 및 생활 습관의 변화가 발생하는 아포지단백질 변형을 평가하기 위해서도 이상적일 수 있다.

또 다른 예로는 본 발명은 질환 상태를 정량하는 키트를 제공하며, 상기 키트는 본 발명의 바이오마커를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면 키트는 여기에 기재된 바이오마커 중 1개 이상을 측정하기 위해서 사용될 수 있으며, 바이오마커는 질병 환자 및 정상 피험체의 시료에 상이하게 존재한다. 또 다른 예로 상기 키트는 또한 치료 과정에 대한 환자의 반응을 모니터링하기 위해서도 사용할 수 있으며, 의사는 시험 결과를 기본으로 치료를 변형시킬 수 있다. 예를 들면 상기 키트는 질환에 있어서 생체외 또는 생체내 동물 모델에서 1개 이상의 바이오마커의 발현을 조절하는 화합물을 규명하기 위해 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 기술의 하나의 실시양태는 단백질 G를 통해 표면-강화 칩(surface-enhanced chips)에 결합된 특이적 항체를 사용하여 플라즈마 시료로부터 직접 아포지단백질을 선택적으로 흡수한다. 단백질 G는 항체의 fc 부분에 결합 함으로써, 생물학적 시료에서 목적하는 특이적 항원에 항체의 결합을 향상시킨다. 표면-강화 칩의 표면은 특이적 아포지단백질을 보유하며, 다른 시료 성분은 세척되어 진다. EAM 용액 매트릭스는 아포지단백질의 레이저 탈착 이온화(laser desorption ionization)를 용이하게 한다. 상기 이온화된 아포지단백질은 이들의 비행 시간에 기초하여 약간 상이한 시간들에서 검출기에 도달하며, 시간 차이를 질량으로 전환시킬 수 있다. 피크의 강도는 각 단백질의 양과 관련이 있다. 본원에서 사용되는, 용어 항체(antibody) 및 항체들은 항체, 면역글로불린, 애피바디(affybodies) 등의 단편(fragments)을 포함한다.

바이오마커(biomarkers)를 측정하는 바람직한 방법은 바이오칩 어레이(biochip array)의 사용을 포함한다. 본 발명에 유용한 바이오칩 어레이는 단백질 및 핵산 어레이를 포함한다. 1이상의 바이오마커는 바이오칩 어레이에서 캡쳐되며, 레이저 이온화처리되어 바이오마커의 분자량을 알아낸다. 예를들면 바이오마커의 분석은 전체 이온 전류에 대해 정상화되는 역치 강도(threshold intensity)에 대한 1 이상의 바이오마커의 분자량이다. 바람직하게, 대수 변환(logarithmic transformation)은 검출된 바이오마커의 수를 제한하여 피크 강도 범위를 감소시키기 위해 사용된다.

본 발명의 바람직한 방법에서, 바이오마커의 프로파일을 준비하고 상기 바이오마커와 질병 상태를 비교하는 단계는 소프트웨어 분류 알고리즘(software classification algorithm)에 의해서 실시된다. 바람직하게, (1) 바이오칩 어레이를 레이저 이온화처리하고 질량/전하 비율에 대한 신호의 강도를 검출하는 단계; (2) 상기 데이터를 컴퓨터 판독가능한 형태로 변환하는 단계; 및 (3) 질병을 가지고 있는 환자에서 존재하고 질병을 가지고 있지 않은 피험체 대조군에서는 부재하는 바이오마커를 나타내는 신호를 검출하기위한 사용자 입력 파라미터에 따라 상기 데이터를 분류하는 알고리즘을 실시하는 단계에 의해서 바이오칩 어레이상에 고정된 피험체 시료에서 데이터가 생성된다. 단계 (1)에서 SELDI-TOF-MS를 사용하는 것이 바람직하며, 통상, (a) 흡수성 물질을 포함하는 질량 분광광도계에 사용할 수 있도록 조절된 프로브(probe)를 제공하는 단계; (b) 피험체 시료를 흡수성 물질과 접촉시키는 단계; (c) 상기 프로브로부터 바이오마커 또는 바이오마커들을 탈착 및 이온화하는 단계; 및 (d) 질량 분광광도계로 이온화된 바이오마커를 검출하는 단계를 포함한다.

하나의 실시예에서, 단백질 인식 및 구조를 결정하기 위해 사용된 CIPHERGEN PROTEINCHIP® 어레이 플랫폼 질량 분광광도계 및 화학 합성기로부터 유래된 SELDI 질량 스펙트럼 데이터 세트들의 감독 분류기법(supervised classification)을 위한 소프트웨어 패키지인 CIPHERGEN BIOMARKER PATTERNSTM 소프트웨어가 사용되어 생성된 스펙트럼에서 패턴을 검출한다. 상기 데이터는 분류 모델을 사용하는 패턴 인식 과정을 사용하여 분류된다. 통상적으로, 상기 스펙트럼은 분류 알고리즘이 얻어지는 2개 이상의 상이한 그룹으로부터의 시료를 나타낼 것이다. 예를 들면, 상기 그룹은 병변(pathological) 대 비(非)병변(예를 들면, 암 대 비(非)암), 약물 반응 대 약물 비(非)반응, 독성 반응 대 비(非)독성 반응, 질병 상태로의 진행 대 질병 상태로의 비(非)진행, 또는 표현형 이상의 존재 대 표현형 이상의 부재가 있 다.

본 발명의 실시양태의 단계 (1)에서 생성된 스펙트럼은 분류 모델을 사용하는 패턴 인식 과정을 사용하여 분류될 수 있다. 몇가지 실시양태에서, "알려진 시료(known samples)"와 같은 시료를 사용하여 생성된 스펙트럼(예를 들면, 질량 스펙트럼 또는 비행 시간 스펙트럼)으로부터 유래된 데이터는 분류 모델을 "검증하기위해" 사용될 수 있다. "알려진 시료"는 미리 분류된(예를 들면, 암 또는 암이 아님) 시료이다. 그후, "알려진 시료"와 같은 시료를 사용하여 생성된 스펙트럼(예를 들면, 질량 스펙트럼 또는 비행 시간 스펙트럼)으로부터 유래된 데이터는 분류 모델을 "검증하기 위해" 사용될 수 있다. "알려진 시료"는 미리 분류된 시료이다. 스펙트럼에서 유래되고 분류 모델을 형성하기위해서 사용되는 데이터는 "검증된 데이터 세트(training data set)"라고 한다. 일단 검증이 되면, 분류 모델은 알려져 있지 않은 시료를 사용하여 생성된 스펙트럼으로부터 유래된 데이터에서 패턴을 인식할 수 있다. 그후 분류 모델을 사용하여 알려져 있지 않은 시료를 부류(classes)로 분류할 수 있다. 상기는 예를 들면 특정 생물학적 시료가 특정 생물학적 상태(예를들면 질병이 있는 것과 질병을 가지고 있지 않은 것)와 관련이 있는지의 여부를 예측하는데 유용할 수 있다.

분류 모델을 형성하는데 사용되는 검증된 데이터는 원 데이터(raw data) 또는 전처리된 데이터(pre-processed data)를 포함할 수 있다. 몇가지 실시양태에서, 원 데이터는 비행 시간 스펙트럼 또는 질량 스펙트럼으로부터 직접 얻어진 후에, 선택적으로 적당한 방식으로 "전처리(preprocessed)"될 수 있다. 예를 들면, 선정된 신호-대-잡음 비율(signal-to-noise ratio) 이상의 신호는 스펙트럼에서 모든 피크를 선택하는 것보다는 스펙트럼에서 피크의 서브세트(subset)가 선택되도록 선택된다. 또다른 예에서, 공동 값(예를 들면 특정 비행시간값 또는 질량-대-전하 비율 값)에서 피크 "클러스터(clusters)"의 선정된 수는 피크들을 선택하기위해서 사용될 수 있다. 명백하게, 주어진 질량-대-전하 비율에서 피크가 질량 스펙트럼의 그룹에서 질량 스펙트럼의 50% 이내에 있다면, 상기 질량-대-전하 비율에서 피크는 검증된 데이터 세트로부터 생략될 수 있다. 상기와 같은 전처리 단계가 사용되어 분류 모델을 검증하기위해서 사용된 데이터의 양을 감소시킨다.

분류 모델은 데이터에 존재하는 객관적 파라미터에 기초하여 데이터 그룹을 부류로 분리하기위해 적당한 통계학적 분류[또는 "학습(learning)"] 방법을 사용하여 형성될 수 있다. 분류 방법은 감독되거나 또는 감독되지 않을 수 있다. 감독 분류기법 및 비감독 분류기법의 예가 Jain, "Statistical Pattern Recognition: A Review", IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, Vol. 22, No. 1, January 2000에 기술되어 있으며, 본원에 상기의 전문이 참고로 통합된다.

감독 분류에서, 공지된 카테고리의 예를 포함하는 검증 데이터가 학습 기작(learning mechanism)으로 제시되며, 각 공지된 부류를 한정하는 1 이상의 관련 세트들을 학습한다. 그후 새로운 데이터를 학습 기작으로 적용될 수 있으며, 그후 학습된 연관성을 사용하여 새로운 데이터를 분류된다. 감독 분류 과정의 예로는 선형회귀과정[예를 들면 다중선형회귀(MLR), 부분최소제곱(PLS) 회귀 및 주성분 회 귀(PCR)), 이진 결정 트리(binary decision trees) [예를 들면, 반복 분할 과정(recursive partitioning processes), 가령 CART-분류 및 회귀 트리), 인공신경망(artificial neural networks) 가령 역전파망(back propagation networks), 판별 분석(discriminant analyses) [예를들면, 베이지안 분류자(Bayesian classifier) 또는 피셔 분석(Fischer analysis)], 로지스틱 분류자(logistic classifiers), 및 서포트 벡터 분류자[support vector classifiers (서포트 벡터 기기)]를 포함한다.

일단 기질, 예를들면 바이오칩 또는 항체상에 캡쳐되면, 적당한 방법을 사용하여 시료에서 바이오마커 또는 바이오마커들을 측정한다. 예를 들면, 바이오마커는 예를들면 기체상 이온 분광분석 방법, 광학 방법, 전기화학 방법, 원자력간 현미경 및 무선 주파수 방법을 포함하는 다양한 검출 방법으로 검출 및/또는 측정될 수 있다. 상기 방법을 사용하여, 1이상의 바이오마커는 시료에서 검출될 수 있다.

본 발명의 바람직한 방법에서, 다수의 바이오마커가 측정된다. 다수의 바이오마커의 사용으로 시험의 예측 값이 증가되어 진단, 독물, 환자 층화(patient stratification) 및 환자 모니터(patient monitoring)에서 더 큰 유용성을 제공한다. "패턴 인식(pattern recognition)"이라 불리는 과정은 다수의 바이오마커에 의해 형성된 패턴은 예측 의약에 대한 임상적 단백질 연구(clinical proteomics)의 민감성 및 특이성을 크게 향상되는 것이 검출되었다. 예를들면 SELDI를 사용하여 수득된 임상적 시료로부터의 데이터에서 잠재성 변형(subtle variations)은 특정 패턴의 단백질 발현이 특정 질병의 존재 또는 부재, 질병 진행의 특정 단계, 또는 약물 처리에 대한 양성 또는 반대 반응과 같은 표현형을 예측할 수 있다는 것을 나 타낸다.

질량 분광분석에서 데이터 생성은 상기에 기술된 바와 같이 이온 검출기에 의해서 이온의 검출을 시작한다. 검출기를 통과하는 이온은 아날로그 신호를 디지털 캡쳐하는 고속 시간-어레이 기록 장치(high speed time-array recording device)에 의해서 디지털화되는 전위(electric potential)를 발생한다. CIPHERGEN PROTEINCHIP® 어레이 시스템은 상기를 달성하기위해서 아날로그 대 디지털 변환기(analog-to-digital converter, ADC)를 사용한다. 상기 ADC는 규칙적인 시공간 간격(regularly spaced time intervals)에서 검출기 출력을 시간-의존성 저장소에 통합시킨다. 상기 시간간격은 전형적으로 1-4 나노초 길이이다. 또한, 최종적으로 분석된 비행시간 스펙트럼은 시료에 대해 이온화 에너지의 단일 펄스로부터의 신호를 나타내는 것이 아니라, 다수의 펄스들로부터의 신호들의 합을 나타낸다. 상기는 잡음을 감소시키고 동적 범위를 증가시킨다. 그후 비행시간 데이터는 데이터 프로세싱 처리된다. CIPHERGEN PROTEINCHIPO 어레이 소프트웨어에서, 데이터 프로세싱은 전형적으로 TOF-to-M/Z 변환, 기준선 감가(baseline subtraction) 및 고주파 잡음 여과(high frequency noise filtering)를 포함한다. 상기 단계에서, 상기 신호는 시간 영역에서 질량 영역으로 전환된다.

기준선 감가는 스펙트럼을 혼란시키는 인공적이고 재현가능한 기기 오프셋을 제거함으로서 데이터 정량화를 향상시킨다. 상기는 피크 너비와 같은 파라미터를 포함하는 알고리즘을 사용하여 스펙트럼 기준선을 계산하는 단계 및 이후에 질량 스펙트럼으로부터 기준선을 감가하는 단계를 포함한다. 1 이상의 스펙트럼으로부 터의 피크 데이터는 추가의 분석, 예를들면 각 원 데이터가 특정 질량 스펙트럼을 나타내는 스프레드시트를 형성함으로써 추가로 분석되며, 각 컬럼은 질량에 의해서 정의된 스펙트럼에서 피크를 나타내며, 각 셀(cell)은 특정 스펙트럼에서 피크의 강도를 포함한다. 다양한 통계적 또는 패턴 인식 접근법을 데이터에 적용할 수 있다. 상기에서 기술된 바와 같이, CIPHERGEN BIOMARKER PATTERNSTM 소프트웨어가 사용되어 생성된 스펙트럼에서 패턴을 검출한다. 상기 데이터는 분류 모델을 사용하는 패턴 인식 과정을 사용하여 분류된다. 통상, 스펙트럼은 분류 알고리즘이 얻어지는 2개 이상의 상이한 그룹으로부터 시료를 나타낼 것이다.

시료는 다양한 질병 상태를 규정하기를 원하는 환자 또는 다른 피험체로부터 수집될 수 있다. 상기 피험체는 예를들면 이들의 의학적 병력으로부터 특정 질병의 형태이거나 또는 더 높은 위험을 가질 것으로 사료되는 특정 사람일 수 있다. 다른 피험체는 특정 질병을 가지고 있는 사람일 수 있으며 이들 치료의 효율성을 모니터한다. 또한, 정해진 조사의 일부로서 피험체로부터 시료를 수득할 수 있다.

개별적으로 바이오마커는 질병 상태의 측정에 도움을 주는데 유용하다. 먼저, 선택된 바이오마커는 본원에 기술된 방법을 사용하여 피험체의 시료에서 측정되며, 예를 들면 SELDI 바이오칩에서 캡쳐된 후에 질량 분광광도계에 의해 검출된다. 그후, 측정은 비(非)질병 상태로부터 상기 질병 상태를 구별하는 진단 양(diagnostic amount) 또는 대조군과 비교한다. 상기 진단 양은 특정 바이오마커는 비(非)질병 상태와 비교하여 질병 상태에서 상향조절되거나 또는 하향조절되는 것을 반영할 것이다. 당분야에서 이해되는 바와 같이, 사용된 특정 진단 양이 조 절되어 진단자의 선호에 따라 진단 분석의 민감성 또는 특이성을 증가시킨다. 그러므로 진단 양과 비교하는 시험 양은 질병 상태를 나타낸다.

하기에 기술된 실시예 방법은 본 발명의 바람직한 실시양태를 사용하는 대표적인 방법이다. 상기 방법에서, 혈청 시료는 환자로부터 수집된 후, 음이온 교환 수지를 사용하여 분류 증류된다. 상기 시료에서 바이오마커는 IMAC copper PROTEINCHIP® 어레이를 사용하여 캡쳐된다. 그후 바이오마커는 SELDI를 사용하여 검출된다. 그후 상기 결과를 컴퓨터 시스템으로 도입되고, 상기 바이오마커를 결정하기 위해 학습 알고리즘 및 분류 알고리즘에서 사용되는 동일한 파라미터를 사용하여 디자인된 알고리즘을 포함한다. 상기 알고리즘은 각 바이오마커와 관련하여 수신된 데이터에 기초한 진단을 생성한다. CIII 이소형 및 심혈관 질병 사이의 상관관계와 관련하여 실험 데이터에 대해 도 1 내지 도 9를 참조한다. 이전에 기술된 바와 같이 다양한 아포지단백질 및 질병 사이의 예시적 상관관계는 문헌에서 확인된다.

진단은 바이오마커를 사용하여 발전된 분류 알고리즘으로 SELDI 시험으로부터 생성된 데이터를 조사함으로써 결정된다. 분류 알고리즘은 바이오마커를 검출하기위해서 사용된 시험 프로토콜의 특징에 좌우된다. 상기 특징은 예를들면 시료 준비, 칩 타입 및 질량 분광광도계 파라미터를 포함한다. 시험 파라미터가 변경된다면, 알고리즘은 변경되어야 한다. 유사하게, 알고리즘이 변경된다면, 시험 프로토콜이 변경될 수 있다.

본 발명에 있어서, 정제된 아포지단백질, 정상 피험체로부터의 플라즈마 시료 및 당뇨병 피험체로부터의 플라즈마 시료가 PG-20 단백질 칩 표면을 사용하여 분석된다. 본 발명의 방법에 따라 분석된 특이적 아포지단백질은 다양한 수준으로 플라즈마, 혈청 및 지단백질 분획물에 존재한다. 각 아포지단백질의 존재는 각 아포지단백질에 대해 특이적인 항체를 사용하여 결정된다. 하기에 기술된 프로토콜은 전류 MS 기술(current MS technology)에 의해서 분석될 수 있는 분자량 범위로 제한된다. 초기에, B1OO (500 kD) 및 B48 (대략 250 kD)은 항체-표면에 결합함으로써 분리되고, 이형된 후 MS 분석 이전에 화학적 또는 효소적으로 절편화되거나 또는 하기 프로토콜을 사용하여 PG20에 결합되면서 직접 분해된다.

1. 시료 준비

SELDI-TOF-MS 절차 이전에, 플라즈마 시료가 완충액 5로 희석되고, 항체는 하기와 같이 PROTEINCHIP®에 결합된다:

플라즈마 시료의 준비:

(1) U9 완충액(9M 요소, 50 mM HEPES, 0.5% CHAPS, pH 7) 준비하는 단계; 및

(2) 플라즈마 시료를 U9 완충액으로 희석하고(1:2), 30분동안 차갑게 회전시키는 단계.

PROTEINCHIP® 어레이에 항체의 결합

(1) 항체를 0.2 mg/ml로 희석하고 어레이상의 스팟에 2 μl를 첨가하는 단계;

(2) 항습 챔버로 어레이를 전달하고, 실온에서 1시간동안 배양하는 단계;

(3) 스팟 표면을 터칭하지 않고 항체를 흡인하는 단계;

(4) 10분동안 15 mL 원심관내 칩을 8 mL의 세척 완충액으로 세척하는 단계;

(5) 비우고 5분동안 8 mL의 포스페이트-완충 식염수로 세척하는 단계; 및

(6) 칩의 표면으로부터 과량의 PBS를 닦아내는 단계.

2. SELDI-TOF-MS 절차

(1) 각 스팟에 2 μl의 플라즈마 시료를 첨가하는 단계;

(2) 항습 챔버에 어레이를 전달하고, 실온에서 1시간동안 배양하는 단계;

(3) 10분동안 15 mL 원심관내 칩을 8 mL의 세척 완충액으로 세척하는 단계;

(4) 비우고, 5분동안 8 mL의 포스페이트-완충 식염수로 세척하는 단계, 및 반복하는 단계;

(5) 비우고, 1분동안 8 mL의 1 mM HEPES로 세척하는 단계, 및 반복하는 단계;

(6) 튜브로부터 칩을 제거하고, 액체를 제거하고, 10분동안 공기중에서 건조하는 단계;

(7) 100 μl의 99.8% 아세토니트릴 및 1OOμl의 1.0% 트리플루오로아세트산을 시나핀산 분말 1 바이알(10 mg)로 첨가하고 5분 동안 상기 분말을 용해되도록 회전함으로써 EAM 용액을 준비하는 단계; 및

(8) 5 μl의 EAM 용액을 각 스팟에 첨가하고, 5분동안 공기중에서 건조하고, 반복하고, 10분동안 공기중에서 건조하는 단계.

상기 절차는 시료 및 시약의 다량 및 자동 첨가하는 바이오프로세서로 사용 하기위해서 변형될 수 있다. 양성 및 음성 대조군은 실험에서 통상 포함된다. TNF-항체 및 항원은 상기 목적을 위해 키트에 포함된다.

3. 핑거프린트(fingerprints)의 생성

플라즈마 시료에 대한 아포지단백질 핑거프린트를 생성하는 절차 및 정제된 아포지단백질이 하기에 기술되었다:

(1) PROTEINCHIP® 어레이 판독기 및 소프트웨어(Ciphergen Biosystems, Inc.)가 사용되어 프로파일을 생성한다.

(2) 스팟 프로토콜(spot protocols)이 생성되고 사용되어 칩을 제조한다.

(3) 데이터 수집 파라미터는 각 항원에 대해서 조절되고, 분자량에 기초한다. Ciphergen Biosystems, Inc.에 의해서 공급되는 PROTEINCHIP® 어레이 항체 캡쳐 키트(array Antibody Capture Kit)에 지시 사항이 포함된다.

(4) 상기 데이터가 분석되고, 아포지단백질은 예를들면 고유 데이터와 자체를 비교하고, 예를들면 대조군 피험체와 같은 정상과 비본질적인 데이터를 비교함으로써 생성된다.

선택적으로, 본 발명은 항체를 비드에 결합하고 비드상에 아포지단백질을 캡쳐하고, 상기 비드로부터 정제된 단백질을 용출한 후, 매트릭스 지원 레이저 탈착 이온화(matrix assisted laser desorptionronization, MALDI) 및 전기분무 방법(electrospray methods)을 포함하는 질량 분광분석에 의해서 검출함으로써 실시될 수 있다. 항체를 비드에 결합시키는 방법은 당분야에 공지된 방법이며, 상기 방법은 본 발명에서 적당하다. MALDI는 레이저-기본 소프트 이온화 방법이며, 상 기에서 시료는 다량의 비휘발성 및 열적으로 불안정한 화합물, 가령 단백질, 올리고뉴클레오티드, 합성 폴리머 및 거대 무기 화합물로부터 완전한 기체상 이온의 제조를 용이하게 하는 화학적 매트릭스내에 포함된다. 상기 매트릭스는 본 기술에서 레이저 광 에너지를 흡수하고, 작은 부분의 표적 기질을 증발시킴으로써 중요한 역할을 한다.

바람직한 실시양태의 상세한 설명 및 첨부된 도면은 본 발명을 설명하기위해 제시되었으며, 본 발명의 정신 및 범위를 제한하는 것으로 이해되지 않는다. 상기 실시양태는 본 발명의 원리 및 이의 실용성을 최상으로 설명하기위해서 선택되고 기술되었다. 당분야의 통상의 지식을 가진 사람은 많은 변형이 본 발명의 범위 및 정신으로부터 벗어나지 않고 본 명세서에 기술된 본 발명에 의해서 만들어질 수 있다는 것을 알 것이다.

Claims (18)

1. 생물학적 시료에서 1개 이상의 선택된 아포지단백질 바이오마커의 프로파일을 수득하는 방법으로서,

   하기 단계 a), b), c) 및 d)를 포함하며, 1개 이상의 질환을 진단할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법:

   a) 시료의 준비 단계;

   b) 표면에 상기 시료를 도포하고, 결합하지 않은 시료 성분을 제거하여, 1개 이상의 선택된 아포지단백질 바이오마커를 측정하는 단계;

   c) 분광법에 의해 시료를 분석하는 단계; 및

   d) 분석법을 사용하여 프로파일을 만드는 단계.
2. 제 1 항에 있어서,

   1개 이상의 선택된 아포지단백질 바이오마커는 Apo CI, Apo CII, Apo CIII, Apo CIV, Apo AI, Apo AII, Apo AIV, Apo AV, Apo B48, Apo B100, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, Apo H, Apo J, Apo L, Apo M, 이들의 이소형 및 이들의 결합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서,

   표면-강화되고 항체 캡쳐 단백질이 코팅된 항체-결합 표면에 시료가 도포되고 결합되며, 결합하지 않은 시료 성분들은 씻어 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2 항에 있어서,

   1개 이상의 선택된 아포지단백질 바이오마커는 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분광법(laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry) 또는 다른 적당한 질량 분광 방법에 의해서 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서,

   시료는 인간 플라즈마, 혈청 및 인간 지단백질 분획물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서,

   1개 이상의 질환은 당뇨병, 발작, 스트레스, 알쯔하이머, 심혈관 질환, 지질 장애, 대사 증후군, 비만 및 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 생물학적 시료에서 특이적 아포지단백질의 농도 및 변형을 측정하는 방법으로서,

   상기 시료는 환자로부터 수득하며, 상기 시료는 플라즈마, 혈청 및 지단백질 분획물을 포함하고, 상기 방법은 하기 단계 a), b), c) 및 d)를 포함하며,

   당뇨병, 발작, 스트레스, 알쯔하이머, 심혈관 질환, 지질 장애, 대사 증후군, 비만 및 동맥경화증을 검출하기 위한 진단 방법으로 사용하기 위해서 아포지단백질의 이소형의 농도를 평가하는 것을 특징으로 하는 방법:

   a) 시료에 일정한 부피의 내부 표준형을 첨가하는 단계;

   b) 표면-강화되고 단백질 G-코팅된 항체-결합 칩에 시료를 도포하고, 결합하지 않은 시료 성분들을 제거하는 단계;

   c) 질량 분광법에 의해 시료를 분석하는 단계; 및

   d) 내부 표준형의 값을 사용하여 아포지단백질의 농도를 측정하는 단계.
8. 제 7 항에 있어서,

   특이적 아포지단백질은 특이적 항체에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서,

   특이적 항체를 항체 캡쳐 단백질이 코팅된 표면 상에 고정시키는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서,

    항체 캡쳐 단백질이 코팅된 표면에 시료를 도포하여 결합시키고, 결합하지 않은 시료 성분은 씻어 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 9 항에 있어서,

    아포지단백질은 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분광법 또는 다른 적당한 질량 분광 방법에 의해서 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 9 항에 있어서,

    아포지단백질은 Apo CI, Apo CII, Apo CIII, Apo CIV, Apo AI, Apo AII, Apo AIV, Apo AV, Apo B48, Apo B100, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, Apo H, Apo J, Apo L 및 Apo M으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 특이적 항체는 Apo CI, Apo CII, Apo CIII, Apo CIV, Apo AI, Apo CII, Apo AIV, Apo AV, Apo B48, Apo B100, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, Apo H, Apo J, Apo L 및 Apo M으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서,

    시료는 인간 플라즈마, 혈청 및 인간 지단백질 분획물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 7 항에 있어서,

    시료 중의 특이적 아포지단백질에 있어서의 농도 값은, 선택된 정제 단백질을 변형시키고 높은 해상도의 질량 분광법을 사용하여 참조 값을 설정하여 개발된 내부 표준형을 기초로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 7 항에 있어서,

    변형은 글리케이션, 시알산화(sialylation), 단편화(fragmentation) 및 아미노산 용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 약물 유전학 분야에서의 반응, 위험 인자, 질환 상태 및 약물 치료를 평가하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 피험체에서 취한 생물학적 시료에서 1개 이상의 선택된 아포지단백질 바이오마커의 프로파일을 수득하는 방법으로서,

    하기 단계 a), b), c) 및 d)를 포함하며, 1개 이상의 선택된 아포지단백질 바이오마커는 Apo CI, Apo CII, Apo CIII, Apo CIV, Apo AI, Apo AII, Apo AIV, Apo AV, Apo B48, Apo B100, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, Apo H, Apo J, Apo L, Apo M, 이들의 이소형 및 이들의 결합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:

    a) 피험체로부터 생물학적 시료를 준비하는 단계;

    b) 1개 이상의 아포지단백질 바이오마커를 특이적으로 캡쳐하는 캡쳐 시약의 표면에 생물학적 시료를 도포하여, 1개 이상의 아포지단백질 바이오마커가 캡쳐 시약에 결합하도록 하고, 결합하지 않은 시료 성분들은 제거하는 단계;

    c) 레이저 탈착/이온화 질량 분광법에 의해 캡쳐된 1개 이상의 아포지단백질을 분석하는 단계; 및

    d) 분석법을 사용하여 프로파일을 준비하는 단계.
18. 제 17 항에 있어서,

    a) 프로파일을 사용하여 피험체에서 질환을 진단하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

Images