MX2008012135A - Tecnica de identificacion genetica de apolipoproteina. - Google Patents

Abstract

Se describe un método para determinar la concentración y modificaciones de apolipoproteínas en muestras biológicas que incluyen plasma, suero y fracciones de lipoproteína, al obtener una muestra de un paciente, añadir un volumen específico de un estándar interno a la muestra, aplicar la muestra a un chip unido a anticuerpo recubierto con proteína G y mejorado en superficie y retirar componentes de muestra no unidos, analizar la muestra mediante espectrometría de masas, determinar la concentración de la apolipoproteína usando valores de estándares internos y evaluar la concentración de la apolipoproteína, sus isoformas, sustituciones y modificaciones de aminoácidos para usarse como una herramienta para el diagnóstico de diabetes, apoplejía, estrés, enfermedad de Alzheimer y enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, trastornos de lípidos, síndrome metabólico, obesidad, aterosclerosis, etcétera).

Description

TECNICA DE IDENTIFICACION GENETICA DE APOLIPOPROTEINA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al campo de composiciones, análisis y cuantificación de apolipoproteinas en muestras biológicas y clínicas. Más detallemente , ' esta invención se refiere a métodos, técnicas y protocolos para la identifición genética, perfilado, determinación y/o cuantificación de apolipoproteinas presentes en muestras de plasma humanó, suero y fracciones de lipoproteína .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las apolipoproteinas, los componentes proteicos de las lipoproteínas , son capaces de solubilizar lipidos hidrofóbicos y facilitar la dirección y transporte de células. Estos componentes, sintetizados en el hígado e intestino, son esenciales para mantener la integridad de partículas de lipoproteína, sirviendo como cofactores para enzimas que actúan en lipoproteínas, y facilitando interacciones mediadas por receptor que eliminan lipidos de la circulación. Existen varios grupos de apolipoproteinas: A (Apo A), B (Apo B) , C (Apo C) y E (Apo E) . Cada uno de los tres grupos A, B y C consiste en dos o más proteínas distintas. Estas son Apo AI, Apo AII, Apo AIV y AV para Apo A; Apo B100 y Apo B48 para Apo B y Apo CI, Apo "di, Apo CIII y Apo CIV para REF. : 196876 Apo C. Apo CI, CIII, CIV y Apo E consisten cada una en dos o más isoformas. Las apolipoproteinas tienen varios papeles en enfermedad y en salud. La apolipoproteina CIII es una proteina de 79 aminoácidos que existe en humanos como tres isoformas difiriendo en la glicosilación en Treonina 74. La isoforma CIII-0 es el producto final de reacciones de enzima sialidasa, tiene una ausencia de residuos de ácido siálico, galactosa y galactosa amina, y equivale a 14% de las isoformas totales. Las isoformas CIII-0 son inhibidores de la unión de lipoproteinas de muy baja densidad (VLDL) al receptor estimulado por lipólisis, la cual es una ruta importante de depuración de lipoproteinas de triglicéridos altas en plasma. La isoforma CIII-0 tiene la actividad más baja a VLDL. La isoforma CIII-1 tiene 1 mol de siálico y equivale a 51% de las isoformas totales. La isoforma CIII-2 es la forma inicial de CIII sintetizada y secretada en el hígado, tiene 2 moles de ácido siálico y equivale a 35% de isoformas totales. La isoforma CIII-2 tiene una afinidad más alta para VLDL y es un inhibidor más deficiente de la unión de VLDL al receptor estimulado por lipólisis. Los métodos actuales para identificar y cuantificar isoformas CIII incluyen el aislamiento de fracciones de lipoproteína de plasma, deslipidación de esta fracción y purificación de la CIII de la fracción hidrosoluble de apolipoproteínas . Las diferentes isoformas purificadas pueden ser detectadas mediante electroforesis con gel de enfoque isoeléctrico, espectrometría de masas y espectroscopia de fluorescencia y absorbancia. Un par de desventajas de los métodos actuales son que son tediosos en aislamiento de CIII de plasma, teniendo sólo una recuperación de proteínas de 60-80%, y que los métodos actuales para diagnóstico clínico para CIII en plasma, tales como ELISA y ensayos inmunoturbidimétricos, sólo pueden detectar CIII total. Las isoformas CIII son clínicamente significativas por varias razones. Los niveles de las isoformas cambian con el nivel de control de glucosa en pacientes diabéticos. Por ejemplo, alta HbAlC se correlaciona directamente con altos niveles de CIII-0. Sujetos hipertrigliceridémicos tienen una proporción incrementada de CIII así como la isoforma CIII-2 en VLDL. Los niveles de CIII-2 se incrementan en mujeres sujetas a varias restricciones calóricas a pesar de niveles CIII totales normales. La variación en CIII-2 se correlaciona positivamente con cambios en triglicéridos VLDL mientras que la variación de CIII-1 se correlaciona inversamente. Con las limitaciones de las técnicas existentes en la cuantificación y detección precisas de las isoformas CIII, su papel en varios procesos metabólicos de gran importancia para entender el metabolismo de lípidos aún está sujeto a controversia. La literatura o técnica anterior reportan varias caracterizaciones y correlaciones entre varias apolipoproteinas y enfermedades. Por ejemplo, Apo D es un transportador multifuncional de varios ligandos y se sabe que se acumula en un sitio especifico para regenerar nervios periféricos en enfermedad de Alzheimer. Además, Apo J hasta donde se ha supuestamente implicado en varios procesos fisiológicos, tales como maduración de espermas, transportación de lipidos, inhibición de complemento, remodelación de tejido, reciclaje de membrana, interacción de célula a célula y célula-substrato, estabilización de proteínas estresadas en un estado competente de doblez y promoción o inhibición de apoptosis. Asimismo, se sabe que Apo H se une estrechamente a superficies negativamente cargadas e inhibe la activación de la vía intrínseca de coagulación de la sangre y la actividad protrombinasa de plaquetas activadas al cubrir las superficies cargadas negativamente necesarias para ambas actividades. Apo F se asocia con LDL e inhibe la actividad de la proteína de transferencia de éster colesterólico (CETP) , y parece ser un importante regulador del transporte de colesterol. Apo F se asocia en un menor grado con VLDL, Apo AI y Apo AII. Se propuso que Apo estaba implicado en el transporte de lipidos. Apo CIV es una apolipoproteína con un tamaño de 14.5 kD en el mismo locus que CI y CII y parece que no se reporta ninguna función en la literatura.

Además, con base en correlaciones epidemiológicas entre enfermedad cardiovascular y niveles de colesterol, los médicos por mucho tiempo han medido y estandarizado la medición de niveles de colesterol para evaluar riesgos de enfermedad cardiaca. Partículas de lipoproteína (LDL y HDL) y el colesterol asociado con ellas también han sido útiles en la -evaluación de riesgos cardiovasculares. Muchos estudios de investigación se han conducido para relacionar los efectos de salud con los tamaños y densidades de partículas de lipoproteínas , pero las conclusiones de estos estudios aún no han sido consistentes. Durante los últimos años ha habido evidencia considerable de que los niveles de apolipoproteínas están asociados con una variedad de condiciones, y recientemente el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre (NHLBI, por sus siglas en inglés), en una reciente junta con los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades, recomendaron que las mediciones de apolipoproteína B fueran incluidas para su estandarización en un futuro cercano. Las apolipoproteínas han estado asociadas con enfermedad cardiovascular, diabetes, apoplejía, obesidad, enfermedad de Alzheimer, VIH y otras enfermedades. Dado el papel primario de las apolipoproteínas en el transporte y metabolismo de lípidos, estas asociaciones no son sorprendentes. La dificultad de purificar, detectar y cuantificar apolipoproteínas no ha hecho fácil llevar a cabo investigaciones entre los niveles de estos compuestos y efectos en la salud. Usando metodología de la técnica anterior, la cuantificación y medición de apolipoproteínas actualmente requiere la etapa de separación de partículas de lipoproteína mediante ultracentrifugación analítica o secuencial, cromatografía en columna, electroforesis o precipitación. Estas técnicas actualmente son demasiado costosas y consumidoras de tiempo para uso clínico de rutina. Otra técnica útil es la cromatografía de líquidos de alto rendimiento, la cual es más rápida pero mucho más compleja y costosa. Otras técnicas usadas para la medición del contenido de Apo A y B incluyen inmunoensayo enzimático (ELISA) , radioinmunoensayo, inmunoensayo de fluorescencia, inmunodifusión radial, nefelometría, tubidimetría y electroinmunoensayo . Recientemente, la espectrometría de masas por ionización de desorción láser incrementada en superficie (SELDI o SELDITOF- S , con TOF significando tiempo de vuelo y MS significando espectrometría de masas) ha ofrecido algunas nuevas opciones para medir apolipoproteínas en plasma, suero y fracciones de lipoproteína. En consecuencia, siempre existe la necesidad de ensayos precisos, rápidos y reproducibles para la separación, identificación y cuantificación de apolipoproteínas. Existe la necesidad de técnicas mejoradas para el establecimiento de huellas genéticas, perfilado, determinación y/o cuantificación de apolipoproteinas presentes en muestras de plasma humano, suero y fracciones de lipoproteinas . Es a estas necesidades entre otras a las que está dirigida la presente invención.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Brevemente, la técnica de esta invención combina técnicas inmunológicas con desorción láser incrementada en superficie/ionización, SELDI, para detectar y medir varias apolipoproteinas directamente en plasma o suero no fraccionado, o en fracciones de lipoproteina . Para la cuantificación de los estándares internos, detección y medición de proteínas conocidas muy similares en propiedades de unión a anticuerpos a las proteínas de interés, pero con una masa molecular visiblemente diferente, serían requeridas. La masa del polipéptido desconocido determinada por espectrometría de masas se compararía con la masa de un polipéptido de referencia de identidad y concentración conocida . Los perfiles de plasma o suero total requieren de una elaborada formación de grupos y técnicas de reconocimiento de patrones para detectar diferencias en muestras de individuos normales y saludables. El uso de anticuerpos específicos en tecnología SELDI lleva a un método de análisis mucho más simple. Otra característica simplificadora de la tecnología SELDI es la cromatografía de retenido. Las proteínas de interés se retienen al unir las proteínas a una superficie específica mientras otros analitos son eliminados. La absorción y desorción pueden modificarse por ajustes en pH, concentración de sal o solventes orgánicos. Acido sinapínico u otra matriz adecuada se mezcla en una solución recién preparada con ácido tetrafluoroacético y se aplica al llamado chip, y, después del secado, las moléculas de analito incrustadas en la matriz son desorbidas por un láser, ionizadas de la fase sólida y aceleradas como iones moleculares intactos. Una modalidad de la técnica preferida de la presente invención usa anticuerpos específicos unidos a chips mejorados en superficie mediante proteína G para absorber selectivamente a polipoproteínas directamente de muestras de plasma. La proteína G une la porción fe de los anticuerpos, incrementando así la unión de los anticuerpos a antígenos de interés específicos en muestras biológicas. La superficie de los chips mejorados en superficie conserva las apolipoproteínas específicas mientras que otros componentes de muestra son eliminados. La matriz de solución EAM facilita la ionización por desorción láser de las apolipoproteínas. Las apolipoproteínas ionizadas alcanzan el detector en tiempos ligeramente diferentes con base en sus tiempos de vuelo, diferencias de tiempo que pueden ser convertidas en masas.

Las intensidades de los picos están relacionadas con la cantidad de cada proteina. Las composiciones, niveles e isoformas de apolipoproteinas en plasma y en fracciones de lipoproteina son determinantes de varios trastornos o condiciones relacionadas con enfermedad cardiovascular y otros trastornos crónicos tales como apoplejía, síndrome metabólico, diabetes, enfermedad de Alzheimer, VIH y pacientes de VIH bajo inhibidores de proteasa (hipertrigliceridémicos ) , y varios tipos de lipoproteinemia . Así, los trastornos potenciales que pueden beneficiarse de un ensayo de diagnóstico clínico para isoformas CIII, tales como la presente invención, incluyen aquellos mencionados arriba. Los estudios técnicos usando fármacos reductores de lípidos se beneficiarían de las técnicas de huella dactilar de apolipoproteinas de la presente invención, y las técnicas de la presente invención harían posible observar los niveles y distribución de apolipoproteinas y sus isoformas en plasma y en diferentes fracciones de lipoproteina para mostrar cómo estos parámetros cambian con diferentes trastornos y tratamientos. Las técnicas de la presente invención también son ideales para evaluar el estado de apolipoproteinas en recién nacidos y para evaluar las modificaciones de apolipoproteinas que ocurren con envejecimiento, nutrición, exposiciones ambientales y cambios en estilo de vida.

Las características ilustrativas de esta invención incluyen definir biomarcadores o perfiles de apolipoproteína específicos de enfermedad y desarrollar ensayos cuantitativos que sean rápidos y útiles para el diagnóstico o categorización de una o más enfermedades o condiciones. Estas características, y otras características y ventajas de la presente invención, se harán más aparentes para aquellos expertos en la técnica relevante cuando la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas se lea en conjunto con las figuras anexas.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La presente invención se entenderá mejor al leer la descripción detallada de las modalidades preferidas y alternas con referencia a las figuras acompañantes, las cuales se ilustran en estándares de isoforma representativos y reproducibilidad de perfiles para la invención, en los cuales los números de referencia iguales indican estructuras similares y se refieren a elementos iguales a lo largo, y en los cuales: La figura 1 es una representación de Espectros de Masas y Pesos Moleculares Reportados de los Diferentes Parámetros de Isoforma CIII. La figura 2 es una representación de un chip CIPHERGEN Q10 para Perfil de Apolipoproteína CIII Agrupada (Isoformas CIII-0, CIII-1 y CIII-2) . La figura 3 es una representación de un chip CIPHERGEN CM10 para Perfil de Apolipoproteina CIII Agrupada (Isoformas CIII-0,, CIII-1 y CIII-2). La figura 4 es una representación de un chip CHIPHERGEN Anti-CIII PS 20 para Reproducibilidad de Perfiles de Isoforma CIII. La figura 5 es una representación de un chip CHIPHERGEN Anti-CIII PS 20 para Reproducibilidad de Perfiles de Isoforma CIII. La figura 6 es una representación de Reproducibilidad de Perfiles de Isoforma CIII en Plasma. La figura 7 es una representación de Perfil de Isoforma CIII en Plasma a Diferentes Diluciones de Plasma. La figura 8 es una representación de Perfil de Isoforma CIII en Plasma a Diferentes Diluciones de Plasma y La figura 9 es una representación de Comparación de un chip CIPHERGEN Anti-CIII PS 20 de Perfil de Isoforma CIII de Sujetos Normales y Diabéticos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente Solicitud de Tratado de Cooperación en Materia de Patentes reclama prioridad del beneficio de la Solicitud de Patente de E.U.A. Provisional titulada "TECNICA DE IDENTIFICACION GENETICA DE APOLIPOPROTEINAS" presentada el 23 de Marzo de 2006, a nombre de los inventores Emelita De Guzman Breyer y Mary K. Robinson, que tiene el No. de Serie 60/743, 678. Esta invención proporciona métodos sensibles y rápidos que pueden ser útiles para tener acceso a enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, trastornos de lipidos, síndrome metabólico y aterosclerosis ), . enfermedad de Alzheimer, estrés, apoplejía, diabetes, que puede ser diagnosticada usando un perfil que comprende apolipoproteínas . El perfil se correlaciona con un estado de una enfermedad, y por lo tanto el estado de una enfermedad en un paciente puede determinarse sensiblemente y rápidamente usando esta invención. Así, una capacidad de esta invención es definir biomarcadores o perfiles de apolipoproteínas específicos de enfermedad y desarrollar ensayos cuantitativos que sean rápidos y útiles para diagnóstico o categorización de una o más enfermedades o condiciones . Más detallemente, en una modalidad ilustrativa, la presente invención proporciona un método para calificar estado de enfermedad en un sujeto, que comprende las etapas de: (1) medir al menos un biomarcador en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador se selecciona del grupo que consiste en Apo CI, Apo CII, Apo CIII, Apo CIV, Apo AI, Apo AII, Apo AIV, Apo AV, Apo B100, Apo B48, Apo E, Apo D, Apo H, Apo G, Apo F, Apo J, Apo L, Apo M, isoformas del mismo y combinaciones del mismo; (2) analizar o cuantificar o medir el por lo menos un biomarcador en la muestra 10 mediante espectrometría; (3) preparar un perfil del por lo menos un biomarcador usando el análisis, cuantificación o medición y (4) comparar el por lo menos un biomarcador con perfiles estándares que indiquen enfermedad, con lo cual la presencia o ausencia del al menos un biomarcador en la muestra indica enfermedad. En una modalidad ilustrativa relacionada la presente invención proporciona un método para cualificar estado de enfermedad en un sujeto que comprende las etapas de: (1) medir una pluralidad de biomarcadores en una muestra del sujeto, en donde 20 de los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en Apo CI, Apo CII, Apo CIII, Apo CIV, Apo AI, Apo AII, Apo AIV, Apo AV, Apo B100, Apo B48, Apo E, Apo D, Apo H, Apo G, Apo F, Apo J, Apo L, Apo M, isoformas de los mismos y combinaciones de los mismos; (2) analizar o cuantificar o medir los biomarcadores en la muestra por espectrometría; (3) preparar un perfil de los biomarcadores usando el análisis, cuantificación o medición y (4) comparar los biomarcadores con perfiles estándares que indiquen enfermedad, con lo cual la presencia o ausencia de los biomarcadores en la muestra indica una enfermedad o enfermedades . En otras modalidades ilustrativas, la etapa de medición comprende cuantificar la cantidad del por lo menos un biomarcador o biomarcadores en la muestra. En modalidades ilustrativas adicionales, la invención incluye la resolución del por lo menos un biomarcador o biomarcadores incluyendo el uso de espectrometría de masas SELDI. El perfilado de proteínas de alta emisión combinado con uso efectivo de herramientas de bioinformática proporciona un enfoque útil para tamizar para biomarcadores. El sistema usado en la presente invención utiliza de preferencia kit de laboratorio PROTEINCHIPO cromatográfico, en detalle, un aparato para tamizar muestras, detectar la presencia de analitos en muestras e identificar tipo de muestra, junto con medir patrones y kit para elaborar y tamizar disposiciones moleculares para ensayar muestras usando SELDI. Las proteínas unidas a las disposiciones se leen en un lector de disposición PROTEINCHIPO, el cual es un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo. Además, el método de esta invención saca ventajas de la capacidad del chipo para detectar proteínas modificadas (proteínas glucosiladas , etc.) y proteínas degradadas. Este método también puede sacar ventaja de la capacidad para detectar apolipoproteínas con modificaciones antes y/o después de traducción. Las formas modificadas después de la traducción incluyen variantes alélicas, variantes de empalme y formas de edición de ARN. Las formas modificadas después de la traducción incluyen formas que resultan de truncamiento, corte proteolitico (por ejemplo, fragmentos de, una proteina progenitora) , glicosilación, lapidación, cisteinilación, glutationilación, fosforilación, prenilación, acilación, acetilación, mutilación, sulfación, sulfonación, hidroxilación, miristoilación, farnesilación, oxidación y ubiquitinación . Las formas modificadas de cualquier biomarcador de esta invención también se pueden usar ellas mismas como biomarcadores . Como se puede ver, los perfiles pueden comprender las composiciones, niveles e isoformas de apolipoproteinas extraídas de plasma y en fracciones de lipoproteína , las cuales son determinantes de varias enfermedades, trastornos o condiciones. Según se usa en la presente, el término enfermedades incluye trastornos y condiciones y se usa específicamente en relación a enfermedad cardiovascular y otros trastornos crónicos tales como apoplejía, síndrome metabólico, diabetes, enfermedad de Alzheimer, VIH, y varios tipos de lipoproteinemia . Por ejemplo, estudios clínicos llevados a cabo en conjunto con las enfermedades y usando fármacos reductores de lípidos se beneficiarían de la técnica de identificación genética de apolipoproteinas de la presente invención. Para otro ejemplo, el uso de la técnica de identificación genética de la presente invención haría posible ver los niveles y distribución de apolipoproteínas y sus isoformas en plasma y en diferentes fracciones de lipoproteína para mostrar cómo estos parámetros cambian con diferentes enfermedades y sus tratamientos. Para otro ejemplo más, la técnica de la presente invención puede ser ideal para evaluar estado de apolipoproteínas en recién nacidos y para evaluar las modificaciones de apolipoproteínas que ocurren con envejecimiento, nutrición, exposiciones ambientales y cambios en estilo de vida. En otro ejemplo más, la presente invención proporciona kits para cualificar estado de enfermedad en los cuales los kits se pueden usar para medir los biomarcadores de la presente invención. Por ejemplo, los kits se pueden usar para medir cualquiera o más de los biomarcadores descritos en la presente, biomarcadores que son diferencialmente presentes en muestras de pacientes enfermos y sujetos normales. Para otro ejemplo, los kits también se pueden usar para monitorear la respuesta del paciente a un curso de tratamiento, haciendo posible al médico modificar el tratamiento con base en los resultados de la prueba. Para otro ejemplo más, los kits se pueden usar para identificar compuestos que modulen la expresión de uno o más de los biomarcadores en modelos de animal in vitro o in vivo para enfermedades.

Una modalidad de la técnica preferida de la presente invención usa anticuerpos específicos unidos a chips mejorados en superficie por medio de proteína G para absorber selectivamente a polipoproteínas directamente de muestras de plasma. La proteína G se une a la porción fe de los anticuerpos, incrementando de esta manera la unión de los anticuerpos a antígenos de interés específicos en muestras biológicas. La superficie de los chips mejorados en superficie conserva las apolipoproteínas específicas mientras que otros componentes de la muestra son eliminados. La matriz de solución EAM facilita la ionización por desorción láser de las apolipoproteínas. Las apolipoproteínas ionizadas alcanzan el detector en momentos ligeramente diferentes con base en sus tiempos de vuelo, diferencias de tiempo que pueden convertirse en masas. Las intensidades de los picos se relacionan con la cantidad de cada proteína. Según se usa en la presente, los términos anticuerpo y anticuerpos incluyen fragmentos de anticuerpos, inmunoglobulinas , aficuerpos, etc. Los métodos preferidos para medir los biomarcadores incluyen el uso de una disposición de biochips. Las disposiciones de biochipos útiles en la invención incluyen disposiciones de proteínas y ácidos nucleicos. Uno o más biomarcadores son capturados en la disposición de biochips y sujetos a ionización láser para detectar el peso molecular de los biomarcadores. El análisis de los biomarcadores es, por ejemplo, por el peso molecular de uno o más de los biomarcadores contra una intensidad umbral que se normaliza contra corriente iónica total. De preferencia, se usa transformación logarítmica para reducir las escalas de intensidad pico y limitar el número de biomarcadores detectados . En métodos preferidos de la presente invención, la etapa de preparar un perfil de biomarcadores y comparar los biomarcadores con un estado de enfermedad se lleva a cabo por un algoritmo de clasificación de software. De preferencia, se generan datos en muestras de sujeto inmovilizadas en una disposición de biochips al (1) someter la disposición de biochips a ionización láser y detectar la intensidad de una señal para relación masa/carga; (2) transformar los datos en forma legible por computadora y (3) ejecutar un algoritmo que clasifique los datos de acuerdo con parámetros de entrada de usuario para detectar . señales que representen biomarcadores que estén presentes en pacientes enfermos y que carezcan de controles de sujetos no enfermos. La etapa (1) usa de preferencia SELDI-TOF-MS, la cual generalmente hablando comprende (a) proporcionar una sonda adaptada para usarse con un espectrómetro de másas que comprende un adsorbente unido al mismo; (b) poner en contacto la muestra objetivo con el adsorbente; (c) resorber y ionizar el biomarcador y biomarcadores de la sonda y (d) detectar los biomarcadores ionizados con el espectrómetro de masas. En un ejemplo, software CIPHERGEN BIOMARKER PATTERNSTM, el cual es un paquete de software para clasificación supervisada de conjuntos de datos espectrales de masas SELDI derivados de los espectrómetros ,de masas y sintetizadores químicos de la plataforma de disposición CIPHERGEN PROTEINCHIP® usados para determinar la identificación y estructura de proteínas, se usa para detectar un patrón en los espectros que son generados. Los datos se clasifican usando un proceso de reconocimiento de patrones que usa un modelo de clasificación. En general, los espectros representarán muestras de al menos dos grupos diferentes para los cuales se busca un algoritmo de clasificación. Por ejemplo, los grupos pueden ser patológicos contra no patológicos (por ejemplo, cáncer contra no cáncer), de respuesta a fármaco contra no ¦ respuesta a fármaco, de respuesta tóxica contra no respuesta tóxica, progresor a estado de enfermedad contra no progresor a estado de enfermedad, o condición fenotípica presente contra condición fenotípica ausente. Los espectros que se generan en la etapa (1) de las modalidades de la invención pueden ser clasificados usando un proceso de reconocimiento de patrones que usa un modelo de clasificación. En algunas modalidades, datos derivados de los espectros (por ejemplo, espectros de masas o espectros de tiempo de vuelo) que se generan usando muestras tales como "muestras conocidas" pueden ser después usados para "entrenar" un modelo de clasificación. Una "muestra conocida" es una muestra que es preclasificada (por ejemplo, cáncer o no cáncer) . Datos derivados de los espectros "por ejemplo, espectros de masas o espectros de tiempos de vuelo" que se generan usando muestras tales como "muestras conocidas" pueden ser después usados para "entrenar" un modelo de clasificación. Una "muestra conocida" es una muestra que es preclasificada . Los datos que se derivan de los espectros y se usan para formar el modelo de clasificación ' pueden ser referidos como "conjunto de datos de entrenamiento". Una vez entrenado, el modelo de clasificación puede reconocer patrones en datos derivados de espectros generados usando muestras desconocidas. El modelo de clasificación puede ser después usado para clasificar las muestras desconocidas en clases. Esto puede ser útil, por ejemplo, para predecir si una muestra biológica detalle está o no asociada con cierta condición biológica (por ejemplo, enfermo contra no enfermo) . El conjunto de datos de entrenamiento que se usa para formar el modelo de clasificación puede comprender datos brutos o datos preprocesados . En algunas modalidades, datos brutos pueden obtenerse directamente de espectros de tiempo de vuelo o espectros de masas, y después pueden ser opcionalmente "preprocesados" en cualquier forma adecuada Por ejemplo, señales por arriba de una relación señal a ruido predeterminada pueden seleccionarse de tal manera que un subconjunto de picos en un espectro se seleccione, en lugar de seleccionar todos los picos en un espectro. En otro ejemplo, un número predeterminado de "racimos de pico" a un valor común (por ejemplo, un valor de tiempo de vuelo detalle o valor de relación masa a carga) se pueden usar para seleccionar picos. Ilustrativamente, si un pico en una cierta relación masa a carga está en menos de 50% de los espectros de masas en un grupo de espectros de masas, entonces el pico en esa relación masa a carga puede omitirse del conjunto de datos de entrenamiento. Etapas de pre-procesamiento tales como éstas pueden usarse para reducir la cantidad de datos que se usen para entrenar el modelo de clasificación. Los modelos de clasificación pueden formarse usando cualquier método de clasificación estadística (o "aprendizaje") adecuado que intente segregar cuerpos de datos en clases con base en parámetros objetivos presentes en los datos. Los métodos de clasificación pueden ser ya sea supervisados o no supervisados. Ejemplos de procesos de clasificación supervisados y no supervisados se describen en Jain, "Statistical Pattern Recognition: A Review", IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence , vol. 22, No. 1, enero de 2000, el cual se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad.

En clasificación supervisada, datos de entrenamiento que contienen ejemplos de categorías conocidas se presentan a un mecanismo de aprendizaje, el cual aprende uno o más conjuntos de relaciones que definen cada una de las clases conocidas. Datos nuevos pueden ser después aplicados al mecanismo de aprendizaje, el cual clasifica después los datos nuevos usando las relaciones aprendidas. Ejemplos de procesos de clasificación supervisados incluyen procesos de progresión lineal (por ejemplo, regresión ' lineal múltiple (MLR), regresión por últimos cuadrados parciales (PLS) y regresión de componentes principales (PCR)), árboles de decisión binarios (por ejemplo, procesos de división recursiva tales como árboles de clasificación y regresión CART) redes neurales artificiales tales como redes de retropropagación, análisis discriminatorios (por ejemplo, clasificador Bayesianó o análisis de Fischer) , clasificadores logísticos y clasificadores de vectores de soporte (máquinas de vectores de soporte) . Una vez capturado sobre un substrato, por ejemplo un biochip o anticuerpo, se puede usar cualquier método para medir un biomarcador o biomarcadores en una muestra. Por ejemplo, los biomarcadores pueden ser detectados y/o medidos mediante una variedad de métodos de detección incluyendo por ejemplo, métodos de espectrometría iónica en fase de gas, métodos ópticos, métodos electroquímicos, microscopía de fuerza atómica y métodos de radiofrecuencia. Usando estos métodos, uno o más biomarcadores pueden detectarse en la muestra. En métodos preferidos de la presente invención, se miden varios biomarcadores. El uso de varios biomarcadores incrementa el valor predictivo de la prueba y proporciona mayor utilidad en el diagnóstico, toxicologia, estratificación de pacientes y monitoreo de pacientes. El proceso llamado "reconocimiento de patrones" detecta los patrones formados por varios biomarcadores ampliamente mejora la sensibilidad y especificidad de proteómica clínica para medicina predictiva. Variaciones útiles en datos provenientes de muestras clínicas, por ejemplo obtenidos usando SELDI, indican que ciertos patrones de expresión de proteínas pueden predecir fenotipos tales como la presencia o ausencia de cierta enfermedad, una etapa detalle de progresión de la enfermedad o una respuesta positiva o adversa a tratamientos con fármacos. La generación de datos en espectrometría de masas empieza con .la detección de iones por un detector iónico como el descrito arriba. Los iones que chocan el detector generan un potencial eléctrico que es digitalizado por un dispositivo de grabación de disposición de tiempo de alta velocidad que captura digitalmente la señal análoga. El sistema de disposición CIPHERGEN PROTEINCHIP® emplea un convertidor análogo a digital (ADC) para lograr esto. El ADC integra salida de detector a intervalos de tiempo separados regularmente en cajones dependientes de tiempo. Los intervalos de tiempo típicamente tienen uno a cuatro nanosegundos de largo. Además, el espectro de tiempo de vuelo finalmente analizado típicamente no representa la señal de un solo pulso de energía ionizante contra una muestra, sino más bien la suma de señales de un número de pulsos. Esto reduce el ruido e incrementa la escala dinámica. Estos datos de tiempo de vuelo son después sujetos a procesamiento de datos. En el software de disposición CIPHERGEN PROTEINCHIPO, el procesamiento de datos típicamente incluye transformación TOF en M/Z, resta de líneas de base y filtración de ruido de alta frecuencia. En esta etapa, las señales se convierten del dominio de tiempo al dominio de masa. La resta de línea de base mejora la cuantificación de datos al eliminar desplazamientos artificiales y de instrumentos reproducibles que alteran el espectro. Incluye calcular una línea de base de espectro usando un algoritmo que incorpora parámetros tales como ancho de pico, y luego restar la línea de base del espectro de masa. Los datos pico de uno o más espectros pueden ser sujetos a análisis adicional al, por ejemplo, crear una hoja de cálculo en la cual cada hilera represente un espectro de masa detalle, cada columna represente un pico de los espectros definida por una masa y cada celda incluya la intensidad del pico en ese espectro detalle. Varios enfoques de reconocimiento estadístico o de patrones pueden aplicarse a los datos. Como se describió arriba, el software CIPHERGEN BIOMARKER PATTERNSTM se usa para detectar un patrón en los espectros que son generados. Los datos se clasifican usando un proceso de reconocimiento de patrones que usa un modelo de clasificación. En general, los espectros representarán muestras de al menos dos grupos diferentes para los cuales se busque un algoritmo de clasificación . Las muestras pueden ser tomadas de pacientes u otros sujetos que deseen establecer varios estados de enfermedad. Los sujetos pueden ser humanos detalles quienes crean que están o pueden estar en riesgo más alto de ciertos tipos de enfermedades, a partir de por ejemplo su historial médico. Otros sujetos pueden ser personas que hayan tenido ciertas enfermedades y deseen monitorear la efectividad de su tratamiento. Además, es posible obtener las muestras de sujetos como parte de exámenes de rutina. Cualquier biomarcador, individualmente, es útil para auxiliar en la determinación de estado de enfermedad. Primero, el biomarcador seleccionado se mide en una muestra del sujeto usando los métodos descritos en la presente, por ejemplo captura en un biochip SELDI seguida por detección por espectrometría de masas. Luego, la medición se compara con una cantidad o control de diagnóstico que distingue ese estado de enfermedad de un estado de no enfermedad. La cantidad de diagnóstico reflejará que un biomarcador detalle es sobre-regulado o sub-regulado en un estado de enfermedad en comparación con un estado de no enfermedad. Como se entiende bien en la técnica, la cantidad de diagnóstico detalle usada puede ajustarse para incrementar la sensibilidad o especificidad del ensayo de diagnóstico dependiendo de la preferencia de quien diagnostique. La cantidad de prueba comparada con la cantidad de diagnóstico indica entonces estado de enfermedad.

Metodologías ejemplares Las metodologías ejemplares descritas abajo son métodos representativos para usar las modalidades preferidas de la invención. En estas metodologías, una muestra de suero puede tomarse de un paciente y luego fraccionarse usando una resina de intercambio aniónico. Los biomarcadores en la muestra son capturados usando una disposición PROTEINCHIP® de cobre IMAC. Los biomarcadores son después detectados usando SELDI . Los resultados se ingresan después en un sistema de computadora, el cual contiene un algoritmo que está diseñado usando los mismos parámetros que fueron usados en el algoritmo de aprendizaje y algoritmo de clasificación para determinar originalmente los biomarcadores. El algoritmo produce un diagnóstico con base en los datos recibidos en relación a cada biomarcador . Véanse figuras 1-9 para datos experimentales que se refieren a correlaciones entre isoforma CIII y enfermedad cardiovascular. Las correlaciones ejemplares entre varias apolipoproteinas y enfermedades, como se describió previamente, fueron confirmadas en la literatura. El diagnóstico puede determinarse al examinar los datos producidos de las pruebas SELDI con el algoritmo de clasificación que se desarrolle usando los biomarcadores . El algoritmo de clasificación depende de los detalles del protocolo de prueba usado para detectar los biomarcadores. Estos detalles incluyen, por ejemplo, preparación de muestra, tipo de chip y parámetros de espectrómetro de masas. Si los parámetros de prueba cambian, el algoritmo debe cambiar. En forma similar, si el algoritmo cambia, puede cambiar el protocolo de prueba. Para la presente invención, apolipoproteinas purificadas, muestras de plasma de sujetos normales y muestras de plasma de sujetos diabéticos fueron analizadas usando la superficie de chip de proteina PG-20. Las apolipoproteinas especificas que fueron analizadas de acuerdo con el método de la invención están presentes en plasma, suero y fracción de lipoproteina a varios niveles. La presencia de cada apolipoproteina se determina usando anticuerpos específicos para cada una de las apolipoproteinas. El protocolo descrito abajo está limitado a la escala de peso molecular que puede analizarse mediante tecnología MS actual. Inicialmente, B100 (500 kD) y B48 (aprox. 250 kD) son ya sea aislados primero al unirse a la superficie del anticuerpo, liberarse y luego química o enzimáticamente fragmentarse antes del análisis MS o mediante digestión directa mientras están unidos al chip PG20 usando el protocolo de abajo. 1. Preparación de la Muestra Antes del procedimiento SELDI-TOF-MS, se diluyeron muestras de plasma con regulador de pH 5 y el anticuerpo se acopló al PROTEINCHIP® como sigue: Preparación de muestra de plasma: (1) Preparar Regulador de pH U9 (urea 9M, 50 mM de HEPES, 0.5% de CHAPS, pH 7) y (2) Diluir muestra de plasma con regulador de pH U9 (1:2) y vortexear en frío durante 30 minutos. Acoplamiento de anticuerpo a disposición PROTEINCHIP®. (1) Diluir anticuerpo a 0.2 mg/ml y añadir 2 µ? a puntos en la disposición; (2) Transferir disposición a una cámara de humedad e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente; (3) Aspirar anticuerpo sin tocar superficie de punto ; (4) Lavar chip en un tubo cónico de 15 mL durante 10 minutos con 8 mL de regulador de pH de lavado; (5) Vaciar y lavar con 8 mL de solución salina de pH regulado con fosfato durante 5 minutos, y repetir y (6) Absorber el exceso de PBS de la superficie del chip. 2. Procedimiento SELDI-TOF-MS (1) Añadir 2 µ? de muestra de plasma a cada punto; (2) Transferir disposición a una cámara de humedad e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente; (3) Lavar chip en tubo cónico de 15 mL con 8 mL de regulador de pH de lavado durante 10 minutos; (4) Vaciar y lavar con 8 mL de solución salina de pH regulado con fosfato durante 5 minutos y repetir; (5) Vaciar y lavar con 8 mL de 1 mM de HEPES 1 minuto, y repetir; (6) Remover chip de tubo, eliminar liquido y secar al aire durante 10 minutos; (7) Preparar solución EAM al añadir 100 µ? de acetonitrilo a 99.8% y 100 µ? de ácido trifluoroacético al 1.0% a 1 frasco (10 mg) de polvo de ácido sinapinico, y vortexear durante 5 minutos para disolver el polvo y (8) Añadir 5 µ? de solución EAM a cada punto y secar al aire durante 5 minutos, repetir y secar al aire durante 10 minutos.

El procedimiento puede modificarse para usarse con un bioprocesador que permita volúmenes más grandes y adición automatizada de muestras y reactivos. Controles tanto positivos como negativos se incluyen normalmente en experimentos. TNF-a anticuerpo y antigeno se incluyen en el kit para este propósito. 3. Generación de Huellas Genéticas El procedimiento para generar huellas genéticas de apolipoproteinas para muestras de plasma y apolipoproteinas purificadas se describe a continuación: (1) El lector de disposición y software PROTEINCHIP® (Ciphergen Biosystems, Inc.) se usan para generar los perfiles . (2) Los protocolos de punto se generan y se usan para adaptarse a los chips. (3) Los parámetros de colección de datos deben ajustarse para cada antigeno y se basan en masa molecular. Se incluyen instrucciones en el Kit de Captura de Anticuerpo de disposición PROTEINCHIP® suministrado por Ciphergen Biosystems, Inc. (4) Los datos se analizaron y las huellas genéticas de apolipoproteinas fueron generadas al, por ejemplo, comparar los datos intrínsecamente con ellos mismos y comparar los datos extrínsicamente con estándares, tales como, por ejemplo, sujetos de control. Como alternativa, esta invención se puede llevar a cabo al acoplar anticuerpos a esferas, capturar las apolipoproteinas sobre las esferas, eluir proteínas purificadas de las esferas y después detectar mediante cualquier versión de espectrometría de masas, incluyendo métodos de desorciónronización asistidos por matriz (MALDI) y métodos de electroaspersión . Los métodos para acoplar anticuerpos a esferas se conocen bien en la técnica y estos métodos son adecuados para la presente invención. MALDI es un método de ionización suave a base de láser en el cual la muestra es incrustada en una matriz química que ampliamente facilite la producción de iones de fase de gas intactos a partir de grandes compuestos no volátiles y térmicamente lábiles tales como proteínas, oligonucleótidos , polímeros sintéticos y grandes compuestos inorgánicos. La matriz juega un papel clave en esta técnica al absorber la energía de luz láser y causar que una pequeña parte del substrato objetivo vaporice . La anterior descripción detallada de las modalidades preferidas y las figuras anexas han sido presentadas sólo por propósitos ilustrativos y descriptivos y no se intenta que sean exhaustivas o limiten el alcance y espíritu de la invención. Las modalidades se seleccionaron y describieron para explicar mejor los principios de la invención y sus aplicaciones prácticas. Alguien de capacidad ordinaria en la técnica entenderá que muchas variaciones pueden hacerse a la invención descrita en esta descripción sin alejarse del alcance y espíritu de la invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para obtener un perfil de al menos un biomarcador de apolipoproteina seleccionado en muestras biológicas, caracterizado porque comprende: a) proporcionar la muestra; b) medir el por lo menos un biomarcador de apolipoproteina seleccionado al aplicar la muestra a una superficie y retirar componentes de muestra no unidos; c) analizar la muestra por espectrometría y d) preparar el perfil usando el análisis, con lo cual al menos una enfermedad puede ser diagnosticada.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el por lo menos un biomarcador de apolipoproteina seleccionado se selecciona del grupo que consiste en Apo CI, Apo CII, Apo CIII, Apo CIV, Apo AI, Apo AII, Apo AIV, Apo AV, Apo B48, Apo B100, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, Apo H, Apo J, Apo L, Apo M, isoformas de los mismos y combinaciones de los mismos.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la muestra se aplica a y se deja unirse con la superficie unida a anticuerpo, revestida con proteína de captura de anticuerpos y mejorada en superficie, y los componentes de muestra no unidos son eliminados.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque por lo menos un biomarcador de apolipoproteina seleccionado se detecta mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por ionización de desorción láser u otro método de espectrometría de masas adecuado .
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra se selecciona del grupo que consiste en plasma humano, suero y fracciones de lipoproteína humana .
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una enfermedad se selecciona del grupo que consiste en diabetes, apoplejía, estrés, enfermedad de Alzheimer, enfermedades cardiovasculares, trastornos de lípidos, síndrome metabólico, obesidad y aterosclerosis .
7. 7. Un método para determinar la concentración y modificaciones de apolipoproteínas específicas en una muestra biológica, la' muestra se obtiene de un paciente y la muestra incluye plasma, suero y fracciones de lipoproteína, caracterizado porque comprende las etapas de: a) añadir un volumen específico de un estándar interno a la muestra; b) aplicar la muestra a un chip unido a anticuerpo recubierto con proteina G y mejorado en superficie y remover componentes de muestra no unidos; c) analizar la muestra mediante espectrometría de masas y d) determinar la concentración de las apolipoproteínas usando valores de estándares internos, en donde la aplicación de este método es para evaluar la concentración de isoformas de las apolipoproteínas para usarse como una herramienta de diagnóstico para detectar diabetes, apoplejía, estrés, enfermedad de Alzheimer, enfermedades cardiovasculares, trastornos de lípidos, síndrome metabólico, obesidad y aterosclerosis .
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque las apolipoproteínas específicas se unen a anticuerpos específicos.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque los anticuerpos específicos son inmovilizados sobre la superficie revestida con proteína de captura de anticuerpos.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la muestra se aplica y se deja unir con la superficie revestida con proteína de captura de anticuerpos, y los componentes de muestra no unidos son eliminados .
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las apolipoproteinas se detectan mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por ionización de desorción láser u otro método de espectrometría de masas adecuado.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las apolipoproteinas se seleccionan del grupo que consiste en Apo CI, Apo CII, Apo CIII, Apo CIV, Apo AI, Apo AII, Apo AIV, Apo AV, Apo B48, Apo B100, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, Apo H, Apo J, Apo L y Apo M y los anticuerpos específicos se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos para Apo CI, Apo CII, Apo CIII, Apo CIV, Apo AI, Apo CII, Apo AIV, Apo AV, Apo B48, Apo B100, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, Apo H, Apo J, Apo L y Apo M.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque las muestras se seleccionan de plasma humano, suero y fracciones de lipoproteína humana.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque valores de concentración para apolipoproteinas específicas en la muestra se basan en estándares internos desarrollados al modificar proteínas purificadas seleccionadas y estableciendo valores de referencia usando espectrometría de masas de alta resolución.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque las modificaciones se seleccionan del grupo que consiste en glicación, sialilación, fragmentación y soluciones de aminoácidos .
16. 16. Un método caracterizado porque es para usarse en la evaluación de factores de riesgo, estado de enfermedad, tratamiento de fármacos y respuesta en el campo de farmacogenética.
17. 17. Un método para obtener un perfil de al menos un biomarcador de apolipoproteína seleccionado en una muestra biológica de un sujeto, caracterizado porque comprende las etapas de: a) proporcionar la muestra biológica de un sujeto; b) aplicar la muestra biológica a la superficie de un reactivo de captura que capture específicamente el por lo menos un biomarcador de apolipoproteína, permitir que el al menos un biomarcador de apolipoproteína se una al reactivo de captura y retirar componentes de muestra no unidos; c) analizar la por lo menos una apolipoproteína capturada mediante espectrometría de masas por ionización/desorción láser y d) preparar el perfil usando el análisis, en donde el por lo menos un biomarcador de apolipoproteína seleccionado se selecciona del grupo que consiste en Apo CI, Apo CII, Apo CIII, Apo CIV, Apo AI, Apo AII, Apo AIV, Apo AV, Apo B48, ApoBlOO, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, Apo H, Apo J, Apo L, Apo M, isoformas de los mismos y combinaciones de los mismos.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende además la etapa de: a) usar el perfil para diagnosticar una enfermedad en el sujeto.