CN118311278A - 原发性醛固酮增多症亚型分类的生物标志物组及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种原发性醛固酮增多症亚型分类的生物标志物组及其试剂盒，其中所述生物标志物组包括APOC3、CD56、CHGA、KRT5、AZGP1、醛固酮和总胆红素。这些组合物可用于原发性醛固酮增多症亚型的分类，具有高特异性及敏感性。

Description

原发性醛固酮增多症亚型分类的生物标志物组及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种原发性醛固酮增多症亚型分类的生物标志物组及其试剂盒。

背景技术

原发性醛固酮增多症（PA）是继发性高血压的主要原因，在严重高血压患者中的患病率约为10%。越来越多的临床和流行病学证据表明，PA在治疗前比一般原发性高血压更能放大心脑血管并发症，即使在控制血压升高后也是如此。原发性醛固酮增多症有两种主要亚型：单侧醛固酮分泌腺瘤（APA），通过肾上腺切除术治疗；双侧醛固酮增多症（BHA），通过药物治疗，如醛固酮拮抗剂。因此，准确的原发性醛固酮增多症（PA）亚型分类至关重要，因为最佳治疗方案依赖于亚型。

发明内容

本发明提供了原发性醛固酮增多症亚型分类标志物、原发性皮质醇增多症亚型分类标志物组以及用于获得样品的原发性乙醛增多症亚型分类标志物水平表示的方法。这些组合物和方法可用于原发性醛固酮增多症亚型的分类。

一种原发性醛固酮增多症亚型分类的生物标志物组，其中所述生物标志物组包括APOC3、CD56、CHGA、KRT5、AZGP1、醛固酮和总胆红素。

进一步的，其中所述原发性醛固酮增多症亚型分类使用逻辑回归的算法通过所述生物标志物组计算原发性增多症亚型分类得分。

一种用于进行原发性醛固酮增多症亚型分类的试剂盒，包括：一个或多个检测元件，用于测量一组原发性醛固酮增多症亚型分类的生物标志物组的样品中生物标志物组的表达水平，所述生物标志物组包括APOC3、CD56、CHGA、KRT5、AZGP1、醛固酮和总胆红素。

本发明技术方案一种原发性醛固酮增多症亚型分类的生物标志物组及其试剂盒，具有以下优点：

本发明公开了5种生物标志物的基因组表达用于原发性醛固酮增多症亚型分类的用途，使用一组基因表达生物标志物来计算原发性醛固酮增多症亚型分类，该评分可用于确定单侧醛固酮分泌腺瘤（APA），双侧醛固酮增多症（BHA）。生物标志物组评分使用逻辑回归的算法，计算得到原发性增多症亚型分类得分具有高特异性、高敏感性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1.本发明的血浆队列的人口统计学图。其中APA：醛固酮分泌腺瘤；BHA：双侧醛固酮增多症；IQR：四分位间距；eGFR：估计肾小球滤过率。

图2. 本发明的血浆APA和BHA差异蛋白质组分析的火山图。

图3. 本发明的APA和BHA在血浆中的蛋白质表达存在显著差异图。*：P<0.05；**：P＜0.01。

图4. 组织和血液中5种生物标志物的比较分析图，以区分APA和BHA。AUC：ROC曲线下面积。

图5. 本发明的数据分析和分类评估的算法比较图，其中A：组织基因表达的PA亚型的不同建模构建算法比较图；B：血浆蛋白质组学PA亚型的不同建模构建算法与现有Kobayashi评分的比较图；C：蛋白质和临床参数组合PA亚型的不同建模构建算法与现有Kobayashi评分的比较图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

下面结合图1至图5说明一种原发性醛固酮增多症亚型分类的生物标志物组及其试剂盒。

本发明提供了原发性醛固酮增多症亚型分类标志物、原发性皮质醇增多症亚型分类标志物组以及用于获得样品的原发性醛缩症亚型分型标志物水平表示的方法。这些组合物和方法可用于原发性醛固酮增多症亚型的分类。本发明的这些和其他目的、优点和特征对于本领域技术人员在阅读如下所述的组合物和方法的细节后将变得显而易见。

所谓“原发性醛固酮增多症”，是指一个人的肾上腺分泌过多一种名为醛固酮的激素的疾病。原发性醛固酮增多症的“亚型分类”通常是指将受试者分为原发性醛固酮增多症、APA和BHA的亚型。

所谓“原发性醛固酮增多症亚型分类标记”，是指其在样本中的代表性与原发性醛缩症亚型的分类相关的分子实体。例如，原发性醛固酮增多症亚型分类标志物可能在来自将发展为APA的个体的样本中与将发展为BHA的个体相比有差异地表现，即在不同水平上表现。例如，与亚型APA相关的样品中的标记物浓度可以是与亚型BHA相关的样品的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、7.5倍、10倍或更高。在其他情况下，标志物水平降低与原发性醛固酮增多症亚型有关。例如，与亚型APA相关的样品中的标记物浓度可以比与亚型BHA相关的样品低10%、低20%、低30%、低40%、低50%或更高。

原发性醛固酮增多症亚型分类标志物可能包括与原发性醛固酮增多症相关的蛋白质生物标志物。

如本发明的实施例中所证明的，发明人已经鉴定了许多与原发性醛固酮增多症相关的生物标志物，并发现其在提供原发性血管紧张素增多症亚型分类中的组合用途（即作为一个组）。这些包括但不限于APOC3、CD56、CHGA、KRT5、AZGP1、醛固酮和总胆红素及其类似物。

进一步地，本发明还提供了原发性醛固酮增多症亚型分类组合。原发性醛固酮增多症亚型分类标志物的“组”是指两个或多个原发性增多症标志物，当结合或单独考虑时，其水平可用于提供原发性血管增多症亚型分类。特别是包含原发性醛固酮增多症亚型分类标记APOC3、CD56、CHGA、KRT5、AZGP1、醛固酮和总胆红素的组。例如，在一些实施方案中，原发性醛固酮增多症亚型分类组可包括APOC3、CD56、CHGA、KRT5、AZGP1、醛固酮和总胆红素。

在本发明的一些方面，提供了用于获得受试者的原发性醛固酮增多症亚型分类标记物水平表示的方法。原发性醛固酮增多症亚型分类标记物水平表示是指生物样本和来自受试者的临床信息中一个或多个受试者原发性血管增多症亚型分类标记物（例如一组原发性纤维增多症亚型分类标记物）的水平的表示。术语“生物样品”包括从生物体中获得的各种样品类型，可用于诊断、预后或监测测定。该术语包括生物来源的血液和其他液体样品或衍生自其的细胞及其后代。该术语包括在采购后以任何方式操纵的样品，例如通过试剂处理、溶解或富集某些成分。该术语包括临床样品，还包括细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品。用于本发明方法的临床样品可以从各种来源获得，特别是血液样品。

样品来源包括血液样品或其制剂，例如全血、血清或血浆和尿液。在许多实施方案中，用于人类样本的合适的初始来源是血液样本。因此，在受试者测定中使用的样品通常是源自血液的样品。血液来源的样品可以来源于全血或其部分，例如血清、血浆等，其中在一些实施方案中，样品来源于血液，允许凝结，并且分离和收集血清以用于测定。

在一些实施方案中，样品是血清或血清衍生的样品。可以采用任何方便的方法来生产流体血清样品。在许多实施方案中，该方法通过皮肤穿刺（例如，手指棒、静脉穿刺）将静脉血抽入凝血或血清分离管中，使血液凝结，并将血清离心离开凝结的血液。然后收集血清并储存，直到进行测定。一旦获得患者来源的样本，就对样本进行分析，以确定原发性醛固酮增多症亚型分类标志物的水平。

样品可以直接使用、冷冻或在适当的温度下短时间保存。通常，样品将来自人，尽管动物模型可能会被使用，例如马、牛、猪、犬、猫、啮齿动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、灵长类动物等。任何证明本发明的一种或多种原发性醛固酮增多症亚型分类标志物在原发性血管紧张素增多症患者中的差异表现的方便的组织样品都可以在本主题方法中进行评估。通常，合适的样品源来源于分子实体，即代谢物、氨基酸或蛋白质已经释放到其中的流体。

受试者样本可通过多种方式进行治疗，以增强对一种或多种原发性醛固酮增多症亚型分类标志物的检测。例如，在样品是血液的情况下，可以在分析之前从样品中去除红细胞（例如，通过离心）。这种治疗可以降低使用亲和试剂检测原发性醛固酮增多症亚型分类标记物水平的非特异性背景水平。原发性醛固酮增多症亚型分类标志物的检测也可以通过使用本领域熟知的程序浓缩样品来增强（例如酸沉淀、醇沉淀、盐沉淀、疏水沉淀、过滤）。在一些实施方案中，测试和对照样品的pH将被调节至并保持在接近中性的pH。这种pH调节将防止复杂物的形成，从而对样品中的标记物水平提供更准确的定量。在实施方案中在样品是尿液的情况下，调节样品的pH，并浓缩样品以增强对标记物的检测。

在实践受试者方法时，评估生物样本中原发性醛固酮增多症亚型分类标志物的水平和个体的临床信息。任何方便的方法都可以评估受试者样本中一种或多种原发性醛固酮增多症亚型分类标志物的水平。例如，可以通过测量一种或多种蛋白质/多肽的水平/量来检测蛋白质标记物。术语“评估”、“分析”、“测量”、“评估”和“确定”可互换地用于指代任何形式的测量，包括确定元素是否存在，以及包括定量和定性确定。评估可以是相对的，也可以是绝对的。

例如，至少一种原发性醛固酮增多症亚型分类标志物的水平可以通过在样品中检测生物标志物的一种或多种多肽或片段的量或水平来评估；以达到生物标志物水平的表示。本申请中使用的术语“蛋白质”、“蛋白质片段”和“多肽”是可互换的。“多肽”是指氨基酸的聚合物（氨基酸序列），而不是指分子的特定长度。因此肽和寡肽被包括在多肽的定义中。该术语还指或包括翻译后修饰的氨基酸和多肽，例如糖基化多肽、乙酰化多肽、磷酸化多肽等。

可以通过首先将样品结合到测定板上来改变上述形式。然后，将第一抗体与测定板一起孵育，然后使用对第一抗体具有特异性的标记的第二抗体检测结合的第一抗体。

固定一种或多种抗体的固体基质可以由多种材料和形状制成，例如微量滴定板、微珠、量尺、树脂颗粒等。可以选择基质以最大限度地提高信噪比，最大限度地减少背景结合，以及易于分离和成本。洗涤可以以最适合所用基质的方式进行，例如，通过从储液器中取出珠或量油尺，排空或稀释储液器，例如微量滴定板孔，或用洗涤溶液或溶剂冲洗珠、颗粒、色谱柱或过滤器。

可以使用非ELISA方法来测量样品中一种或多种蛋白质、多肽、氨基酸、代谢产物和蛋白质的水平。代表性实例包括但不限于质谱法、蛋白质组阵列、xMAP™ 微球技术、流式细胞术、蛋白质印迹和免疫组织化学。

为了测量蛋白质、多肽、氨基酸、代谢产物、脂质浓度，包括样品中的比例，应采用定量分析方法，包括色谱法、光谱法和质谱法。液相色谱-质谱法是特别优选的。色谱法可以包括GC、LC、HPLC和UPLC；光谱学可以包括UV/Vis、IR和NMR；质谱法可以包括ESI-QqQ、ESI-QqTOF、MALDI QqQ、MALDI QqTOF和MALDI-TOF-TOF。优选使用FIA和HPLC串联质谱法（高分辨率）。这些分析方法通常是本领域技术人员已知的。

为了测量多肽、氨基酸、氨基酸类似物和代谢产物的量，靶向代谢组学用于量化样品中的代谢产物，包括多肽的分析物类别、氨基酸、生物胺、酰基肉碱、己糖、鞘脂和甘油磷脂。定量是在同位素标记（重）内标物存在的情况下进行的，并通过如上所述的方法进行测定。所得数据提供了关于已探测的每个标记物在样品中的水平的信息，其中该信息是关于标记物是否存在以及通常在什么水平，并且其中该数据可以是定性的和定量的。因此，在检测是定性的情况下，该方法提供了对目标标记物（例如氨基酸、代谢物或蛋白质）是否存在于被分析的样品中的读数或评估，例如评估。在另一些实施方案中，所述方法提供了对目标标记物是否存在于被测定的样品中的定量检测，即对目标分析物的实际量或相对丰度的评估或评估，例如，被测定样品中的氨基酸、代谢产物或蛋白质。在这样的实施方案中，定量检测可以是绝对的，或者如果该方法是检测样品中的两种或多种不同分析物，例如目标核酸或蛋白质的方法，则可以是相对的。因此，当用于量化样品中的目标分析物（例如蛋白质、多肽、氨基酸或代谢产物）时，术语“量化”可以指绝对或相对量化。绝对定量可以通过包含已知浓度的一种或多种对照分析物并用已知对照分析物参考目标分析物的检测水平（例如，通过生成标准曲线）来实现。或者，可以通过比较两种或多种不同的目标分析物之间的检测水平或量来实现相对定量，以提供两种或更多种不同分析物中的每一种的相对定量，例如，相对于彼此。

一旦确定了一种或多种原发性醛固酮增多症亚型分类标志物的水平，就可以通过多种方式中的任何一种来分析测量结果，以获得原发性增多症亚型分类标志物水平的表示。

例如，可以单独分析一种或多种原发性醛固酮增多症亚型分类标志物的测量结果，以制定原发性增多症亚型分类图谱。如本发明所用，“原发性醛固酮增多症亚型分类图谱”是指患者样本中一种或多种原发性皮质醇增多症亚型分类标志物的标准化水平，例如，患者样本中血清学蛋白浓度的标准化程度。图谱可通过本领域已知的多种方法中的任何一种生成。例如，每个标记物的水平可以相对于所选管家基因的表达或相对于整个面板上的信号进行log2转换和标准化，等等。计算原发性醛固酮增多症亚型分类谱的其他方法对于普通技术人员来说将是公知的。

作为另一个例子，可以对一组原发性醛固酮增多症亚型分类标志物的测量结果进行集体分析，以得出单个原发性增多症亚型分类得分。“原发性醛固酮增多症亚型分类得分”是指一个单一的度量值，表示原发性增多症亚型分类面板中每种原发性皮质醇增多症亚型分类标志物的加权水平。因此，在一些实施方案中，受试者方法包括检测样本中原发性醛固酮增多症亚型分类组的标记物水平，并基于原发性增多症亚型分类标记物的加权水平来计算原发性血管紧张症亚型分类得分。患者样本的原发性醛固酮增多症亚型分类得分可以通过本领域已知的用于计算生物标志物得分的多种方法和算法中的任何一种来计算。例如，加权的标记物水平，例如通过例如将每个归一化标记物水平乘以加权因子来加权的log2变换和归一化标记物级别，可以被相加，并且在某些情况下被平均，以得到代表所分析的原发性醛固酮增多症亚型分类标记物的组的单个值。

在某些情况下，面板中每个标记物的加权因子或简称“权重”可能反映了样品中分析物水平的变化。例如，每个原发性醛固酮增多症亚型分类标志物的分析物水平可以被对数转换并加权为1（对于在原发性醛固酮增多症中水平增加的那些标志物）或-1（对于在原发性醛固酮减少症中水平降低的那些标志物），以及确定为达到原发性醛固酮增多症特征的增加的标志物与减少的标志物之和之间的比率。在其他情况下，权重可以反映每个标记对标记组在进行亚型分类时的特异性、敏感性和/或准确性的重要性。这样的权重可以通过任何方便的统计机器学习方法来确定，例如，可以使用从中获得样本的数据集的主成分分析（PCA）、线性回归、支持向量机（SVM）和/或随机森林。在某些情况下，每个标记的权重由获得患者样本的数据集定义。在其他情况下，每个标记的权重可以基于参考数据集或“训练数据集”来定义。

本领域普通技术人员可以通过使用基于计算机的系统，例如使用本领域已知的任何硬件、软件和数据存储介质，并使用便于此类分析的任何算法，轻松地执行这些分析方法。例如，数据挖掘算法可以通过“云计算”、基于智能手机或基于客户端-服务器的平台等应用。

在一些实施方案中，仅评估一种标记物的丰度，例如蛋白质水平，以产生标记物水平的表示。在其他实施例中，评估两个或更多个的水平，即面板和标记。因此，在主题方法中评估样品中至少一种标记物的丰度。在某些实施方案中，所进行的评估可以被视为蛋白质组的评估，因为该术语在本领域中被使用。

在一些情况下，确定或获得受试者的原发性醛固酮增多症亚型分类标记表示（例如，原发性血管紧张素增多症亚型分类概况或原发性血管炎亚型分类得分）的受试者方法还包括提供原发性醛固酮增多症亚型分类标记表示作为报告。

如此获得的原发性醛固酮增多症亚型分类标志物水平的表示有许多用途。例如，标记物水平的表示可以用于原发性醛固酮增多症的亚型分类。即，提供关于受试者是APA还是BHA（原发性醛固酮增多症的亚型）的亚型测定。在某些情况下，受试者可能表现出原发性醛固酮增多症的临床症状，例如高血压、血液中钾水平低、一直感到疲劳、头痛、肌肉无力和麻木。

直接使用标记物水平的表示，即不与表型决定元件进行比较，来进行原发性醛固酮增多症亚型分类。

受试者方法可用于各种不同类型的受试者。在许多实施方案中，受试者属于哺乳动物类，包括食肉目（例如狗和猫）、啮齿目（例如小鼠、豚鼠和大鼠）、兔形目（例如兔子）和灵长类（例如人类、黑猩猩和猴子）。在某些实施方案中，动物或宿主，即受试者是人类。

在一些实施方案中，受试者提供原发性醛固酮增多症亚型分类的方法。在一些实施方案中，本公开的原发性醛固酮增多症亚型分类是通过提供（即生成）书面报告来提供的，该书面报告包括技术人员的评估，例如，技术人员对患者当前是否受原发性醛固酮增多症、亚型（APA或BHA）或受试者原发性醛固酮增多症严重程度的确定，等（“原发性醛固酮增多症亚型分类”）。因此，主题方法可以进一步包括生成或输出提供技术人员评估结果的报告的步骤，该报告可以以电子介质（例如，计算机监视器上的电子显示器）的形式或有形介质（例如打印在纸上或其他有形介质上的报告）的形式提供。

还提供了用于实践一种或多种上述方法的试剂、系统和试剂盒。例如一种或多种检测元件，例如用于检测蛋白质、氨基酸、代谢产物和蛋白质等的抗体或氨基酸。

一种专门用于产生标志物水平表征（如原发性醛固酮增多症亚型分类标志物水平表示）的试剂是特异性结合氨基酸标志物的抗体的集合，例如ELISA形式，xMAP™ 微球形式，在阵列上，悬浮液中，通过流式细胞术、蛋白质印迹、点印迹或免疫组织化学进行分析。使用这些抗体的方法在本领域中是众所周知的。这些抗体可以在溶液中提供。或者，它们可以预先结合到固体基质，例如，多孔培养皿的孔或xMAP微球的表面。

进一步地，本发明包括探针阵列、引物集合或抗体集合，其包括对选自APOC3、CD56、CHGA、KRT5、AZGP1、醛固酮和总胆红素的至少一种标记物具有特异性的探针、引物或抗体（也称为试剂）。在某些实施方案中，探针、重同位素和抗体的收集包括对APOC3、CD56、CHGA、KRT5、AZGP1、醛固酮和总胆红素特异性的试剂，以及在相关途径中特异性的生物化学底物。受试者探针、重同位素或抗体集合或试剂可以包括仅对上面列出的氨基酸和代谢物具有特异性的试剂，或者它们可以包括对上面没有列出的附加基因/蛋白质/脂质/辅因子具有特异性，例如探针、同位素、引物或对本领域已知其表达模式与原发性醛固酮增多症相关的基因/蛋白质/脂质/辅因子特异性的抗体。

实施例1

根据病理生理学，原发性醛固酮增多症可进一步分为四大亚型：单侧醛固酮分泌腺瘤（APA）、双侧醛固酮增多症（BHA）、原发性单侧增生和家族性醛固酮增多。约95%的PA患者属于APA或BHA3。

APA亚型需要单侧肾上腺切除术来切除产生醛固酮的腺瘤。另一方面，对BHA亚型进行靶向药物治疗是最佳治疗。由于易于操作和技术可及性，建议将CT或MRI肾上腺成像作为PA患者分型的初始步骤。然而，分类的准确性和特异性非常有限，不同队列研究的结果是一致的。在最近对25项研究（共4669名受试者）的肾上腺成像用于PA亚型诊断的系统荟萃分析中，总体结果显示，单侧PA识别的敏感性差68%（95%CI:61%-74%），特异性差57%（95%CI:50%-65%）。由于亚型成像的局限性，目前的临床指南建议肾上腺静脉取样（AVS）作为亚型诊断的标准程序。虽然AVS已在临床实践中使用多年，但它是一种侵入性测试，具有技术挑战、程序标准化差、成本高、耗时且不易获得。最近也报道了AVS对更好的亚型诊断的有争议的结果。在一项研究中，当通过AVS或放射学成像确定亚型诊断时，没有临床结果。在另一项针对65岁以下患者的研究中，基于AVS侧化标准的肾上腺切除术决定没有导致生化结果的差异。

根据AVS的有效性问题，已经开发了几种非侵入性评估方法，以提供更简单但相对准确的亚型分类。例如，Küpers评分及其修订版将CT结果与血钾水平、eGFR或尿醛固酮浓度的临床测量相结合，以诊断单侧PA患者。对于双侧诊断，Kobayashi评分是最近根据CT结果、血钾水平、基线ARR比率、醛固酮浓度和性别制定的。然而，目前大多数评分系统的效率受到研究中小队列数量的限制，准确性通常只集中在一个亚型上。考虑到这些因素，本研究检查了在血液中使用基于质谱的靶向蛋白质组分析来开发诊断分层小组，该小组可能会提高APA和BHA亚型的检测准确性。

患者招募-所有患者都完成了血浆醛固酮/肾素比率（ARR）的初步PA筛查测试。为了避免由于分母过低而引起的数据失真，血浆肾素活性（PRA）<0.2 ng/ml/h被设置为0.2用于ARR的计算。初次筛查之前，所有受试者均单独使用a1肾上腺素受体拮抗剂或维拉帕米缓释剂或肼嗪进行稳定的降压治疗，血清钾水平正常。稳定降压治疗的持续时间取决于患者正在服用的降压药物。MR拮抗剂（如螺内酯、依普利酮）、保钾利尿剂（如阿米洛利、三氨苯）和耗钾利尿药（如氢氯噻嗪、呋塞米）应在ARR测试前至少停用四周。血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、肾素抑制剂、二氢吡啶钙通道拮抗剂、b-肾上腺素能阻滞剂和中枢a-2激动剂（如可乐定、a-甲基多巴）应在ARR测试前至少停用两周。PA患者通过生理盐水输注试验和/或卡托普利激发的验证性试验得到进一步诊断。在盐水输注试验中，在输注2升0.9%NaCl 4小时后，血浆醛固酮浓度（PAC）>10ng/dl证实了PA的诊断。对于卡托普利激发，在接受50mg卡托普利2小时后，PAC抑制<30%证实了PA。

如果AVS成功且没有显性副作用，则诊断为特发性醛固酮增多症（IHA）。根据四角标准:1诊断为醛固酮生成腺瘤（APA）。AVS时醛固酮分泌偏侧；2.外科手术；3.病理上的腺瘤；4.肾上腺切除术后血压得到控制或改善。肾上腺切除术后6个月随访血压结果。如果在没有药物的情况下血压＜140/90mmHg，则高血压可以治愈；如果在相同或减少降压药物数量和/或减少规定的每日剂量的情况下，血压＜140/70mmHg则高血压可以改善。

蛋白质组学分析。采集血浆样本，然后用冷冻离心机以2000xg离心15分钟，从血浆中去除细胞和血小板。离心后，立即将液体上清液（血浆）转移到聚丙烯管中。将血浆保存在0.5 ml等分试样中，并储存在-80°C下，等待进一步分析。

取10μL血浆，在冰上解冻，过滤，然后加入滤筒中在室温下孵育5分钟。在滤筒和离心机中加入400μL洗脱缓冲液后，合并两轮收集。然后使用10KDa截止浓缩器对组合样品进行浓缩，最终样品体积约为60μL。接下来，将样品变性、烷基化，然后用胰蛋白酶消化16-18小时。消化后，用SPE筒（WAT023590）纯化肽混合物。将最终洗脱的肽干燥并在0.1%甲酸缓冲液中溶解，并准备进行以下蛋白质组学分析。

通过microBCA测定法测定肽浓度。将最终的1-1.5μg样品掺入5 fmol或50 fmol同位素标记的内肽标准品（内标物的量选择取决于不同的靶蛋白），然后注入TSQ-Altis（Thermo）三重四重质谱仪进行SRM分析。沿着反相梯度分离和检测肽。梯度分离包含水中01%甲酸作为流动相A，丙酮腈中01%甲酸用作流动相B。MS数据是在正NSI SRM模式下获得的，分辨率为0.7FWHM。分析质谱数据，通过内部浓度与代表肽的峰面积比和相应的内部标准的倍数计算靶蛋白的定量。

从Gene expression Omnibus获得如下基因表达数据集：GSE8514、GSE60042、GSE10927、GSE156931、GSE171558。除非另有说明，显著性定义为P<0.05。统计检验为双尾检验，包括T检验和Mann-Whitney U检验。使用Logistic回归生成受试者特征曲线（ROC AUC），每个检测到的靶蛋白。受试者特征曲线（ROC AUC）下区域之间的差异用于评估性能。

对医学中常用的5种算法进行了优化数据分析和分类评估：随机森林（RF）、逻辑回归（Logistic）、支持向量机（SVM）、XGB、k近邻（KNN）、弹性网络（EN）和拉索回归（LASSO）。根据ROC AUC，作为最终验证阶段的一部分，确定了最佳分类。

结果

PA亚型生物标志物组开发的研究设计。PA队列预筛选、生物标志物选择、基于组织和血液的亚型模型构建以及潜在生物学探索差异通路分析的总体工作流程。本发明的研究分5个步骤进行：1，收集APA和BHA的回顾性血浆队列，并通过基于LC-MS/MS的靶向蛋白质组学进行预筛选。2、利用统计学和生物信息学分析进行特征选择，确定生物标志物组。3、分别分析血液和组织中生物标志物的蛋白质丰度和相应的基因表达。分析结果导致构建了基于组织和基于血液的分型模型。4、对多靶点血清学分型组的临床疗效进行评价，并与Kobayashi评分模型进行比较。还探讨了分型小组与APA干预结果之间的潜在联系。5，为了探索潜在的生物学，确定了APA和BHA组织之间的差异途径，并与文献中蛋白质组学研究的结果进行了比较。

PA队列患者的特征。最初的PA患者是根据ARR测试招募的。APA亚型后来通过四角标准得到证实，BHA亚型通过AVS测试中没有优势侧得到证实。蛋白质组分析的最终队列的人口统计学和临床特征如图1所示，其中包括36名APA和24名BHA患者。除了APA样本中醛固酮和总胆红素水平较高外，这两组的特征没有显著差异。

从定量蛋白质组学靶向分析中选择差异表达蛋白。蛋白质检测和定量通过MRM模式测定，并用相应的同位素标记的内标进行加标。考虑到APA或BHA产生细胞弥漫性增生的组织病理特征，本发明认为该平台将为发现原发性醛固酮增多症的蛋白质组生物标志物提供有用的工具。本发明的全面靶向定量质谱法为每个样本筛选了1500多种蛋白质。定量靶向蛋白的浓度，并基于APA与BHA的分化能力（ROC AUC>0.7），选择12种蛋白。这12种候选蛋白质生物标志物是：Afamin（AFM）、载脂蛋白C1（APOC1）、载脂质蛋白C2（APOC2）、载油脂蛋白C3（APOC3）、载脂肪蛋白C4（APOC4）、α-2-糖蛋白1、锌结合（AZGP1）、神经细胞粘附分子1（CD56/NCAM1）、嗜铬粒蛋白A（CHGA）、角蛋白5（KRT5）、淋巴细胞胞浆蛋白1（LCP1）、肽基丙异构酶A（PPIA）和血清淀粉样蛋白A4，构成（SAA4）。为了进一步从这12种蛋白质中鉴定出最显著的差异表达蛋白质，本发明应用了倍数变化大于2或小于0.5和P值小于0.05的标准，如图2所示，选择了5种蛋白质（APOC3、CD56、CHGA、KRT5和AZGP1）。如图3所示，本发明发现APA中4蛋白显著下调，1蛋白显著上调。

使用五种生物标志物对组织和血液进行亚型分析。原发性醛固酮增多症是一种由于各种病理原因导致肾上腺醛固酮过度表达的疾病。本发明假设血液中发现的蛋白质的显著差异是由组织中导致脱落到血液中的病理生理学变化引起的。为了测试从血浆中鉴定的五种蛋白质是否能够反映组织的病理学并用作亚型生物标志物，比较APA和BHA组织中5种差异蛋白生物标志物的相应基因表达水平。APA和BHA之间的分型能力通过ROC AUC进行评估。图4显示了5种生物标志物的比较分析，以区分组织和血液之间的APA和BHA。从组织基因表达水平来看，所有5种生物标志物的亚型ROC AUC均良好（>0.7），这表明从血液中发现的蛋白质生物标志物是由APA和BHA组织中差异表达的基因引起的。在确认了单个蛋白质或基因的亚型能力后，本发明将所有5种蛋白质或基因组合起来，形成一个预测APA或BHA的小组。评估了医学中常用的不同算法用于优化数据分析和分类，包括随机森林（RF）、逻辑回归（Logistic）、支持向量机（SVM）、XGB、k近邻（KNN）、弹性网络（EN）和拉索回归（LASSO）。如图5中A所示，对于所有不同的测试算法，组织中分型的5个基因组的ROC AUC为1.000（完全分离）。在血浆蛋白组中，如图5中B所示，根据逻辑建模，用于分型的5种蛋白组的最佳ROC AUC为0.876（95%CI:0.759-0.945）。从图1中患者特征的比较来看，两项临床测量显示出显著差异。APA患者的血浆醛固酮和总胆红素水平均显著升高。为了测试临床参数的添加是否可以进一步提高蛋白质组分型面板的性能，本发明比较了6种主要算法和不同的交叉验证方法。如图5中C所示，使用醛固酮和总胆红素的5种蛋白质生物标志物的逻辑回归模型提供了0.978（95%CI:0.901-0.98）的最佳ROC AUC。作为参考，还计算了队列中的Kobayashi评分，ROC AUC为0.735（95%CI:0.594-0.876）。在本研究中使用的队列中，新组合在APA和BHA之间的分离明显比基于Kobayashi评分的分离更好。

在描述本发明的方法和组合物之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法或组合物，当然，这可能会有所不同。还应理解，本发明中使用的术语仅用于描述特定实施例，而不旨在进行限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限定。

除非另有定义，否则本发明中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本发明所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但现在描述一些潜在的和优选的方法和材料。本发明提及的所有出版物通过引用合并于此，以公开和描述引用这些出版物的方法和/或材料。应当理解，在存在矛盾的情况下，本公开取代合并出版物的任何公开。

正如本领域技术人员在阅读本公开后显而易见的那样，本发明描述和说明的每个单独的实施例都具有离散的组件和特征，这些组件和特征可以很容易地与其他几个实施例中的任何一个的特征分离或组合，而不偏离本发明的范围或精神。任何列举的方法都可以按照列举的事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序来执行。

Claims (3)

1.一种原发性醛固酮增多症亚型分类的生物标志物组，其特征在于，其中所述生物标志物组包括APOC3、CD56、CHGA、KRT5、AZGP1、醛固酮和总胆红素。

2.根据权利要求1所述的生物标志物组，其特征在于，其中所述原发性醛固酮增多症亚型分类使用逻辑回归的算法通过所述生物标志物组计算原发性增多症亚型分类得分。

3.一种用于进行原发性醛固酮增多症亚型分类的试剂盒，其特征在于，包括：一个或多个检测元件，用于测量一组原发性醛固酮增多症亚型分类的生物标志物组的样品中生物标志物组的表达水平，所述生物标志物组包括APOC3、CD56、CHGA、KRT5、AZGP1、醛固酮和总胆红素。