CN113567687A - 检测样品中两种生物标志物的表达水平的试剂在制备用于检测子痫前期试剂盒中的应用 - Google Patents

检测样品中两种生物标志物的表达水平的试剂在制备用于检测子痫前期试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明首次发现了与子痫前期相关的生物标记物瘦素与神经酰胺两者比值，通过检测受试者瘦素与神经酰胺两者比值水平的变化，来实现子痫前期的早期诊断。可用于孕期评估子痫前期患病风险，具有较高的准确性、特异性，为子痫前期早期预测及精准预防提供了一种有效的方法。在发病早期对有子痫前期风险的孕妇进行及时、准确的辅助诊断，帮助临床对患者进行密切监测、及时进行有效干预以控制病情、延长孕周，对于降低子痫前期发病率与死亡率、保障母婴安全具有重要意义。

Description

检测样品中两种生物标志物的表达水平的试剂在制备用于检 测子痫前期试剂盒中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种检测样品两种生物标志物的表达水平的试剂在制备用于检测子痫前期试剂盒中的应用。
背景技术
子痫前期，又名先兆子痫（preeclampsia, PE）是一种严重的妊娠多系统并发症，对母亲和婴儿都有不良影响。该疾病的发病率约占中国和全球所有妊娠的5-8%，该疾病造成全球所有孕产妇死亡的18%，也是胎儿和新生儿死亡的主要原因。医学中把伴有子痫前期或子痫前期风险称之为子痫前期患者。临床表现多变，但通常可见高血压和蛋白尿。特点如下：20周后新发高血压及蛋白尿；伴/不伴血小板减少、肾功能损害、肝功能损害、肺水肿、中枢神经或视觉障碍。子痫前期的治疗以对症治疗为主，唯一有效的治疗措施是终止妊娠。子痫前期的原因和发病机制仍不确定，诊断依赖于非特异性病程后期出现的实验室和临床体征和症状，使诊断和临床管理决策变得困难。临床迫切需要一种更早、更可靠的疾病早筛、预后和监测的标志物和方法，以便更及时和个性化的对子痫前期进行预防和治疗，并显著提高我们对子痫前期发病机制的理解。
发明内容
本发明的主要目的在于提供检测样品中两种生物标志物的表达水平的试剂，灵敏和特异性的在制备用于检测子痫前期试剂盒中的应用。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了检测样品中两种生物标志物的表达水平的试剂在制备用于检测子痫前期试剂盒中的应用，其中两种生物标志物分别为瘦素及神经酰胺，其中通过测定瘦素与神经酰胺的表达的比值确立子痫前期的风险。
进一步地，包括如下步骤：
(1)准备取自受试者的待测样品；
(2)对步骤(1)的待测样品中的瘦素与神经酰胺进行定量测定，得到两者比值水平；
(3)将步骤(2)中得到的比值水平和阈值水平进行比较，所述比值水平高于阈值水平，则判断所述受试者伴有子痫前期。
进一步地，瘦素与神经酰胺的比值的阈值水平分别为：孕期小于12周：0.24；孕期12-24周：0.19；孕期25-36周：0.28。
进一步地，所述受试者伴有子痫前期，瘦素在受试者血清内的范围分别为: 孕期小于12周：15.8-27.7μg/L；孕期12-24周：19.6-30.7μg/L；孕期24-36周：19.2-33.1μg/L。
进一步地，所述受试者伴有子痫前期，神经酰胺在受试者血清内的范围分别为：孕期小于12周：47.3-61.6μg/L；孕期12-24周：46.0-60.3μg/L；孕期25-36周：45.3-63.4μg/L。
进一步地，所述受试者伴有子痫前期，其瘦素与神经酰胺两者比值的水平为：孕期小于12周：0.30-0.56；孕期12-24周：0.41-0.59；孕期25-36周：0.35-0.77。
进一步地，所述神经酰胺为神经酰胺d18:1/14:0、神经酰胺d18:1/16:0、神经酰胺d18:1/18:1、神经酰胺d18:1/17:0、神经酰胺d18:0/16:0、神经酰胺d18:1/18:0、二氢神经酰胺d18:0/18:1、二氢神经酰胺d18:0/18:0、神经酰胺d18:1/20:0、神经酰胺d18:1/22:0、神经酰胺d18:1/24:1、二氢神经酰胺d18:0/24:1、神经酰胺d18:1/24:0、神经酰胺d18:1/20:1、神经酰胺d18:1/22:1、神经酰胺d18:1/24:2、神经酰胺d18:1/21:0、二氢神经酰胺d18:0/20:0、二氢神经酰胺d18:0/21:0、二氢神经酰胺d18:0/22:0、神经酰胺d18:1/23:0、二氢神经酰胺d18:0/23:0、神经酰胺d18:1/25:0、神经酰胺d18:1/26:0、二氢神经酰胺d18:0/25:0、二氢神经酰胺d18:0/26:0、神经酰胺d18:1/14:0中的一种或多种。
进一步地，其中所述样品选自血液样品、血清样品、血浆样品和尿液样品或任何上述样品的提取物。
根据本发明的另一方面，用于制备对子痫前期的前期诊断风险进行分级的诊断试剂。
进一步地，其所述受试者为：
（a）有子痫前期病史；
（b）35岁以上；
（c）多胎妊娠；
（d）初产妇；
（e）生育间隔在两年以下或者十年以上者；
（f）患有肥胖症；
（g）有慢性高血压、偏头痛、1型或2型糖尿病、肾病、血栓形成倾向或狼疮病史；以上情况的一种或几种。
本发明的有益效果是：
本发明首次发现了与子痫前期相关的生物标记物瘦素与神经酰胺两者比值，通过检测受试者瘦素与神经酰胺两者比值水平的变化，来实现子痫前期的早期风险评估。可用于孕期评估子痫前期患病风险，具有较高的准确性，为子痫前期早期预测及精准预防提供了一种有效的方法。可在发病早期对有子痫前期风险的孕妇进行及时、准确的辅助诊断，帮助临床对患者进行密切监测、及时进行有效干预以控制病情、延长孕周，对于降低子痫前期发病率与死亡率、保障母婴安全具有重要意义。一旦确定子痫前期的诊断，该妇女就可以接受有助于改善子痫前期的程序。此类程序的示例包括但不限于降低血压的药物、皮质类固醇的使用、抗惊厥药物（例如硫酸镁）、卧床休息以及如果诊断是在37孕周或之后做出的考虑分娩。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1.PE生物标志物发现和测试的研究概要图。
图2.发现组中，孕妇血清中瘦素、神经酰胺d18:1/25:0和神经酰胺d18:1/26:0在不同胎龄下的浓度图。
图3. 发现组中，孕妇血清中瘦素/神经酰胺d18:1/25:0（左）和瘦素/神经酰胺d18:1/26:0（右）在不同胎龄下的浓度图。
图4.测试组中，孕妇血清中瘦素、神经酰胺d18:1/25:0和神经酰胺d18:1/26:0在不同胎龄下的浓度图。
图5. 瘦素/神经酰胺d18:1/25:0、瘦素/神经酰胺d18:1/26:0、 sFlt-1/PlGF在不同胎龄期的AUC图。
图6.测试组中，瘦素/神经酰胺d18:1/25:0比率和sFlt-1/PlGF比率在不同胎龄时间的子痫前期预测能力。
图7. 瘦素/神经酰胺d18:1/25:0比率和sFlt-1/PlGF比率作为标志物在预测子痫前期方法的灵敏度、特异性、PPV和NPV的对比。
图8.验证组中，非子痫前期和子痫前期孕妇血清中瘦素/神经酰胺d18:1/25:0比率和sFlt-1/PlGF比率的比较图。
图9.不同标志物在预测子痫前期中的性能比较。
图10.不同类别神经酰胺在患者和非患者中的含量对比1。
图11.不同类别神经酰胺在患者和非患者中的含量对比2。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部试验结果。
本发明提供了用于获取受试者人体的子痫前期（preeclampsia，PE）标志物水平的表示方法。子痫前期标志物水平表示是指一个或多个受试者子痫前期标志物含量的多寡、有无等表征特性，例如一组受试者生物样本中的子痫前期标志物的浓度。术语“生物样本”包括从生物体中获得的各种类型的样本，可用于诊断、预后或监测分析。该术语包括血液和其他生物来源的液体样本或由此而来的细胞及其后代。该术语包括样品在购买后以任何方式操作过，如通过试剂处理、增溶或富集某些成分。该术语包括临床样本，还包括细胞上清液、细胞裂解液、血清、血浆、生物液体和组织样本。本发明方法中使用的临床样本可以从多种来源获得，特别是血液样本。
样本来源包括血液样本或其制剂，如全血、血清或血浆以及尿液。在许多实施例中，人体样本的合适初始来源是血液样本。因此，在实验中使用的样本通常是血液样本。血液来源的样本可以来自全血或其部分，如血清、血浆等，在某些实施例中，样本来自血液，允许凝固，分离和收集的血清用于化验。
在某些实施例中，该样本是血清或血清来源的样本。可以采用任何方便的制备液体血清样本的方法。在许多实施例中，该方法采用皮肤穿刺(如手指戳、静脉穿刺)将静脉血抽取到凝血或血清分离管中，使血液凝结，并将血清从凝血中分离出来。然后将血清收集并保存，直到进行化验。一旦获得患者的样本，就对样本进行分析，以确定子痫前期标志物的水平。
受试者样本通常是在妊娠的前、中期或晚期从个体获得的。“妊娠期”是指哺乳动物的妊娠期，即从受精到出生的发育间隔时间，加上两周，即最后一次月经期的第一天。指的是妊娠的第一个、第二个或第三个阶段，每个阶段都有3个月长。例如，“最初三个月”指的是从最后一次月经的第一天到妊娠的第13周；“中期妊娠”指的是妊娠第14周到第27周；“第三妊娠期”指的是从第28周到出生，也就是38-42周的妊娠期。
获得的样品可以直接使用、冷冻或在适当的培养基中短期保存。一般来说，样本将来自人类患者，但动物模型也可以使用，如马、牛、猪、犬、猫、啮齿动物，如老鼠、大鼠、仓鼠、灵长类动物等。任何方便的组织样本，如果能证明本文所披露的一个或多个子痫前期标志物在子痫前期患者中的差异表现，都可以在本课题的方法中进行评估。典型地，适当的样品来源将从所关注的分子实体，即RNA转录本或蛋白质，被释放到的液体中获得。
受试者样本可采用多种方法进行处理，以增强对一种或多种子痫前期标志物的检测。例如，当样品是血液时，可以在化验前将红细胞从样品中除去(例如，通过离心)，使用亲和试剂检测水平的子痫前期标志物，这样的样本处理可能有助于降低非特异性背景水平。使用目前已知的方法(如酸沉淀、醇沉淀、盐沉淀、疏水沉淀、过滤)对样品进行浓缩，也可提高子痫前期标志物的检测。在某些实施例中，测试和对照样品的pH值将被调整到并保持在接近中性，这样的pH值调整将防止复杂的生化反应发生，有利于样本的稳定，从而提供更准确的定量样品中的标记物水平。在实施例中，样品是尿液，为了加强标记物的检测，样品的pH值被调整，样品被浓缩。
在实践主体方法时，评估来自个体的生物样本中的子痫前期标志物水平。受试者样本中一个或多个子痫前期标志物的水平可以用任何方便的方法进行评估。例如，子痫前期基因表达水平可以通过检测一个或多个子痫前期基因的一个或多个核酸RNA转录本(如mRNA)的水平/数量来检测。蛋白质标记物可以通过检测一个或多个蛋白质/多肽的水平/数量来检测。术语“评价”、“分析”、“检测”、“评估”和“确定”可以互换使用，指任何形式的检测，包括确定某一元素是否存在，以及包括定量和定性的决定。评估可以是相对的，也可以是绝对的。
例如，可以通过检测样品中一个或多个蛋白质/多肽或片段的数量或水平来评估至少一个子痫前期标记的水平，以达到蛋白质水平表示。本应用中使用的术语“蛋白质”和“多肽”是可以互换的。“多肽”是指一种氨基酸聚合物(氨基酸序列)，而不是指特定长度的分子。因此，多肽的定义包括多肽和寡肽。该术语还指或包括翻译后修饰的多肽，如糖基化多肽、乙酰化多肽、磷酸化多肽等。该定义包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物的多肽，具有取代键的多肽，以及其他已知的技术修饰，包括自然发生的和非自然发生的。
当要检测蛋白质水平时，可以采用任何方便的评估蛋白质水平的方案，其中一个或多个蛋白质的水平被检测的样品。例如，检测蛋白质水平的一种代表性和方便的方法是ELISA。在ELISA和基于ELISA的检测中，对所述蛋白质特异性的一种或多种抗体可以固定在选定的固体表面上，最好是显示蛋白质亲和力的表面，如聚苯乙烯微滴度板的孔。洗涤去除不完全吸附的物质后，检测板孔被涂上一种非特异性的“阻断”蛋白，该蛋白对牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液等检测样品具有抗原中性。这可以阻断固定表面上的非特异性吸附位点，从而减少因抗原与表面的非特异性结合而引起的背景。洗涤去除未结合的阻断蛋白后，固定化表面在有利于免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下与待测样品接触。这些条件包括用稀释剂如BSA或牛γ球蛋白(BGG)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)/Tween或者PBSATriton-X100中稀释样品，这也有助于减少非特异性背景，并允许样品在大约25°C-27°C的温度下孵育约2-4小时(尽管也可以使用其他温度)。孵育后，将抗血清接触的表面清洗，以去除非免疫复合物材料。典型的洗涤程序包括用PBS/Tween、PBS/Triton-X100或硼酸盐缓冲液等溶液洗涤。然后，通过将结合的免疫复合物施加于对不同于第一抗体的靶点具有特异性的第二抗体，并检测第二抗体的结合，可以确定免疫复合物形成的发生和数量。在某些实施例中，第二抗体将具有相关酶，例如脲酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶，在与合适的显色底物孵育时将产生显色沉淀。例如，可以使用脲酶或过氧化物酶结合的抗人IgG，在有利于形成免疫复合物的条件下(例如，在室温下PBS/Tween等含PBS的溶液中孵育2小时)一段时间。孵化后第二抗体和洗涤去除的材料，标签是量化，例如通过孵化显色底物，如尿素和溴甲酚紫脲酶的标签或2,2'-叠氮基-二-(3-乙基-苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)和过氧化氢，以过氧化氢物标签为例。定量是通过检测颜色产生的程度来实现的，例如，使用可见光谱分光光度计。
可以先将样品与检测板交联，从而改变上述操作步骤。第一抗体与检测板孵育，然后使用有标记的能和第一抗特异性结合的第二抗体检测已经和样品结合的第一抗体。
固定抗体的固体基质可以由多种材料制成并具有多种形状，例如微量滴定板、微珠、试纸条、树脂颗粒等。可以选择基质以最大化信号噪声比，以最大限度地减少背景结合，以及便于分离和降低成本。可以以最适合所用底物的方式进行洗涤，例如，从储液器中取出珠子或试纸条，清空或稀释储液器如微量滴定板孔，用洗涤液或溶剂冲洗、过滤珠子、颗粒、色谱柱。
或者，可以采用非基于ELISA的方法来检测样品中一种或多种蛋白质的水平。代表性实例包括但不限于质谱、蛋白质组学阵列、xMAP™微球技术、流式细胞术、蛋白质印迹和免疫组织化学。
作为另一个例子，至少一种子痫前期标志物的水平可以通过检测患者样品中由所述基因编码的一种或多种RNA转录物或其片段的量或水平来评估，以获得核酸标志物表示。可以使用任何方便的方案来检测样品中的核酸水平。虽然检测核酸的多种不同方式是已知的，例如差异基因表达分析领域中采用的那些，但是用于产生标记表示的一种代表性和方便类型的方案是基于阵列的基因表达谱方案。这样的应用是杂交检测，其中使用在要生成的标记表示中展示要检测/描绘的每个基因的“探针”核酸的核酸。在这些检测中，首先从被检测的初始核酸样品制备靶核酸样品，其中制备可包括用标记物例如信号产生系统的成员标记靶核酸。在靶核酸样品制备之后，样品在杂交条件下与阵列接触，由此在靶核酸之间形成复合物，该复合物与附着于阵列表面的探针序列互补。然后定性或定量检测杂交复合物的存在。
可实施以产生主题方法中使用的标记表示的特定杂交技术包括美国专利号：5,143,854；5,288,644；5,324,633；5,432,049；5,470,710；5,492,806；5,503,980；5,510,270；5,525,464；5,547,839；5,580,732；5,661,028；5,800,992；其公开内容以引用方式并入本文；以及WO95/21265；WO96/31622；WO97/10365；WO97/27317；EP373203；和EP785280。在这些方法中，将一系列“探针”核酸与如上所述的靶核酸接触，所述“探针”核酸包括针对每个表型决定基因的探针，其表达被检测。在杂交条件下进行接触，例如严格杂交条件，然后去除未结合的核酸。如本文所用，术语“严格检测条件”是指与产生核酸结合对相容的条件，例如表面结合和液相核酸，具有足够的互补性以在检测中提供所需水平的特异性，同时与互补性不足的结合成员之间形成结合对的相容性较差，无法提供所需的特异性。严格的检测条件是杂交和洗涤条件的总和或组合（总体）。
杂交核酸的所得模式提供了关于已被探测的每个基因的表达的信息，其中表达信息是关于基因是否表达以及通常在什么水平上表达数据，即标记表示（例如，以转录体的形式），可以是定性的和定量的。
或者，可以采用非基于阵列的方法来定量样品中一种或多种核酸的水平，包括那些基于扩增方案的方法，例如基于聚合酶链反应(PCR)的检测，包括定量PCR、逆转录PCR(RT-PCR)、实时PCR等。
所得数据提供了关于样品中已探测的每个标志物的水平的信息，其中信息是关于标志物是否存在以及通常处于什么水平，并且其中数据可以是定性的和定量。因此，当检测是定性的时，该方法提供目标标记物，例如核酸或蛋白质，是否存在于被分析的样品中的读数或评价，例如评估。在其他实施方案中，该方法提供了目标标志物是否存在于被分析的样品中的定量检测，即，评估或评估目标分析物例如样品中的核酸或蛋白质的实际量或相对丰度。被分析的样品。在此类实施方案中，定量检测可以是绝对的，或者如果该方法是检测样品中的两种或更多种不同分析物例如靶核酸或蛋白质的方法，则可以是相对的。因此，在对样品中的靶分析物定量例如核酸或蛋白质进行定量时，术语“定量”可以指绝对或相对定量。绝对定量可以通过包括已知浓度的一种或多种对照分析物并将目标分析物的检测水平与已知对照分析物参照（例如，通过物质的标准曲线）来实现。或者，可以通过比较两种或更多种不同目标分析物之间的检测水平或量来实现相对定量，以提供两种或更多种不同分析物中每一种的相对定量，例如，不同样本间的相对定量。
一旦确定了一种或多种子痫前期标志物的水平，可以以多种方式中的任一种分析检测结果以获得子痫前期标志物水平表示。
例如，可以单独分析一种或多种子痫前期标志物的检测结果以形成子痫前期概况。如本文所用，“子痫前期概况”是患者样品中一种或多种子痫前期标志物的标准化水平，例如，患者样品中血清学蛋白浓度的标准化水平。概况可以由许多本领域已知的方法。例如，每个标记的水平可以相对于所选管家基因的表达或相对于整个标志物的信号等进行log2转化和标准化。计算子痫前期概况的其他方法将为普通技术人员所熟知。
作为另一个例子，一组子痫前期标志物的检测可以被共同分析以获得单个子痫前期评分。“子痫前期评分”是指代表子痫前期标志物候选物集合中每个子痫前期标志物的加权水平的单个贡献度或度量值得分值。因此，在一些实施方案中，子痫前期的前期诊断风险进行分级包括检测样品中子痫前期组的标志物水平，并基于子痫前期标志物的加权水平计算子痫前期评分。患者样品的子痫前期评分可以通过本领域已知的用于计算生物标记评分的多种方法和算法中的任一种来计算。例如，加权标记水平，例如已通过例如将每个标准化标记水平乘以加权因子加权的log2转换和标准化标记水平可被总计并在某些情况下平均以获得代表所分析的子痫前期标记组的单个值。
在某些情况下，样本中每个标记的加权因子或简单的“权重”可以反映样品中分析物水平的变化。例如，每个子痫前期标志物的分析物水平可以进行对数转换并加权为1（对于那些在子痫前期中水平升高的标志物）或-1（对于那些在子痫前期中水平降低的标志物），并且增加的标记物和减少的标记物之间的比率决定了子痫前期的特征。在其他情况下，权重可以反映每个标志物对标志物组在进行诊断、预后或监测评估中的特异性、敏感性和/或准确性的重要性。这种权重可以通过任何方便的统计机器学习方法来确定，例如可以使用主成分分析(PCA)、线性回归、支持向量机(SVM)和/或从中获得样本的数据集的随机森林。在某些情况下，每个标记的权重由从中获得患者样本的数据集定义。在其他情况下，可以基于参考数据集或“训练数据集”定义每个标记的权重。
这些分析方法可以由本领域普通技术人员通过采用基于计算机的系统，例如：使用本领域已知的任何硬件、软件和数据存储介质，并采用任何便于这种分析的算法。例如，可以通过“云计算”、基于智能手机或基于客户端-服务器的平台等应用数据挖掘算法。
在某些实施例中，仅对一个标记物的表达水平(如多肽水平)进行评估以得到标记物的表达量。在其他实施例中，评估两个或两个以上的标记物水平，即一个候选标记物集合。因此，在子痫前期的前期诊断风险进行分级中，对样本中至少一个标记物的表达进行评估。在某些实施例中，所作的评估可视为本技术中所使用的蛋白质组的评估。
还提供了用于实施一种或多种上述方法的试剂、系统和试剂盒。主题试剂、系统和试剂盒可能有很大差异。所述试剂包括专门设计用于从样品产生子痫前期标志物的上述标志物水平表示的试剂，如样本稀释液、缓冲液、质控液、提取液等。例如，一种或多种检测元件，例如：用于检测蛋白质的抗体或肽、用于检测核酸的寡核苷酸等。在一些情况下，检测元件包括检测单个子痫前期标志物表达的试剂，例如，检测元件可以是试纸，包含一个或多个检测元件的板、阵列或混合物，例如可用于同时检测一种或多种子痫前期标志物表达的一种或多种抗体、一种或多种寡核苷酸、一组或多组PCR引物等。
一种类型的试剂是专门针对生成标记水平表示,如子痫前期标记水平表示,是一个集绑定专门蛋白质标记的抗体,如以ELISA的格式,在一个xMAP™微球的格式,在蛋白质组数组,流式细胞术分析悬架,通过western blotting,dot blotting，或者免疫组化。使用相同的方法在艺术中被很好地理解。这些抗体可以在溶液中提供。或者，它们可以预先与固体基质结合，例如，多孔皿的孔或xMAP微球的表面。
这种试剂的另一种类型是一组探针核酸，其中所研究的基因被表示出来。在该技术中，有各种不同的阵列格式，有各种不同的探针结构、衬底组成和附着技术(例如，点印迹阵列、微阵列等)。所述代表性阵列结构包括美国专利号:5,143,854;5288644;5324633;5432049;5470710;5492806;5503980;5510270;5525464;5547839;5580732;5661028;5800992;在此以参考方式纳入的披露；以及WO95/21265;WO96/31622;WO97/10365;WO97/27317;EP373203;和EP785280。
另一种专门用于生成基因标记水平表征的试剂，如子痫前期基因，是一组基因特异性引物，旨在选择性地扩增此类基因(如使用基于PCR的技术，如实时RT-PCR)。基因特异性引物及其使用方法在美国专利No.5,994,076中进行了描述，在此将其公开作为参考。
特别所述是探针阵列，引物集合，或抗体集合，包括探针、引物或抗体(也称为试剂)，这些探针、引物或抗体至少针对从瘦素（Lep）、神经酰胺（Cer) N-二十五酰-D-赤式-鞘氨醇如：d18:1/25:0、神经酰胺d18:1/26:0、或辅助因子/辅基血红素的生化底物。在某些实施例中，探针、引物或抗体的集合包括特定于瘦素的试剂、神经酰胺d18:1/25:0、神经酰胺d18:1/26:0以及特定于血红素的生化底物。受试者探针、引物或抗体收集或试剂可能包括仅针对上述列出的基因/蛋白质/脂类/辅助因子的试剂，也可能包括针对上述未列出的其他基因/蛋白质/脂类/辅助因子的试剂，如探针、引物、或针对表达模式已知与子痫前期相关的基因/蛋白质/脂类/辅助因子的特异性抗体，如sFlt-1(VEGF-RI)和PIGF。
在某些情况下，可能会提供一个系统。在本文中，术语“系统”是指试剂的集合，无论其如何汇编，例如，从同一或不同来源购买的试剂集合。在某些情况下，可能会提供一套工具包。这里使用的术语“试剂盒”是指所提供的试剂的集合，例如，销售的试剂的集合。例如，基于核酸或抗体的样本核酸或蛋白检测，可以分别与电化学生物传感器平台相结合，允许对这些生物标志物进行多重检测，用于个性化的子痫前期护理。
本发明的系统和试剂盒可包括上述阵列、基因特异性引物集合或蛋白特异性抗体集合。系统和工具可能会进一步包括一个或多个额外的试剂采用各种方法,如引物生成目标核酸、核苷酸和/或rNTPs，这可能是预先混合或单独的、一个或多个独特的标记核苷酸和/或rNTPs，如生物素化的或者Cy3Cy5标记核苷酸,具有不同散射光谱的金或银粒子，或其他合成后标记试剂，如荧光染料的化学活性衍生物，酶，如逆转录酶，DNA聚合酶，RNA聚合酶等，各种缓冲介质，如杂交和洗涤缓冲液，预制的探针阵列，标记探针纯化试剂及组分，如自旋柱等；信号产生及检测试剂，如标记二抗、链霉亲和素-碱性磷酸酶结合物、化学荧光或化学发光底物等。
除了上述组件之外，试剂盒将进一步包括用于实施主题方法的说明。这些说明可以多种形式存在于主题试剂盒中，其中一种或多种形式可以存在于试剂盒中。这些说明可以存在的一种形式是作为在合适的介质或基材上的印刷信息，例如，在其上印刷信息的一张或多张纸、在试剂盒的包装中、在包装插页中等。另一种方式是计算机可读介质，例如磁盘、CD等，其上已经记录了信息。另一种可能存在的方式是网站地址，该地址可以通过互联网用于访问已删除站点上的信息。试剂盒中可以存在任何方便的手段。
提供以下实施例以说明而非限制。
本发明标志物发现的研究分为样本设计、PE生物标志物发现、测试、验证和预测标志物构建步骤如图1所示。
ELISA检测候选PE标志物。检测血清Lep（瘦素），并对现在临床使用的可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1）及胎盘生长因子(PIGF)进行检测，以作为对照。采用夹心ELISA和竞争ELISA两种方法。对于夹心酶联免疫吸附法，将捕获抗体预涂在微孔板上，然后将标准品和血清样品加入微孔板的孔中与捕获抗体结合。在大量清洗以避免非特异性结合物后，将与辣根过氧化物酶(HRP)结合的第二种检测抗体加入到孔中。在大量清洗以去除任何未结合的抗体-酶试剂后，将HRP底物溶液和终止液添加到微孔板孔中。检测微孔板孔的光密度(OD)，OD与样品中存在的分析物的量成正比。根据标准曲线计算样品分析物浓度。对于竞争性ELISA，抗血清捕获抗体被预先包被到微孔板上。将恒定浓度的生物素化示踪剂(bt-示踪剂)和不同浓度的未标记标准肽或样品肽添加到孔中，并竞相与抗血清特异性结合。经过大量洗涤以避免非特异性粘结剂和去除非结合试剂后，将链霉亲和素结合的HRP加入到孔中，特异性结合bt示踪剂，添加底物后产生可溶的彩色产物。检测微孔板孔的光密度(OD)，OD与样品中存在的分析物的量成反比。
本发明使用两款试剂制成试剂盒，本试剂盒基于液相色谱-质谱技术和酶联免疫技术，对血清或血浆中的神经酰胺和瘦素进行检测。
神经酰胺试剂检验原理：试剂采用液相色谱-质谱检测技术（LC-MS/MS,UPLC-MS）测定人血清或血浆样本中神经酰胺的浓度。试剂盒以氘代神经酰胺为内标, 采用液相色谱-质谱技术直接对样本中的神经酰胺进行定量分析, 获得该神经酰胺及其内标的峰面积。并通过内标法建立标准曲线检测待测样本中神经酰胺浓度。
瘦素检验原理：试剂采用纯化抗瘦素(Leptin)包被的微孔板、酶标记抗-Leptin和Leptin参考品及其他试剂组成,应用双抗体夹心法原理(ELISA)检测人血清或血浆样本中瘦素的浓度。
其中试剂1为检验神经酰胺试剂，而试剂2为检验瘦素的试剂，其中试剂1由内标液（氘代神经酰胺）、校准品 (不同浓度的神经酰胺)、 质控品 (不同浓度的神经酰胺) 及稀释液 (甲醇和/或异丙醇)组成。其中校准品作为定量检测使用，而质控品作为验证数据可靠性使用。
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神经酰胺试剂检验方法：
1.试剂1配制
注意：液体试剂使用前需放在冰上完全解冻后涡旋混匀使用。
内标液(KA)的配制：在冰上, 在内标剂(KA)中准确加入 28 ml稀释液 (KL), 混匀, 得到神经酰胺(Cer(d7-d18:1/16:0),标示浓度均为5 nmol/L的内标液(KA), 备用。
2.样品处理
建议按照以下顺序对样本进行处理和进样分析：1个溶剂空白对照样本, 1个双空白对照样本, 1个单空白对照样本, 6个校准品(KB-KG), 1个溶剂空白对照样本, 4个质控品(KH-KK), 1个溶剂空白对照样本, 之后每1个质控血清样本后放置10个测定样本为一个循环（建议不要超过10个循环）, 最后放置1个质控血清样本, 4个质控品(KH-KK)和1个溶剂空白对照样本。可根据实际情况进行相应修改。
溶剂空白对照样本的配制：吸取 180 μL 稀释液(KL)供色谱进样分析。
双空白对照样本的配制：在冰上, 准确吸取 10 μL 稀释液(KN)于 1.5 ml 离心管中，加入 200 μL稀释液(KL), 涡旋混合 60 秒, 高速离心（12000 g, 4℃）5 分钟, 吸取 180 μL 上清液供色谱进样分析。
单空白对照样本的配制：在冰上, 准确吸取 10 μL 稀释液(KN)于 1.5 mL 离心管中，加入 200 μL 内标液(KA), 涡旋混合 60 秒, 高速离心（12000 g, 4℃）5 分钟, 吸取 180 μL 上清液供色谱进样分析。
校准品的配制：在冰上，分别准确吸取 10 μL 校准品(KB), (KC), (KD), (KE),(KF), (KG)于 1.5 ml 离心管中，分别加入 200 μL内标液(KA), 涡旋混合 60 秒, 高速离心（12000 g, 4℃）5 分钟, 吸取 180 μl 上清液供色谱进样分析。
质控品的配制：在冰上，分别准确吸取 10 μL质控品(KH), (KI), (KJ), (KK)于1.5 ml 离心管中；分别加入 10 μL稀释液 (KM)和 200 μL内标液(KA), 涡旋混合 60 秒,高速离心（12000 g, 4℃）5 分钟, 吸取180 μL上清液供色谱进样分析。
测定样本的准备：在冰上, 准确吸取 10 μL待测样本于 1.5 ml 离心管中，加入200 μL内标液(KA), 涡旋混合 60 秒, 高速离心（12000 g, 4℃）5 分钟, 吸取 180 μL上清液供色谱进样分析。
用质谱法检测PE标志物候选者。建立了高通量UPLC/MS/MS(超高效液相色谱-串联质谱联用法)检测血清神经酰胺水平的方法。
材料。校准标准神经酰胺d18:1/24:0和稳定同位素标记内标神经酰胺d18:1/24:0购自Avanti Lipids公司(Alabaster,AL)。HPLC级水、甲醇、2-丙醇和氯仿从FisherScientific(Pittsburgh,PA)中获得。分析级碳酸氢铵购自Sigma Aldrich(St.Louis,MO)。脱脂血清VD-DDC质谱仪金从Golden West Biological(Temecula,CA)获得。所有材料直接使用，无需进一步净化。
质谱MRM检测。在10mM碳酸氢铵存在下，以10μL/min的速度将0.50μM的相应标准品直接注射到质谱仪中，分别优化靶向神经酰胺和二氢神经酰胺的MRM检测。在质谱仪上，优化并记录了母离子m/z、子离子m/z、碰撞能量和射频透镜的SRM跃进。
样品制备。制备空白，将10 μL的脱脂血清加入10μL的2-丙醇，得到空白样品。用200 μL甲醇和内标工作液提取空白样品，分别得到双空白和单空白。在校准器的制备中，将10 μL的脱脂血清与10 μL的校准器工作液加标，得到相应水平的校准器。分别用200 μL内标工作溶液提取加标校准器，得到一套基于6个浓度水平的校准器。制备QC时，将10μL的脱脂血清与10 μL的QC工作液加标，得到相应水平的QC。分别用200 μL内标工作液提取加标后的QC，得到4个浓度水平的一套qc。血清样品的制备，将10 μL的未知样品加入10 μL的2-丙醇，用200 μL内标工作液提取。提取后，所有提取样品经强涡30秒，在4℃下12,000g高速离心5分钟。然后，从每个样品中取出180 μL上清液，转移到一个带有微插入物的自动进样器小瓶中进行LC/MS分析。（QC为质量控制样本）
质谱分析。样品制备后，将10μL的样品注入配备有ACEExcelSuperC18色谱柱的Thermo Ultimate 3000 UPLC系统中(1.7m,100mm2.1mm;MAC-MOD分析，Chadds,PA)。流动相由甲醇和2-丙醇的混合物以1:1的比例组成，用10mM的碳酸氢铵缓冲。采用5分钟等径洗脱程序进行色谱分离。LC洗脱液在前1.0分钟直接进入废物，然后在1.1到5分钟切换回电喷雾界面，允许目标神经酰胺和二氢神经酰胺依次洗脱、电离和被系统检测。流速恒定在0.3mL/min，自动进样器和柱箱温度分别保持在4℃和30℃。质谱仪在预定的多反应监测(MRM)模式下运行，以连续获取LC洗脱液的数据。保留时间依赖的数据采集使用预定义的不同宽度的保留时间窗口(中链1.2分钟，长链和二氢神经酰胺1.5分钟)来记录目标分析物的提取离子色谱图(EIC)。
定量。色谱峰积分和分析物定量采用X Calibur4.0软件包。定量离子的IS归一化峰面积比与定标器中的加标浓度进行对比，建立基于6个水平的校准曲线。采用加权因子为1/x2的线性回归拟合进行标定。然后，在相关系数的平方上设置>=0.99的截止值，以确保校准曲线定量合格。然后将目标物的IS归一化峰面积比代入相应的标定曲线，得到空白、QC和血清样品中绝对定量浓度。
统计分析。采用“流行病学计算器”(R epicalc包)对患者的人口学和临床资料进行分析。对连续变量采用学生t检验和Mann-Whitney u检验计算p值，对分类变量采用Fisher精确检验和卡方检验进行比较分析。通过文献复习确定一组子痫前期的临床危险因素，并通过单因素和多因素分析探讨其对子痫前期诊断的影响。血清蛋白统计分析提供了对每种分析物鉴别PE和正常妊娠对照受试者的能力的总体效果估计。假设检验使用学生t检验(双尾)和Mann-Whitney u检验(双尾)，以及local FDR(Efron et al. Empiricalbayes analysis of microarray experiment. J Am Stat Assoc 2001;96:1151 -60）来纠正多个假设检验问题。通过ROC曲线分析评估每个生物标志物标志物分析的预测性能(Zweig et al.)。受试者工作特征(ROC)图:临床医学的基本评价工具。生物标志物组评分定义为孕妇循环中各自上调和下调蛋白生物标志物的几何平均值之间的比值的自然对数。由Lep、APO-A1、FGA、pikachurin和PlFG组成的复合标志物作为PE分类标志物，以Lep与神经酰胺的比值d18:1/25:0或Lep与神经酰胺的比值d18:1/26:0计算得分，并通过ROCAUC表现进行评价。sFlt1与PlGF的比值作为参考。
探索和验证PE标志物候选者的研究设计。如图1所示，在确诊后收集PE患者血清样本的发现队列(PE=32,control=32)中，检测Lep、Cer以及Lep与Cer的比值，并探讨标志物的二元分类性能和比值。然后在一个独立的纵向队列(PE=20，对照组=20)上检测血清中Lep、Cer的水平以及Lep与Cer的比值，并评估它们在确诊PE前评估PE的表现。sFlt1与PlGF的比值作为参考生物标志物。
如图10所示，评估发现队列中用于PE评估的生物标志物。分别检测了28种神经酰胺和二氢神经酰胺（DHCer）的水平，包括Cer d18:1/14:0、Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:1、Cer d18:1/17:0、Cer d18:0/16:0、Cer d18:1/18:0、DHCer d18:0/18:1、DHCer d18:0/18:0、Cer d18:1/20:0、Cer d18:1/22:0、Cer d18:1/24:1、DHCer d18:0/24:1、Cer d18:1/24:0、Cer d18:1/20:1、Cer d18:1/22:1、Cer d18:1/24:2、Cer d18:1/21:0、DHCer d18:0/20:0、DHCer d18:0/21:0、DHCer d18:0/22:0、Cer d18:1/23:0、DHCer d18:0/23:0、Cerd18:1/25:0、Cer d18:1/26:0、DHCer d18:0/25:0、DHCer d18:0/26:0、Cer d18:1/14:0、Lep。PE患者的Lep在妊娠24-28周显著上调(P=0.02;褶皱的变化=3.3;图2).Cerd18:1/25:0和d18:1/26:0在24-28周轻微下调(变异倍数=0.8;图2)。PE患者的Lep/Cerd18:1/25:0比值和Lep/Cerd18:1/26:0比值在妊娠24-33周时均显著升高(P=0.02;图3)。在24-33周时，比值的AUC均为0.83。
评估测试队列中即将进行PE评估的生物标志物。为了确定PE血清学蛋白组是否能够开发一种即时实用的临床工具，我们使用纵向队列对Lep和两种Cer进行了检测，在5-29周内收集样本，并在确诊PE之前进行检测。PE患者Lep在10-14周(P=0.02)和15-25周(P=3×10-6)显著上调(图4)。Cerd18:1/25:0和d18:1/26:0在5-29周内下调。在16-20周(P=0.004,18:1/25:0,P=0.0009,18:1/26:0和21-29周(P=0.002,18:1/25:0,P=0.0009,P=0.0009)，PE患者与对照组之间的差异有统计学意义。在妊娠5-29周期间，PE患者与对照组的BMI归一化Lep/Cerd18:1/25:0比值有显著差异：5-11周P=0.005;P=5×10-4在12-15周和16-20周;21-29周P=6×10-4。BMI归一化Lep/Cerd18:1/26:0比值有相似的趋势：5-11周P=0.02;12-15周P=0.001;16-20周P=7×10-4;在21-29周时，P=4×10-4。BMI归一化Lep/Cer比值的AUC在12-15周时达到峰值d18:1/25:0为0.95,d18:1/26:0为0.93;图6)。与sFlt-1/PlGF比值的参考点相比，BMI归一化的Lep/Cer比值的AUC明显更好(P=0.002Lep/Cerd18:1/25:0;P=0.001Lep/Cerd18:1/26:0)（图5）。
测试队列中。20例患者中有17例确诊为PE。17个患者中，9例(52.9%)被确定由BMI归一化的Lep/Cer18:1/25:0比率>23周证实的PE的诊断前，和16个(94.1%)被确定>15周之前确定的PE的诊断(图6) 。均值±SD的识别和诊断之间的差距为23.9±4.0周。与参考点sFlt-1/PlGF在确诊前15周>仅识别4例患者相比，Lep/Cerd18:1/25:0比值能够更早地预测PE(P=0.01) (图6)。
标志物的性能验证：敏感性、特异性、PPV和NPV。本发明标志物和现有临床标志物进行对比，对敏感性、特异性、PPV和NPV进行分析。结果显示，本发明标志物的检测性能均优于现有技术（图7）。从区分能力上进行比较，本发明标志物的检测性能均优于现有技术（P<0.01 vs P=0.2）（图8）。同时，将单独使用Lep、Cer以及Lep/Cer比值分别作为标志物进行子痫前期预测的方法性能比较，从P值、倍率差异和AUC三个方面，Lep/Cer比值明显优于单独使用（图9）。
同时对前期挖掘的多种Cer标志物在患子痫前期者和非子痫前期者中的浓度进行对比，多数Cer都具有良好的区分度，是作为标志物的依据之一（图10、图11）。
最终试验结果：
Lep在孕妇血清内的正常参考区间范围为
孕期 单位 μg/L
1～12周 8.10 <λ≤13.90
12～24周 10.00 <λ≤14.80
24～36周 14.20 <λ≤21.00
Lep在患者血清内的参考区间范围为:
孕期 单位 μg/L
1～12周 15.80 <λ≤27.70
12～24周 19.60 <λ≤30.70
24～36周 19.20 <λ≤33.10
神经酰胺N-二十五酰-D-赤式-鞘氨醇（Cer d18:1/25:0）在孕妇血清内的正常参考区间分别为：
孕期 单位 μg/L
1～12周 58.50 <λ≤96.90
12～24周 67.10 <λ≤94.10
24～36周 72.20 <λ≤103.20
神经酰胺N-二十五酰-D-赤式-鞘氨醇（Cer d18:1/25:0）在患者血清内的参考区间分别为：
孕期 单位 μg/L
1～12周 47.30 ≤λ≤61.60
12～24周 46.00≤λ≤60.30
24～36周 45.30 ≤λ≤63.40
Lep与Cer d18:1/25:0的比值在孕妇血清内的正常参考区间分别为：
孕期 浓度比值
1～12周 0.11<ξ ≤0.24
12～24周 0.13<ξ≤0.19
24～36周 0.17<ξ≤0.28
Lep与Cer的比值在患者内的参考区间分别为：
孕期 浓度比值
1～12周 0.24≤ξ ≤0.56
12～24周 0.19≤ξ ≤0.59
24～36周 0.28≤ξ ≤0.77
本发明首次发现了与子痫前期相关的生物标记物瘦素与神经酰胺两者比值，通过检测受试者瘦素与神经酰胺两者比值水平的变化，来实现子痫前期的早期风险评估。可用于孕期评估子痫前期患病风险，具有较高的准确性，为子痫前期早期预测及精准预防提供了一种有效的方法。可在发病早期对有子痫前期风险的孕妇进行及时、准确的辅助诊断，帮助临床对患者进行密切监测、及时进行有效干预以控制病情、延长孕周，对于降低子痫前期发病率与死亡率、保障母婴安全具有重要意义。一旦确定子痫前期的诊断，该妇女就可以接受有助于改善子痫前期的程序。此类程序的示例包括但不限于降低血压的药物、皮质类固醇的使用、抗惊厥药物（例如硫酸镁）、卧床休息以及如果诊断是在37孕周或之后做出的考虑分娩。
本领域技术人员会理解，本发明不限于这里的实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。

Claims (10)

1.检测样品中两种生物标志物的表达水平的试剂在制备用于检测子痫前期试剂盒中的应用，其中两种生物标志物分别为瘦素及神经酰胺，其中通过测定瘦素与神经酰胺的表达的比值确立子痫前期的风险。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
包括如下步骤：
(1)准备取自受试者的待测样品；
(2)对步骤(1)的待测样品中的瘦素与神经酰胺进行定量测定，得到两者比值水平；
(3)将步骤(2)中得到的比值水平和阈值水平进行比较，所述比值水平高于阈值水平，则判断所述受试者伴有子痫前期。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：瘦素与神经酰胺的比值的阈值水平分别为：孕期小于12周：0.24；孕期12-24周：0.19；孕期25-36周：0.28。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述受试者伴有子痫前期，瘦素在受试者血清内的范围分别为: 孕期小于12周：15.8-27.7μg/L；孕期12-24周：19.6-30.7μg/L；孕期24-36周：19.2-33.1μg/L。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述受试者伴有子痫前期，神经酰胺在受试者血清内的范围分别为：孕期小于12周：47.3-61.6μg/L；孕期12-24周：46.0-60.3μg/L；孕期25-36周：45.3-63.4μg/L。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述受试者伴有子痫前期，其瘦素与神经酰胺两者比值的水平为：孕期小于12周：0.30-0.56；孕期12-24周：0.41-0.59；孕期25-36周：0.35-0.77。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的应用，其特征在于，所述神经酰胺为神经酰胺d18:1/14:0、神经酰胺d18:1/16:0、神经酰胺d18:1/18:1、神经酰胺d18:1/17:0、神经酰胺d18:0/16:0、神经酰胺d18:1/18:0、二氢神经酰胺d18:0/18:1、二氢神经酰胺d18:0/18:0、神经酰胺d18:1/20:0、神经酰胺d18:1/22:0、神经酰胺d18:1/24:1、二氢神经酰胺d18:0/24:1、神经酰胺d18:1/24:0、神经酰胺d18:1/20:1、神经酰胺d18:1/22:1、神经酰胺d18:1/24:2、神经酰胺d18:1/21:0、二氢神经酰胺d18:0/20:0、二氢神经酰胺d18:0/21:0、二氢神经酰胺d18:0/22:0、神经酰胺d18:1/23:0、二氢神经酰胺d18:0/23:0、神经酰胺d18:1/25:0、神经酰胺d18:1/26:0、二氢神经酰胺d18:0/25:0、二氢神经酰胺d18:0/26:0、神经酰胺d18:1/14:0中的一种或多种。
8.根据权利要求1-6任意一项所述的应用，其特征在于，其中所述样品选自血液样品、血清样品、血浆样品和尿液样品或任何上述样品的提取物。
9.权利要求1-6任意一项所述的应用，用于制备对子痫前期的前期风险进行分级的诊断试剂。
10.权利要求2-6任意一项所述的应用，其所述受试者为：
（a）有子痫前期病史；
（b）35岁以上；
（c）多胎妊娠；
（d）初产妇；
（e）生育间隔在两年以下或者十年以上者；
（f）患有肥胖症；
（g）有慢性高血压、偏头痛、1型或2型糖尿病、肾病、血栓形成倾向或狼疮病史；
以上情况的一种或几种。
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