KR20180105156A - 비알코올성 지방간 질환 (nafld)과 비알코올성 지방간염 (nash) 생물마커 및 이들의 용도 - Google Patents

비알코올성 지방간 질환 (nafld)과 비알코올성 지방간염 (nash) 생물마커 및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

개체가 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD), 그리고 더욱 특정하게는, 지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및 섬유증의 연관된 장애 중에서 하나 또는 그 이상을 앓는 지를 결정하기 위한 방법, 조성물 및 키트가 제공된다. 개체가 비알코올성 지방증을 앓는 지를 결정하기 위한 방법, 조성물 및 키트 역시 제공된다. 개체가 비알코올성 지방간염 (NASH)을 앓는 지를 결정하기 위한 방법, 조성물 및 키트 역시 제공된다.

Description

비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)과 비알코올성 지방간염 (NASH) 생물마커 및 이들의 용도
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2016년 2월 8일자 제출된 US 가출원 번호 62/292,582 및 2016년 7월 13일자 제출된 US 가출원 번호 62/362,019에 우선권을 주장하고, 이들은 각각 어떤 목적으로든 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
발명의 분야
본 출원은 예로서, 지방증 및 비알코올성 지방간염 (NASH)을 앓는 개체를 확인하기 위해, 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)의 생물마커 검출 및 특징화에 전반적으로 관계한다. 다양한 구체예에서, 본 발명은 개체에서 NAFLD 및 NASH를 특징짓기 위한 하나 또는 그 이상의 생물마커, 방법, 장치, 시약, 시스템 및 키트에 관계한다.
배경
다음 설명은 정보의 요약을 제공하고, 그리고 제공된 임의의 정보 또는 본원에서 참조된 임의의 간행물이 본 출원의 선행 기술이라는 것을 시인하는 것이 아니다.
비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)은 알코올 병력의 부재에서, 염증 및 섬유증이 있거나 또는 없는 간 지방증의 존재로서 규정된다. NAFLD는 비알코올성 지방간 (NAFL) 및 비알코올성 지방간염 (NASH)으로 세분된다. NAFL에서, 간 지방증은 유의미한 염증의 증거 없이 존재하고, 반면 NASH에서, 간 지방증은 알코올성 지방간염과 조직학적으로 구별하기 어려울 수 있는 간 염증과 연관된다.
NAFLD는 전 세계적으로 유행되고 있고, 그리고 비만의 급속히 증가하는 유병률의 결과로서, 북아메리카에서 간 질환의 주도적인 원인이다. 하지만, NAFL 및 NASH의 발생에 관한 정확한 개체군-기초된 데이터는 부분적으로, 진단이 조직병리학적 문서화를 필요로 하기 때문에 희소하다. NAFLD에 대한 주요 위험 요인은 내장 비만, 2형 당뇨병, 혈액 내에 높은 수준의 트리글리세리드 (지방), 그리고 높은 혈압이다. U.S.에서, NAFLD는 개체군의 20-40%에서 존재하고, 그리고 NASH는 비만한 개체군의 약 25%에서 존재한다. NASH 환자 중에서 10 내지 29 퍼센트는 간경변이 발달하고, 그리고 이들 중에서 4-27%는 간암이 발달한다.
NASH를 앓는 대부분의 사람은 증상이 없다. 일부는 우상측 사분면 통증, 간비대, 또는 비특이적 증상, 예를 들면, 복부 불편, 허약, 피로 또는 권태감을 가질 수 있다. 의사 또는 간호사는 일과적인 혈액 검사의 결과로부터 NASH의 존재를 의심할 수 있다. NAFLD에서, 간 효소 아스파르테이트 아미노전달효소 (AST) 및 알라닌 아미노전달효소 (ALT)가 종종 높다.
NASH를 확증하기 위한 현재 최적 표준은 간 생검의 조직학적 평가인데, 이것은 값비싸고, 침습성이고, 그리고 통증, 출혈, 또는 심지어 사망을 유발할 수 있다.
NAFLD 및 NASH 둘 모두의 다양한 시기를 확인하고 식별하는 (그리고 따라서, 간 생검에 대한 요구를 감소시키는) 단순한 혈액 검사가 매우 바람직할 것이다.
요약
일부 구체예에서, 개체가 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)을 앓는 지를 결정하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 지방증을 앓는 개체를 확인하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 지방증의 심각도를 결정하는 방법이 제공된다.
일부 구체예에서, 개체가 비알코올성 지방간염 (NASH)을 앓는 지를 결정하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, NASH를 앓는 개체를 확인하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, NASH를 앓는 개체를 지방증을 앓는 개체로부터 식별하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, NASH의 심각도를 결정하는 방법이 제공된다.
일부 구체예에서, 본원에서 방법은 개체가 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)을 앓는 지를 결정하기 위한 것이고, 상기 방법은 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 생물마커 단백질로부터 N 생물마커 단백질을 갖는 생물마커 패널을 형성하고, 그리고 개체로부터 표본 내에 상기 패널의 N 생물마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 N은 최소한 5이다. 일부 구체예에서, N은 5 내지 10이거나, 또는 N은 6 내지 10이거나, 또는 N은 7 내지 10이거나, 또는 N은 8 내지 10이거나, 또는 N은 9 내지 10이거나, 또는 N 최소한 6이거나, 또는 N 최소한 7이거나, 또는 N 최소한 8이거나, 또는 N 최소한 9이다. 일부 구체예에서, N은 5이거나, 또는 N은 6이거나, 또는 N은 7이거나, 또는 N은 8이거나, 또는 N은 9이거나, 또는 N은 10이다.
일부 구체예에서, 개체가 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)을 앓는 지를 결정하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 개체로부터 표본 내에 ITGA1/ITGB1의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 대조 수준보다 높은 ITGA1/ITGB1의 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시한다. 일부 구체예에서, 개체가 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)을 앓는 지를 결정하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 개체로부터 표본 내에 HSP90AA1/HSP90AB1의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 대조 수준보다 높은 HSP90AA1/HSP90AB1의 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시한다. 일부 구체예에서, 개체가 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)을 앓는 지를 결정하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 개체로부터 표본 내에 ITGA1/ITGB1 및 HSP90AA1/HSP90AB1의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 대조 수준보다 높은 ITGA1/ITGB1의 수준 및/또는 HSP90AA1/HSP90AB1의 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체로부터 표본 내에 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, KYNU, POR 및 THBS2에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 또는 최소한 7개의 생물마커의 수준을 검출하는 것을 더욱 포함하고, 여기서 개별 생물마커의 대조 수준보다 높은 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, KYNU, POR 및 THBS2에서 선택되는 최소한 하나의 생물마커의 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, COLEC11 및 THBS2의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체에서 AST 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 상승된 AST 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시한다.
일부 구체예에서, 본원에서 방법은 개체가 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)을 앓는 지를 결정하기 위한 것이고, 상기 방법은 개체로부터 표본 내에 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 THBS2에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 최소한 10개, 또는 11개의 생물마커의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 개별 생물마커의 대조 수준보다 높은 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 THBS2에서 선택되는 최소한 하나의 생물마커의 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 HSP90AA1/HSP90AB1 또는 ITGA1/ITGB1, 또는 HSP90AA1/HSP90AB1 및 ITGA1/ITGB1 둘 모두의 수준을 검출하는 것을 포함한다.
본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 상기 방법은 개체가 지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및/또는 섬유증을 앓는 지를 결정하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 방법은 개체가 지방증을 앓는 지를 결정하기 위한 것이고, 상기 방법은 ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 및 CSF1R에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 또는 7개의 생물마커를 포함하는 생물마커 패널을 제공하고; 개체가 지방증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 지방증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 이들 생물마커의 수준을 검출하여 상기 생물마커 패널 내에 생물마커에 상응하는 생물마커 값을 제공하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 방법은 개체가 지방증을 앓는 지를 결정하기 위한 것이고, 상기 방법은 개체가 지방증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 지방증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 및 CSF1R에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 또는 7개의 생물마커를 검출하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 생물마커 패널은 ACY1, KNYU, 그리고 ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 및 CSF1R에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 또는 5개의 추가 생물마커를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 ACY1, KNYU, 그리고 ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 및 CSF1R에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 또는 5개의 추가 생물마커를 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1 및 CSF1R에서 선택되는 최소한 하나의 생물마커를 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 ACY1, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, POR, THBS2 및 KYNU에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 또는 6개의 생물마커를 검출하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 방법은 개체가 소엽 염증을 앓는 지를 결정하기 위한 것이고, 상기 방법은 ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B 및 POR에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 또는 8개의 생물마커를 포함하는 생물마커 패널을 제공하고; 개체가 소엽 염증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 소엽 염증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 이들 생물마커의 수준을 검출하여 상기 생물마커 패널 내에 생물마커에 상응하는 생물마커 값을 제공하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 방법은 개체가 소엽 염증을 앓는 지를 결정하기 위한 것이고, 상기 방법은 개체가 소엽 염증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 소엽 염증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B 및 POR에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 또는 8개의 생물마커를 검출하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 생물마커 패널은 ACY1, THBS2, COLEC11, 그리고 ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B 및 POR에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 또는 5개의 추가 생물마커를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 ACY1, THBS2, COLEC11, 그리고 ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B 및 POR에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 또는 5개의 추가 생물마커를 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 ITGA1/ITGB1을 검출하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 방법은 개체가 간세포 팽창을 앓는 지를 결정하기 위한 것이고, 상기 방법은 ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, C7, POR, LGALS3BP 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 또는 8개의 생물마커를 포함하는 생물마커 패널을 제공하고; 개체가 간세포 팽창을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 간세포 팽창을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 이들 생물마커의 수준을 검출하여 상기 생물마커 패널 내에 생물마커에 상응하는 생물마커 값을 제공하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 방법은 개체가 간세포 팽창을 앓는 지를 결정하기 위한 것이고, 상기 방법은 개체가 간세포 팽창을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 간세포 팽창을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, C7, POR, LGALS3BP 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 또는 8개의 생물마커를 검출하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 생물마커 패널은 ACY1, COLEC11, THBS2, 그리고 ITGA1/ITGB1 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 최소한 1개 또는 2개의 추가 생물마커를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 ACY1, COLEC11, THBS2, 그리고 ITGA1/ITGB1 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 최소한 1개 또는 2개의 추가 생물마커를 검출하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 방법은 개체가 섬유증을 앓는 지를 결정하기 위한 것이고, 상기 방법은 C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 DCN에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 최소한 10개, 최소한 11개, 최소한 12개, 최소한 13개, 또는 14개의 생물마커를 포함하는 생물마커 패널을 제공하고; 개체가 섬유증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 섬유증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 이들 생물마커의 수준을 검출하여 상기 생물마커 패널 내에 생물마커에 상응하는 생물마커 값을 제공하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 방법은 개체가 섬유증을 앓는 지를 결정하기 위한 것이고, 상기 방법은 개체가 섬유증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 섬유증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 DCN에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 최소한 10개, 최소한 11개, 최소한 12개, 최소한 13개, 또는 14개의 생물마커를 검출하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 생물마커 패널은 C7, COLEC11, THBS2, 그리고 ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1 및 DCN에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 또는 3개의 추가 생물마커를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 C7, COLEC11, THBS2, 그리고 ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1 및 DCN에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 또는 3개의 추가 생물마커를 검출하는 것을 포함한다.
본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 개체는 지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및/또는 섬유증이 발달할 위험에 처해있다.
본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 개체는 NAFLD이 발달할 위험에 처해 있을 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 개체는 지방증이 발달할 위험에 처해 있을 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 개체는 NASH가 발달할 위험에 처해 있을 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 개체는 비만, 복부 비만, 대사 증후군, 심혈관 질환 및 당뇨병에서 선택되는 NAFLD 동시이환을 앓을 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 개체는 비만일 수 있다.
본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 최소한 하나의 생물마커는 단백질 생물마커일 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 각 생물마커는 단백질 생물마커일 수 있다. 일부 구체예에서, 방법은 개체로부터 표본의 생물마커를 한 세트의 생물마커 포획 시약과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 생물마커 포획 시약의 세트의 각 생물마커 포획 시약은 검출되는 상이한 생물마커에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 각 생물마커 포획 시약은 항체 또는 앱타머이다. 일부 구체예에서, 각 생물마커 포획 시약은 앱타머이다. 일부 구체예에서, 최소한 하나의 앱타머는 느린 오프 레이트 앱타머이다. 일부 구체예에서, 최소한 하나의 느린 오프 레이트 앱타머는 변형을 갖는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 또는 최소한 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 각 느린 오프 레이트 앱타머는 ≥ 30 분, ≥ 60 분, ≥ 90 분, ≥ 120 분, ≥ 150 분, ≥ 180 분, ≥ 210 분, 또는 ≥ 240 분의 오프 레이트 (t½)로 이의 표적 단백질에 결합한다.
본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 표본은 혈액 표본일 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 표본은 혈청 표본 및 혈장 표본에서 선택될 수 있다.
본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 개체가 NAFLD 또는 NASH를 앓으면, 개체는 체중 감소, 혈당 제어 및 알코올 회피에서 선택되는 섭생이 권장될 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 개체가 NAFLD 또는 NASH를 앓으면, 개체는 위 우회로 조성술이 권장될 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 개체가 NAFLD 또는 NASH를 앓으면, 개체는 피오글리타존, 비타민 E 및 메트포르민에서 선택되는 최소한 하나의 치료적 작용제가 처방될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 방법은 의료보험료 또는 생명보험료를 결정하는 것을 목적으로 한다. 일부 구체예에서, 방법은 의료보험료 또는 생명보험료를 결정하는 것을 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 방법은 상기 방법으로부터 발생하는 정보를 이용하여 의학적 자원의 활용을 예측하고 및/또는 관리하는 것을 더욱 포함한다.
일부 구체예에서, 키트가 제공된다. 일부 구체예에서, 키트는 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 THBS2에서 선택되는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 최소한 10개, 또는 11개의 앱타머를 포함한다.
일부 구체예에서, 키트는 ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 및 CSF1R에서 선택되는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 또는 7개의 앱타머를 포함한다.
일부 구체예에서, 키트는 ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B 및 POR에서 선택되는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 또는 8개의 앱타머를 포함한다.
일부 구체예에서, 키트가 제공되고, 여기서 상기 키트는 ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, C7, POR, LGALS3BP 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 또는 8개의 앱타머를 포함한다.
일부 구체예에서, 키트는 C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 DCN에서 선택되는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 최소한 10개, 최소한 11개, 최소한 12개, 최소한 13개, 또는 14개의 앱타머를 포함한다. 본원에서 구체예 중에서 한 가지에서, 각 앱타머는 상이한 표적 단백질에 결합한다.
본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 최소한 하나의 앱타머는 느린 오프 레이트 앱타머일 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 각 앱타머는 느린 오프 레이트 앱타머일 수 있다. 일부 구체예에서, 최소한 하나의 느린 오프 레이트 앱타머는 소수성 변형을 갖는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 또는 최소한 10개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 각 느린 오프 레이트 앱타머는 ≥ 30 분, ≥ 60 분, ≥ 90 분, ≥ 120 분, ≥ 150 분, ≥ 180 분, ≥ 210 분, 또는 ≥ 240 분의 오프 레이트 (t½)로 이의 표적 단백질에 결합한다.
일부 구체예에서, 조성물이 제공된다. 일부 이런 구체예에서, 조성물은 개체로부터 표본의 단백질, 그리고 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 THBS2에서 선택되는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 최소한 10개, 또는 11개의 앱타머를 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은 개체로부터 표본의 단백질, 그리고 ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 및 CSF1R에서 선택되는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 또는 7개의 앱타머를 포함한다.
일부 구체예에서, 개체로부터 표본의 단백질, 그리고 ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B 및 POR에서 선택되는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 또는 8개의 앱타머를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 구체예에서, 각 앱타머는 상이한 표적 단백질에 결합한다.
일부 구체예에서, 개체로부터 표본의 단백질, 그리고 ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, C7, POR, LGALS3BP 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 또는 8개의 앱타머를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 구체예에서, 개체로부터 표본의 단백질, 그리고 C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 DCN에서 선택되는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 최소한 10개, 최소한 11개, 최소한 12개, 최소한 13개, 또는 14개의 앱타머를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 구체예에서, 각 앱타머는 상이한 표적 단백질에 특이적으로 결합한다.
본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 표본은 혈액 표본일 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 표본은 혈청 표본 및 혈장 표본에서 선택될 수 있다.
본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 최소한 하나의 앱타머는 느린 오프 레이트 앱타머일 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 각 앱타머는 느린 오프 레이트 앱타머일 수 있다. 일부 구체예에서, 최소한 하나의 느린 오프 레이트 앱타머는 소수성 변형을 갖는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 또는 최소한 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 각 느린 오프 레이트 앱타머는 ≥ 30 분, ≥ 60 분, ≥ 90 분, ≥ 120 분, ≥ 150 분, ≥ 180 분, ≥ 210 분, 또는 ≥ 240 분의 오프 레이트 (t½)로 이의 표적 단백질에 결합한다.
본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 각 생물마커는 단백질 생물마커일 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 상기 방법은 개체로부터 표본의 생물마커를 한 세트의 생물마커 포획 시약과 접촉시키는 것을 포함할 수 있고, 여기서 생물마커 포획 시약의 세트의 각 생물마커 포획 시약은 검출되는 생물마커에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 생물마커 포획 시약의 세트의 각 생물마커 포획 시약은 검출되는 상이한 생물마커에 특이적으로 결합한다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 각 생물마커 포획 시약은 항체 또는 앱타머일 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 각 생물마커 포획 시약은 앱타머일 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 최소한 하나의 앱타머는 느린 오프 레이트 앱타머일 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 최소한 하나의 느린 오프 레이트 앱타머는 변형을 갖는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 또는 최소한 10개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 변형은 소수성 변형이다. 일부 구체예에서, 변형은 소수성 염기 변형이다. 일부 구체예에서, 변형 중에서 하나 또는 그 이상은 도면 11에서 도시된 변형에서 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 각 느린 오프 레이트 앱타머는 ≥ 30 분, ≥ 60 분, ≥ 90 분, ≥ 120 분, ≥ 150 분, ≥ 180 분, ≥ 210 분, 또는 ≥ 240 분의 오프 레이트 (t½)로 이의 표적 단백질에 결합한다.
본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 표본은 혈액 표본일 수 있다. 일부 구체예에서, 혈액 표본은 혈청 표본 및 혈장 표본에서 선택된다.
본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 조성물에서 표본은 혈액 표본일 수 있다. 일부 구체예에서, 혈액 표본은 혈청 표본 및 혈장 표본에서 선택된다.
본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 키트 또는 조성물은 느린 오프 레이트 앱타머인 최소한 하나의 앱타머를 포함할 수 있다. 본원에서 설명된 구체예 중에서 한 가지에서, 키트 또는 조성물의 각 앱타머는 느린 오프 레이트 앱타머일 수 있다. 일부 구체예에서, 최소한 하나의 느린 오프 레이트 앱타머는 변형을 갖는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 또는 최소한 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 변형을 갖는 최소한 하나의 뉴클레오티드는 소수성 염기 변형을 갖는 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 변형을 갖는 각 뉴클레오티드는 소수성 염기 변형을 갖는 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 각 소수성 염기 변형은 도면 11에서 변형에서 독립적으로 선택된다. 일부 구체예에서, 키트에서 각 느린 오프 레이트 앱타머는 ≥ 30 분, ≥ 60 분, ≥ 90 분, ≥ 120 분, ≥ 150 분, ≥ 180 분, ≥ 210 분, 또는 ≥ 240 분의 오프 레이트 (t½)로 이의 표적 단백질에 결합한다.
도면의 간단한 설명
도면 1은 실시예 2에서 설명된 바와 같이, 지방증 분류기의 안정성 선별 통로를 보여준다.
도면 2는 실시예 2에서 설명된 바와 같이, 지방증에 대한 9가지 생물마커 분류기의 ROC 곡선을 보여준다.
도면 3은 실시예 2에서 설명된 바와 같이, 지방증에 대한 9-마커 랜덤 포레스트 분류기에 대한 부류에 의한 투표를 보여준다.
도면 4는 실시예 2에서 설명된 바와 같이, 지방증에 대한 9-마커 분류기에서 각 생물마커에 대한 누적 분포 함수를 보여준다.
도면 5는 실시예 2에서 설명된 바와 같이, NASH (섬유증) 분류기의 안정성 선별 통로를 보여준다.
도면 6은 실시예 2에서 설명된 바와 같이, NASH (섬유증)에 대한 4가지 생물마커 분류기의 ROC 곡선을 보여준다.
도면 7은 실시예 2에서 설명된 바와 같이, 개체 군 각각에서 NASH (섬유증)에 대한 4-마커 분류기에 대한 상자 플롯을 보여준다.
도면 8은 실시예 2에서 설명된 바와 같이, NASH (섬유증)에 대한 4-마커 분류기에서 각 생물마커에 대한 누적 분포 함수를 보여준다.
도면 9는 본원에서 설명된 다양한 컴퓨터-실행된 방법용으로 무제한적 예시적인 컴퓨터 시스템을 도해한다.
도면 10은 생물학적 표본에서 하나 또는 그 이상의 생물마커를 검출하는데 이용될 수 있는 무제한적 예시적인 앱타머 검정을 도해한다.
도면 11은 앱타머, 예를 들면, 느린 오프 레이트 앱타머 내로 통합될 수 있는 일정한 예시적인 변형된 피리미딘을 보여준다.
도면 12는 실시예 5에서 설명된 바와 같이, 개체 군 각각에서 지방증에 대한 8-마커 분류기에 대한 상자 플롯을 보여준다.
도면 13은 실시예 5에서 설명된 바와 같이, 개체 군 각각에서 섬유증에 대한 8-마커 분류기에 대한 상자 플롯을 보여준다.
도면 14는 실시예 5에서 설명된 바와 같이, NASH (섬유증)에 대한 4-마커 분류기에서 각 생물마커에 대한 누적 분포 함수를 보여준다.
도면 15는 실시예 6에서 설명된 바와 같이, 실제 표본 군에 따라, 은닉 해제 후 맹검 표본에 대한 지방증에 대한 8-마커 분류기의 상자 플롯을 보여준다.
도면 16은 실시예 6에서 설명된 바와 같이, 발견 세트 및 맹검 검증 세트에 대한 8-마커 지방증 분류기 성과에 대한 ROC 곡선을 보여준다.
도면 17은 실시예 6에서 설명된 바와 같이, 실제 표본 군에 따라, 은닉 해제 후 맹검 표본에 대한 섬유증에 대한 8-마커 분류기의 상자 플롯을 보여준다.
도면 18은 실시예 6에서 설명된 바와 같이, 발견 세트 및 2개의 맹검 검증 세트에 대한 8-마커 섬유증 분류기 성과에 대한 ROC 곡선을 보여준다.
도면 19a 및 b는 실시예 6에서 설명된 바와 같이, (a) 8-마커 지방증 분류기 및 (b) 8-마커 섬유증 분류기를 이용하여, 20% 홀드-아웃 실증 세트의 2500 부트스트랩 반복의 감수성 및 특이성 분포를 보여준다.
도면 20은 실시예 7에서 설명된 바와 같이, 실제 표본 군에 따라, 소아 표본 각각에서 8-마커 지방증 분류기의 상자 플롯을 보여준다.
도면 21은 실시예 8에서 설명된 바와 같이, 기준선 간 생검으로부터 조직학적 점수 및 NAS 점수의 분포를 보여준다.
도면 22는 실시예 8에서 설명된 바와 같이, 지방증에 대한 상위 6가지 생물마커에 대한 상자 플롯을 보여준다.
도면 23은 실시예 8에서 설명된 바와 같이, 소엽 염증에 대한 상위 6가지 생물마커에 대한 상자 플롯을 보여준다.
도면 24는 실시예 8에서 설명된 바와 같이, 간세포 팽창에 대한 상위 6가지 생물마커에 대한 상자 플롯을 보여준다.
도면 25는 실시예 8에서 설명된 바와 같이, 섬유증에 대한 상위 6가지 생물마커에 대한 상자 플롯을 보여준다.
도면 26은 실시예 8에서 설명된 바와 같이, NAS 점수에 대한 상위 6가지 생물마커에 대한 상자 플롯을 보여준다.
도면 27은 실시예 8에서 설명된 바와 같이, NASH 진단에 대한 상위 6가지 생물마커에 대한 상자 플롯을 보여준다.
도면 28은 조직학적 범주 및 NASH 진단에 의한 유의미한 단백질 생물마커의 벤 다이어그램을 보여준다.
도면 29는 지방증에 대한 특질 선별을 보여준다.
도면 30은 소엽 염증에 대한 특질 선별을 보여준다.
도면 31은 간세포 팽창에 대한 특질 선별을 보여준다.
도면 32는 섬유증에 대한 특질 선별을 보여준다.
도면 33a 및 33b는 단백질 1 (33a) 및 단백질 2 (33b)에 대한 나이브 베이즈 모형을 적합시키는데 이용된 훈련 데이터의 확률 밀도 함수 (표본 크기에 의해 척도화됨)를 보여준다. 곡선은 부류에 의해 착색되고, 그리고 표본 1에 대한 단백질 치수 (
Figure pct00001
=3.79301, 2.59934)는 파선 수직선에 의해 대표된다. 이것은 표본 1이 대조 분포에서 비롯되었을 가능성이 더욱 높다는 것을 그래픽적으로 지시한다.
도면 34a 및 34b는 2개 단백질 마커 나이브 베이즈 모형을 적합시키는데 이용된 훈련 데이터의 이변량 플롯을 보여준다. 점선은 모형 파라미터의 부류 특이적 수단이고, 포인트는 부류에 의해 지시되고 (속이 차있는 원은 대조이고, 점선 원은 질환이다), 그리고 p = 0.5 컷오프를 반영하는 비선형 베이즈 결정 경계는 곡선에 의해 표시된다. 녹색 "x"는 표본 1-5의 좌표를 나타낸다.
상세한 설명
비록 본 발명이 일정한 대표적인 구체예와 함께 설명될 것이지만, 본 발명은 청구항에 의해 규정되고, 그리고 이들 구체예에 한정되지 않는 것으로 이해될 것이다.
당업자는 본 발명의 실시에 이용될 수 있는, 본원에서 설명된 것들과 유사하거나 균등한 많은 방법과 재료를 인식할 것이다. 본 발명은 설명된 방법과 재료에 결코 한정되지 않는다.
달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에서 설명된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법, 장치와 재료가 본 발명의 실시에 이용될 수 있지만, 일정한 방법, 장치와 재료가 본원에서 설명된다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 공개된 특허 문서 및 특허 출원은 마치 각 개별 간행물, 공개된 특허 문서, 또는 특허 출원이 참조로서 편입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 것처럼 본원에 참조로서 편입된다.
첨부된 청구항을 비롯하여, 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함하고, 그리고 "최소한 하나" 및 "하나 또는 그 이상"과 교체가능하게 이용될 수 있다. 따라서, "앱타머"에 대한 언급은 앱타머의 혼합물을 포함하고, "프로브"에 대한 언급은 프로브의 혼합물을 포함하고, 기타 등등이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "포함한다," "포함하는," "함유한다," "함유하는," "내포한다," "내포하는" 및 이들의 임의의 변이체는 하나의 요소 또는 요소의 목록을 포함하거나, 함유하거나 또는 내포하는 제법, 방법, 제법한정 물건, 또는 물질 조성물이 명시적으로 열거되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있도록, 비-배타적 포함을 커버하는 것으로 의도된다.
본 출원은 개체가 NAFLD를 앓는 지를 결정하기 위한 생물마커, 방법, 장치, 시약, 시스템 및 키트를 포함한다. 본 출원은 또한, 개체가 NASH를 앓는 지를 결정하기 위한 생물마커, 방법, 장치, 시약, 시스템 및 키트를 포함한다. 일부 구체예에서, NAFLD를 앓는 개체가 NASH를 앓는 지를 결정하기 위한 생물마커, 방법, 장치, 시약, 시스템 및 키트가 제공된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "ITGA1/ITGB1"은 ITGA1 및/또는 ITGB1 및/또는 ITGA1과 ITGB1의 복합체를 지칭하는데 이용된다. 따라서, 방법이 생물마커 "ITGA1/ITGB1"을 검출하는 것을 포함하면, 상기 방법은 ITGA1, ITGB1, ITGA1과 ITGB1 둘 모두 및/또는 ITGA1과 ITGB1의 복합체를 검출하는 것을 포함할 수 있다. ITGA1/ITGB1에 특이적으로 결합하는 생물마커 포획 시약은 ITGA1 및/또는 ITGB1 및/또는 ITGA1과 ITGB1 둘 모두 및/또는 ITGA1과 ITGB1의 복합체에 결합할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "HSP90AA1/HSP90AB1"은 HSP90AA1 및/또는 HSP90AB1을 지칭하는데 이용된다. 따라서, 방법이 생물마커 "HSP90AA1/HSP90AB1"을 검출하는 것을 포함하면, 상기 방법은 HSP90AA1, HSP90AB1, 또는 HSP90AA1과 HSP90AB1 둘 모두를 검출하는 것을 포함할 수 있다. HSP90AA1/HSP90AB1에 특이적으로 결합하는 생물마커 포획 시약은 HSP90AA1 및/또는 HSP90AB1 및/또는 HSP90AA1과 HSP90AB1 둘 모두에 결합할 수 있다.
일부 구체예에서, 개체가 NAFLD를 앓는 지를 결정하기 위해 단독으로 또는 다양한 조합에서 이용되는 하나 또는 그 이상의 생물마커가 제공된다. 아래에 상세하게 설명된 바와 같이, 예시적인 구체예는 표 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9에서 제공된 하나 또는 그 이상의 생물마커가 있거나 또는 없이, 표 15 및 표 16에서 제공된 생물마커를 포함한다.
이들 생물마커는 멀티플렉스 앱타머-기초된 검정을 이용하여 확인되었다. 표 3은 정상적인 비만한 개체로부터 획득된 표본을 NAFLD를 앓는 개체로부터 표본으로부터 식별하는데 유용한 9가지 생물마커를 열거한다. 표 4는 지방증을 앓는 개체로부터 획득된 표본을 NASH 시기 2, 3 및 4를 앓는 개체로부터 표본으로부터 식별하는데 유용한 4가지 생물마커를 열거한다. 표 8은 정상적인 비만한 개체로부터 획득된 표본을 NAFLD를 앓는 개체로부터 표본으로부터 식별하는데 유용한 8가지 생물마커를 열거한다. 표 9는 지방증을 앓는 개체로부터 획득된 표본을 NASH 시기 2, 3 및 4를 앓는 개체로부터 표본으로부터 식별하는데 유용한 8가지 생물마커를 열거한다. 표 6 및 7은 서로 및/또는 표 3, 4, 8 및/또는 9로부터 생물마커와 임의의 조합으로 이용될 수 있는 추가 생물마커를 열거한다. 일부 구체예에서, 표 3, 4, 6, 7, 8 및 9로부터 생물마커의 부분집합은 표 5에서 도시된 패널 내로 합동된다.
표 15 및 표 16은 NASH의 조직학적 등급 분류를 특징짓는데 유용한 생물마커를 열거한다. 일부 구체예에서, 표 15 및/또는 표 16으로부터 하나 또는 그 이상의 생물마커는 개체가 지방증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 NASH를 앓을 가능성을 결정하기 위해 단독으로 또는 다양한 조합에서 용도가 제공된다. 일부 구체예에서, 표 15 및/또는 표 16으로부터 하나 또는 그 이상의 생물마커는 개체가 지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및/또는 섬유증을 앓는 지를 결정하는데 유용하다. 일부 구체예에서, 표 15 및/또는 표 16으로부터 하나 또는 그 이상의 생물마커는 개체가 지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및/또는 섬유증을 앓을 가능성을 결정하는데 유용하다. 일부 구체예에서, 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 생물마커 중에서 하나 또는 그 이상은 개체가 임의의 시기의 NASH를 앓는 지를 결정하는데 단독으로 또는 다양한 조합에서 유용하다. 일부 구체예에서, 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 생물마커 중에서 하나 또는 그 이상은 표 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 생물마커와 합동되어 패널을 형성할 수 있다.
일부 구체예에서, 표 15 및 표 16에서 열거된 생물마커 중에서 하나 또는 그 이상은 개체가 NASH가 발달할 위험에 처해있는 지를 확인하는데 유용하다. 일부 구체예에서, 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 생물마커 중에서 하나 또는 그 이상은 개체가 지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및/또는 섬유증이 발달할 위험에 처해있는 지를 확인하는데 유용하다. 일부 구체예에서, 개체가 지방증을 앓는 지를 결정하기 위해 단독으로 또는 다양한 조합에서 이용되는 하나 또는 그 이상의 생물마커가 제공된다. 일부 구체예에서, 개체는 비만하다. 표 15 및/또는 표 16에서 생물마커 중에서 하나 또는 그 이상은 본원에서 설명된 방법에서 표 3 및/또는 표 4 및/또는 표 6 및/또는 표 7 및/또는 표 8 및/또는 표 9로부터 하나 또는 그 이상의 생물마커와 합동으로 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 개체가 임의의 시기의 NASH를 앓는 지를 결정하기 위해 단독으로 또는 다양한 조합에서 이용되는 하나 또는 그 이상의 생물마커가 제공된다. 일부 구체예에서, 개체가 시기 2, 3 또는 4 NASH를 앓는 지를 결정하기 위해 단독으로 또는 다양한 조합에서 이용되는 하나 또는 그 이상의 생물마커가 제공된다. 일부 구체예에서, 개체는 지방증을 앓는 것으로 이미 알려져 있다. 아래에 상세하게 설명된 바와 같이, 예시적인 구체예는 표 15 및/또는 표 16에서 제공된 생물마커를 포함하는데, 이들은 멀티플렉스 앱타머-기초된 검정을 이용하여 확인되었다. 일부 구체예에서, 패널에서 생물마커의 숫자 및 정체는 생물마커 값의 특정 조합에 대한 감수성 및 특이성에 근거하여 선별된다. 용어 "감수성" 및 "특이성"은 생물학적 표본에서 검출된 하나 또는 그 이상의 생물마커 수준에 근거하여, 개체를 질환을 앓거나 또는 질환을 앓지 않는 것으로 정확하게 분류하는 능력에 대하여 본원에서 이용된다. 일부 구체예에서, 용어 "감수성" 및 "특이성"은 생물학적 표본에서 검출된 하나 또는 그 이상의 생물마커 수준에 근거하여, 개체를 지방증을 앓거나 또는 지방증을 앓지 않는 것으로 정확하게 분류하는 능력에 대하여 본원에서 이용될 수 있다. 이런 구체예에서, "감수성"은 지방증을 앓는 개체를 정확하게 분류하는 것에 대하여 생물마커(들)의 성과를 지시한다. "특이성"은 지방증을 앓지 않는 개체를 정확하게 분류하는 것에 대하여 생물마커(들)의 성과를 지시한다. 가령, 한 세트의 대조 표본 (가령, 건강한 개체 또는 지방증을 앓는 것으로 알려지지 않은 개체로부터 표본) 및 시험 표본 (가령, 지방증을 앓는 개체로부터 표본)을 시험하는데 이용된 생물마커의 패널에 대한 85% 특이성 및 90% 감수성은 대조 표본 중에서 85%가 패널에 의해 대조 표본으로서 정확하게 분류되고, 그리고 시험 표본의 90%가 패널에 의해 시험 표본으로서 정확하게 분류되었다는 것을 지시한다.
일부 구체예에서, 용어 "감수성" 및 "특이성"은 생물학적 표본에서 검출된 하나 또는 그 이상의 생물마커 수준에 근거하여, 개체를 NASH (또는 시기 2, 3 또는 4 NASH)를 앓거나 또는 지방증을 앓는 것으로 정확하게 분류하는 능력에 대하여 본원에서 이용될 수 있다. "감수성"은 NASH (또는 시기 2, 3 또는 4 NASH)를 앓는 개체를 정확하게 분류하는 것에 대하여 생물마커(들)의 성과를 지시한다. "특이성"은 NASH를 앓지 않는 (또는 시기 2, 3 또는 4 NASH를 앓지 않는) 개체를 정확하게 분류하는 것에 대하여 생물마커(들)의 성과를 지시한다. 가령, 한 세트의 대조 표본 (가령, 지방증을 앓는 개체로부터 표본) 및 시험 표본 (가령, NASH, 또는 시기 2, 3 또는 4 NASH를 앓는 개체로부터 표본)을 시험하는데 이용된 생물마커의 패널에 대한 85% 특이성 및 90% 감수성은 대조 표본 중에서 85%가 패널에 의해 대조 표본으로서 정확하게 분류되고, 그리고 시험 표본 중에서 90%가 패널에 의해 시험 표본으로서 정확하게 분류되었다는 것을 지시한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 생물마커의 패널의 전반적인 성과는 곡선 아래 면적 (AUC) 값에 의해 표시된다. AUC 값은 본원에서 예시되는 수신자 작동 특성 (ROC) 곡선으로부터 도출된다. ROC 곡선은 시험의 가양성 비율 (1-특이성)에 대하여 시험의 진양성 비율 (감수성)의 플롯이다. 용어 "곡선 아래 면적" 또는 "AUC"는 수신자 작동 특성 (ROC) 곡선의 곡선 아래 면적을 지칭하는데, 이들 둘 모두 당해 분야에서 널리 공지된다. AUC 척도는 완전한 데이터 범위를 교차하여 분류기의 정확도를 비교하는데 유용하다. 더욱 큰 AUC를 갖는 분류기는 관심되는 2가지 군 (가령, 정상적인 개체 및 NAFLD를 앓는 개체, 또는 지방증을 앓는 개체 및 NASH를 앓는 개체) 사이에서 알려지지 않은 것들을 정확하게 분류하는 더욱 큰 능력을 갖는다. ROC 곡선은 2가지 개체군을 구별하는데 있어서 특정 특질 (가령, 본원에서 설명된 생물마커 중에서 한 가지 및/또는 추가 생물의학 정보의 임의의 항목)의 성과를 플롯팅하는데 유용하다. 전형적으로, 전체 개체군을 교차하여 특질 데이터는 단일 특질의 값에 근거하여, 오름차순으로 분류된다. 이후, 상기 특질의 각 값에 대해, 데이터에 대한 진양성 및 가양성 비율이 계산된다. 진양성 비율은 상기 특질에 대한 값을 초과하는 사례의 숫자를 계수하고, 그리고 이후, 사례의 총수로 나눗셈함으로써 결정된다. 가양성 비율은 상기 특질에 대한 값을 초과하는 대조의 숫자를 계수하고, 그리고 이후, 대조의 총수로 나눗셈함으로써 결정된다. 비록 이러한 정의가 특질이 대조와 비교하여 사례에서 상승되는 시나리오를 지칭하긴 하지만, 이러한 정의는 또한, 특질이 대조와 비교하여 사례에서 더욱 낮은 시나리오에도 적용된다 (이런 시나리오에서, 상기 특질에 대한 값 미만의 표본이 계수될 것이다). ROC 곡선은 단일 특질뿐만 아니라 다른 단일 출력에 대해서 산출될 수 있다, 예를 들면, 단일 합계 값을 제공하기 위해 2개 또는 그 이상 특질의 조합이 수학적으로 합동 (가령, 덧셈, 뺄셈, 곱셈 등)될 수 있고, 그리고 이러한 단일 합계 값은 ROC 곡선에서 플롯팅될 수 있다. 추가적으로, 복수 특질의 임의의 조합 (여기서 상기 조합은 단일 출력 값을 도출한다)이 ROC 곡선에서 플롯팅될 수 있다.
일부 구체예에서, 방법은 개체가 NAFLD를 앓는 지를 결정하기 위해 개체로부터 표본 내에 표 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9에서 열거된 최소한 하나의 생물마커가 있거나 또는 없이, 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 최소한 하나의 생물마커의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 상기 방법은 개체로부터 표본 또는 표본의 부분을 최소한 하나의 포획 시약과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 각 포획 시약은 수준이 검출되는 생물마커에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 표본, 또는 표본으로부터 단백질을 최소한 하나의 앱타머와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 각 앱타머는 수준이 검출되는 생물마커에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 방법은 개체가 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)을 앓는 지를 결정하는 것을 포함하고, 상기 방법은 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 생물마커 단백질로부터 N 생물마커 단백질을 갖는 생물마커 패널을 형성하고, 그리고 개체로부터 표본 내에 상기 패널의 N 생물마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 N은 최소한 5이다. 일부 구체예에서, N은 5 내지 10이거나, 또는 N은 6 내지 10이거나, 또는 N은 7 내지 10이거나, 또는 N은 8 내지 10이거나, 또는 N은 9 내지 10이거나, 또는 N 최소한 6이거나, 또는 N 최소한 7이거나, 또는 N 최소한 8이거나, 또는 N 최소한 9이거나, 또는 N은 5이거나, 또는 N은 6이거나, 또는 N은 7이거나, 또는 N은 8이거나, 또는 N은 9이거나, 또는 N은 10이다. 일부 구체예에서, 방법은 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 THBS2에서 선택되는 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 또는 10개의 수준을 검출하여 개체가 NAFLD를 앓는 지를 결정하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 개체로부터 표본 내에 ITGA1/ITGB1의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 대조 수준보다 높은 ITGA1/ITGB1의 수준은 상기 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시한다.
일부 구체예에서, 방법은 개체로부터 표본 내에 HSP90AA1/HSP90AB1의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 대조 수준보다 높은 HSP90AA1/HSP90AB1의 수준은 상기 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시한다.
일부 구체예에서, 방법은 개체로부터 표본 내에 ITGA1/ITGB1 및 HSP90AA1/HSP90AB1의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 대조 수준보다 높은 ITGA1/ITGB1의 수준 및/또는 HSP90AA1/HSP90AB1의 수준은 상기 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 개체로부터 표본 내에 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, KYNU, POR 및 THBS2에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 또는 최소한 7개의 생물마커의 수준을 검출하는 것을 더욱 포함하고, 여기서 개별 생물마커의 대조 수준보다 높은 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, KYNU, POR 및 THBS2에서 선택되는 최소한 하나의 생물마커의 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, COLEC11 및 THBS2의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 개체에서 AST 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 상승된 AST 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시한다.
다른 구체예에서, 방법은 개체로부터 표본 내에 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 THBS2에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 또는 10개의 생물마커의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 개별 생물마커의 대조 수준보다 높은 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 THBS2에서 선택되는 최소한 하나의 생물마커의 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시한다. 일부 구체예에서, 방법은 HSP90AA1/HSP90AB1 또는 ITGA1/ITGB1, 또는 HSP90AA1/HSP90AB1 및 ITGA1/ITGB1 둘 모두의 수준을 검출하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 개체가 지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및/또는 섬유증을 앓는 지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 지방증은 경등도, 중등도 또는 중증도 지방증이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체가 비알코올성 지방간염 (NASH)을 앓는 지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체가 NASH, 예를 들면, 시기 1, 2, 3 또는 4 NASH를 앓는 지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 개체는 NAFLD가 발달할 위험에 처해있다. 일부 구체예에서, 개체는 NASH가 발달할 위험에 처해있다. 일부 구체예에서, 개체는 지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및/또는 섬유증이 발달할 위험에 처해있다. 일부 구체예에서, 개체는 비만한 개체이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체가 지방증을 앓는 지를 결정하고 및/또는 지방증이 경등도, 중등도 또는 중증도인 지를 결정하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 지방증을 검출하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 및 CSF1R에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 또는 6개의 생물마커를 포함하는 생물마커 패널을 제공하고; 개체가 지방증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 지방증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 생물마커의 수준을 검출하여 상기 생물마커 패널 내에 생물마커에 상응하는 생물마커 값을 제공하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 개체가 지방증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 지방증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 및 CSF1R에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 또는 6개의 생물마커의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 생물마커 패널은 ACY1, KNYU, 그리고 ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1 및 CSF1R에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 또는 4개의 추가 생물마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 ACY1, KNYU, 그리고 ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1 및 CSF1R에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 또는 4개의 추가 생물마커를 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1 및 CSF1R에서 선택되는 최소한 하나의 생물마커를 검출하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 개체가 소엽 염증을 앓는 지를 결정하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B 및 POR에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 또는 8개의 생물마커를 포함하는 생물마커 패널을 제공하고; 개체가 소엽 염증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 소엽 염증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 이들 생물마커의 수준을 검출하여 상기 생물마커 패널 내에 생물마커에 상응하는 생물마커 값을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체가 소엽 염증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 소엽 염증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B 및 POR에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 또는 8개의 생물마커를 포함하는 생물마커 패널을 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 생물마커 패널은 ACY1, THBS2, COLEC11, 그리고 ITGA1/ITGB1 및 POR에서 선택되는 최소한 1개 또는 2개의 추가 생물마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 ACY1, THBS2, COLEC11, 그리고 ITGA1/ITGB1 및 POR에서 선택되는 최소한 1개 또는 2개의 추가 생물마커를 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 ITGA1/ITGB1을 검출하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 개체가 간세포 팽창을 앓는 지를 결정하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, C7, POR, LGALS3BP 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 또는 8개의 생물마커를 포함하는 생물마커 패널을 제공하고; 개체가 간세포 팽창을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 간세포 팽창을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 이들 생물마커의 수준을 검출하여 상기 생물마커 패널 내에 생물마커에 상응하는 생물마커 값을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체가 간세포 팽창을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 간세포 팽창을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, C7, POR, LGALS3BP 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 또는 8개의 생물마커를 포함하는 생물마커 패널을 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 생물마커 패널은 ACY1, COLEC11, THBS2, 그리고 ITGA1/ITGB1 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 최소한 1개 또는 2개의 추가 생물마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 ACY1, COLEC11, THBS2, 그리고 ITGA1/ITGB1 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 최소한 1개 또는 2개의 추가 생물마커를 검출하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 개체가 섬유증을 앓는 지를 결정하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 DCN에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 최소한 10개, 최소한 11개, 최소한 12개, 최소한 13개, 또는 14개의 생물마커를 포함하는 생물마커 패널을 제공하고; 개체가 섬유증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 섬유증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 이들 생물마커의 수준을 검출하여 상기 생물마커 패널 내에 생물마커에 상응하는 생물마커 값을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 생물마커 패널은 개체가 섬유증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 섬유증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 DCN에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 최소한 10개, 최소한 11개, 최소한 12개, 최소한 13개, 또는 14개의 생물마커를 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 C7, COLEC11, THBS2, 그리고 ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1 및 DCN에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 또는 3개의 추가 생물마커를 포함하는 생물마커 패널을 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 C7, COLEC11, THBS2, 그리고 ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1 및 DCN에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 또는 3개의 추가 생물마커를 검출하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 표 15 및 표 16에서 생물마커에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 또는 최소한 10개 생물마커의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 개별 생물마커의 대조 수준보다 높은 표 15 또는 표 16에서 생물마커의 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시한다.
본원에서 확인된 생물마커는 NAFLD를 효과적으로 확인하는데 이용될 수 있는 생물마커의 부분집합 또는 패널에 대한 다수의 선택을 제공한다. 본원에서 확인된 생물마커는 지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및/또는 섬유증을 효과적으로 확인하는데 이용될 수 있는 생물마커의 부분집합 또는 패널에 대한 다수의 선택을 제공한다. 본원에서 확인된 생물마커는 NASH를 효과적으로 확인하는데 이용될 수 있는 생물마커의 부분집합 또는 패널에 대한 다수의 선택을 제공한다. 본원에서 확인된 생물마커는 시기 1, 2, 3 또는 4의 NASH를 효과적으로 확인하는데 이용될 수 있는 생물마커의 부분집합 또는 패널에 대한 다수의 선택을 제공한다. 이런 생물마커의 적절한 숫자의 선별은 선택된 생물마커의 특정한 조합에 의존할 수 있다. 이에 더하여, 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에서, 명시적으로 지시된 경우를 제외하고, 생물마커의 패널은 표 3, 4, 6, 7, 8, 9, 또는 15에서 도시되지 않은 추가 생물마커를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 방법은 개체로부터 표본 내에 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 THBS2에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 또는 최소한 10개의 생물마커의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 최소한 하나의 생물마커의 수준은 상기 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시한다.
일부 구체예에서, 방법은 개체가 NASH, 또는 시기 2, 3 또는 4 NASH를 앓는 지를 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 표 3, 4, 6, 7, 8, 9 및/또는 15에서 열거된 최소한 하나의 생물마커의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 상기 방법은 개체로부터 표본 또는 표본의 부분을 최소한 하나의 포획 시약과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 각 포획 시약은 수준이 검출되는 생물마커에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 표본, 또는 표본으로부터 단백질을 최소한 하나의 앱타머와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 각 앱타머는 수준이 검출되는 생물마커에 특이적으로 결합한다.
본원에서 확인된 생물마커는 NASH, 또는 시기 2, 3 또는 4 NASH를 효과적으로 확인하는데 이용될 수 있는 생물마커의 부분집합 또는 패널에 대한 다수의 선택을 제공한다. 이런 생물마커의 적절한 숫자의 선별은 선택된 생물마커의 특정한 조합에 의존할 수 있다. 이에 더하여, 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에서, 명시적으로 지시된 경우를 제외하고, 생물마커의 패널은 표 3, 4, 6, 7, 8, 9, 또는 15에서 도시되지 않은 추가 생물마커를 포함할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "비알코올성 지방간 질환" 또는 "NAFLD"는 지방이 과도한 알코올 이용의 부재에서, 염증 및 섬유증이 있거나 또는 없이, 간에서 침착되는 질환 (간 지방증)을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "지방증" 및 "비알코올성 지방증"은 교체가능하게 이용되고, 그리고 과도한 알코올 이용의 부재에서, 염증 또는 섬유증 업이, 경등도, 중등도 및 중증도 지방증을 포함한다. 표 1은 경등도, 중등도 및 중증도 지방증의 예시적인 분류를 보여준다.
본원에서 이용된 바와 같이, "비알코올성 지방간염" 또는 "NASH"는 간에 염증 및/또는 섬유증이 있는 NAFLD를 지칭한다. NASH는 4가지 시기로 나눠질 수 있다. NASH의 시기를 결정하는 예시적인 방법은 예로서, Kleiner et al., 2005, Hepatology, 41(6):1313-1321, 그리고 Brunt et al., 2007, Modern Pathol., 20: S40-S48에서 설명된다. 표 1은 시기 1, 2, 3, 및 4 NASH의 예시적인 분류를 보여준다.
본원에서 이용된 바와 같이, 개체에 관하여 "비만"은 30 또는 그 이상의 BMI를 갖는 개체를 지칭한다.
"생물학적 표본", "표본" 및 "시험 표본"은 개체로부터 획득된 또는 만약 그렇지 않으면 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 유체, 조직 또는 세포를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다. 이것은 혈액 (전혈, 백혈구, 말초혈 단핵 세포, 백혈구연층, 혈장 및 혈청 포함), 객담, 눈물, 점액, 코 세척액, 코 흡인물, 소변, 타액, 복막 세척액, 복수, 낭성 유체, 선액, 림프액, 기관지 흡인물, 윤활액, 관절 흡인물, 장기 분비물, 세포, 세포 추출물 및 뇌척수액을 포함한다. 이것은 또한, 전술한 것들 모두의 실험적으로 분리된 분획물을 포함한다. 가령, 혈액 표본은 혈청, 혈장, 또는 특정 유형의 혈액 세포, 예를 들면, 적혈구 또는 백혈구 (백혈구)를 내포하는 분획물 내로 분획될 수 있다. 일부 구체예에서, 표본은 개체로부터 표본의 조합, 예를 들면, 조직 및 유체 표본의 조합일 수 있다. 용어 "생물학적 표본"은 또한, 예로서 대변 표본, 조직 표본, 또는 조직 생검으로부터 균질화된 고체 물질을 내포하는 물질을 포함한다. 용어 "생물학적 표본"은 또한, 조직 배양액 또는 세포 배양액으로부터 유래된 물질을 포함한다. 생물학적 표본을 획득하기 위한 임의의 적합한 방법이 이용될 수 있다; 예시적인 방법은 가령, 정맥절개술, 면봉 (가령, 협측 면봉), 그리고 미세 바늘 흡인물 생검 절차를 포함한다. 미세 침 흡인에 감수성인 예시적인 조직은 림프절, 폐, 갑상선, 가슴, 췌장 및 간을 포함한다. 표본은 또한, 예로서 현미해부 (가령, 레이저 포획 현미해부 (LCM) 또는 레이저 현미해부 (LMD)), 방광 세척, 도말 (가령, PAP 도말), 또는 관 세척에 의해 수집될 수 있다. 개체로부터 획득되거나 또는 유래된 "생물학적 표본"은 개체로부터 획득된 후, 임의의 적합한 방식으로 처리된 임의의 이런 표본을 포함한다.
게다가, 일부 구체예에서, 생물학적 표본은 다수의 개체로부터 생물학적 표본을 취하고, 그리고 이들을 풀링하거나, 또는 각 개체의 생물학적 표본의 분취량을 풀링함으로써 도출될 수 있다. 모아진 표본은 단일 개체로부터 표본에 대해 본원에서 설명된 바와 같이 처리될 수 있고, 그리고 예로서, 불량한 예후가 모아진 표본에서 확립되면, 어떤 개체(들)가 지방증 및/또는 NASH를 앓는 지를 결정하기 위해 각 개체 생물학적 표본이 재-시험될 수 있다.
"표적", "표적 분자" 및 "피분석물"은 생물학적 표본 내에 존재할 수 있는 관심되는 임의의 분자를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다. "관심되는 분자"는 특정 분자의 임의의 경미한 변이, 예를 들면, 단백질의 경우에, 예로서 아미노산 서열에서 경미한 변이, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 분자의 정체를 실제적으로 변경하지 않는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예를 들면, 표지화 성분으로 접합을 포함한다. "표적 분자", "표적" 또는 "피분석물"은 분자 또는 멀티-분자 구조의 한 가지 유형 또는 종의 한 세트의 사본을 지칭한다. "표적 분자", "표적" 및 "피분석물"은 분자 또는 멀티-분자 구조의 하나 이상의 유형 또는 종을 지칭한다. 예시적인 표적 분자는 단백질, 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 어피바디, 항체 모방체, 바이러스, 병원체, 독성 물질, 기질, 대사산물, 이행 상태 유사체, 보조인자, 저해제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자, 세포, 조직, 그리고 임의의 전술한 것들의 임의의 단편 또는 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 분자는 단백질인데, 이러한 사례에서 표적 분자는 "표적 단백질"로서 지칭될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "포획 작용제" 또는 "포획 시약"은 생물마커에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. "표적 단백질 포획 시약"은 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 무제한적 예시적인 포획 시약은 앱타머, 항체, 아드넥틴, 안키린, 다른 항체 모방체 및 다른 단백질 골격, 자가항체, 키메라, 소형 분자, 핵산, 렉틴, 리간드-결합 수용체, 각인된 중합체, 아비머, 펩티드모방체, 호르몬 수용체, 사이토킨 수용체, 합성 수용체, 그리고 전술한 포획 시약 중에서 한 가지의 변형 및 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 포획 시약은 앱타머 및 항체에서 선택된다.
용어 "항체"는 임의의 종류의 전장 항체, 그리고 Fab 단편, F(ab')2 단편, 단일 사슬 항체, Fv 단편 및 단일 사슬 Fv 단편을 비롯하여, 이런 항체의 단편 및 유도체를 지칭한다. 용어 "항체"는 또한, 합성적으로-유래된 항체, 예를 들면, 파지 전시-유래된 항체 및 단편, 아피바디, 나노바디 등을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "마커" 및 "생물마커"는 개체에서 정상적인 또는 비정상적인 과정, 또는 개체에서 질환 또는 다른 상태를 지시하거나 또는 이의 징후인 표적 분자를 지칭하기 위해 교체가능하게 이용된다. 더욱 특정하게는, "마커" 또는 "생물마커"는 정상적인 또는 비정상적인 지와 상관없이, 그리고 비정상적이면, 만성 또는 급성인 지와 상관없이, 특정한 생리학적 상태 또는 과정의 존재와 연관된 해부학적, 생리학적, 생화학적, 또는 분자 파라미터이다. 생물마커는 실험실 검정 및 의학적 영상화를 비롯한 다양한 방법에 의해 검출가능하고 계측가능하다. 일부 구체예에서, 생물마커는 표적 단백질이다.
본원에서 이용된 바와 같이, "생물마커 수준" 및 "수준"은 생물학적 표본에서 생물마커를 검출하기 위한 임의의 분석법을 이용하여 이루어지고, 그리고 생물학적 표본에서 생물마커의, 생물마커에 대한, 또는 생물마커에 상응하는 존재, 부재, 절대적 양 또는 농도, 상대적 양 또는 농도, 역가, 수준, 발현 수준, 계측된 수준의 비율, 또는 기타 유사한 것을 지시하는 계측을 지칭한다. "수준"의 정확한 성격은 생물마커를 검출하는데 이용된 특정 분석법의 특정한 설계 및 성분에 의존한다.
표적 분자의 "대조 수준"은 질환 또는 장애를 앓지 않는 개체로부터, 또는 질환 또는 장애를 앓는 것으로 의심되지 않는 개체로부터 동일한 표본 유형에서 표적 분자의 수준을 지칭한다. 표적 분자의 "대조 수준"은 본 발명 방법이 실행될 때마다 결정될 필요가 없고, 그리고 특정 표본에서 수준이 정상적인 수준보다 높거나 낮은 지를 결정하기 위한 참조 또는 역치로서 이용되는 이전에 결정된 수준일 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 방법에서 대조 수준은 NAFLD를 앓지 않는 1명 또는 그 이상의 개체에서 관찰되었던 수준이다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 방법에서 대조 수준은 NAFLD를 앓지만, NASH를 앓지 않는 1명 또는 그 이상의 개체에서 관찰되었던 수준이다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 방법에서 대조 수준은 복수의 정상적인 개체, 또는 NAFLD를 앓지만 NASH를 앓지 않는 개체에서 관찰되었던, 임의선택적으로 통계학적 변이가 플러스 또는 마이너스된 평균 또는 평균 수준이다.
본원에서 이용된 바와 같이, "개체" 및 "피험자"는 시험 개체 또는 환자를 지칭하는데 교체가능하게 이용된다. 개체는 포유동물 또는 비포유동물일 수 있다. 다양한 구체예에서, 개체는 포유동물이다. 포유류 개체는 인간 또는 비인간일 수 있다. 다양한 구체예에서, 개체는 인간이다. 건강한 또는 정상적인 개체는 관심되는 질환 또는 장애 (가령, NASH)가 전통적인 진단적 방법에 의해 검출되지 않는 개체이다.
"진단한다", "진단하는", "진단" 및 이들의 변이는 하나 또는 그 이상의 징후, 증상, 데이터, 또는 개체에 관계하는 다른 정보의 기초에서 상기 개체의 건강 상태 또는 조건의 검출, 결정 또는 인식을 지칭한다. 개체의 건강 상태는 건강한 / 정상적인 상태 (다시 말하면, 질환 또는 장애의 부재의 진단)로서 진단되거나, 또는 병든 / 비정상적인 상태 (다시 말하면, 질환 또는 장애의 존재의 진단, 또는 질환 또는 장애의 특징의 사정)으로서 진단될 수 있다. 용어 "진단한다", "진단하는", "진단" 등은 특정 질환 또는 장애에 대하여, 질환의 초기 검출; 질환의 특징화 또는 분류; 질환의 진행, 관해 또는 재발의 검출; 그리고 개체에 치료 또는 요법의 투여 후 질환 반응의 검출을 포괄한다. NAFLD의 진단은 NAFLD를 앓는 개체를 이를 앓지 않는 개체로부터 식별하는 것을 포함한다. NASH의 진단은 NASH를 앓는 개체를 간에서 지방증을 앓지만 NASH를 앓지 않는 개체로부터 및 간 질환을 앓지 않는 개체로부터 식별하는 것을 포함한다.
"예측한다", "예측하는", "예후" 및 이들의 변이는 질환 또는 장애를 앓는 개체에서 질환 또는 장애의 장래 코스의 예측 (가령, 환자 생존의 예측)을 지칭하고, 그리고 이런 용어는 개체에 치료 또는 요법의 투여 후 질환 반응의 평가를 포괄한다.
"평가한다", "평가하는", "평가" 및 이들의 변이는 "진단한다" 및 "예측한다" 둘 모두를 포괄하고, 그리고 또한, 질환을 앓지 않는 개체에서 질환 또는 장애의 장래 코스에 관한 결정 또는 예측뿐만 아니라 겉보기에 질환이 치유되었던 개체에서 질환 또는 장애가 재발할 가능성에 관한 결정 또는 예측을 포괄한다. 용어 "평가한다"는 또한, 요법에 대한 개체의 반응을 사정하는, 예를 들면, 예로서 개체가 치료적 작용제에 우호적으로 반응할 가능성이 높거나 또는 치료적 작용제에 반응할 가능성이 낮은 (또는 예로서, 독성 또는 다른 바람직하지 않은 부작용을 경험할) 지를 예측하는, 개체에 투여를 위한 치료적 작용제를 선별하는, 또는 개체에게 투여되었던 요법에 대한 개체의 반응을 모니터링하거나 또는 결정하는 것을 포괄한다. 따라서, NAFLD를 "평가하는" 것은 예로서, 다음 중에서 한 가지를 포함할 수 있다: 개체에서 NAFLD의 장래 코스를 예측한다; NAFLD가 NASH로 진행할 것인 지를 예측한다; NASH의 특정 시기가 NASH의 더욱 높은 시기로 진행할 것인 지를 예측한다; 기타 등등.
본원에서 이용된 바와 같이, 생물마커 수준에 대하여 "검출하는" 또는 "결정하는"은 생물마커 수준에 상응하는 신호를 관찰하고 기록하는데 이용된 기기 및 신호를 산출하는데 필요한 물질/물질들 둘 모두의 이용을 포함한다. 다양한 구체예에서, 수준은 형광, 화학발광, 표면 플라스몬 공명, 표면 음향 파, 질량 분광분석법, 적외선 분광법, 라만 분광법, 원자력 현미경검사, 주사형 터널링 현미경검사, 전기화학적 검출 방법, 핵 자기 공명, 양자점 등을 비롯한 임의의 적합한 방법을 이용하여 검출된다.
본원에서 이용된 바와 같이, "NAFLD를 앓는 개체"는 NAFLD로 진단된 개체를 지칭한다. 일부 구체예에서, NAFLD는 일과적인 검진, 대사 증후군 및 비만의 모니터링, 또는 약물 (가령, 콜레스테롤 저하제 또는 스테로이드)의 가능한 부작용에 대한 모니터링 동안 의심된다. 일부 경우에, 간 효소, 예를 들면, AST 및 ALT가 높다. 일부 구체예에서, 개체는 복부 또는 흉부 영상화, 간 초음파, 또는 자기 공명 영상법 이후에 진단된다. 일부 구체예에서, 다른 질환, 예를 들면, 과잉 알코올 소비, C형 간염 및 윌슨병은 NAFLD 진단에 앞서 배제되었다. 일부 구체예에서, 개체는 간 생검 이후에 진단되었다.
본원에서 이용된 바와 같이, "지방증을 앓는 개체" 및 "비알코올성 지방증을 앓는 개체"는 교체가능하게 이용되고, 그리고 지방증으로 진단되었던 개체를 지칭한다. 일부 구체예에서, 지방증은 일반적으로, NAFLD에 대해 앞서 설명된 방법에 의해 진단된다.
본원에서 이용된 바와 같이, "NASH를 앓는 개체"는 NASH로 진단되었던 개체를 지칭한다. 일부 구체예에서, NASH는 일반적으로, NAFLD에 대해 앞서 설명된 방법에 의해 진단된다. 일부 구체예에서, 진행된 섬유증은 예로서, Gambino R, et.al. Annals of Medicine 2011;43(8):617-49에 따라, NAFLD를 앓는 환자에서 진단된다.
본원에서 이용된 바와 같이, "NAFLD가 발달할 위험에 처해있는 개체"는 하나 또는 그 이상의 NAFLD 동시이환, 예를 들면, 비만, 복부 비만, 대사 증후군, 심혈관 질환 및 당뇨병을 앓는 개체를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "지방증이 발달할 위험에 처해있는 개체"는 지방증을 앓는 것으로 진단되지 않았지만, 하나 또는 그 이상의 NAFLD 동시이환, 예를 들면, 비만, 복부 비만, 대사 증후군, 심혈관 질환 및 당뇨병을 앓는 개체를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "NASH가 발달할 위험에 처해있는 개체"는 하나 또는 그 이상의 NAFLD 동시이환, 예를 들면, 비만, 복부 비만, 대사 증후군, 심혈관 질환 및 당뇨병을 계속하여 앓는, 지방증을 앓는 개체를 지칭한다.
본원에서 "고체 지지체"는 분자가 공유 또는 비공유 결합을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있는 표면을 갖는 임의의 기질을 지칭한다. "고체 지지체"는 다양한 물리적 형식을 가질 수 있는데, 이들은 예로서, 막; 칩 (가령, 단백질 칩); 슬라이드 (가령, 유리 슬라이드 또는 커버슬립); 칼럼; 속이 빈, 속이 꼭 찬, 속이 반쯤 찬, 구멍- 또는 공동-내포 입자, 예를 들면, 예로서 비드; 겔; 광섬유 물질을 비롯한 섬유; 매트릭스; 및 표본 리셉터클을 포함할 수 있다. 예시적인 표본 리셉터클은 표본 웰, 튜브, 모세관, 바이알, 그리고 표본을 유지할 수 있는 임의의 다른 용기, 그루브 또는 인덴션을 포함한다. 표본 리셉터클은 멀티-표본 플랫폼, 예를 들면, 마이크로역가 평판, 슬라이드, 미소유체공학 장치 등에 내포될 수 있다. 지지체는 자연 또는 합성 물질, 유기 또는 무기 물질로 구성될 수 있다. 포획 시약이 부착되는 고체 지지체의 조성은 일반적으로, 부착 방법 (가령, 공유 부착)에 의존한다. 다른 예시적인 리셉터클은 미소액적 및 미소유체 제어된 또는 벌크 오일/수성 유제를 포함하는데, 이들 내에서 검정 및 관련된 조작이 일어날 수 있다. 적합한 고체 지지체는 예로서, 플라스틱, 수지, 다당류, 실리카 또는 실리카-기초된 물질, 기능화된 유리, 변형된 실리콘, 탄소, 금속, 무기 유리, 막, 나일론, 자연 섬유 (예를 들면, 예로서 실크, 양털 및 솜), 중합체 등을 포함한다. 고체 지지체를 구성하는 물질은 반응성 기, 예를 들면, 예로서 카르복시, 아미노, 또는 히드록실 기를 포함할 수 있는데, 이들은 포획 시약의 부착에 이용된다. 중합성 고체 지지체는 예로서, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 글리콜 테트라프탈레이트, 폴리비닐 아세트산염, 폴리염화비닐, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴로니트릴, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 부틸 고무, 스티렌부타디엔 고무, 자연 고무, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, (폴리)테트라플루오로에틸렌, (폴리)플루오르화비닐리덴, 폴리카보네이트 및 폴리메틸펜텐을 포함할 수 있다. 이용될 수 있는 적합한 고체 지지체 입자는 예로서, 인코딩된 입자, 예를 들면, Luminex®-유형 인코딩된 입자, 자성 입자 및 유리 입자를 포함한다.
생물마커의 예시적인 용도
다양한 예시적인 구체예에서, 개체가 NAFLD를 앓는 지를 결정하기 위한 방법이 제공된다. 다양한 구체예에서, 개체가 NAFLD를 앓는 지를 결정하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 생물마커 단백질로부터 N 생물마커 단백질을 갖는 생물마커 패널을 형성하고, 그리고 개체로부터 표본 내에 상기 패널의 N 생물마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 N은 최소한 5이다. 다양한 구체예에서, 개체가 NAFLD를 앓는 지를 결정하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 개체가 NAFLD를 앓는 지를 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 최소한 하나의 생물마커의 수준을 검출하는 것을 포함한다.
다양한 구체예에서, 개체가 경등도, 중등도 또는 중증도 지방증일 수 있는 지방증을 앓는 지를 결정하기 위한 방법이 제공된다. 다양한 구체예에서, 개체가 시기 1, 2, 3 또는 4 NASH일 수 있거나, 또는 시기 2, 3 또는 4 NASH일 수 있는 NASH를 앓는 지를 결정하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 지방증을 앓는 개체가 시기 1, 2, 3 또는 4 NASH일 수 있거나, 또는 시기 2, 3 또는 4 NASH일 수 있는 NASH를 앓는 지를 결정하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, NASH의 조직학적 병기결정을 특징짓기 위한 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 개체가 지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및/또는 섬유증을 앓는 지를 결정하기 위한 방법이 제공된다. 이들 방법은 본원에서 설명된 임의의 분석법을 비롯한 수많은 분석법에 의해, 개체의 순환 내에, 예를 들면, 혈청 또는 혈장 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 생물마커에 상응하는 하나 또는 그 이상의 생물마커 수준을 검출하는 것을 포함한다. 이들 생물마커는 예로서, 정상적인 개체 (여기서 정상적인 개체는 비만한 개체일 수 있다)와 비교하여 NAFLD를 앓는 개체에서 상이한 수준으로 존재한다. 일부 구체예에서, 생물마커는 정상적인 개체 (여기서 정상적인 개체는 비만한 개체일 수 있다)와 비교하여, NASH (가령, 시기 1, 2, 3 또는 4 NASH, 또는 시기 2, 3 또는 4 NASH)를 앓는 개체에서 상이한 수준으로 존재한다. 일부 구체예에서, 생물마커는 지방증 (이것은 경등도, 중등도 또는 중증도 지방증일 수 있다)을 앓는 개체와 비교하여, NASH (가령, 시기 1, 2, 3 또는 4 NASH, 또는 시기 2, 3 또는 4 NASH)를 앓는 개체에서 상이한 수준으로 존재한다.
일부 구체예에서, 생물마커는 정상적인 개체 (여기서 정상적인 개체는 비만한 개체일 수 있다)와 비교하여, 지방증을 앓는 개체에서 상이한 수준으로 존재한다. 일부 구체예에서, 생물마커는 정상적인 개체 (여기서 정상적인 개체는 비만한 개체일 수 있다)와 비교하여, 소엽 염증을 앓는 개체에서 상이한 수준으로 존재한다. 일부 구체예에서, 생물마커는 정상적인 개체 (여기서 정상적인 개체는 비만한 개체일 수 있다)와 비교하여, 간세포 팽창을 앓는 개체에서 상이한 수준으로 존재한다. 일부 구체예에서, 생물마커는 정상적인 개체 (여기서 정상적인 개체는 비만한 개체일 수 있다)와 비교하여, 섬유증을 앓는 개체에서 상이한 수준으로 존재한다.
개체에서 차별적 수준의 생물마커의 검출은 예로서, 개체가 NAFLD (이것은 지방증 또는 NASH일 수 있다)를 앓는 지, 또는 지방증을 앓는 개체가 NASH가 발달했는 지의 결정을 허용하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 생물마커 중에서 한 가지가 NAFLD의 발달에 대해 개체 (가령, 비만한 개체)를 모니터링하거나, 또는 NASH의 발달에 대해 지방증을 앓는 개체를 모니터링하는데 이용될 수 있다.
본원에서 설명된 생물마커 중에서 한 가지가 개체가 NAFLD를 앓는 지를 결정하는데 이용될 수 있는 방식의 실례로서, NAFLD로 진단되지 않았지만 하나 또는 그 이상의 NAFLD 동시이환을 앓는 개체에서 설명된 생물마커 중에서 하나 또는 그 이상의 수준은 개체가 침습성 시험, 예를 들면, 간 생검을 이용하여 결정될 때보다 초기 단계에서 NAFLD가 발달하였다는 것을 지시할 수 있다. 본 발명 방법이 비침습성이기 때문에, 이들은 NAFLD가 발달할 위험에 처해있는 개체 (예를 들면, 예로서 비만한 개체)를 모니터링하는데 이용될 수 있다. 초기 단계에서 NAFLD를 검출함으로써, 의학적 개입이 더욱 효과적일 수 있다. 이런 의학적 개입은 체중 감소, 혈당 제어 및 알코올 회피를 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 치료적 작용제, 예를 들면, 피오글리타존, 비타민 E 및/또는 메트포르민이 이용될 수 있다. 가령, Sanyal et al., 2010, NEJM, 362: 1675-1685를 참조한다. 일부 경우에, 이런 초기 개입은 간부전 및 간 이식에 대한 요구를 지연시키거나 또는 예방할 수 있다.
유사하게, 본원에서 설명된 생물마커가 지방증을 앓는 개체가 NASH가 발달할 지를 결정하는데 이용될 수 있는 방식의 추가 실례로서, 지방증을 앓는 개체에서 설명된 생물마커 중에서 하나 또는 그 이상의 수준은 상기 개체가 NASH가 발달할거란 것을 지시할 수 있다. 본 발명 방법이 비침습성이기 때문에, 지방증을 앓는 개체는 NASH의 발달에 대해 모니터링될 수 있다. 초기 단계에서 NASH를 검출함으로써, 의학적 개입은 더욱 효과적일 수 있다. 이런 의학적 개입은 체중 감소, 혈당 제어 및 알코올 회피를 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 치료적 작용제, 예를 들면, 피오글리타존, 비타민 E 및/또는 메트포르민이 이용될 수 있다. 가령, Sanyal et al., 2010, NEJM, 362: 1675-1685를 참조한다. 일부 경우에, 이런 초기 개입은 간부전 및 간 이식에 대한 요구를 지연시키거나 또는 예방할 수 있다.
이에 더하여, 일부 구체예에서, 시간의 추이에서 개체에서 생물마커 중에서 하나 또는 그 이상의 차별적 발현 수준은 특정 치료적 섭생에 대한 개체의 반응을 지시할 수 있다. 일부 구체예에서, 추적 모니터링 동안 생물마커 중에서 하나 또는 그 이상의 발현에서 변화는 특정 요법이 효과적이라는 것을 지시할 수 있거나, 또는 치료적 섭생이 어떤 방식으로든, 예를 들면, 혈당을 더욱 공격적으로 제어하거나, 체중 감소를 더욱 공격적으로 추구하거나, 기타 등등에 의해 변경되어야 한다는 것을 암시할 수 있다. 일부 구체예에서, 시간의 추이에서 개체에서 생물마커 중에서 하나 또는 그 이상의 일정한 발현 수준은 개체의 지방증이 악화되지 않거나, 또는 NASH로 발달하지 않는다는 것을 지시할 수 있다.
독립형 진단적 시험으로서 생물마커 수준을 시험하는 것에 더하여, 생물마커 수준은 또한, 질환의 감수성의 증가된 위험을 지시하는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNPs), 또는 다른 유전자 병변 또는 가변성의 결정과 함께 행위될 수 있다. (가령, Amos et al., Nature Genetics 40, 616-622 (2009)를 참조한다).
독립형 진단적 시험으로서 생물마커 수준을 시험하는 것에 더하여, 생물마커 수준은 또한, 다른 NAFLD 선별검사 방법, 예를 들면, 확대된 간의 검출, 혈액 검사 (예로서, 일정한 간 효소, 예를 들면, ALT 및/또는 AST에서 상승을 검출하기 위해), 복부 초음파 및 간 생검과 함께 행위될 수 있다. 일부 경우에, 본원에서 설명된 생물마커를 이용하는 방법은 NAFLD 또는 NASH에 대한 더욱 공격적 치료, 더욱 빈번한 추적 선별검사, 기타 등등을 실행하기 위한 의학적 및 경제적 정당화를 조장할 수 있다. 생물마커는 또한, NAFLD가 발달할 위험에 처해있지만 지방증으로 진단되지 않았던 개체에서, 진단적 시험이 이들 개체가 상기 질환이 발달할 개연성이 있다는 것을 지시하면, 치료를 시작하는데 이용될 수 있다.
다른 NAFLD 진단적 방법과 함께 생물마커 수준을 시험하는 것에 더하여, 생물마커에 관한 정보는 또한, 다른 유형의 데이터, 특히 NAFLD에 대한 개체의 위험을 지시하는 데이터와 함께 평가될 수 있다. 이들 다양한 데이터는 컴퓨터 또는 다른 기구/장치에서 구현될 수 있는 자동화된 방법, 예를 들면, 컴퓨터 프로그램/소프트웨어에 의해 사정될 수 있다.
생물마커 및 생물마커 수준의 검출 및 결정
본원에서 설명된 생물마커에 대한 생물마커 수준은 임의의 다양한 공지된 분석법을 이용하여 검출될 수 있다. 한 구체예에서, 생물마커 수준은 포획 시약을 이용하여 검출된다. 다양한 구체예에서, 포획 시약은 용해 상태에서 생물마커에 노출될 수 있거나, 또는 포획 시약이 고체 지지체 위에 고정되는 동안 생물마커에 노출될 수 있다. 다른 구체예에서, 포획 시약은 고체 지지체 상에서 이차 특질과 반응성인 특질을 내포한다. 이들 구체예에서, 포획 시약은 용해 상태에서 생물마커에 노출될 수 있고, 그리고 이후, 포획 시약 상에 특질이 생물마커를 고체 지지체 상에 고정시키기 위해 고체 지지체 상에서 이차 특질과 함께 이용될 수 있다. 포획 시약은 수행되는 분석의 유형에 근거하여 선별된다. 포획 시약은 앱타머, 항체, 아드넥틴, 안키린, 다른 항체 모방체 및 다른 단백질 골격, 자가항체, 키메라, 소형 분자, F(ab')2 단편, 단일 사슬 항체 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 핵산, 렉틴, 리간드-결합 수용체, 아피바디, 나노바디, 각인된 중합체, 아비머, 펩티드모방체, 호르몬 수용체, 사이토킨 수용체, 합성 수용체, 그리고 이들의 변형 및 단편을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, 생물마커 수준은 생물마커/포획 시약 복합체를 이용하여 검출된다.
일부 구체예에서, 생물마커 수준은 생물마커/포획 시약 복합체로부터 유래되고, 그리고 간접적으로, 예를 들면, 예로서 생물마커/포획 시약 상호작용에 뒤따르지만 생물마커/포획 시약 복합체의 형성에 의존하는 반응의 결과로서 검출된다.
일부 구체예에서, 생물마커 수준은 생물학적 표본에서 생물마커로부터 직접적으로 검출된다.
일부 구체예에서, 생물마커는 생물학적 표본에서 2개 또는 그 이상의 생물마커의 동시적 검출을 허용하는 다중화된 형식을 이용하여 검출된다. 다중화된 형식의 일부 구체예에서, 포획 시약은 고체 지지체 상에서 구별된 위치에서 직접적으로 또는 간접적으로, 공유적으로 또는 비공유적으로 고정된다. 일부 구체예에서, 다중화된 형식은 구별된 고체 지지체를 이용하고, 여기서 각 고체 지지체는 고체 지지체와 연관된 독특한 포획 시약, 예를 들면, 예로서 양자점을 갖는다. 일부 구체예에서, 개별 장치는 생물학적 표본에서 검출되는 복수 생물마커 중에서 각 한 가지의 검출에 이용된다. 개별 장치는 생물학적 표본에서 각 생물마커가 동시에 처리될 수 있게 허용하도록 설정될 수 있다. 가령, 마이크로역가 평판은 평판에서 각 웰이 생물학적 표본에서 검출되는 복수 생물마커 중에서 하나 또는 그 이상을 분석하는데 이용되도록 이용될 수 있다.
전술한 구체예 중에서 하나 또는 그 이상에서, 형광 태그는 생물마커 수준의 검출을 할 수 있게 하는 생물마커/포획 시약 복합체의 성분을 표지화하는데 이용될 수 있다. 다양한 구체예에서, 형광 표지는 공지된 기술을 이용하여 본원에서 설명된 생물마커 중에서 한 가지에 특이적인 포획 시약에 접합될 수 있고, 그리고 형광 표지는 이후, 상응하는 생물마커 수준을 검출하는데 이용될 수 있다. 적합한 형광 표지는 희토류 킬레이트, 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 알로피코시아닌, PBXL-3, Qdot 605, 리사민, 피코에리트린, 텍사스 레드, 그리고 다른 이런 화합물을 포함한다.
일부 구체예에서, 형광 표지는 형광 염료 분자이다. 일부 구체예에서, 형광 염료 분자는 최소한 하나의 치환된 인돌륨 고리 시스템을 포함하는데, 여기서 인돌륨 고리의 3-탄소 상에서 치환체는 화학적으로 반응성 기 또는 접합된 물질을 내포한다. 일부 구체예에서, 염료 분자는 AlexFluor 분자, 예를 들면, 예로서 AlexaFluor 488, AlexaFluor 532, AlexaFluor 647, AlexaFluor 680, 또는 AlexaFluor 700을 포함한다. 일부 구체예에서, 염료 분자는 첫 번째 유형 및 두 번째 유형의 염료 분자, 예를 들면, 예로서 2개의 상이한 AlexaFluor 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 염료 분자는 첫 번째 유형 및 두 번째 유형의 염료 분자를 포함하고, 그리고 이들 2개의 염료 분자는 상이한 방출 스펙트럼을 갖는다.
형광은 넓은 범위의 검정 형식과 양립성인 다양한 기계장치로 계측될 수 있다. 가령, 분광형광계는 마이크로역가 평판, 현미경 슬라이드, 인쇄된 어레이, 큐벳 등을 분석하도록 설계되었다. J.R. Lakowicz, Springer Science + Business Media, Inc.에 의한, 2004에 의한 Principles of Fluorescence Spectroscopy를 참조한다. Bioluminescence & Chemiluminescence: Progress & Current Applications; Philip E. Stanley and Larry J. Kricka editors, World Scientific Publishing Company, January 2002를 참조한다.
하나 또는 그 이상의 구체예에서, 화학발광 태그는 임의선택적으로, 생물마커 수준의 검출을 할 수 있게 하는 생물마커/포획 복합체의 성분을 표지화하는데 이용될 수 있다. 적합한 화학발광 물질은 옥살릴 염화물, 로다민 6G, Ru(bipy)3 2+ , TMAE (테트라키스(디메틸아미노)에틸렌), 피로갈롤 (1,2,3-트리히드록시벤젠), 루시게닌, 퍼옥시옥살레이트, 아릴 옥살산염, 아크리디늄 에스테르, 디옥세탄 등 중에서 한 가지를 포함한다.
일부 구체예에서, 검출 방법은 생물마커 수준에 상응하는 검출가능한 신호를 산출하는 효소/기질 조합을 포함한다. 일반적으로, 효소는 분광광도법, 형광 및 화학발광을 비롯하여 다양한 기술을 이용하여 계측될 수 있는 발색 기질의 화학적 변경을 촉매작용한다. 적합한 효소는 예로서, 루시페라아제, 루시페린, 말산 탈수소효소, 요소분해효소, 양고추냉이 과산화효소 (HRPO), 알칼리 인산분해효소, 베타-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 그리고 글루코오스-6-인산염 탈수소효소, 요산분해효소, 크산틴 옥시다아제, 락토페록시다아제, 마이크로페록시다아제 등을 포함한다.
일부 구체예에서, 검출 방법은 계측가능한 신호를 산출하는 형광, 화학발광, 방사성 핵종 또는 효소/기질 조합의 조합일 수 있다. 일부 구체예에서, 다중모드 신호전달은 생물마커 검정 형식에서 독특하고 유리한 특징을 가질 수 있었다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 생물마커에 대한 생물마커 수준은 아래에 논의된 바와 같이, 단일플렉스 앱타머 검정, 다중화된 앱타머 검정, 단일플렉스 또는 다중화된 면역검정, mRNA 발현 프로파일링, miRNA 발현 프로파일링, 질량 분광계 분석, 조직학적/세포학적 방법 등을 비롯한 임의의 분석법을 이용하여 검출될 수 있다.
앱타머-기초된 검정을 이용하여 생물마커 수준의 결정
생물학적 표본 및 다른 표본에서 생리학적으로 유의미한 분자의 검출 및 정량을 향해 지향된 검정은 과학적 연구에서 및 건강 관리 분야에서 중요한 도구이다. 이런 검정의 한 가지 부류는 고체 지지체 위에 고정된 하나 또는 그 이상의 앱타머를 포함하는 마이크로어레이의 이용을 수반한다. 이들 앱타머는 각각, 고도로 특이적 방식에서 및 매우 높은 친화성으로 표적 분자에 결합할 수 있다. 가령, "Nucleic Acid Ligands"라는 제목의 U.S. 특허 번호 5,475,096을 참조한다; 또한, 예로서 각각 "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip"이라는 제목의 U.S. 특허 번호 6,242,246, U.S. 특허 번호 6,458,543 및 U.S. 특허 번호 6,503,715를 참조한다. 일단 마이크로어레이가 표본과 접촉되면, 앱타머는 표본 내에 존재하는 그들의 개별 표적 분자에 결합하고, 그리고 따라서, 생물마커에 상응하는 생물마커 수준의 결정을 할 수 있게 한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "앱타머"는 표적 분자에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 핵산을 지칭한다. 친화성 상호작용은 정도의 문제인 것으로 인식된다; 하지만, 이러한 문맥에서, 표적에 대한 앱타머의 "특이적 결합 친화성"은 앱타머가 일반적으로, 이것이 시험 표본에서 다른 성분에 결합하는 것보다 훨씬 높은 정도의 친화성으로 이의 표적에 결합한다는 것을 의미한다. "앱타머"는 특정 뉴클레오티드 서열을 갖는 한 가지 유형 또는 종의 핵산 분자의 한 세트의 사본이다. 앱타머는 수많은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 비롯하여, 임의의 적합한 숫자의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. "앱타머"는 분자의 하나 이상의 이런 세트를 지칭한다. 상이한 앱타머는 동일하거나 상이한 숫자의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 앱타머는 DNA 또는 RNA 또는 화학적으로 변형된 핵산일 수 있고, 그리고 단일 가닥, 이중 가닥이거나, 또는 이중 가닥 영역을 내포할 수 있고, 그리고 고차 구조를 포함할 수 있다. 앱타머는 또한, 광앱타머일 수 있고, 여기서 광반응성 또는 화학적으로 반응성 기능기가 앱타머가 이의 상응하는 표적에 공유 연결되도록 허용하기 위해 앱타머 내에 포함된다. 본원에서 개시된 앱타머 방법 중에서 한 가지는 동일한 표적 분자에 특이적으로 결합하는 2개 또는 그 이상의 앱타머의 이용을 포함할 수 있다. 아래에 더욱 설명된 바와 같이, 앱타머는 태그를 포함할 수 있다. 앱타머가 태그를 포함하면, 앱타머의 모든 사본은 동일한 태그를 가질 필요가 없다. 게다가, 상이한 앱타머가 각각 태그를 포함하면, 이들 상이한 앱타머는 동일한 태그 또는 상이한 태그를 가질 수 있다.
앱타머는 SELEX 과정을 비롯한 임의의 공지된 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 일단 확인되면, 앱타머는 화학적 합성 방법 및 효소적 합성 방법을 비롯한 임의의 공지된 방법에 따라서 제조되거나 또는 합성될 수 있다.
용어 "SELEX" 및 "SELEX 과정"은 (1) 바람직한 방식으로 표적 분자와 상호작용하는, 예를 들면, 단백질에 높은 친화성으로 결합하는 앱타머의 선별 및 (2) 이들 선별된 핵산의 증폭의 조합을 일반적으로 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다. SELEX 과정은 특정한 표적 또는 생물마커에 높은 친화성을 갖는 앱타머를 확인하는데 이용될 수 있다.
SELEX는 일반적으로, 핵산의 후보 혼합물을 제조하고, 원하는 표적 분자에 후보 혼합물을 결합시켜 친화성 복합체를 형성하고, 결합되지 않은 후보 핵산으로부터 친화성 복합체를 분리하고, 친화성 복합체로부터 핵산을 분리하고 단리하고, 핵산을 정제하고, 그리고 특정한 앱타머 서열을 확인하는 것을 포함한다. 상기 과정은 선별된 앱타머의 친화성을 더욱 정밀화하기 위한 복수 라운드를 포함할 수 있다. 상기 과정은 과정 내에 하나 또는 그 이상의 포인트에서 증폭 단계를 포함할 수 있다. 가령, "Nucleic Acid Ligands"라는 제목의 U.S. 특허 번호 5,475,096을 참조한다. SELEX 과정은 표적에 공유 결합하는 앱타머뿐만 아니라 표적에 비공유적으로 결합하는 앱타머를 산출하는데 이용될 수 있다. 가령, "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX."라는 제목의 U.S. 특허 번호 5,705,337을 참조한다.
SELEX 과정은 앱타머에 향상된 특징, 예를 들면, 예로서 향상된 생체내 안정성 또는 향상된 전달 특징을 부여하는 변형된 뉴클레오티드를 내포하는 높은 친화성 앱타머를 확인하는데 이용될 수 있다. 이런 변형의 실례는 리보오스 및/또는 인산염 및/또는 염기 위치에서 화학적 치환을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드를 내포하는 SELEX 과정-확인된 앱타머는 "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides"라는 제목의 U.S. 특허 번호 5,660,985에서 설명되는데, 이것은 피리미딘의 5'- 및 2'-위치에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유도체를 내포하는 올리고뉴클레오티드를 설명한다. U.S. 특허 번호 5,580,737 (상기 참조)은 2'-아미노 (2'-NH2), 2'-플루오르 (2'-F) 및/또는 2'-O-메틸 (2'-OMe)로 변형된 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 내포하는 고도로 특이적 앱타머를 설명한다. "SELEX and PHOTOSELEX"라는 제목의 U.S. 특허 출원 공개 번호 2009/0098549를 또한 참조하는데, 이것은 확대된 물리적 및 화학적 성질을 갖는 핵산 라이브러리, 그리고 SELEX 및 photoSELEX에서 이들의 용도를 설명한다.
SELEX는 또한, 바람직한 오프 레이트 특징을 갖는 앱타머를 확인하는데 이용될 수 있다. "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates"라는 제목의 U.S. 공개 번호 US 2009/0004667을 참조하는데, 이것은 표적 분자에 결합할 수 있는 앱타머를 산출하기 위한 향상된 SELEX 방법을 설명한다. 개별 표적 분자로부터 더욱 느린 해리율을 갖는 앱타머 및 광앱타머를 생산하기 위한 방법이 설명된다. 상기 방법은 후보 혼합물을 표적 분자와 접촉시키고, 핵산-표적 복합체의 형성이 발생하도록 허용하고, 그리고 느린 오프 레이트 농축 과정을 수행하는 것을 수반하는데, 여기서 빠른 해리율을 갖는 핵산-표적 복합체는 해리하고 재형성되지 않을 것이고, 반면 느린 해리율을 갖는 복합체는 무손상 상태로 남아있을 것이다. 추가적으로, 이들 방법은 향상된 오프 레이트 성과를 갖는 앱타머를 산출하기 위해 후보 핵산 혼합물의 생산에서 변형된 뉴클레오티드의 이용을 포함한다. 무제한적 예시적인 변형된 뉴클레오티드는 예로서, 도면 11에서 도시된 변형된 피리미딘을 포함한다. 일부 구체예에서, 앱타머는 변형, 예를 들면, 염기 변형을 갖는 최소한 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 앱타머는 표적 단백질과의 소수성 접촉을 허용하는 소수성 변형, 예를 들면, 소수성 염기 변형을 갖는 최소한 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 이런 소수성 접촉은 앱타머에 의한 더욱 큰 친화성 및/또는 더욱 느린 오프 레이트 결합에 기여한다. 소수성 변형을 갖는 무제한적 예시적인 뉴클레오티드는 도면 11에서 도시된다. 일부 구체예에서, 앱타머는 소수성 변형을 갖는 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 또는 최소한 10개의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 각 소수성 변형은 다른 것들과 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구체예에서, 앱타머에서 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 또는 최소한 10개의 소수성 변형은 도면 11에서 도시된 소수성 변형에서 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 구체예에서, 느린 오프 레이트 앱타머 (소수성 변형을 갖는 최소한 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 앱타머를 포함)는 ≥ 30 분, ≥ 60 분, ≥ 90 분, ≥ 120 분, ≥ 150 분, ≥ 180 분, ≥ 210 분, 또는 ≥ 240 분의 오프 레이트 (t½)를 갖는다.
일부 구체예에서, 검정은 앱타머가 그들의 표적 분자에 공유 결합하거나 또는 이들을 "광교차연결"할 수 있게 하는 광반응성 기능기를 포함하는 앱타머를 이용한다. 가령, "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip"이라는 제목의 U.S. 특허 번호 6,544,776을 참조한다. 이들 광반응성 앱타머는 광앱타머로서 또한 지칭된다. 가령, 각각 "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"이라는 제목의 U.S. 특허 번호 5,763,177, U.S. 특허 번호 6,001,577 및 U.S. 특허 번호 6,291,184를 참조한다; 가령, "Photoselection of Nucleic Acid Ligands"라는 제목의 U.S. 특허 번호 6,458,539를 또한 참조한다. 마이크로어레이가 표본과 접촉되고 광앱타머가 그들의 표적 분자에 결합하는 기회를 가진 후, 광앱타머는 광활성화되고, 그리고 고체 지지체는 임의의 비특이적으로 결합된 분자를 제거하기 위해 세척된다. 가혹한 세척 조건이 이용될 수 있는데, 그 이유는 광앱타머에 결합되는 표적 분자가 일반적으로, 광앱타머 상에서 광활성화된 기능기(들)에 의해 창출된 공유 결합으로 인해 제거되지 않기 때문이다. 이러한 방식으로, 상기 검정은 시험 표본에서 생물마커에 상응하는 생물마커 수준의 검출을 할 수 있게 한다.
일부 검정 형식에서, 앱타머는 표본과 접촉되기 전에 고체 지지체 위에 고정된다. 하지만, 일정한 환경 하에, 표본과의 접촉에 앞서 앱타머의 고정은 최적 검정을 제공할 수 없다. 가령, 앱타머의 프리-고정은 고체 지지체의 표면 상에서 표적 분자와 앱타머의 비효율적 혼합을 유발할 수 있고, 표적 분자에 앱타머의 효율적인 결합을 허용하기 위해 아마도 지루한 반응 시간, 그리고 이런 이유로, 연장된 배양 기간을 야기한다. 게다가, 광앱타머가 검정에서 이용될 때, 그리고 고체 지지체로서 활용되는 물질에 따라, 고체 지지체는 광앱타머 및 그들의 표적 분자 사이에 공유 결합의 형성을 달성하는데 이용된 광을 산란시키거나 또는 흡수하는 경향이 있을 수 있다. 게다가, 이용된 방법에 따라, 앱타머에 결합된 표적 분자의 검출은 부정확에 종속될 수 있는데, 그 이유는 고체 지지체의 표면이 또한, 이용되는 임의의 표지화 작용제에 노출되고 이들에 의해 영향을 받을 수 있기 때문이다. 최종적으로, 고체 지지체 상에서 앱타머의 고정은 일반적으로, 표본에 앱타머의 노출에 앞서 앱타머-제조 단계 (다시 말하면, 고정)를 수반하고, 그리고 이러한 제조 단계는 앱타머의 활성 또는 기능성에 영향을 줄 수 있다.
앱타머가 용해 상태에서 이의 표적을 포획하고, 그리고 이후, 검출에 앞서 앱타머-표적 혼합물의 특정한 성분을 제거하도록 설계되는 분리 단계를 이용하는 것을 허용하는 앱타머 검정 역시 설명되었다 ("Multiplexed Analyses of Test Samples"라는 제목의 U.S. 공개 번호 2009/0042206을 참조한다). 설명된 앱타머 검정 방법은 핵산 (다시 말하면, 앱타머)을 검출하고 정량함으로써 시험 표본에서 비-핵산 표적 (가령, 단백질 표적)의 검출 및 정량을 할 수 있게 한다. 설명된 방법은 비-핵산 표적을 검출하고 정량하기 위한 핵산 대용물 (다시 말하면, 앱타머)을 창출하고, 따라서 증폭을 비롯한 매우 다양한 핵산 기술이 단백질 표적을 비롯한 더욱 넓은 범위의 원하는 표적에 적용될 수 있도록 허용한다.
앱타머는 앱타머 생물마커 복합체 (또는 광앱타머 생물마커 공유 복합체)로부터 검정 성분의 분리를 용이하게 하고 검출 및/또는 정량을 위한 앱타머의 단리를 허용하도록 작제될 수 있다. 한 구체예에서, 이들 구조체는 앱타머 서열 내에 개열가능한 또는 방출가능한 요소를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 추가 기능성, 예를 들면, 표지화된 또는 검출가능한 성분, 스페이서 성분, 또는 특이적 결합 태그 또는 고정 요소가 앱타머 내로 도입될 수 있다. 가령, 앱타머는 개열가능한 모이어티, 표지, 표지를 분리하는 스페이서 성분, 그리고 개열가능한 모이어티를 통해 앱타머에 연결된 태그를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 개열가능한 요소는 광개열가능 링커이다. 광개열가능 링커는 비오틴 모이어티 및 스페이서 섹션에 부착될 수 있고, 아민의 유도체화를 위한 NHS 기를 포함할 수 있고, 그리고 비오틴 기를 앱타머에 도입하고, 따라서 검정 방법에서 추후에 앱타머의 방출을 허용하는데 이용될 수 있다.
모든 검정 성분이 용해 상태에서 행위되는 균질한 검정은 신호의 검출에 앞서 표본 및 시약의 분리를 필요로 하지 않는다. 이들 방법은 신속하고 이용하기 쉽다. 이들 방법은 특정한 표적과 반응하는 분자 포획 또는 결합 시약에 근거된 신호를 산출한다. 본원에서 설명된 방법의 일부 구체예에서, 분자 포획 시약은 앱타머 또는 항체 또는 기타 유사한 것을 포함하고, 그리고 특정한 표적은 표 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9에서 도시된 생물마커일 수 있다.
일부 구체예에서, 신호 산출을 위한 방법은 형광단-표지화된 포획 시약 및 이의 특정한 생물마커 표적의 상호작용으로 인한 비등방성 신호 변화를 이용한다. 표지화된 포획 시약이 표적과 반응할 때, 증가된 분자량은 복합체에 부착된 형광단의 회전 움직임이 비등방성 값을 훨씬 느리게 변화시키도록 유발한다. 비등방성 변화를 모니터링함으로써, 결합 이벤트가 용액에서 생물마커를 정량적으로 계측하는데 이용될 수 있다. 다른 방법은 형광 분극 검정, 분자 비콘 방법, 시간 분해 형광 퀀칭, 화학발광, 형광 공명 에너지 전달 등을 포함한다.
생물학적 표본에서 생물마커 수준을 검출하는데 이용될 수 있는 예시적인 용액-기초된 앱타머 검정은 다음을 포함한다: (a) 생물학적 표본을 첫 번째 태그를 포함하고 생물마커에 대한 특정한 친화성을 갖는 앱타머와 접촉시킴으로써 혼합물을 제조하고, 여기서 앱타머 친화성 복합체는 생물마커가 표본 내에 존재할 때 형성되고; (b) 혼합물을 첫 번째 포획 요소를 포함하는 첫 번째 고체 지지체에 노출시키고, 그리고 첫 번째 태그가 첫 번째 포획 요소와 연관되도록 허용하고; (c) 첫 번째 고체 지지체와 연관되지 않은 혼합물의 임의의 성분을 제거하고; (d) 두 번째 태그를 앱타머 친화성 복합체의 생물마커 성분에 부착하고; (e) 첫 번째 고체 지지체로부터 앱타머 친화성 복합체를 방출하고; (f) 방출된 앱타머 친화성 복합체를 두 번째 포획 요소를 포함하는 두 번째 고체 지지체에 노출시키고, 그리고 두 번째 태그가 두 번째 포획 요소와 연관되도록 허용하고; (g) 앱타머 친화성 복합체로부터 비-복합화된 앱타머를 분할함으로써 혼합물로부터 임의의 비-복합화된 앱타머를 제거하고; (h) 고체 지지체로부터 앱타머를 용리하고; 그리고 (i) 앱타머 친화성 복합체의 앱타머 성분을 검출함으로써 생물마커를 검출한다.
앱타머를 이용하여 생물학적 표본에서 생물마커를 검출하는 무제한적 예시적인 방법은 실시예 7에서 설명된다. 또한, Kraemer et al., PLoS One 6(10): e26332를 참조한다.
면역검정을 이용한 생물마커 수준의 결정
면역검정 방법은 상응하는 표적 또는 피분석물에 대한 항체의 반응에 근거되고, 그리고 특정한 검정 형식에 따라 표본 내에 피분석물을 검출할 수 있다. 면역반응성에 근거하여 검정 방법의 특이성 및 감수성을 향상시키기 위해, 단일클론 항체 및 이들의 단편이 그들의 특정한 에피토프 인식 때문에 종종 이용된다. 다중클론 항체는 또한, 단일클론 항체와 비교하여 표적에 대한 그들의 증가된 친화성 때문에, 다양한 면역검정에서 성공적으로 이용되었다. 면역검정은 넓은 범위의 생물학적 표본 매트릭스에 이용되도록 설계되었다. 면역검정 형식은 정성적, 반정량적 및 정량적 결과를 제공하도록 설계되었다.
정량적 결과는 검출되는 특정한 피분석물의 공지된 농도로 창출된 표준 곡선의 이용을 통해 산출된다. 미지의 표본으로부터 반응 또는 신호는 표준 곡선 위에 플롯팅되고, 그리고 미지의 표본 내에 표적에 상응하는 양 또는 수준이 확립된다.
다양한 면역검정 형식이 설계되었다. ELISA 또는 EIA는 피분석물의 검출을 위해 정량적일 수 있다. 이러한 방법은 피분석물 또는 항체에 표지의 부착에 의존하고, 그리고 표지 성분은 효소를 직접적으로 또는 간접적으로 포함한다. ELISA 시험은 피분석물의 직접적인, 간접적인, 경쟁적, 또는 샌드위치 검출을 위해 형식화될 수 있다. 다른 방법은 표지, 예를 들면, 예로서 방사성 동위원소 (I125) 또는 형광에 의존한다. 추가 기술은 예로서, 응집, 혼탁측정기, 혼탁도측정, 웨스턴 블롯, 면역침전, 면역세포화학, 면역조직화학, 유세포분석법, Luminex 검정 등을 포함한다 (ImmunoAssay: A Practical Guide, Brian Law에 의해 편집, Taylor & Francis, Ltd.에 의해 공개, 2005 판을 참조한다).
예시적인 검정 형식은 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사면역검정, 형광, 화학발광, 그리고 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 또는 시간 분해-FRET (TR-FRET) 면역검정을 포함한다. 생물마커를 검출하기 위한 절차의 실례는 생물마커 면역침전, 그 이후에 크기 및 펩티드 수준 식별을 허용하는 정량적 방법, 예를 들면, 겔 전기이동, 모세관 전기영동, 평면 전기크로마토그래피 등을 포함한다.
검출가능한 표지 또는 신호 발생 물질을 검출하고 및/또는 정량하기 위한 방법은 표지의 성격에 의존한다. 적절한 효소에 의해 촉매된 반응의 산물 (여기서 검출가능한 표지는 효소이다; 상기 참조)은 제한 없이, 형광, 발광 또는 방사성일 수 있거나, 또는 이들은 가시광선 또는 자외선을 흡수할 수 있다. 이런 검출가능한 표지를 검출하는데 적합한 검출기의 실례는 제한 없이, X선 필름, 방사능 계수, 섬광 계수기, 분광광도계, 비색계, 형광측정기, 광도계 및 농도계를 포함한다.
검출 방법 중에서 한 가지는 반응의 임의의 적합한 제조, 처리 및 분석을 허용하는 임의의 형태에서 수행될 수 있다. 이것은 예로서, 다중웰 검정 평판 (가령, 96 웰 또는 386 웰)에서 이거나, 또는 임의의 적합한 어레이 또는 마이크로어레이를 이용하는 것일 수 있다. 다양한 작용제에 대한 원액은 수동으로 또는 로봇으로 만들어질 수 있고, 그리고 모든 차후 피펫팅, 희석, 혼합, 분포, 세척, 배양, 표본 판독, 데이터 수집 및 분석은 상업적으로 가용한 분석 소프트웨어, 로봇공학, 그리고 검출가능한 표지를 검출할 수 있는 검출 기계장치를 이용하여 로봇으로 행위될 수 있다.
유전자 발현 프로파일링을 이용하여 생물마커 수준의 결정
생물학적 표본에서 mRNA를 계측하는 것은 일부 구체예에서, 생물학적 표본에서 상응하는 단백질의 수준의 검출에 대한 대용으로서 이용될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 생물마커 또는 생물마커 패널은 적절한 RNA를 검출함으로써 검출될 수 있다.
일부 구체예에서, mRNA 발현 수준은 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR, 그 이후에 qPCR)에 의해 계측된다. RT-PCR은 mRNA로부터 cDNA를 창출하는데 이용된다. cDNA는 DNA 증폭 과정이 진행됨에 따라서 형광을 발생시키도록 qPCR 검정에서 이용될 수 있다. 표준 곡선에 대조적으로, qPCR은 절대적 치수, 예를 들면, 세포당 mRNA의 사본수를 산출할 수 있다. 노던 블롯, 마이크로어레이, 침입자 검정, 그리고 모세관 전기영동과 합동된 RT-PCR 모두 표본 내에 mRNA의 발현 수준을 계측하는데 이용되었다. Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004를 참조한다.
생체내 분자 영상화 기술을 이용한 생물마커의 검출
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 생물마커는 분자 영상 검사에서 이용될 수 있다. 가령, 영상화 작용제는 생체내에서 생물마커를 검출하는데 이용될 수 있는 포획 시약에 연계될 수 있다.
생체내 영상화 기술은 개체의 체내에서 특정 질환의 상태를 결정하기 위한 비침습성 방법을 제공한다. 가령, 신체의 전체 부분, 또는 심지어 전체 신체가 3차원 이미지로서 개관될 수 있고, 따라서 체내에서 형태 및 구조에 관한 귀중한 정보를 제공한다. 이런 기술은 생체내에서 생물마커에 관한 정보를 제공하기 위해 본원에서 설명된 생물마커의 검출과 합동될 수 있다.
생체내 분자 영상화 기술의 이용은 기술에서 다양한 진전으로 인해 확대되고 있다. 이들 진전은 신체 내에서 강한 신호를 제공할 수 있는 새로운 조영제 또는 표지, 예를 들면, 방사성 표지 및/또는 형광 표지의 개발; 및 신체 외부로부터 이들 신호를 충분한 감수성 및 정확도로 검출하고 분석하여 유용한 정보를 제공할 수 있는 유력한 새로운 영상화 기술의 개발을 포함한다. 조영제는 적절한 영상화 시스템에서 가시화될 수 있고, 따라서 조영제가 위치되는 신체의 부분 또는 부분들의 이미지를 제공한다. 조영제는 포획 시약, 예를 들면, 예로서 앱타머 또는 항체 및/또는 펩티드 또는 단백질, 또는 올리고뉴클레오티드 (가령, 유전자 발현의 검출을 위해), 또는 하나 또는 그 이상의 거대분자 및/또는 다른 미립자 형태와 함께 이들 중에서 한 가지를 내포하는 복합체에 결합되거나 또는 이것과 연관될 수 있다.
조영제는 또한, 영상화에서 유용한 방사성 원자를 특징으로 할 수 있다. 적합한 방사성 원자는 신티그래피 연구를 위한 테크네튬-99m 또는 요오드-123을 포함한다. 다른 쉽게 검출가능한 모이어티는 예로서, 자기 공명 영상법 (MRI)을 위한 스핀 표지, 예를 들면, 예로서 요오드-123 어게인, 요오드-131, 인듐-111, 플루오르-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함한다. 이런 표지는 당해 분야에서 널리 공지되고, 그리고 당업자에 의해 쉽게 선별될 수 있었다.
표준 영상화 기술은 자기 공명 영상법, 전산화 단층촬영술 스캐닝, 양전자 방출 단층촬영술 (PET), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영술 (SPECT) 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 진단적 생체내 영상화의 경우에, 가용한 검출 기기의 유형은 소정의 조영제, 예를 들면, 소정의 방사성 핵종 및 이것이 표적으로 하는데 이용되는 특정 생물마커 (단백질, mRNA 등)를 선별하는데 있어서 주요 인자이다. 선택되는 방사성 핵종은 전형적으로, 소정의 유형의 기기에 의해 검출가능한 유형의 붕괴를 갖는다. 또한, 생체내 진단을 위한 방사성 핵종을 선별할 때, 이의 반감기는 표적 조직에 의한 최대 흡수의 시점에서 충분한 검출을 할 수 있게 할 만큼 길어야 하지만, 호스트의 유해한 방사가 최소화될 만큼 짧아야 한다.
예시적인 영상화 기술은 PET 및 SPECT를 포함하지만 이들에 한정되지 않는데, 이들은 방사성 핵종이 개체에게 합성적으로 또는 국부 투여되는 영상화 기술이다. 방사성추적자의 차후 흡수가 시간의 추이에서 계측되고, 그리고 표적화된 조직 및 생물마커에 관한 정보를 획득하는데 이용된다. 이용된 특정한 동위원소의 높은-에너지 (감마-광선) 방출, 그리고 이들을 검출하는데 이용된 기기의 감수성 및 고도화 때문에, 방사성의 2차원 분포는 신체의 외부로부터 추론될 수 있다.
PET에서 통상적으로 이용되는 양전자-방출 핵종은 예로서, 탄소-11, 질소-13, 산소-15 및 플루오르-18을 포함한다. 전자 포착 및/또는 감마-방출에 의해 붕괴하는 동위원소가 SPECT에서 이용되고 예로서, 요오드-123 및 테크네튬-99m을 포함한다. 아미노산을 테크네튬-99m으로 표지화하기 위한 예시적인 방법은 불안정 테크네튬-99m-전구체 복합체를 형성하기 위한 킬레이팅 전구체의 존재에서 과테크니튬산 이온의 환원인데, 상기 복합체는 차례로, 이중기능성으로 변형된 화학주성 펩티드의 금속 결합 기와 반응하여 테크네튬-99m-화학주성 펩티드 접합체를 형성한다.
항체는 이런 생체내 영상화 진단적 방법에 빈번하게 이용된다. 생체내 진단을 위한 항체의 제조 및 이용은 당해 분야에서 널리 공지된다. 유사하게, 앱타머가 이런 생체내 영상화 진단적 방법에 이용될 수 있다. 가령, 본원에서 설명된 특정 생물마커를 확인하는데 이용된 앱타머는 생체내에서 생물마커를 검출하기 위해 적절하게 표지화되고 개체 내로 주사될 수 있다. 이용되는 표지는 앞서 설명된 바와 같이, 이용되는 영상화 양식에 따라서 선별될 것이다. 앱타머-지향된 영상화 작용제는 다른 영상화 작용제와 비교하여 조직 침투, 조직 분포, 동역학, 제거, 효능 및 선택성에 관련된 독특하고 유리한 특징을 가질 수 있었다.
이런 기술은 또한, 예로서 안티센스 올리고뉴클레오티드로 영상화를 통한 유전자 발현의 검출을 위해, 표지화된 올리고뉴클레오티드로 임의선택적으로 수행될 수 있다. 이들 방법은 예로서, 형광 분자 또는 방사성 핵종을 표지로서 이용한 제자리 혼성화에 이용된다. 유전자 발현의 검출을 위한 다른 방법은 예로서, 리포터 유전자의 활성의 검출을 포함한다.
영상화 기술의 다른 일반적인 유형은 광학적 영상화인데, 여기서 개체 내에 형광 신호는 개체의 외부에 있는 광학적 장치에 의해 검출된다. 이들 신호는 실제 형광 및/또는 생물발광에 기인할 수 있다. 광학적 검출 장치의 감수성에서 향상은 생체내 진단적 검정을 위한 광학적 영상화의 유용성을 증가시켰다.
다른 기술의 리뷰를 위해, N. Blow, Nature Methods, 6, 465-469, 2009를 참조한다.
조직학/세포학 방법을 이용한 생물마커의 결정
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 생물마커는 조직학적 또는 세포학적 방법을 이용하여 다양한 조직 표본에서 검출될 수 있다. 가령, 기관지내 및 경기관지 생검, 미세 바늘 흡인물, 절단 바늘, 그리고 코어 생검이 조직학에 이용될 수 있다. 기관지 세척 및 브러싱, 흉막 흡인, 그리고 객담이 세포학에 이용될 수 있다. 본원에서 확인된 임의의 생물마커는 질환의 징조로서 검체를 염색하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 상응하는 생물마커/생물마커들에 특이적인 하나 또는 그 이상의 포획 시약/시약들이 표본의 세포학적 평가에서 이용되고, 그리고 다음 중에서 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다: 세포 표본을 수집하고, 세포 표본을 고정시키고, 탈수시키고, 청소하고, 세포 표본을 현미경 슬라이드 위에 고정시키고, 세포 표본을 투과하고, 피분석물 회수를 위해 처리하고, 염색하고, 탈염하고, 세척하고, 차단하고, 그리고 완충된 용액에서 하나 또는 그 이상의 포획 시약/시약들과 반응시킨다. 다른 구체예에서, 세포 표본은 세포 블록으로부터 생산된다.
일부 구체예에서, 상응하는 생물마커에 특이적인 하나 또는 그 이상의 포획 시약/시약들은 조직 표본의 조직학적 평가에서 이용되고, 그리고 다음 중에서 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다: 조직 검체를 수집하고, 조직 표본을 고정시키고, 탈수시키고, 청소하고, 조직 표본을 현미경 슬라이드 위에 고정시키고, 조직 표본을 투과하고, 피분석물 회수를 위해 처리하고, 염색하고, 탈염하고, 세척하고, 차단하고, 재수화시키고, 그리고 완충된 용액에서 포획 시약/시약들과 반응시킨다. 다른 구체예에서, 고정 및 탈수는 동결로 대체된다.
다른 구체예에서, 상응하는 생물마커/생물마커들에 특이적인 하나 또는 그 이상의 앱타머/앱타머들이 조직학적 또는 세포학적 표본과 반응되고, 그리고 핵산 증폭 방법에서 핵산 표적으로서 역할을 할 수 있다. 적합한 핵산 증폭 방법은 예로서, PCR, q-베타 복제효소, 회전환 증폭, 가닥 대체, 헬리카아제 의존성 증폭, 루프 매개된 등온 증폭, 리가아제 연쇄 반응, 그리고 제한 및 환상 보조된 회전환 증폭을 포함한다.
한 구체예에서, 조직학적 또는 세포학적 평가에서 이용을 위한 상응하는 생물마커에 특이적인 하나 또는 그 이상의 포획 시약/시약들은 다음 중에서 한 가지를 포함할 수 있는 완충된 용액에서 혼합된다: 차단 물질, 경쟁자, 세정제, 안정제, 담체 핵산, 다가음이온 물질 등.
"세포학 프로토콜"은 일반적으로, 표본 수집, 표본 고정, 표본 부동화 및 염색을 포함한다. "세포 제조물"은 제조된 세포의 염색을 위한 하나 또는 그 이상의 앱타머의 이용을 비롯하여, 표본 수집 후 여러 처리 단계를 포함할 수 있다.
질량 분광분석법 방법을 이용한 생물마커 수준의 결정
다양한 형상의 질량분광계가 생물마커 수준을 검출하는데 이용될 수 있다. 여러 유형의 질량분광계가 가용하거나 또는 다양한 형상에서 생산될 수 있다. 일반적으로, 질량분광계는 다음의 주요 성분을 갖는다: 표본 주입구, 이온 공급원, 질량 분석기, 검출기, 진공 시스템, 기기-제어 장치, 그리고 데이터 시스템. 표본 주입구, 이온 공급원 및 질량 분석기에서 차이는 일반적으로, 기기의 유형 및 이의 능력을 규정한다. 가령, 주입구는 모세관-칼럼 액체 크로마토그래피 공급원일 수 있거나, 또는 예로서, 매트릭스-보조된 레이저 탈착에서 이용되는 직접적인 프로브 또는 스테이지일 수 있다. 통상적인 이온 공급원은 예로서, 나노스프레이 및 마이크로스프레이를 비롯한 전기분무, 또는 매트릭스-보조된 레이저 탈착일 수 있다. 통상적인 질량 분석기는 사중극 질량 필터, 이온 트랩 질량 분석기 및 비행 시간 질량 분석기를 포함한다. 추가 질량 분광분석법 방법은 당해 분야에서 널리 공지된다 (Burlingame et al. Anal. Chem. 70:647 R-716R (1998); Kinter and Sherman, New York (2000)을 참조한다).
단백질 생물마커 및 생물마커 수준은 다음 중에서 한 가지에 의해 검출되고 계측될 수 있다: 전기분무 이온화 질량 분광분석법 (ESI-MS), ESI-MS/MS, ESI-MS/(MS)n, 매트릭스-보조된 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분광분석법 (MALDI-TOF-MS), 표면-증강된 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광분석법 (SELDI-TOF-MS), 실리콘 상에서 탈착/이온화 (DIOS), 이차성 이온 질량 분광분석법 (SIMS), 사중극 비행 시간 (Q-TOF), 탠덤 비행 시간 (TOF/TOF) 기술, 소위 울트라플렉스 III TOF/TOF, 대기압 화학적 이온화 질량 분광분석법 (APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI-(MS)N, 대기압 광이온화 질량 분광분석법 (APPI-MS), APPI-MS/MS 및 APPI-(MS)N, 사중극 질량 분광분석법, 푸리에 변환 질량 분광분석법 (FTMS), 정량적 질량 분광분석법, 그리고 이온 트랩 질량 분광분석법.
표본 준비 전략이 단백질 생물마커의 질량 분광 특징화 및 생물마커 수준의 결정 전에 표본을 표지화하고 농축하는데 이용된다. 표지화 방법은 상대적 및 절대적 정량 (iTRAQ)을 위한 등압 태그, 그리고 세포 배양 중인 아미노산에서 안정성 동위원소 표지화 (SILAC)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 질량 분광 분석에 앞서 후보 생물마커 단백질에 대한 표본을 선별적으로 농축하는데 이용되는 포획 시약은 앱타머, 항체, 핵산 프로브, 키메라, 소형 분자, F(ab')2 단편, 단일 사슬 항체 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 핵산, 렉틴, 리간드-결합 수용체, 아피바디, 나노바디, 안키린, 도메인 항체, 대안적 항체 골격 (가령, 디아바디 등), 각인된 중합체, 아비머, 펩티드모방체, 펩토이드, 펩티드 핵산, 트레오스 핵산, 호르몬 수용체, 사이토킨 수용체, 합성 수용체, 그리고 이들의 변형 및 단편을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
전술한 검정은 본원에서 설명된 방법에서 유용한 생물마커 수준의 검출을 할 수 있게 하고, 여기서 상기 방법은 개체로부터 생물학적 표본에서, 표 3, 4, 6, 7, 8 및 9에서 생물마커에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 또는 최소한 9개의 생물마커를 검출하는 것을 포함한다. 다양한 구체예에서, 이들 방법은 본원에서 설명된 생물마커의 군, 예를 들면, 표 5에서 도시된 패널 및 표 3, 4, 6, 7, 8 및 9에서 도시된 생물마커의 부분집합 중에서 한 가지에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 생물마커의 수준을 검출하는 것을 포함한다. 따라서, 설명된 생물마커 중에서 일부가 NAFLD 및/또는 NASH를 검출하는데 단독으로 유용할 수 있긴 하지만, 2개 또는 그 이상 생물마커의 패널을 형성하기 위한 복수 생물마커 및 이들 생물마커의 부분집합의 군화를 위한 방법 역시 본원에서 설명된다. 본원에서 설명된 방법 중에서 한 가지에 따라서, 생물마커 수준은 개별적으로 검출되고 분류될 수 있거나, 또는 이들은 예로서, 멀티플렉스 검정 형식에서처럼 집합적으로 검출되고 분류될 수 있다.
생물마커의 분류 및 질환 점수의 계산
일부 구체예에서, 소정의 진단적 시험을 위한 생물마커 "서명"은 한 세트의 생물마커를 내포하고, 각 생물마커는 관심되는 개체군에서 특징적인 수준을 갖는다. 일부 구체예에서, 특징적인 수준은 특정 군에서 개체에 대한 생물마커 수준의 평균 또는 평균을 지칭할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 진단적 방법은 개체로부터 미지의 표본을 2가지 군, NAFLD 군 또는 정상적인 군 중에서 한 가지에 배정하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 진단적 방법은 개체로부터 미지의 표본을 2가지 군, NASH 군 또는 NAFLD 군 중에서 한 가지로 배정하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 진단적 방법은 개체로부터 미지의 표본을 3가지 군: 정상적인 군, NASH가 아닌 NAFLD 군 및 NASH 군 중에서 한 가지에 배정하는데 이용될 수 있다.
2가지 또는 그 이상의 군 중에서 한 가지로 표본의 배정은 분류로서 알려져 있고, 그리고 이러한 배정을 달성하는데 이용된 절차는 분류기 또는 분류 방법으로서 알려져 있다. 분류 방법은 채점 방법으로서 또한 지칭될 수 있다. 한 세트의 생물마커 수준으로부터 진단적 분류기를 구축하는데 이용될 수 있는 많은 분류 방법이 있다. 일부 경우에, 분류 방법은 감독된 학습 기술을 이용하여 수행되는데, 여기서 데이터 세트는 식별하는 것이 희망되는 2가지 (또는 그 이상, 복수 분류 상태의 경우) 상이한 군 내에서 개체로부터 획득된 표본을 이용하여 수집된다. 각 표본이 속하는 부류 (군 또는 개체군)가 각 표본에 대해 사전에 알려져 있기 때문에, 분류 방법은 원하는 분류 반응을 제공하도록 훈련될 수 있다. 진단적 분류기를 산출하기 위해 무감독 학습 기술을 이용하는 것이 또한 가능하다.
진단적 분류기를 개발하기 위한 통상적인 접근법은 의사결정 나무; 배깅 + 부스팅 + 포레스트; 규칙 추론 기초된 학습; 파르젠 윈도우; 선형 모형; 로지스틱; 신경망 방법; 무감독 군집화; K-수단; 계층적 올림/내림; 반-감독된 학습; 기본형 방법; 최근접 이웃; 핵 밀도 추정; 서포트 벡터 기계; 숨겨진 마르코프 모형; 볼츠만 학습을 포함하고; 그리고 분류기는 단순히 또는 특정 목적 함수를 최소화하는 방식으로 합동될 수 있다. 리뷰를 위해, 가령, Pattern Classification, R.O. Duda, et al., 편집자, John Wiley & Sons, 2nd edition, 2001을 참조한다; 또한, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, et al., editors, Springer Science+Business Media, LLC, 2nd edition, 2009를 참조한다.
감독된 학습 기술을 이용하여 분류기를 생산하기 위해, 훈련 데이터로 불리는 한 세트의 표본이 획득된다. 진단적 시험의 맥락에서, 훈련 데이터는 미지의 표본이 추후 배정될 상이한 군 (부류)으로부터 표본을 포함한다. 가령, 대조 개체군에서 개체 및 특정 질환 개체군에서 개체로부터 수집된 표본은 미지의 표본 (또는 더욱 구체적으로, 이들 표본이 획득되었던 개체)을 질환을 앓는 것으로 또는 질환이 없는 것으로 분류할 수 있는 분류기를 개발하기 위한 훈련 데이터를 구성할 수 있다. 훈련 데이터로부터 분류기의 개발은 분류기를 훈련하는 것으로 알려져 있다. 분류기 훈련에 대한 특정한 상세는 감독된 학습 기술의 성격에 의존한다. 나이브 베이지안 분류기를 훈련하는 것은 이런 감독된 학습 기술의 실례이다 (가령, Pattern Classification, R.O. Duda, et al., 편집자, John Wiley & Sons, 2nd edition, 2001을 참조한다; 또한, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, et al., editors, Springer Science+Business Media, LLC, 2nd edition, 2009를 참조한다). 나이브 베이지안 분류기의 훈련은 예로서, U.S. 공개 번호: 2012/0101002 및 2012/0077695에서 설명된다.
훈련 세트에서 표본보다 많은 더욱 가능성 있는 생물마커 수준이 전형적으로 있기 때문에, 과다적합을 방지하는데 유의해야 한다. 과다적합은 통계 모형이 근원적인 관계 대신에 무작위 오차 또는 잡음을 설명할 때 발생한다. 과다적합은 예로서, 분류기를 개발하는데 이용된 생물마커의 숫자를 제한하고, 생물마커 반응이 서로 무관하다고 가정하고, 이용된 근원적인 통계 모형의 복잡성을 제한하고, 그리고 근원적인 통계 모형이 데이터에 합치하도록 담보하는 것을 비롯한 다양한 방식으로 회피될 수 있다.
한 세트의 생물마커를 이용한 진단적 시험의 개발의 예시적인 실례는 생물마커의 엄격한 독립된 처리와 함께 베이즈 정리에 근거된 단순한 확률적 분류기인 나이브 베이즈 분류기의 적용을 포함한다. 각 생물마커는 각 부류에서 계측된 RFU 값 또는 로그 RFU (상대적 형광 단위) 값에 대한 부류-의존성 확률 밀도 함수 (pdf)에 의해 설명된다. 한 부류에서 생물마커의 세트에 대한 조인트 pdfs는 각 생물마커에 대한 개별 부류-의존성 pdfs의 산물인 것으로 가정된다. 이러한 문맥에서 나이브 베이즈 분류기를 훈련하는 것은 부류 의존성 pdfs를 특징짓기 위해 파라미터를 배정하는 것에 이른다 ("파라미터화"). 부류-의존성 pdfs에 대한 임의의 근원적인 모형이 이용될 수 있지만, 상기 모형은 훈련 세트에서 관찰된 데이터에 전반적으로 합치되어야 한다.
나이브 베이즈 분류기의 성과는 분류기를 구축하고 훈련하는데 이용된 생물마커의 숫자 및 품질에 의존한다. 단일 생물마커는 이의 KS-거리 (Kolmogorov-Smirnov)에 따라서 수행될 것이다. 우수한 KS 거리 (>0.3, 예로서)를 갖는 차후 생물마커의 부가는 일반적으로, 차후에 부가된 생물마커가 첫 번째 생물마커와 무관하면 분류 성과를 향상시킬 것이다. 감수성 플러스 특이성을 분류기 점수로서 이용하여, 많은 높은 채점 분류기는 탐욕 알고리즘의 변이로 산출될 수 있다. (탐욕 알고리즘은 전체 최적값을 발견하는 희망으로 각 시기에서 국부 최적 선택을 하는 메타휴릭스틱 문제 해결을 추종하는 임의의 알고리즘이다.)
분류기 성과를 묘사하는 다른 방식은 수신자 작동 특성 (ROC), 또는 단순히 ROC 곡선 또는 ROC 플롯을 통하는 것이다. ROC는 식별 역치가 변함에 따라서, 이진 분류기 시스템에 대한 감수성, 또는 진양성 비율 대 가양성 비율 (1 - 특이성 또는 1 - 진음성 비율)의 그래픽적 플롯이다. ROC는 또한, 양성 중에서 진양성의 분율 (TPR = 진양성 비율) 대 음성 중에서 가양성의 분율 (FPR = 가양성 비율)을 플롯팅함으로써 동등하게 대표될 수 있다. 상대적 작동 특성 곡선으로서 또한 알려져 있는데, 그 이유는 이것이 규준이 변함에 따라서 2가지 작동 특성 (TPR & FPR)의 비교이기 때문이다. ROC 곡선 (AUC) 아래 면적은 진단 정확도의 요약 척도로서 통상적으로 이용된다. 이것은 0.0 내지 1.0의 값을 취할 수 있다. AUC는 중요한 통계학적 성질을 갖는다: 분류기의 AUC는 분류기가 무작위로 선택된 음성 사례보다 무작위로 선택된 양성 사례를 높게 순위매길 확률과 동등하다 (Fawcett T, 2006. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters .27: 861-874). 이것은 윌콕슨 순위 검정과 동등하다 (Hanley, J.A., McNeil, B.J., 1982. The meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve. Radiology 143, 29-36.).
예시적인 구체예는 NAFLD를 앓는 개체를 확인하기 위한 진단적 시험을 산출하기 위해 다양한 조합에서, 표 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9로부터 하나 또는 그 이상의 생물마커가 있거나 또는 없이, 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 수많은 생물마커를 이용한다. 표 3, 4, 6, 7, 8, 9, 15 및 16에서 열거된 생물마커는 분류기를 산출하기 위해 많은 방식에서 합동될 수 있다. 일부 구체예에서, 생물마커의 패널은 선별되는 특정한 진단적 성과 규준에 따라 생물마커의 상이한 세트로 구성된다. 가령, 생물마커의 일정한 조합은 다른 조합보다 더욱 민감한 (또는 더욱 특이적인) 시험을 산출할 수 있다. 일부 구체예에서, NAFLD를 앓는 개체를 확인하기 위한 생물마커의 패널은 표 5에서 패널에서 선택된다.
예시적인 구체예는 지방증을 앓는 개체를 확인하기 위한 진단적 시험을 산출하기 위해 다양한 조합에서, 표 3, 4, 6, 7, 8 및/또는 9로부터 하나 또는 그 이상의 생물마커가 있거나 또는 없이, 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 수많은 생물마커를 이용한다. 표 3, 4, 6, 7, 8, 9, 15 및 16에서 열거된 생물마커는 분류기를 산출하기 위해 많은 방식에서 합동될 수 있다. 일부 구체예에서, 생물마커의 패널은 선별되는 특정한 진단적 성과 규준에 따라 생물마커의 상이한 세트로 구성된다. 가령, 생물마커의 일정한 조합은 다른 조합보다 더욱 민감한 (또는 더욱 특이적인) 시험을 산출할 수 있다. 일부 구체예에서, 지방증을 앓는 개체를 확인하기 위한 생물마커의 패널은 표 5에서 패널에서 선택된다. 일부 구체예에서, 지방증을 앓는 개체를 확인하기 위한 생물마커의 패널은 표 3에서 생물마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 지방증을 앓는 개체를 확인하기 위한 생물마커의 패널은 표 8에서 생물마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 지방증을 앓는 개체를 확인하기 위한 생물마커의 패널은 표 15로부터 최소한 5개의 생물마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 지방증을 앓는 개체를 확인하기 위한 생물마커의 패널은 표 16으로부터 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 또는 5개의 생물마커를 포함한다.
예시적인 구체예는 소엽 염증을 앓는 개체를 확인하기 위한 진단적 시험을 산출하기 위해 다양한 조합에서, 하나 또는 그 이상의 추가 생물마커가 있거나 또는 없이, 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 수많은 생물마커를 이용한다. 일부 구체예에서, 생물마커의 패널은 선별되는 특정한 진단적 성과 규준에 따라 생물마커의 상이한 세트로 구성된다. 가령, 생물마커의 일정한 조합은 다른 조합보다 더욱 민감한 (또는 더욱 특이적인) 시험을 산출할 수 있다. 일부 구체예에서, 소엽 염증을 앓는 개체를 확인하기 위한 생물마커의 패널은 ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B 및 POR에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 또는 8개의 생물마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 소엽 염증을 앓는 개체를 확인하기 위한 생물마커의 패널은 ACY1, THBS2, COLEC11, 그리고 ITGA1/ITGB1 및 POR에서 선택되는 최소한 1개 또는 2개의 추가 생물마커를 포함한다.
예시적인 구체예는 간세포 팽창을 앓는 개체를 확인하기 위한 진단적 시험을 산출하기 위해 다양한 조합에서, 하나 또는 그 이상의 추가 생물마커가 있거나 또는 없이, 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 수많은 생물마커를 이용한다. 일부 구체예에서, 생물마커의 패널은 선별되는 특정한 진단적 성과 규준에 따라 생물마커의 상이한 세트로 구성된다. 가령, 생물마커의 일정한 조합은 다른 조합보다 더욱 민감한 (또는 더욱 특이적인) 시험을 산출할 수 있다. 일부 구체예에서, 간세포 팽창을 앓는 개체를 확인하기 위한 생물마커의 패널은 ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, C7, POR, LGALS3BP 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 또는 8개의 생물마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 간세포 팽창을 앓는 개체를 확인하기 위한 생물마커의 패널은 ACY1, COLEC11, THBS2, 그리고 ITGA1/ITGB1 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 최소한 1개 또는 2개의 추가 생물마커를 포함한다.
예시적인 구체예는 섬유증을 앓는 개체를 확인하기 위한 진단적 시험을 산출하기 위해 다양한 조합에서, 하나 또는 그 이상의 추가 생물마커가 있거나 또는 없이, 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 수많은 생물마커를 이용한다. 일부 구체예에서, 생물마커의 패널은 선별되는 특정한 진단적 성과 규준에 따라 생물마커의 상이한 세트로 구성된다. 가령, 생물마커의 일정한 조합은 다른 조합보다 더욱 민감한 (또는 더욱 특이적인) 시험을 산출할 수 있다. 일부 구체예에서, 섬유증을 앓는 개체를 확인하기 위한 생물마커의 패널은 C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 DCN에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 최소한 10개, 최소한 11개, 최소한 12개, 최소한 13개, 또는 14개의 생물마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 섬유증을 앓는 개체를 확인하기 위한 생물마커의 패널은 C7, COLEC11, THBS2, 그리고 ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1 및 DCN에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개 또는 3개의 추가 생물마커를 포함한다.
예시적인 구체예는 NASH를 앓는 개체를 확인하기 위한 진단적 시험을 산출하기 위해 다양한 조합에서, 하나 또는 그 이상의 추가 생물마커가 있거나 또는 없이, 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 수많은 생물마커를 이용한다. 표 3, 4, 6, 7, 8, 9, 15 및 16에서 열거된 생물마커는 분류기를 산출하기 위해 많은 방식에서 합동될 수 있다. 일부 구체예에서, 생물마커의 패널은 선별되는 특정한 진단적 성과 규준에 따라 생물마커의 상이한 세트로 구성된다. 가령, 생물마커의 일정한 조합은 다른 조합보다 더욱 민감한 (또는 더욱 특이적인) 시험을 산출할 수 있다. 일부 구체예에서, NASH를 앓는 개체를 확인하기 위한 생물마커의 패널은 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 생물마커 단백질로부터 N 생물마커 단백질을 포함하고, 여기서 N은 최소한 5이다.
예시적인 구체예는 NAFLD, 지방증 및/또는 NASH를 앓는 개체를 확인하기 위한 진단적 시험을 산출하기 위해 다양한 조합에서, 하나 또는 그 이상의 추가 생물마커가 있거나 또는 없이, 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 수많은 생물마커를 이용한다. 표 3, 4, 6, 7, 8, 9, 15 및 16에서 열거된 생물마커는 분류기를 산출하기 위해 많은 방식에서 합동될 수 있다. 일부 구체예에서, 생물마커의 패널은 선별되는 특정한 진단적 성과 규준에 따라 생물마커의 상이한 세트로 구성된다. 가령, 생물마커의 일정한 조합은 다른 조합보다 더욱 민감한 (또는 더욱 특이적인) 시험을 산출할 수 있다. 일부 구체예에서, NAFLD, 지방증 및/또는 NASH를 앓는 개체를 확인하기 위한 생물마커의 패널은 표 5에서 패널에서 선택된다. 일부 구체예에서, NAFLD, 지방증 및/또는 NASH를 앓는 개체를 확인하기 위한 생물마커의 패널은 표 15 및/또는 표 16에서 열거된 생물마커 단백질로부터 N 생물마커 단백질을 포함하고, 여기서 N은 최소한 5이다.
일부 구체예에서, 일단 패널이 하나 또는 그 이상의 추가 생물마커가 있거나 또는 없이, 표 15 및/또는 표 16으로부터 생물마커의 특정 세트를 포함하는 것으로 규정되고, 그리고 분류기가 한 세트의 훈련 데이터로부터 구축되면, 진단적 시험 파라미터는 완전하다. 일부 구체예에서, 생물학적 표본은 분류에 이용된 유관한 정량적 생물마커 수준을 산출하기 위해 하나 또는 그 이상의 검정에서 실행된다. 계측된 생물마커 수준은 분류, 그리고 부류 배정의 신뢰도를 반영하는 표본에 대한 임의선택적 점수를 출력하는 분류 방법에 대한 입력으로서 이용된다.
일부 구체예에서, 생물학적 표본은 임의선택적으로 희석되고 다중화된 앱타머 검정에서 실행되고, 그리고 데이터는 아래와 같이 사정된다. 첫 번째, 검정으로부터 데이터가 임의선택적으로 정규화되고 보정되고, 그리고 결과의 생물마커 수준이 베이즈 분류 체계에 대한 입력으로서 이용된다. 두 번째, 로그 우도 비율이 각 계측된 생물마커에 대해 개별적으로 연산되고, 그리고 이후, 합산되어 최종 분류 점수가 산출되는데, 이것은 진단 점수로서 또한 지칭된다. 결과의 배정뿐만 아니라 전반적인 분류 점수가 보고될 수 있다. 일부 구체예에서, 각 생물마커 수준에 대해 연산된 개체 로그 우도 위험 요인 역시 보고될 수 있다.
키트
본원에서 설명된 생물마커의 임의의 조합은 예로서, 본원에서 개시된 방법을 수행하는데 이용하기 위한 적합한 키트를 이용하여 검출될 수 있다. 게다가, 임의의 키트는 본원에서 설명된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 검출가능한 표지, 예를 들면, 형광 모이어티 등을 내포할 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 (a) 생물학적 표본에서 하나 또는 그 이상의 생물마커를 검출하기 위한 하나 또는 그 이상의 포획 시약 (가령, 예로서 최소한 하나의 앱타머 또는 항체), 그리고 임의선택적으로 (b) 생물학적 표본이 획득되었던 개체가 NAFLD, 지방증 및/또는 NASH (가령, 시기 1, 2, 3 또는 4 NASH, 또는 시기 2, 3 또는 4 NASH)를 앓는 지를 예측하기 위한 하나 또는 그 이상의 소프트웨어 또는 컴퓨터 프로그램 제품을 포함한다. 대안으로, 하나 또는 그 이상의 컴퓨터 프로그램 제품보다는, 인간에 의해 상기 단계를 수동으로 수행하기 위한 하나 또는 그 이상의 명령이 제공될 수 있다.
일부 구체예에서, 키트는 고체 지지체, 포획 시약 및 신호 발생 물질을 포함한다. 키트는 또한, 장치 및 시약을 이용하고, 표본을 취급하고, 그리고 데이터를 분석하기 위한 명령을 포함할 수 있다. 게다가, 키트는 생물학적 표본을 분석하고 분석의 결과를 보고하기 위한 컴퓨터 시스템 또는 소프트웨어에서 이용될 수 있다.
키트는 또한, 생물학적 표본을 처리하기 위한 하나 또는 그 이상의 시약 (가령, 용해화 완충액, 세정제, 세척액, 또는 완충액)을 내포할 수 있다. 본원에서 설명된 키트 중에서 한 가지는 또한, 예로서, 완충액, 차단제, 질량 분광분석법 매트릭스 물질, 항체 포획 작용제, 양성 대조 표본, 음성 대조 표본, 소프트웨어 및 정보, 예를 들면, 프로토콜, 보도 및 참고 데이터를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, NAFLD 및/또는 NASH의 분석을 위한 키트가 제공되고, 여기서 이들 키트는 본원에서 설명된 하나 또는 그 이상의 생물마커에 대한 PCR 프라이머를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 생물마커의 이용 및 NAFLD 및/또는 NASH 예후와의 상관을 위한 사용설명서를 더욱 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 키트는 본원에서 설명된 생물마커 중에서 하나 또는 그 이상의 보체를 내포하는 DNA 어레이, 시약 및/또는 표본 DNA를 증폭하거나 또는 단리하기 위한 효소를 포함할 수 있다. 키트는 실시간 PCR을 위한 시약, 예를 들면, TaqMan 프로브 및/또는 프라이머, 그리고 효소를 포함할 수 있다.
가령, 키트는 (a) 시험 표본에서 하나 또는 그 이상의 생물마커의 수준을 결정하기 위한 최소한 하나의 포획 시약을 포함하는 시약, 그리고 임의선택적으로 (b) 시험 표본에서 정량된 각 생물마커의 양을 하나 또는 그 이상의 미리 결정된 컷오프와 비교하는 단계를 수행하기 위한 하나 또는 그 이상의 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램은 상기 비교에 근거하여 정량된 각 생물마커에 대한 점수를 배정하고, 그리고 일부 구체예에서, 정량된 각 생물마커에 대한 배정된 점수를 합동하여 전체 점수를 획득한다. 게다가, 일부 구체예에서, 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램은 전체 점수를 미리 결정된 점수와 비교하고, 그리고 상기 비교를 이용하여 개체가 NAFLD, 지방증 및/또는 NASH를 앓는 지를 결정한다. 대안으로, 하나 또는 그 이상의 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램보다는, 인간에 의해 상기 단계를 수동으로 수행하기 위한 하나 또는 그 이상의 명령이 제공될 수 있다.
컴퓨터 방법 및 소프트웨어
일단 생물마커 또는 생물마커 패널이 선별되면, 개체에서 NAFLD를 사정하기 위한 방법은 다음을 포함할 수 있다: 1) 생물학적 표본을 수집하거나 또는 만약 그렇지 않으면 획득하고; 2) 생물학적 표본에서 패널 내에 생물마커 또는 생물마커들을 검출하고 계측하기 위한 분석법을 수행하고; 그리고 3) 생물마커 수준의 결과를 보고한다. 일부 구체예에서, 생물마커 수준의 결과는 정량적으로보다는 정성적으로, 예를 들면, 예로서 제안된 진단 ("NAFLD," "지방증," "NASH," "NASH 시기 2, 3 또는 4," 등) 또는 "양성" 및 "음성"이 규정된 경우에 단순히 양성 / 음성 결과가 보고된다. 일부 구체예에서, 개체에서 NAFLD를 사정하기 위한 방법은 다음을 포함할 수 있다: 1) 생물학적 표본을 수집하거나 또는 만약 그렇지 않으면 획득하고; 2) 생물학적 표본에서 패널 내에 생물마커 또는 생물마커들을 검출하고 계측하기 위한 분석법을 수행하고; 3) 임의의 데이터 정규화 또는 표준화를 수행하고; 4) 각 생물마커 수준을 계산하고; 그리고 5) 생물마커 수준의 결과를 보고한다. 일부 구체예에서, 생물마커 수준은 일부 방식으로 합동되고, 그리고 합동된 생물마커 수준에 대한 단일 값이 보고된다. 이러한 접근법에서, 일부 구체예에서, 보고된 값은 질환의 존재 또는 부재의 징조인 미리 설정된 역치값과 비교되는 모든 생물마커 계산의 합으로부터 결정된 단일 숫자일 수 있다. 또는 진단 점수는 생물마커 값을 각각 나타내는 일련의 막대일 수 있고, 그리고 반응의 패턴은 질환의 존재 또는 부재의 결정을 위해 미리 설정된 패턴과 비교될 수 있다.
본원에서 설명된 방법의 최소한 일부 구체예는 컴퓨터의 이용으로 실행될 수 있다. 컴퓨터 시스템 100의 실례는 도면 9에서 도시된다. 도면 9에 관하여, 프로세서 101, 입력 장치 102, 출력 장치 103, 저장 장치 104, 컴퓨터-판독가능한 저장 매체 판독기 105a, 통신 시스템 106 처리 가속 (가령, DSP 또는 특수-목적 프로세서) 107 및 메모리 109를 포함하는, 버스 108을 통해 전기적으로 연계되는 하드웨어 요소로 구성된 시스템 100이 도시된다. 컴퓨터-판독가능한 저장 매체 판독기 105a가 컴퓨터-판독가능한 저장 매체 105b에 더욱 연계되고, 상기 조합은 컴퓨터-판독가능한 정보를 일시적으로 및/또는 더욱 영구적으로 내포하기 위한 원격, 국부, 고정된 및/또는 제거가능한 저장 장치 플러스 저장 매체, 메모리 등을 포괄적으로 나타내고, 이들은 저장 장치 104, 메모리 109 및/또는 임의의 다른 이런 접근가능한 시스템 100 리소스를 포함할 수 있다. 시스템 100은 또한, 운영 체계 192 및 다른 코드 193, 예를 들면, 프로그램, 데이터 등을 포함하는 소프트웨어 요소 (현재 작업 메모리 191 내에 위치되는 것으로 도시됨)를 포함한다.
도면 9에 대하여, 시스템 100은 광범위한 유연성 및 적용성을 갖는다. 따라서, 예로서 현재 바람직한 프로토콜, 프로토콜 변이, 연장 등에 따라서 더욱 설정될 수 있는 하나 또는 그 이상의 서버를 실행하기 위해 단일 구조가 활용될지도 모른다. 하지만, 구체예가 더욱 특정한 적용 요건에 따라서 충분히 활용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 가령, 하나 또는 그 이상의 시스템 요소가 시스템 100 성분 내에 (가령, 통신 시스템 106 내에) 하위요소로서 실행될지도 모른다. 맞춤형 하드웨어가 또한 활용될지도 모르고 및/또는 특정 요소가 하드웨어, 소프트웨어 또는 둘 모두에서 실행될지도 모른다. 게다가, 다른 컴퓨팅 장치, 예를 들면, 네트워크 입출력장치 (도시되지 않음)에 연결이 이용될 수 있긴 하지만, 다른 컴퓨팅 장치에 유선, 무선, 모뎀 및/또는 다른 연결 또는 연결들이 또한 활용될 수도 있는 것으로 이해된다.
한 양상에서, 시스템은 NAFLD 및/또는 NASH에 특유한 생물마커의 특질을 내포하는 데이터베이스를 포함할 수 있다. 생물마커 데이터 (또는 생물마커 정보)는 컴퓨터 실행된 방법의 일부로서 이용을 위한, 컴퓨터에 대한 입력으로서 활용될 수 있다. 생물마커 데이터는 본원에서 설명된 바와 같은 데이터를 포함할 수 있다.
한 양상에서, 시스템은 하나 또는 그 이상의 프로세서에 입력 데이터를 제공하기 위한 하나 또는 그 이상의 장치를 더욱 포함한다.
시스템은 순위매겨진 데이터 요소의 데이터 세트를 저장하기 위한 메모리를 더욱 포함한다.
다른 양상에서, 입력 데이터를 제공하기 위한 장치는 데이터 요소의 특징을 검출하기 위한 검출기, 예를 들면, 예로서 질량분광계 또는 유전자 칩 판독기를 포함한다.
시스템은 데이터베이스 관리 시스템을 부가적으로 포함할 수 있다. 사용자 요청 또는 조회는 상기 조회를 처리하여 훈련 세트의 데이터베이스로부터 유관한 정보를 추출하는 데이터베이스 관리 시스템에 의해 이해되는 적절한 언어로 형식화될 수 있다.
시스템은 네트워크 서버 및 하나 또는 그 이상의 클라이언트가 연결되는 네트워크에 연결가능할 수 있다. 네트워크는 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 근거리 통신망 (LAN) 또는 광역 통신망 (WAN)일 수 있다. 바람직하게는, 서버는 컴퓨터 프로그램 제품 (가령, 소프트웨어)을 실행하여 사용자 요청을 처리하기 위한 데이터베이스 데이터에 접근하는데 필요한 하드웨어를 포함한다.
시스템은 데이터베이스 관리 시스템으로부터 명령을 실행하기 위한 운영 체계 (가령, UNIX® 또는 Linux)를 포함할 수 있다. 한 양상에서, 운영 체계는 전역 통신 네트워크, 예를 들면, 인터넷에서 작동하고, 그리고 전역 통신 네트워크 서버를 활용하여 이런 네트워크에 연결될 수 있다.
시스템은 당해 분야에서 공지된 그래픽 사용자 인터페이스에서 일과적으로 발견되는 바와 같이, 인터페이스 요소, 예를 들면, 버튼, 풀다운 메뉴, 화면이동 막대, 문자를 입력하기 위한 필드 등을 포함하는 그래픽 디스플레이 인터페이스를 포함하는 하나 또는 그 이상의 장치를 포함할 수 있다. 사용자 인터페이스에 입력된 요청은 시스템 데이터베이스 중에서 하나 또는 그 이상에서 유관한 정보를 찾도록 형식화하기 위해 시스템에서 애플리케이션 프로그램에 전송될 수 있다. 사용자에 의해 입력된 요청 또는 조회는 임의의 적합한 데이터베이스 언어로 구축될 수 있다.
그래픽 사용자 인터페이스는 운영 체계의 일부로서 그래픽 사용자 인터페이스 코드에 의해 산출될 수 있고, 그리고 데이터를 입력하고 및/또는 입력된 데이터를 전시하는데 이용될 수 있다. 처리된 데이터의 결과는 인터페이스에서 전시되거나, 시스템과 통신하여 프린터 상에 인쇄되거나, 기억 장치에서 저장되고 및/또는 네트워크 위에서 전송되거나, 또는 컴퓨터 판독가능 매체의 형태로 제공될 수 있다.
시스템은 데이터 요소에 관한 데이터 (가령, 발현 값)를 시스템에 제공하기 위한 입력 장치와 통신할 수 있다. 한 양상에서, 입력 장치는 예로서, 질량분광계, 유전자 칩 또는 어레이 판독기 등을 비롯한 유전자 발현 프로파일링 시스템을 포함할 수 있다.
다양한 구체예에 따른 생물마커 정보를 분석하기 위한 방법 및 기구는 임의의 적합한 방식으로, 예를 들면, 컴퓨터 시스템 상에서 작동하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 실행될 수 있다. 프로세서 및 무작위 접근 메모리, 예를 들면, 원격으로-접근가능한 애플리케이션 서버, 네트워크 서버, 개인용 컴퓨터 또는 워크스테이션을 포함하는 전통적인 컴퓨터 시스템이 이용될 수 있다. 추가 컴퓨터 시스템 성분은 기억 장치 또는 정보 저장 시스템, 예를 들면, 대량 저장 시스템 및 사용자 인터페이스, 예를 들면, 전통적인 모니터, 자판 및 추적 장치를 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 독립형 시스템이거나 또는 서버 및 하나 또는 그 이상의 데이터베이스를 포함하는 컴퓨터의 네트워크의 일부일 수 있다.
생물마커 분석 시스템은 데이터 분석을 완결하기 위한 기능 및 작업, 예를 들면, 데이터 수집, 처리, 분석, 보고 및/또는 진단을 제공할 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 컴퓨터 시스템은 생물마커에 관련된 정보를 제공받고, 저장하고, 검색하고, 분석하고, 보고할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 실행할 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 다양한 기능 또는 작업을 수행하는 복수 모듈, 예를 들면, 미가공 데이터를 처리하고 보충 데이터를 산출하기 위한 처리 모듈, 그리고 미가공 데이터 및 보충 데이터를 분석하여 질환 상태 및/또는 진단을 산출하기 위한 분석 모듈을 포함할 수 있다. NAFLD, 지방증 및/또는 NASH를 확인하는 것은 질환에 비하여 개체의 상태에 관한 추가 생물의학 정보를 비롯한 임의의 다른 정보를 산출 또는 수집하거나, 추가 시험이 바람직할 수 있는 지를 확인하거나, 또는 개체의 건강 상태를 달리 평가하는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 설명된 일부 구체예는 컴퓨터 프로그램 제품을 포함하도록 실행될 수 있다. 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨터 판독가능 매체를 포함할 수 있는데, 상기 매체에서 애플리케이션 프로그램이 컴퓨터 상에서 데이터베이스로 실행되도록 유발하기 위한 컴퓨터 판독가능 프로그램 코드가 구현된다.
본원에서 이용된 바와 같이, "컴퓨터 프로그램 제품"은 임의의 성격 (가령, 서면, 전자, 자성, 광학적 또는 기타 유사한 것)의 물리적 매체에서 내포되고 컴퓨터 또는 다른 자동화된 자료 처리 시스템에서 이용될 수 있는, 자연 또는 프로그래밍 언어 진술의 형태에서 명령의 조직화된 세트를 지칭한다. 이런 프로그래밍 언어 진술은 컴퓨터 또는 자료 처리 시스템에 의해 실행될 때, 컴퓨터 또는 자료 처리 시스템이 진술의 특정 내용에 따라서 행동하도록 유발한다. 컴퓨터 프로그램 제품은 제한 없이: 소스 및 목적 코드에서 프로그램 및/또는 컴퓨터 판독가능 매체에 내장된 시험 또는 데이터 라이브러리를 포함한다. 게다가, 컴퓨터 시스템 또는 자료 처리 설비 장치가 미리 선별된 방식으로 행동할 수 있게 하는 컴퓨터 프로그램 제품이 원본 소스 코드, 어셈블리 코드, 목적 코드, 기계 언어, 전술한 것들의 암호화된 또는 압축된 버전, 그리고 임의의 모든 등가물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다수의 형태로 제공될 수 있다.
한 양상에서, 개체가 NAFLD를 앓는 지, 개체가 지방증을 앓는 지 및/또는 개체가 NASH (가령, 시기 1, 2, 3 또는 4 NASH, 또는 시기 2, 3 또는 4 NASH)를 앓는 지를 지시하기 위한 컴퓨터 프로그램 제품이 제공된다. 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨팅 장치 또는 시스템의 프로세서에 의해 실행가능한 프로그램 코드를 구현하는 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하고, 상기 프로그램 코드는 개체로부터 생물학적 표본에 기인한 데이터를 회수하는 코드 (여기서 상기 데이터는 본원에서 설명된 생물마커 중에서 하나 또는 그 이상에 상응하는 생물마커 수준을 포함한다), 그리고 생물마커 수준의 함수로서 개체의 NAFLD, 지방증 및/또는 NASH 상태를 지시하는 분류 방법을 실행하는 코드를 포함한다.
다양한 구체예가 방법 또는 기구로서 설명되긴 했지만, 구체예는 컴퓨터와 연계된 코드, 예를 들면, 컴퓨터 상에 상주하는 또는 컴퓨터에 의해 접근가능한 코드를 통해 실행될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 가령, 상기 논의된 많은 방법을 실행하기 위해 소프트웨어 및 데이터베이스가 활용될 수 있었다. 따라서, 하드웨어에 의해 달성된 구체예에 더하여, 또 한 가지 주목할 만한 것은 이들 구체예가 컴퓨터 판독가능 프로그램 코드가 그 안에 구현된 컴퓨터 이용가능 매체로 구성된 제조 물품의 이용을 통해 달성될 수 있다는 점인데, 이것은 이러한 설명에서 개시된 기능의 실시가능성을 유발한다. 이런 이유로, 구체예가 또한 프로그램 코드 수단에서 이러한 특허에 의해 보호되는 것으로 고려되는 것이 요망된다. 게다가, 이들 구체예는 제한 없이, RAM, ROM, 자성 매체, 광학 매체, 또는 광자기 매체를 비롯한 사실상 임의의 종류의 컴퓨터-판독가능한 메모리에서 저장된 코드로서 구현될 수 있다. 훨씬 일반적으로, 이들 구체예는 소프트웨어, 또는 하드웨어, 또는 일반용 프로세서, 마이크로코드, 프로그램가능 논리 배열 (PLAs) 또는 애플리케이션-특이적 집적 회로 (ASICs)에서 작동하는 소프트웨어를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 이들의 임의의 조합에서 실행될 수 있었다.
구체예는 반송파뿐만 아니라 전송 매체를 통해 전파된 신호 (가령, 전기적 및 광학적)에서 구현된 컴퓨터 신호로서 달성될 수 있는 것으로 또한 구상된다. 따라서, 상기 논의된 다양한 유형의 정보가 구조, 예를 들면, 데이터 구조에서 형식화되고, 그리고 전송 매체를 통해 전기 신호로서 전송되거나 또는 컴퓨터 판독가능 매체에서 저장될 수 있었다.
치료 방법
일부 구체예에서, 개체가 NAFLD, 지방증, 또는 NASH를 앓는다는 결정 이후에, 상기 개체는 상기 질환의 악화를 지연시키거나 또는 예방하는 치료적 섭생을 겪는다. NAFLD, 지방증 및/또는 NASH에 대한 무제한적 예시적인 치료적 섭생은 체중 감소, 혈당 제어 및 알코올 회피를 포함한다. 일부 구체예에서, 개체는 치료적 작용제, 예를 들면, 피오글리타존, 비타민 E 및/또는 메트포르민이 제공된다. 가령, Sanyal et al., 2010, NEJM, 362: 1675-1685를 참조한다. 일부 구체예에서, 개체는 예로서, 체중 감소를 가속화하기 위해 위 우회로 (또는 유사한) 수술을 겪는다.
일부 구체예에서, NAFLD를 모니터링하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 개체가 NAFLD를 앓는 지를 결정하는 본 발명 방법은 시간 0에서 실행된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 개체에서 NAFLD의 진행을 모니터링하기 위해 시간 1에서, 그리고 임의선택적으로, 시간 2에서, 그리고 임의선택적으로, 시간 3 등에서 다시 한 번 실행된다. 일부 구체예에서, 상이한 생물마커가 개체의 질환의 현재 상태에 따라 및/또는 질환이 진행하는 것으로 생각되거나 또는 예측되는 속도에 따라, 상이한 시점에서 이용된다.
다른 방법
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 생물마커 및 방법은 의료보험료 및/또는 생명보험료를 결정하는데 이용된다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 방법의 결과는 의료보험료 및/또는 생명보험료를 결정하는데 이용된다. 일부 이런 사례에서, 의료 보험 또는 생명 보험을 제공하는 조직은 개체의 NAFLD 또는 NASH 상태에 관한 정보를 요청하거나 또는 만약 그렇지 않으면 획득하고, 그리고 상기 정보를 이용하여 개체에 대한 적절한 의료보험료 또는 생명보험료를 결정한다. 일부 구체예에서, 시험이 의료 보험 또는 생명 보험을 제공하는 조직에 의해 요청되고 비용이 지불된다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 생물마커 및 방법은 의학적 자원의 활용을 예측하고 및/또는 관리하는데 이용된다. 일부 이런 구체예에서, 이들 방법은 이런 예측의 목적으로 실행되지 않지만, 상기 방법으로부터 획득된 정보가 이런 예측 및/또는 의학적 자원의 활용의 관리에서 이용된다. 가령, 시험 시설 또는 병원은 특정 시설에서 또는 특정 지리적 지역에서 의학적 자원의 활용을 예측하고 및/또는 관리하기 위해, 많은 개체에 대해 본 발명 방법으로부터 정보를 모을 수 있다.
실시예
다음 실시예는 단지 예시적인 목적으로만 제공되고 첨부된 청구항에 의해 규정된 바와 같은 출원의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 다음 실시예에서 설명된 일과적인 분자생물학 기술은 표준 실험실 매뉴얼, 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2001)에서 설명된 바와 같이 실행될 수 있다.
실시예 1. NAFLD 연구 개체
생물마커를 확인하는데 이용된 표본은 Geisinger Health으로부터 구하였다. 혈청 표본이 수집되었고, 그리고 간 생검이 체중 감소를 위한 비만 수술을 받기 전 576명의 비만한 환자에서 수행되었다.
표본은 레드 톱 혈청 튜브에서 수집되고 프로토콜에 따라 처리되었다; 간단히 말하면, 표본은 30 분 동안 실온에서 응고하도록 허용되고, 그리고 이후, 10 분 동안 1300xg에서 원심분리되었고, 그리고 상위층은 제거되고 -80℃에서 보관되었다. 표본은 분취하기 위해 1회 및 검정을 위해 1회 해동되었다.
NAFLD를 앓는 개체를 정상적인 비만한 개체로부터 식별할 생물마커 및 NASH를 앓는 개체를 간에서 지방증을 앓는 개체로부터 식별할 생물마커를 확인하기 위해, 연구 개체는 Brunt 분류 방법 (Brunt et al., 2007, Modern Pathol., 20: S40-S48)을 이용하여, 간 생검 결과에 따라 정상, 3가지 수준의 간 지방증 (경등도, 중등도 및 중증도 지방증), 그리고 4가지 시기의 NASH로 나누어졌다. 이들 군은 표 1에서 보여 지는 바와 같이 하위분류되었다.
표 1: 지방증 및 NASH 시기 군의 하위분류
군 지방증 염증 팽창 섬유증
비만한 대조 0 0 0 0
경등도 지방증 1 0 또는 1 0 0
중등도 지방증 2 0, 1 또는 2 0 0
중증도 지방증 3 0, 1 또는 2 0 0
NASH 시기 1 1, 2 또는 3 0, 1 또는 2 1 0 또는 1
NASH 시기 2 1, 2 또는 3 0, 1 또는 2 2 2
NASH 시기 3 (가교) 1, 2 또는 3 0, 1 또는 2 2 3
NASH 시기 4 (간경변) 1, 2 또는 3 0, 1 또는 2 2 4
개체 인구학
상기 논의된 각 군에서 개체에 대한 일정한 특징은 표 2에서 도시된다.
표 2: 개체 인구학
군 여성 # 남성 # 전체 맹검 # 생검에서 연령, 평균 년 BMI, 평균 kg/m 2 LDL,
평균 mg/dl 		당뇨병을 앓는 %
대조 111 14 125 41 44.59 46.8 107.86 28 (22.4%)
경등도 지방증 44 7 51 16 45.75 46.6 112.12 15 (29.4%)
중등도 지방증 25 7 32 10 44.5 44.77 103.29 12 (37.5%)
중증도 지방증 45 9 54 17 47.11 47.75 101.11 23 (42.6%)
NASH 시기 1 93 20 113 37 46.69 47.29 103.37 58(51.3%)
NASH 시기 2 27 11 38 12 48.52 48.9 109.74 22 (57.9%)
NASH 시기 3 12 8 20 0 50.05 46.27 101.06 17(85%)
NASH 시기 4 6 4 10 0 48.7 47.22 101.9 5 (50%)
총합 363 80 443
표 2에서 보여 지는 바와 같이, 연령, 체질량 지수 및 LDL 수준이 개체에 대해 결정되었고, 그리고 모든 군을 교차하여 균형화되는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2. 생물마커 확인을 위한 멀티플렉스 앱타머 검정
전술한 군에서 정상, NAFLD 및 NASH 표본의 표본 품질은 표본 취급, 예를 들면, 전단, 세포 용해, 그리고 사례 및 대조에서 보체 활성화와 연관된 생물마커의 분포를 비교함으로써 사정되었다. 표본 품질은 우수하였고, 그리고 대조 바이어스의 사례가 없었다.
NAFLD 및 NASH를 예측하는 생물마커를 확인하기 위해, 멀티플렉스 앱타머 검정이 표본 및 대조를 분석하는데 이용되었다. 이러한 실험에서 이용된 다중화된 분석은 낮은 검출 한계 (1 pM 중앙), ~7 로그의 역동적 범위 및 ~5% 중앙 변이 계수에서, 작은 표본 용적 (~65 μl의 혈청 또는 혈장)으로부터 혈액에서 1129개 단백질을 검출하기 위한 앱타머를 포함하였다. 멀티플렉스 앱타머 검정은 예로서, Gold et al. (2010) Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. PLoS ONE 5(12): e15004; 및 U.S. 공개 번호: 2012/0101002 및 2012/0077695에서 설명된다.
안정성 선별은 절반 데이터의 많은 부분집합을 취하고 라쏘 분류기를 이용한 생물마커 선별을 수행하는데, 이것은 규칙적 로지스틱 회귀 모형이다. 가령, Meinshausen et al., 2010, J. Royal Statistical Soc: Series B (Statistical Methodology), 72: 417-473을 참조한다. 단일 생물마커에 대한 선별 통로는 상기 생물마커가 다양한 람다에 걸쳐 라쏘 모형에 의해 선별된 이들 부분집합의 비율이다. 람다는 얼마나 많은 생물마커가 라쏘에 의해 선별되는 지를 결정하는 조율 파라미터이다. 다양한 람다 값에 걸쳐 최대 선별 확률은 한 세트의 생물마커를 선별하는데 이용되는 궁극적 계량이다.
후보 생물마커는 안정성 선별에 의해 확인되었고, 이들은 이후, 랜덤 포레스트 분류기 모형을 산출하는데 이용되었다. 가령, Shi et al., J. Comput. Graph. Stat. 15(1): 118-138 (2006)을 참조한다. 간단히 말하면, 랜덤 포레스트 예측자는 개별 분류 나무 예측자의 앙상블이다. 가령, Breiman, Machine Learning, 45(1): 5-32 (2001)를 참조한다. 각 관찰을 위해, 각 개별 나무는 한 부류에 대해 투표하고, 그리고 포레스트는 복수의 투표를 갖는 부류를 예측한다. 사용자는 각 노드에서 최고 분할을 위해 검색되는 무작위로 선별된 변수 (mtry)의 숫자를 명시한다. 지니 지수는 분할 규준으로서 이용된다. 가령, Breiman et al., Classification and Regression Trees, Chapman and Hall, New York, 1984를 참조한다. 가능한 가장 큰 나무는 성장되고 전지되지 않는다. 포레스트에서 각 나무의 뿌리 노드는 본래 데이터로부터 부트스트랩 표본을 훈련 세트로서 내포한다. 본래 데이터 세트의 거의 1/3이 훈련 세트 내에 있지 않다는 관찰 결과는 아웃 오브 백 (OOB) 관찰 결과로서 지칭된다. OOB 예측에 아래와 같이 도달할 수 있다: 본래 데이터에서 사례의 경우에, 상응하는 부트스트랩 표본에서 사례를 내포하지 않은 나무만을 수반하는 복수 투표에 의해 결과를 예측한다. 이들 OOB 예측을 훈련 세트 결과와 대조함으로써, OOB 오차 비율로서 지칭되는 예측 오차 비율의 추정값에 도달할 수 있다.
일도량 분석이 비파라미터 콜모고르프 스머노프 검증 (KS 통계)을 이용하여 수행되었는데, 이것은 사례 (경등도, 중등도 및 중증도 지방증 및/또는 NASH 1-4) 및 대조 (정상적인 비만한)로서 지정된 2가지 참조 분포에 대한 각 앱타머의 누적 분포 함수 사이에 거리를 정량한다. 랜덤 포레스트 분류기의 성과는 분류기를 구축하고 훈련하는데 이용된 생물마커의 숫자 및 품질에 의존한다. 단일 생물마커는 본원에서 예시된 바와 같이 이의 KS-거리 및 이의 PCA (주성분 분석) 값에 따라서 수행될 것이다. 분류기 성과 계량이 감수성 (진양성의 분율,
Figure pct00002
) 및 특이성 (1 마이너스 가양성의 분율,
Figure pct00003
)의 합으로서 규정되면, 완벽한 분류기는 2의 점수를 가질 것이고, 그리고 무작위 분류기는 평균적으로, 1의 점수를 가질 것이다. KS-거리의 정의를 이용하여, cdf (누적 분포 함수) 함수에서 차이를 최대화시키는 값 x *는
Figure pct00004
를 야기하는 x에 대해
Figure pct00005
를 풂으로써 발견될 수 있다, 다시 말하면, KS 거리는 부류-의존성 pdfs (확률 밀도 함수)가 교차하는 경우에 발생한다. x *의 이러한 값을 KS-거리에 대한 표현으로 치환하는 것은 KS에 대한 다음의 정의를 산출하고:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
,
KS 거리는 1 마이너스 x*에서 컷오프를 갖는 시험을 이용한 오차의 전체 분율이고, 본질적으로 단일 피분석물 베이지안 분류기이다. 우리가 KS-거리의 상기 정의를 합동하여
Figure pct00010
의 점수를 규정하기 때문에, 우리는 감수성 + 특이성 = 1 + KS이라고 보고 있다. 우리는 분류기를 구축하는데 내재적으로 적합한 통계로 생물마커를 선별한다.
우수한 KS 거리 (>0.3, 예로서)를 갖는 차후 생물마커의 부가는 일반적으로, 차후에 부가된 생물마커가 첫 번째 생물마커와 무관하면 분류 성과를 향상시킬 것이다. 감수성 플러스 특이성을 분류기 점수로서 이용하여, 많은 높은 채점 분류기가 산출될 수 있다.
A. 지방증 분류기
개체 분류에 근거하여, 우리는 모든 지방증 군뿐만 아니라 NASH 시기 1-4가 간 세포에서 지방을 갖는다고 가정하였다. 분류기 (지방증, 또는 간에서 지방)는 비만한 정상적인 개체를 모든 NAFLD 개체와 비교함으로써 개발되었다.
안정성 선별에 의해 선택된 마커 (도면 1 참조)는 모형을 산출하기 위해 랜덤 포레스트 알고리즘에 공급되었다. 결과의 ROC 곡선이 제공된다 (하기 참조).
NAFLD (지방증)에 대한 9가지 마커 분류기에 대한 ROC 곡선은 도면 2에서 도시된다. 곡선 아래 면적 (AUC)은 0.90 +/- 0.03이었다. 0.5의 컷오프에서, 감수성은 92%이고 특이성은 63%이었다.
각 분류기의 모형으로부터 확률 점수, 다시 말하면, Prob(지방증)은 이것이 구축되었던 이진 결정에 더하여, 이것이 심각도/모니터링 모형으로서 이용될 수 있는 지를 사정하기 위해 모든 군을 교차하여 각 개체에 대해 플롯팅되었다 (도면 3). 상기 플롯은 지방증 없음 및 지방증 사이에 명백한 구별을 보여주고, 그리고 확률 투표가 지방증의 수준이 증가할수록 증가한다는 것을 보여준다. 모든 시기에서 NASH 개체는 중증도 지방증을 앓는다.
도면 4는 분류기에서 9가지 생물마커에 대한 누적 분포 함수 (CDFs)를 보여준다.
표 3은 9-마커 분류기에서 생물마커를 보여준다. 표 3은 또한, 일정한 생물마커에 대한 대체 명칭, 유전자 명칭 및 각 생물마커에 대한 UniProt 수탁 번호를 제공하고, 그리고 생물마커가 정상적인 개체군과 비교하여, NAFLD 개체군에서 더욱 높은 또는 더욱 낮은 수준으로 존재하는 지를 제공한다.
표 3: NAFLD에 대한 9가지 생물마커 분류기
생물마커/가성명 유전자 명칭 UniProt 모든 NAFLD 개체군에서 더욱 높은 / 더욱 낮은 생물마커 수준
아미노아실라아제-1 ACY1 Q03154 더욱 높은
성호르몬 결합 글로불린 SHBG P04278 더욱 낮은
카텝신 Z, 카텝신 P, 카텝신 X CTSZ Q9UBR2 더욱 높은
c-met, 간세포 성장 인자 수용체, Met 원종양유전자 티로신 키나아제 MET P08581 더욱 낮은
겔솔린 GSN P06396 더욱 낮은
갈렉틴-3 결합 단백질, 렉틴 갈락토시드-결합 가용성 3-결합 단백질 LGALS3BP Q08380 더욱 높은
조직-유형 플라스미노겐 활성인자, tPA PLAT P00750 더욱 높은
신경 세포 부착 분자 L1-유사 단백질 CHL1 O00533 더욱 낮은
항트롬빈 III SERPINC1 P01008 더욱 낮은
도면 3은 각 개체 군 (왼쪽에서 오른쪽으로: 정상, 경등도 지방증, 중등도 지방증, 중증도 지방증, NASH1, NASH2, NASH3, NASH4)에서 9가지 생물마커 분류기에 대한 상자 플롯을 보여준다. 각 상자 내에 흑색 라인은 데이터 포인트의 중앙 (또는 50번째 백분위수)을 나타내고, 그리고 상자 그 자체는 25번째로부터 75번째 백분위수의 데이터 포인트를 포괄하는 구역인 사분위수간 범위 (IQR)를 나타낸다. 위스커는 상기 상자의 위쪽 및 아래쪽의 1.5 x IQR 내에 데이터 포인트를 커버하도록 확장된다.
B. NASH (섬유증) 분류기
NASH를 앓는 모든 개체는 섬유증과 연관된 일부 형태의 염증 및 팽창을 앓는다. 우리는 이런 이유로, 모든 지방증 군을 NASH 시기 2, 3 및 4와 비교하였다. 진정한 섬유증 생물마커의 확인을 담보하기 위해, NASH 시기 1 군은 배제되었다.
안정성 선별에 의해 선택된 마커 (도면 5)는 모형을 산출하기 위해 랜덤 포레스트 알고리즘에 공급되었다. 결과의 ROC는 아래에 제공된다.
NASH 시기 2, 3 및 4 (섬유증)에 대한 4가지 마커 분류기에 대한 ROC 곡선은 도면 6에서 도시된다. 곡선 아래 면적 (AUC)은 0.82 +/- 0.07이었고, 0.5의 컷오프에서 감수성은 62%이고 특이성은 92%이었다.
각 분류기의 모형으로부터 확률 점수, 다시 말하면, Prob(지방증)은 이것이 구축되었던 이진 결정에 더하여, 이것이 심각도/모니터링 모형으로서 이용될 수 있는 지를 사정하기 위해 모든 군을 교차하여 각 개체에 대해 플롯팅되었다 (도면 7). 상기 플롯은 지방증 없음 및 지방증 사이에 명백한 구별을 보여주고, 그리고 확률 투표가 지방증의 수준이 증가할수록 증가한다는 것을 보여준다. 모든 시기에서 NASH 개체는 중증도 지방증을 앓는다.
표 4는 4-마커 분류기에서 생물마커를 보여준다. 표 4는 또한, 일정한 생물마커에 대한 대체 명칭, 유전자 명칭 및 각 생물마커에 대한 UniProt 수탁 번호를 제공하고, 그리고 생물마커가 모든 NAFLD 개체군과 비교하여, NASH 2, 3 및 4 개체군에서 더욱 높은 또는 더욱 낮은 수준으로 존재하는 지를 제공한다.
표 4: 지방증 (NAFLD)과 대비하여 NASH 시기 2, 3 및 4에 대한 4가지 생물마커 분류기
생물마커/가성명 유전자 명칭 UniProt 섬유증 (NASH) 개체군에서 더욱 높은 / 더욱 낮은 생물마커 수준
보체 C7 C7 P10643 더욱 높은
콜렉틴 신장 1 COLEC11 Q9BWP8 더욱 높은
펩티딜프롤릴 이성화효소 D PPID Q08752 더욱 낮은
인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 3 IGFBP3 P17936 더욱 낮은
도면 7은 각 개체 군 (왼쪽에서 오른쪽으로: 정상, 경등도 지방증, 중등도 지방증, 중증도 지방증, NASH1, NASH2, NASH3, NASH4)에서 4가지 생물마커 분류기에 대한 상자 플롯을 보여준다. 각 상자 내에 흑색 라인은 데이터 포인트의 중앙 (또는 50번째 백분위수)을 나타내고, 그리고 상자 그 자체는 25번째로부터 75번째 백분위수의 데이터 포인트를 포괄하는 구역인 사분위수간 범위 (IQR)를 나타낸다. 위스커는 상기 상자의 위쪽 및 아래쪽의 1.5 x IQR 내에 데이터 포인트를 커버하도록 확장된다.
도면 8은 분류기에서 4가지 생물마커에 대한 CDFs를 보여준다.
실시예 3. NAFLD 및/또는 NASH에 대한 추가 생물마커 및 분류기
안정성 선별은 절반 데이터의 많은 부분집합을 취하고 라쏘 분류기를 이용한 생물마커 선별을 수행하는데, 이것은 규칙적 로지스틱 회귀 모형이다. 가령, Meinshausen et al., 2010, J. Royal Statistical Soc: Series B (Statistical Methodology), 72: 417-473을 참조한다. 단일 생물마커에 대한 선별 통로는 상기 생물마커가 다양한 람다에 걸쳐 라쏘 모형에 의해 선별된 이들 부분집합의 비율이다. 람다는 얼마나 많은 생물마커가 라쏘에 의해 선별되는 지를 결정하는 조율 파라미터이다. 다양한 람다 값에 걸쳐 최대 선별 확률은 한 세트의 생물마커를 선별하는데 이용되는 궁극적 계량이다.
안정성 선별 방법을 이용하여, 다양한 군의 개체를 식별하기 위한 추가 분류기가 규정되었다. 이들 분류기 (상기 논의된 분류기 포함)는 표 5에서 도시된다. 비교 2 및 5로부터 마커는 앞서 논의된 바와 같이, 지방증 (NAFLD) 및 섬유증 (NASH)에 대한 랜덤 포레스트 분류기를 구축하는데 이용되었다.
표 5. 안정성 선별을 이용하여 획득된 분류기
비교 감수성 특이성 마커
1 NASH 시기 1 내지 4와 대비하여 대조
 0.8641304 0.8196721 ACY1, SHBG, LGALS3BP, SIGLEC7, CTSZ, MET, GSN
2 (모든 지방증 + NASH 시기 1-4)와 대비하여 대조
 0.8635015 0.7452830 ACY1, SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1, SERPINC1
3 모든 지방증과 대비하여 대조
0.7664234 0.7440000 ACY1, SHBG, SIGLEC14
4 NASH 1와 대비하여 모든 지방증
0.4901961 0.5743243 TOP1, SIGLEC14
5 NASH 시기 2-4와 대비하여 모든 지방증
0.7543860 0.8310811 C7, COLEC11, PPID,
IGFBP3
6 NASH 시기 1-4와 대비하여 모든 지방증
0.6734694 0.5983607 SIGLEC14, AIMP1, TOP1,
COLEC11, CA6, STX1A
*모든 지방증: 경등도, 중등도 및 중증도 지방증
표 5에서 비교 1은 86.4% 감수성 및 82% 특이성으로, 대조 개체를 NASH 시기 1 내지 4로부터 식별하는 7-마커 분류기를 보여준다. 비교 3은 76.6% 감수성 및 74.4 % 특이성으로, 모든 지방증 (경등도, 중등도 및 중증도)과 대비하여 대조 개체를 식별하는 3-마커 분류기를 보여준다.
상기 표 3 및 4에 있지 않은, 표 5에서 열거된 생물마커에 관한 추가 정보는 표 6에서 도시된다.
표 6: NAFLD 및/또는 NASH에 대한 추가 생물마커
생물마커/가성명 유전자 명칭 UniProt 비만한 대조와 대비하여 NASH 대 지방증에서 더욱 높은 / 더욱 낮은 생물마커 수준
시알산-결합 Ig-유사 렉틴 7 SIGLEC 7 Q9Y286 더욱 높은
Siglec-14 SIGLEC14 Q08ET2 더욱 높은
국소이성화효소 I TOP1 P11387 더욱 낮은
내피-단핵구 활성화 폴리펩티드 2 (EMAP-2) AIMP1 Q12904 더욱 낮은
탄산 탈수효소 6 CA6 Q16623 더욱 낮은
신탁신 1A STX1A Q9Y286 더욱 낮은
NASH 시기 1 내지 4와 대비하여 대조군에 대한 일도량 KS 거리에 의한 상위 25가지 생물마커는 표 7에서 도시된다. 이들 생물마커, 그리고 이들 생물마커의 조합은 대조 개체 (가령, 비만한 개체)를 NASH를 앓는 개체로부터 분리하고 및/또는 대조 개체를 지방증을 앓는 개체로부터 분리하는데 이용될 수 있다.
표 7: 상위 25가지 생물마커
생물마커 서명된 ks 거리 UniProt 비만한 대조와 대비하여 NASH에서 더욱 높은 / 더욱 낮은 생물마커 수준
ACY1 0.61843 Q03154 더욱 높은
THBS2 0.48071 P35442 더욱 높은
LGALS3BP 0.44946 Q08380 더욱 높은
KYNU 0.44146 Q16719 더욱 높은
COLEC11 0.43708 Q9BWP8 더욱 높은
CTSZ 0.42166 Q9UBR2 더욱 높은
IL19 0.41688 Q9UHD0 더욱 높은
POR 0.41021 P16435 더욱 높은
INS 0.40888 P01308 더욱 높은
SHBG -0.39253 P04278 더욱 낮은
GPT 0.37459 Q9H3H5 더욱 높은
GNS 0.37136 P15586 더욱 높은
RET 0.37043 P07949 더욱 높은
AFM 0.36986 P43652 더욱 높은
SELE 0.36239 P16581 더욱 높은
CD163 0.36146 Q86VB7 더욱 높은
ENPP7 0.35518 Q6UWV6 더욱 높은
IGFBP7 0.35063 Q16270 더욱 높은
GSN -0.34851 P06396 더욱 낮은
SIGLEC7 0.34564 Q9Y286 더욱 높은
LAMA1.LAMB1.LAMC1 0.33401 P25391 P07942 P11047 더욱 높은
IL18R1 0.31973 Q13478 더욱 높은
FN1 0.31898 P02751 더욱 높은
TGFBI 0.31823 Q15582 더욱 높은
AKR1A1 0.31421 P14550 더욱 높은
실시예 4: 앱타머를 이용한 예시적인 생물마커 검출
표본 내에 하나 또는 그 이상의 생물마커를 검출하는 예시적인 방법은 가령, Kraemer et al., PLoS One 6(10): e26332에서 설명되고, 그리고 아래에 설명된다. 정량의 3가지 상이한 방법: 마이크로어레이-기초된 혼성화, Luminex 비드-기초된 방법, 그리고 qPCR이 설명된다.
시약
HEPES, NaCl, KCl, EDTA, EGTA, MgCl2 및 Tween-20은 가령, Fisher Biosciences으로부터 구입될 수 있다. 명목상 8000 분자량의 덱스트란 황산염 나트륨 염 (DxSO4)은 가령, AIC로부터 구입될 수 있고, 그리고 최소한 20 시간 동안 1회 교환으로 탈이온수에 대해 투석된다. KOD EX DNA 중합효소는 가령, VWR로부터 구입될 수 있다. 테트라메틸암모늄 염화물 및 CAPSO는 가령, Sigma-Aldrich로부터 구입될 수 있고, 그리고 스트렙타비딘-피코에리트린 (SAPE)은 가령, Moss Inc.로부터 구입될 수 있다. 4-(2-아미노에틸)-벤젠술포닐플루오르화물 염산염 (AEBSF)은 가령, Gold Biotechnology로부터 구입될 수 있다. 스트렙타비딘-코팅된 96-웰 평판은 가령, Thermo Scientific로부터 구입될 수 있다 (Pierce 스트렙타비딘 코팅된 평판 HBC, 투명한, 96-웰, 제품 번호 15500 또는 15501). NHS-PEO4-비오틴은 가령, Thermo Scientific로부터 구입될 수 있고 (EZ-Link NHS-PEO4-비오틴, 제품 번호 21329), 무수성 DMSO에서 용해되고, 그리고 단일 이용 분취량에서 동결 보관될 수 있다. IL-8, MIP-4, 리포칼린-2, RANTES, MMP-7 및 MMP-9는 가령, R&D Systems로부터 구입될 수 있다. 레시스틴 및 MCP-1은 가령, PeproTech로부터 구입될 수 있고, 그리고 tPA는 가령, VWR로부터 구입될 수 있다.
핵산
전통적인 (아민- 및 비오틴-치환된 포함) 올리고데옥시뉴클레오티드는 가령, Integrated DNA Technologies (IDT)로부터 구입될 수 있다. Z-블록은 서열 5′- (AC-BnBn)7-AC-3′의 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드인데, 여기서 Bn은 벤질-치환된 데옥시우리딘 잔기를 표시한다. Z-블록은 전통적인 포스포라미디트 화학을 이용하여 합성될 수 있다. 앱타머 포획 시약 또한, 전통적인 포스포라미디트 화학에 의해 합성될 수 있고, 그리고 예로서, 산물을 용리하기 위한 팀버라인 TL-600 또는 TL-150 가열기 및 트리에틸암모늄 중탄산염 (TEAB) / ACN의 구배를 이용하여, 예로서, Waters Autopurification 2767 시스템 (또는 Waters 600 시리즈 반자동화 시스템)에서 80℃에서 작동하는 21.5 x75 mm PRP-3 칼럼에서 정제될 수 있다. 검출은 260 nm에서 수행되고, 그리고 분획물은 최고 분획물을 풀링하기에 앞서 주요 피크를 교차하여 수집된다.
완충액
완충액 SB18은 40 mM HEPES, 101 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 그리고 NaOH로 pH 7.5로 조정된 0.05% (v/v) Tween 20으로 구성된다. 완충액 SB17은 1 mM 트리소듐 EDTA로 보충된 SB18이다. 완충액 PB1은 10 mM HEPES, 101 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM 트리소듐 EDTA, 그리고 NaOH로 pH 7.5로 조정된 0.05% (v/v) Tween-20으로 구성된다. CAPSO 용리 완충액은 100 mM CAPSO pH 10.0 및 1 M NaCl로 구성된다. 중화 완충액은 500 mM HEPES, 500 mM HCl 및 0.05% (v/v) Tween-20을 내포한다. Agilent 혼성화 완충액은 키트 (올리고 aCGH/ChIP-온-칩 혼성화 키트)의 일부로서 공급되는 독점 제제이다. Agilent 세척 완충액 1은 독점 제제 (올리고 aCGH/ChIP-온-칩 세척 완충액 1, Agilent)이다. Agilent 세척 완충액 2는 독점 제제 (올리고 aCGH/ChIP-온-칩 세척 완충액 2, Agilent)이다. TMAC 혼성화 용액은 4.5 M 테트라메틸암모늄 염화물, 6 mM 트리소듐 EDTA, 75 mM Tris-HCl (pH 8.0) 및 0.15% (v/v) 사르코실로 구성된다. KOD 완충액 (10-배 농축된)은 1200 mM Tris-HCl, 15 mM MgSO4, 100 mM KCl, 60 mM (NH4)2SO4, 1% v/v Triton-X 100 및 1 mg/mL BSA로 구성된다.
표본 준비
혈청 (100 μL 분취량에서 -80℃에서 보관됨)은 25℃ 수조에서 10 분 동안 해동되고, 이후 표본 희석에 앞서 얼음 위에서 보관된다. 표본은 8 초 동안 온건한 와동에 의해 혼합된다. 6% 혈청 표본 용액은 0.6 mM MgCl2, 1 mM 트리소듐 EGTA, 0.8 mM AEBSF 및 2 μM Z-블록으로 보충된 0.94 x SB17 내로 희석에 의해 제조된다. 6% 혈청 원액의 일부는 0.6% 혈청 스톡을 창출하기 위해 SB17에서 10-배 희석된다. 6% 및 0.6% 스톡은 일부 구체예에서, 높은- 및 낮은-존재비 피분석물을 검출하는데 각각 이용된다.
포획 시약 (앱타머) 및 스트렙타비딘 평판 제조
앱타머는 그들의 동계 피분석물 (또는 생물마커)의 상대적 존재비에 따라 2가지 혼합물로 군화된다. 스톡 농도는 각 앱타머에 대해 4 nM이고, 그리고 각 앱타머의 최종 농도는 0.5 nM이다. 앱타머 스톡 혼합물은 SB17 완충액에서 4-배 희석되고, 5 분 동안 95℃로 가열되고, 이용에 앞서 15 분 기간에 걸쳐 37℃로 냉각되었다. 이러한 변성-복원 주기는 앱타머 이형태체 분포를 정규화하고, 그리고 따라서, 가변적 이력에도 불구하고 재현가능한 앱타머 활성을 담보하는 것으로 의도된다. 스트렙타비딘 평판은 이용에 앞서 150 μL 완충액 PB1로 2회 세척된다.
평형화 및 평판 포획
열-냉각된 2 x 앱타머 혼합물 (55 μL)은 동등한 용적의 6% 또는 0.6% 혈청 희석과 합동되어, 3% 및 0.3% 혈청을 내포하는 평형화 혼합물을 생산한다. 평판은 실리콘 밀봉 매트 (Axymat 실리콘 밀봉 매트, VWR)로 밀봉되고 37℃에서 1.5 h 동안 배양된다. 평형화 혼합물이 이후, 세척된 96-웰 스트렙타비딘 평판의 웰로 이전되고, 그리고 800 rpm에서 2 시간 동안 진탕하면서, 37℃에서 세팅된 에펜도르프 열혼합기에서 더욱 배양되었다.
수동 검정
달리 명시되지 않으면, 액체는 덤핑, 그 이후에 층상 페이퍼 타월 위에 2번의 가볍게 두드림에 의해 제거된다. 세척 용적은 150 μL이고, 그리고 모든 진탕 배양은 25℃, 800 rpm에서 세팅된 에펜도르프 열혼합기에서 행위된다. 평형화 혼합물은 피펫팅에 의해 제거되고, 그리고 평판은 1 mM 덱스트란 황산염 및 500 μM 비오틴으로 보충된 완충액 PB1로 1 분 동안 2회, 이후 완충액 PB1로 15 초 동안 4 회 세척된다. 완충액 PB1에서 1 mM NHS-PEO4-비오틴의 새로 만들어진 용액 (150 μL/웰)이 첨가되고, 그리고 평판은 진탕하면서 5 분 동안 배양된다. NHS-비오틴 용액이 제거되고, 그리고 평판은 20 mM 글리신으로 보충된 완충액 PB1로 3 회 및 완충액 PB1로 3 회 세척된다. 1 mM DxSO4로 보충된 85 μL의 완충액 PB1이 이후, 각 웰에 첨가되고, 그리고 평판은 진탕하면서 20 분 동안 5 cm의 거리에서 BlackRay UV 램프 (명목상 파장 365 nm) 하에 방사선조사된다. 표본은 새로운, 세척된 스트렙타비딘-코팅된 평판, 또는 기존의 세척된 스트렙타비딘 평판의 이용되지 않은 웰로 이전되어, 높은 및 낮은 표본 희석 혼합물을 단일 웰 내로 합동한다. 표본은 진탕하면서 실온에서 10 분 동안 배양된다. 흡착되지 않은 물질은 제거되고, 그리고 평판은 30% 글리세롤로 보충된 완충액 PB1로 각각 15 초 동안 8 회 세척된다. 평판은 이후, 완충액 PB1로 1회 세척된다. 앱타머는 실온에서 5 분 동안 100 μL CAPSO 용리 완충액으로 용리된다. 90 μL의 용출물은 96-웰 HybAid 평판으로 이전되고 10 μL 중화 완충액이 첨가된다.
반자동화 검정
흡착된 평형화 혼합물을 보유하는 스트렙타비딘 평판은 BioTek EL406 평판세척기의 데크 상에 배치되는데, 이것은 다음의 단계를 수행하도록 프로그램된다: 흡착되지 않은 물질이 흡인에 의해 제거되고, 그리고 웰이 1 mM 덱스트란 황산염 및 500 μM 비오틴으로 보충된 300 μL의 완충액 PB1로 4 회 세척된다. 웰이 이후, 300 μL 완충액 PB1로 3 회 세척된다. 완충액 PB1에서 1 mM NHS-PEO4-비오틴의 150 μL의 새로 제조된 (DMSO에서 100 mM 스톡으로부터) 용액이 첨가된다. 평판이 진탕하면서 5 분 동안 배양된다. 액체가 흡인되고, 그리고 웰이 10 mM 글리신으로 보충된 300 μL 완충액 PB1로 8 회 세척된다. 1 mM 덱스트란 황산염으로 보충된 100 μL의 완충액 PB1이 첨가된다. 이들 자동화된 단계 후, 평판은 평판세척기로부터 제거되고, 그리고 20 분 동안 5 cm의 거리에서 UV 광원 (BlackRay, 명목상 파장 365 nm) 하에 적재된 열진탕기 상에 배치된다. 상기 열진탕기는 800 rpm 및 25℃에서 세팅된다. 20 분 방사선조사 후, 표본은 새로운, 세척된 스트렙타비딘 평판 (또는 기존의 세척된 평판의 이용되지 않은 웰)으로 수동으로 이전된다. 높은-존재비 (3% 혈청+3% 앱타머 혼합물) 및 낮은-존재비 반응 혼합물 (0.3% 혈청+0.3% 앱타머 혼합물)은 이러한 시점에서 단일 웰 내로 합동된다. 이러한 "Catch-2" 평판은 BioTek EL406 평판세척기의 데크 상에 배치되고, 이것은 다음의 단계를 수행하도록 프로그램된다: 평판이 진탕하면서 10 분 동안 배양된다. 액체가 흡인되고, 그리고 웰이 30% 글리세롤로 보충된 300 μL 완충액 PB1로 21 회 세척된다. 웰이 300 μL 완충액 PB1로 5 회 세척되고, 그리고 최종 세척액이 흡인된다. 100 μL CAPSO 용리 완충액이 첨가되고, 그리고 앱타머가 진탕하면서 5 분 동안 용리된다. 이들 자동화된 단계 이후에, 평판은 이후, 평판세척기의 데크로부터 제거되고, 그리고 표본의 90 μL 분취량이 10 μL 중화 완충액을 내포하는 HybAid 96-웰 평판의 웰로 수동으로 이전된다.
맞춤 Agilent 8 x15k 마이크로어레이에 혼성화
24 μL의 중화된 용출물은 새로운 96-웰 평판으로 이전되고, 그리고 10 Cy3 앱타머로 구성된 한 세트의 혼성화 대조를 내포하는 6 μL의 10 x Agilent 블록 (올리고 aCGH/ChIP-온-칩 혼성화 키트, 큰 용적, Agilent 5188-5380)이 각 웰에 첨가된다. 30 μL 2 x Agilent 혼성화 완충액이 각 표본에 첨가되고 혼합된다. 40 μL의 결과의 혼성화 용액은 혼성화 개스킷 슬라이드 (혼성화 개스킷 슬라이드, 슬라이드 형식마다 8-마이크로어레이, Agilent)의 각 "웰" 내로 수동으로 피펫팅된다. 20 x dT 링커를 갖는 각 앱타머의 40개 뉴클레오티드 무작위 영역에 상보적인 어레이마다 10개 프로브를 보유하는 맞춤 Agilent 마이크로어레이 슬라이드는 제조업체의 프로토콜에 따라서 개스킷 슬라이드 상에 배치된다. 어셈블리 (혼성화 챔버 키트 - SureHyb에서 이용가능, Agilent)는 클램핑되고, 그리고 20 rpm에서 회전하면서 60℃에서 19 시간 동안 배양된다.
혼성화후 세척
대략 400 mL Agilent 세척 완충액 1이 2개의 별개 유리 염색 접시 각각 내로 배치된다. 슬라이드 (한 번에 2개 이내)는 세척 완충액 1에서 침수되는 동안 분해되고 분리되고, 이후 세척 완충액 1을 또한 내포하는 두 번째 염색 접시에서 슬라이드 선반으로 이전된다. 슬라이드는 교반하면서 세척 완충액 1에서 추가 5 분 동안 배양된다. 슬라이드는 37℃로 전평형화된 세척 완충액 2로 이전되고 교반하면서 5 분 동안 배양된다. 슬라이드는 아세토니트릴을 내포하는 네 번째 염색 접시로 이전되고 교반하면서 5 분 동안 배양된다.
마이크로어레이 영상화
마이크로어레이 슬라이드는 100% PMT 세팅에서 5 μm 분해능에서 Cy3-통로 및 0.05에서 가능한 XRD 옵션을 이용하여, Agilent G2565CA 마이크로어레이 스캐너 시스템으로 영상화된다. 결과의 TIFF 이미지는 GE1_105_Dec08 프로토콜을 갖는 Agilent 특질 추출 소프트웨어 버전 10.5.1.1을 이용하여 처리된다. 일차 Agilent 데이터는 보충 정보로서 가용하다 (도면 S6).
Luminex 프로브 설계
비드에 고정된 프로브는 표적 앱타머의 40개 뉴클레오티드 무작위 영역의 3' 단부에 상보적인 40개 데옥시뉴클레오티드를 갖는다. 앱타머 상보성 영역은 5′ 아미노 말단을 보유하는 헥사에틸렌글리콜 (HEG) 링커를 통해 Luminex 마이크로스피어에 연계된다. 비오틴화된 검출 데옥시올리고뉴클레오티드는 표적 앱타머의 5′ 프라이머 영역에 상보적인 17-21개 데옥시뉴클레오티드를 포함한다. 비오틴 모이어티는 검출 올리고의 3' 단부에 첨부된다.
Luminex 마이크로스피어에 프로브의 연계
프로브는 다음의 변형을 제외하고, 본질적으로 제조업체의 사용설명서에 따라서 Luminex 마이크로플렉스 마이크로스피어에 연계된다: 아미노 말단 올리고뉴클레오티드 양은 2.5 x106 마이크로스피어마다 0.08 nMol이고, 그리고 두 번째 EDC 첨가는 10 mg/mL에서 5 μL이다. 연계 반응은 25℃ 및 600 rpm에서 세팅된 에펜도르프 열진탕기에서 수행된다.
마이크로스피어 혼성화
마이크로스피어 원액 (약 40000 마이크로스피어/μL)은 마이크로스피어를 현탁하기 위해 와동되고 60 초 동안 Health Sonics 초음파 클리너 (모형: T1.9C)에서 초음파처리된다. 현탁된 마이크로스피어는 1.5 x TMAC 혼성화 용액에서 반응마다 2000 마이크로스피어로 희석되고, 그리고 와동 및 초음파처리에 의해 혼합된다. 반응마다 33 μL의 비드 혼합물이 96-웰 HybAid 평판 내로 이전된다. 1 x TE 완충액에서 7 μL의 15 nM 비오틴화된 검출 올리고뉴클레오티드 스톡이 각 반응에 추가되고 혼합된다. 10 μL의 중화된 검정 표본이 첨가되고, 그리고 평판은 실리콘 캡 매트 밀봉으로 밀봉된다. 평판은 먼저, 96℃에서 5 분 동안 배양되고, 그리고 전통적인 혼성화 오븐에서 하룻밤 동안 교반 없이 50℃에서 배양된다. 필터 평판 (Dura pore, Millipore 부품 번호 MSBVN1250, 1.2 μm 구멍 크기)은 0.5% (w/v) BSA로 보충된 75 μL 1 x TMAC 혼성화 용액으로 미리 적셔진다. 혼성화 반응으로부터 전체 표본 용적은 필터 평판으로 이전된다. 혼성화 평판은 0.5% BSA를 내포하는 75 μL 1 x TMAC 혼성화 용액으로 헹굼되고, 그리고 임의의 남아있는 물질은 필터 평판으로 이전된다. 표본은 느린 진공 하에, 약 8 초에 걸쳐 진공처리된 150 μL 완충액으로 여과된다. 필터 평판은 0.5% BSA를 내포하는 75 μL 1 x TMAC 혼성화 용액으로 1회 세척되고, 그리고 필터 평판에서 마이크로스피어는 0.5% BSA를 내포하는 75 μL 1 x TMAC 혼성화 용액에서 재현탁된다. 필터 평판은 광으로부터 보호되고 1000 rpm에서 5 분 동안 에펜도르프 열혼합기 R에서 배양된다. 필터 평판은 이후, 0.5% BSA를 내포하는 75 μL 1 x TMAC 혼성화 용액으로 1회 세척된다. 1 x TMAC 혼성화 용액에서 75 μL의 10 μg/mL 스트렙타비딘 피코에리트린 (SAPE-100, MOSS, Inc.)이 각 반응에 추가되고 1000 rpm에서 25℃에서 60 분 동안 에펜도르프 열혼합기 R에서 배양된다. 필터 평판은 0.5% BSA를 내포하는 75 μL 1 x TMAC 혼성화 용액으로 2회 세척되고, 그리고 필터 평판에서 마이크로스피어는 0.5% BSA를 내포하는 75 μL 1 x TMAC 혼성화 용액에서 재현탁된다. 필터 평판은 이후, 광으로부터 보호되고 1000 rpm에서 5 분 동안 에펜도르프 열혼합기 R에서 배양된다. 필터 평판은 이후, 0.5% BSA를 내포하는 75 μL 1 x TMAC 혼성화 용액으로 1회 세척된다. 마이크로스피어는 0.5% BSA로 보충된 75 μL 1 x TMAC 혼성화 용액에서 재현탁되고 XPonent 3.0 소프트웨어를 운영하는 Luminex 100 기기에서 분석된다. 최소한 100 마이크로스피어가 높은 PMT 보정 및 7500 내지 18000의 이중항 선별기 세팅 하에 비드 유형마다 계수된다.
QPCR 판독
qPCR에 대한 표준 곡선은 10-배 희석액 및 주형 없음 대조로, 108 내지 102개 사본의 범위에서 물에서 준비된다. 중화된 검정 표본은 diH2O 내로 40-배 희석된다. qPCR 마스터 믹스는 2 x 최종 농도에서 제조된다 (2 x KOD 완충액, 400 μM dNTP 혼합물, 400 nM 전방과 후방 프라이머 혼합물, 2 x SYBR Green I 및 0.5 U KOD EX). 10 μL의 2 x qPCR 마스터 믹스가 10 μL의 희석된 검정 표본에 첨가된다. qPCR은 96℃에서 2 분, 그 이후에 5 초 동안 96℃ 및 30 초 동안 72℃의 40 주기로 BioRad MyIQ iCycler에서 이행된다.
실시예 5. 추가 NAFLD 및 NASH 분석
실시예 1에서 설명된 표본에 대한 실시예 2에서 설명된 멀티플렉스 앱타머 검정으로부터 데이터는 로지스틱 회귀 모형을 이용한 추가 분석에 종속되었다.
안정성 선별은 절반 데이터의 많은 부분집합을 취하고 라쏘 분류기를 이용한 생물마커 선별을 수행하는데, 이것은 규칙적 로지스틱 회귀 모형이다. 가령, Meinshausen et al., 2010, J. Royal Statistical Soc: Series B (Statistical Methodology), 72: 417-473을 참조한다. 단일 생물마커에 대한 선별 통로는 상기 생물마커가 다양한 람다에 걸쳐 라쏘 모형에 의해 선별된 이들 부분집합의 비율이다. 람다는 얼마나 많은 생물마커가 라쏘에 의해 선별되는 지를 결정하는 조율 파라미터이다. 다양한 람다 값에 걸쳐 최대 선별 확률은 한 세트의 생물마커를 선별하는데 이용되는 궁극적 계량이다.
C. 지방증 분류기
개체 분류에 근거하여, 우리는 모든 지방증 군뿐만 아니라 NASH 시기 1-4가 간 세포에서 지방을 갖는다고 가정하였다. 분류기 (지방증, 또는 간에서 지방)는 비만한 정상적인 개체를 모든 NAFLD 및 NASH 개체와 비교함으로써 개발되었다.
마커는 분류기를 산출하기 위해 로지스틱 회귀 모형으로 적합되었다.
표 8은 8-마커 지방증 (NAFLD) 분류기에서 생물마커를 보여준다. 표 8은 또한, 상기 모형에 대한 로지스틱 회귀 계수 및 계수 추정에 대한 95% 신뢰 구간을 보여준다. 8-마커 분류기는 PLAT를 제외하고, 표 3에서 도시된 분류된 9-마커의 모든 마커를 내포한다.
표 8: NAFLD에 대한 8가지 생물마커 분류기
생물마커 모든 NAFLD 개체군에서 더욱 높은 / 더욱 낮은 생물마커 수준 계수 낮은 95% 신뢰 구간 높은 95% 신뢰 구간
인터셉트 23.682 0.0205235 48.665007
ACY1 더욱 높은 2.205 1.479981 3.028281
SHBG 더욱 낮은 -1.219 -1.96066 -0.52774
CTSZ 더욱 높은 3.070 1.607459 4.636245
MET 더욱 낮은 -1.900 -3.84342 -0.01765
GSN 더욱 낮은 -2.014 -4.08462 0.024845
LGALS3BP 더욱 높은 1.814 0.58276 3.132223
CHL1 더욱 낮은 -2.491 -4.46361 -0.59133
SERPINC1 더욱 낮은 -1.502 -2.96705 -0.13184
도면 12는 지방증 및 NASH 개체의 각 세트에 대한 8 마커 분류기에 대한 상자 플롯을 보여준다. 각 상자 내에 흑색 라인은 데이터 포인트의 중앙 (또는 50번째 백분위수)을 나타내고, 그리고 상자 그 자체는 25번째로부터 75번째 백분위수의 데이터 포인트를 포괄하는 구역인 사분위수간 범위 (IQR)를 나타낸다. 위스커는 상기 상자의 위쪽 및 아래쪽의 1.5 x IQR 내에 데이터 포인트를 커버하도록 확장된다. 상기 플롯은 지방증 없음 및 지방증 사이에 명백한 구별을 보여주고, 그리고 확률 투표가 지방증의 수준이 증가할수록 증가한다는 것을 보여준다. 모든 시기에서 NASH 개체는 중증도 지방증을 앓는다.
D. NASH (섬유증) 분류기
NASH를 앓는 모든 개체는 섬유증과 연관된 일부 형태의 염증 및 팽창을 앓는다. 이러한 분석을 위해, 우리는 경등도 및 중등도 지방증 군을 NASH 시기 2, 3 및 4와 비교하였다. 진정한 섬유증 생물마커의 확인을 담보하기 위해, NASH 시기 1 군은 배제되었다. 중증도 지방증을 앓는 개체는 이러한 분석에서 제외되었는데, 그 이유는 이들 개체에서 생검 표본추출이 일부 섬유증을 놓칠 수 있었기 때문이다.
마커는 모형을 산출하기 위한 분류기를 산출하기 위해 로지스틱 회귀 모형으로 적합되었다.
표 9은 8-마커 섬유증 (NASH) 분류기에서 생물마커를 보여준다. 표 9는 또한, 상기 모형에 대한 로지스틱 회귀 계수 및 계수 추정에 대한 95% 신뢰 구간을 보여준다. 8-마커 분류기는 표 4에서 도시된 분류된 4-마커의 모든 마커 플러스 4가지 추가 마커를 내포한다.
표 9: 경등도 내지 중등도 지방증 (NAFLD)과 대비하여 NASH 시기 2, 3 및 4에 대한 8가지 생물마커 분류기
생물마커/가성명 섬유증 (NASH) 개체군에서 더욱 높은 / 더욱 낮은 생물마커 수준 계수 낮은 95% 신뢰 구간 높은 95% 신뢰 구간
인터셉트 -58.307 -117.01013 -8.491203
C7 더욱 높은 2.711339 0.016014 5.569299
COLEC11 더욱 높은 0.578295 -1.01116 2.184399
PPID 더욱 낮은 -1.47222 -3.09367 0.024429
IGFBP3 더욱 낮은 -1.88591 -4.25566 0.245891
GPC5 더욱 낮은 -2.24248 -3.99262 -0.74934
HIPK3 더욱 높은 1.176491 0.286007 2.806758
IGFBP7 더욱 높은 4.363192 1.274937 8.250915
IL3RA 더욱 높은 3.106253 0.455772 6.208888
도면 13은 각 개체 군 (왼쪽에서 오른쪽으로: 정상, 경등도 지방증, 중등도 지방증, 중증도 지방증, NASH1, NASH2, NASH3, NASH4)에서 8가지 생물마커 섬유증 분류기에 대한 상자 플롯을 보여준다. 각 상자 내에 흑색 라인은 데이터 포인트의 중앙 (또는 50번째 백분위수)을 나타내고, 그리고 상자 그 자체는 25번째로부터 75번째 백분위수의 데이터 포인트를 포괄하는 구역인 사분위수간 범위 (IQR)를 나타낸다. 위스커는 상기 상자의 위쪽 및 아래쪽의 1.5 x IQR 내에 데이터 포인트를 커버하도록 확장된다.
표 9에서 섬유증 분류기에서 4가지 추가 생물마커는 각 생물마커의 대체 명칭, 유전자 명칭 및 UniProt 수탁 번호와 함께 표 10에서 도시된다.
표 10: 섬유증 8 생물마커 분류기에서 추가 생물마커
생물마커/가성명 유전자 명칭 UniProt
글리피칸-5 GPC5 Q8N158
호메오도메인-상호작용 단백질 키나아제 3 HIPK3 Q9H422
인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 7 IGFBP7 Q16270
인터류킨-3 수용체 알파
 IL3RA P26951
도면 14는 섬유증에 대한 8-마커 분류기에서 4가지 추가 마커에 대한 누적 분포 함수를 보여준다.
실시예 6. 맹검 표본의 은닉 해제
표 2에서 보여 지는 바와 같이, 대조, 경등도 지방증, 중등도 지방증, 중증도 지방증, NASH 시기 1 및 NASH 시기 2 각각에서 한 세트의 표본은 맹검이었다. 각 맹검 표본이 지방증을 앓는 개체로부터 유래할 확률은 표 8에서 도시된 8-마커 분류기를 이용하여 결정되었다. 도면 15는 실제 표본 군에 따라, 은닉 해제 후 맹검 표본에 대한 상자 플롯을 보여준다.
도면 16은 발견 세트 및 맹검 검증 세트에 대한 8-마커 지방증 분류기 성과를 보여준다. 위쪽 곡선은 발견 세트에 대한 ROC 곡선인데, 이것은 0.927 ± 0.03의 곡선 아래 면적 (AUC), 그리고 0.5의 컷오프에서 92.8%의 감수성 및 73.3%의 특이성을 갖는다. 아래쪽 곡선은 맹검 검증 세트에 대한 ROC 곡선인데, 이것은 0.889 ± 0.06의 AUC, 그리고 0.5의 컷오프에서 88%의 감수성 및 65.8%의 특이성을 갖는다.
표 10은 개체를 지방증에 대해 양성 또는 음성으로서 확인하기 위한 맹검 검증 세트에 대한 8 마커 지방증 분류기의 성과를 보여준다.
표 10: 맹검 검증 세트에 대한 8 마커 지방증 분류기의 성과
[표 10]
Figure pct00011
각 맹검 표본이 섬유증을 앓는 개체로부터 유래될 확률은 표 9에서 도시된 8-마커 분류기를 이용하여 결정되었다. 도면 17은 실제 표본 군에 따라, 은닉 해제 후 맹검 표본에 대한 상자 플롯을 보여준다.
도면 18은 발견 세트 및 2가지 상이한 맹검 검증 세트에 대한 8-마커 섬유증 분류기 성과를 보여준다. 두 번째 검증 세트는 첫 번째 검증 세트 플러스 정상적인 군 (질환에 대해 음성인 개체)을 포함한다. 상기 모형이 정상적인 군으로 훈련되지 않았기 때문에, 이것은 이들 표본에 미경험인데, 이것은 가양성을 드러낼 수 있다. 위쪽 곡선 (적색)은 발견 세트에 대한 ROC 곡선 (NASH 등급 2, 3 및 4와 대비하여 대조 (경등도+중등도 지방증))인데, 이것은 0.929 ± 0.04의 곡선 아래 면적 (AUC), 그리고 0.5의 컷오프에서 78.8%의 감수성 및 89.9%의 특이성을 갖는다. 중앙 곡선 (청색)은 첫 번째 맹검 검증 세트에 대한 ROC 곡선인데, 이것은 0.885 ± 0.11의 AUC, 그리고 0.5의 컷오프에서 66.7%의 감수성 및 84.6%의 특이성을 갖는다. 아래쪽 곡선 (시안색)은 두 번째 맹검 검증 세트에 대한 ROC 곡선인데, 이것은 0.891 ± 0.08의 AUC, 그리고 0.5의 컷오프에서 66.7%의 감수성 및 89.5%의 특이성을 갖는다.
표 11 및 12는 개체를 섬유증에 대해 양성 또는 음성으로서 확인하기 위한 2가지 맹검 검증 세트에 대한 8 마커 섬유증 분류기의 성과를 보여준다.
표 11: 첫 번째 맹검 검증 세트에 대한 8 마커 섬유증 분류기의 성과
진실/시험 음성 양성 전체
음성 22 4 26
양성 4 8 12
전체 26 12 38
표 12: 두 번째 맹검 검증 세트에 대한 8 마커 섬유증 분류기의 성과
진실/시험 음성 양성 전체
음성 60 7 67
양성 4 8 12
전체 64 15 79
도면 19는 (a) 8-마커 지방증 분류기 및 (b) 8-마커 섬유증 분류기를 이용하여, 20% 홀드-아웃 실증 세트의 2500 부트스트랩 반복의 감수성 및 특이성 분포를 보여준다. 경험적 95% 신뢰 구간이 도시될 뿐만 아니라 훈련 및 검증 추정이 도시되는데, 이들 둘 모두 95% 신뢰 구간 범위 안에 있다.
실시예 7. 소아 개체에서 분류기의 성과
소아로부터 90개의 혈청 표본이 the Pediatric Gastroenterology and Nutrition Department of the Medical College of Wisconsin으로부터 획득되었다. 표본을 기여하는 이들 개체는 4개 군에 속하였다: 비비만성 대조 (N=45), 정상적인 간 기능 검사를 갖는 비만한 개체 (N=20), 상승된 간 기능 검사를 갖는 비만한 개체 (N=7), 그리고 NASH로 진단된 개체 (N=18). 이들 표본은 표 8에서 도시된 8-마커 지방증 분류기 및 표 9에서 도시된 8-마커 섬유증 분류기를 이용하여 시험되었다.
각 소아 표본이 지방증을 앓는 개체로부터 유래될 확률은 표 8에서 도시된 8-마커 분류기를 이용하여 결정되었다. 도면 20은 실제 표본 군에 따라, 소아 표본에 대한 상자 플롯을 보여준다. 지방증 분류기는 NASH를 앓는 소아 개체를 정확하게 확인하였다.
지방증 분류기와 달리, 8-마커 섬유증 분류기는 이러한 실험에서 섬유증을 앓는 소아 개체를 효과적으로 확인하지 못하였다. (데이터 제시되지 않음.)
실시예 8. 지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및 섬유증에 대한 생물마커 패널을 개발하기 위한 생물마커 발견
총 297개 성인 혈청 표본이 분석되었다. 이들 표본은 3가지 NASH CRN 코호트로부터 유래된다: NAFLD 데이터베이스 (n=81), PIVENS 시험 (n=80), 그리고 DB2 (n=136). NAFLD 및 DB2 무리는 NAFLD 및 NASH 자연 병력을 연구하기 위해 확립되었다. PIVENS 시험 (비알코올성 지방간염을 앓는 비당뇨병성 환자의 치료를 위한 피오글리타존 대 비타민 E 대 위약)은 비당뇨병성 NASH 환자에서 치료를 조사하기 위해 NASH CRN에 의해 수행되었다. 모든 표본은 치료전 수집되었고, 그리고 혈청 수집의 6 개월 이내에 획득된 기준선 간 생검 결과를 갖는다. 표 13 및 도면 21은 기준선 간 생검으로부터 조직학적 점수 및 NAFLD 활성 점수 (NAS 점수)의 분포를 보여준다. NAS는 예로서, Kleiner et al., Hepatology 41(6):1313-21 (2005)에서 설명된 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)에 대한 조직학적 채점 시스템이다. 이것은 지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및 섬유증을 포함하는, 간 침범의 4가지 범주에 근거된다. 지방증은 0 내지 3으로 채점되고 지방증에 관련된 표면 구역의 백분율에 근거된다. 소엽 염증은 0 내지 3으로 채점되고 200x 필드마다 병소의 숫자에 근거된다. 간세포 팽창은 0 내지 2로 채점되고 팽창된 간세포의 유병률 (가령, 없음, 희귀, 또는 많음)에 근거된다. 섬유증은 0 내지 4로 채점되고 간경변 (4로 채점됨)까지 섬유증의 정도 및 위치에 근거된다.
표 13: 기준선 간 생검 조직학
범주 표본 수치 (n) 전체
0 1 2 3
지방증 44 81 102 70 297
소엽 염증 9 215 56 17 297
간세포 팽창 172 43 82 NA 297
섬유증 * 147 21/18/12 61 37 296
*1개 표본에 대한 섬유증 점수 결여
생물마커 수준은 NASH CRN 조사관 (데이터 사전에서 nashdx 분야)에 의해 제공된 NASH 진단 (NASH Dx)과 비교되었다. 양성 NASH 진단 (진단 코드 =2)은 123명 연구 참가자에 대해 기록되었다. 이들 표본은 NAFLD 아님 (진단 코드 99, n=31) 또는 NAFLD이지만 NASH 아님 (진단 코드 0, n=143)을 갖는 개체로부터 174개 표본과 비교되었다.
후보 생물마커 확인
Jonckheere-Terpstra 검증 (JT-검증)이 NASH (지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및 섬유증)의 개별 조직학적 성분의 후보 생물마커, NAS 점수, 그리고 NASH Dx를 확인하기 위해 적용되었다. JT 검증은 순차적 독립 변수 (낮은 것으로부터 높은 것으로 조직학 점수) 및 연속적 종속 변수 (SOMAscan 단백질 치수) 사이에 통계학적으로 유의한 경향이 있는 지를 결정하는데 이용될 수 있는 순위-기초된 비파라미터 검증이다. SOMAscan 프로테오믹 계측에 더하여, 20가지 연속적인 임상적 변수가 이러한 분석에서 잠재적 생물마커로서 포함되었다.
다중 비교를 교정한 후에, 유의미한 마커의 숫자 (< 0.01의 본페로니 교정된 p-값에 근거됨)는 조직학적 성분에 따라, 27 내지 132의 범위에서 변하였다 (표 14). 각 범주에서 상위 6가지 단백질에 대한 상자 플롯은 도면 22-27에서 도시된다. 이들 상위 6가지 생물마커에서 유일한 임상적 변수는 AST (도면에서 clin.ast로 표지화됨)이다.
표 14: JT-검증에 의한 유의미한 단백질의 숫자, 본페로니 교정된 p <0.01
범주 단백질의 숫자
지방증 27
염증 48
팽창 104
섬유증 132
NAS 96
NASH Dx 86
도면 22에서 보여 지는 바와 같이, 생물마커 ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1 및 CSF1R 중에서 하나 또는 그 이상이 개체가 지방증을 앓을 가능성을 결정하는데 이용될 수 있다.
도면 23에서 보여 지는 바와 같이, 생물마커 ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1 및 POR 중에서 하나 또는 그 이상이 개체가 소엽 염증을 앓을 가능성을 결정하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 임상적 AST 수준 역시 고려될 수 있다.
도면 24에서 보여 지는 바와 같이, 생물마커 ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1 및 HSP90AA1/HSP90AB1 중에서 하나 또는 그 이상이 개체가 간세포 팽창을 앓을 가능성을 결정하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 임상적 AST 수준 역시 고려될 수 있다.
도면 25에서 보여 지는 바와 같이, 생물마커 C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1 및 DCN 중에서 하나 또는 그 이상이 개체가 섬유증을 앓을 가능성을 결정하는데 이용될 수 있다.
범주를 교차하여 가장 높은 순위 혈청 단백질에서 중복이 있다. 상이한 조직학적 범주에서 질환 심각도는 관련될 수 있다. 가령, 2의 간세포 팽창 점수를 갖는 환자는 섬유증 역시 앓을 가능성이 높다. 조직학적 범주에 의한 6가지 가장 높은 순위 마커 사이에서 10개의 독특한 단백질이 있다 (표 15).
표 15: 각 조직학적 범주에서 가장 높게 순위매겨진 단백질의 중복
유전자 ID 단백질 (UniProt ID) 지방증 염증 팽창 섬유증 총합
ACY1 아미노아실라아제 1 (Q03154) + + + - 3
C7 보체 성분 7 (P10643) - - - + 1
COLEC11 콜렉틴 (Q9BWP8) - + + + 3
CSF1R 집락 자극 인자 1 수용체 (P07333) + - - - 1
DCN 데코린 (P07585) - - - + 1
HSP90AA1/HSP90AB1 열 충격 단백질 90kDa 알파/베타 (P07900/P08238) + - + + 3
ITGA1/ITGB1 인테그린, 알파 1/베타 1 (P56199/P05556) + + + + 4
KYNU 키뉴레니나아제 (Q16719) + - - - 1
POR P450 시토크롬 산화환원 효소 (P16435) + + - - 2
THBS2 트롬보스폰딘 2 (P35442) - + + + 3
표 15에서 열거된 생물마커에 더하여, 임상적 AST 수준은 소엽 염증 및 간세포 팽창에 대한 상위 6개 마커 중에서 일부를 형성하였다. 임상적 AST 수준은 당해 분야에서 공지된 일과적인 혈액 검사를 이용하여 결정된다.
중복되는 독특한 혈청 마커의 더욱 넓은 보기는 도면 28에서 도시되는데, 여기서 각 범주에서 모든 유의미한 (본페로니 교정된 p < 0.01) 단백질이 비교된다. 이러한 분석은 NASH 생물학의 복수 양상을 포착하거나, 또는 한 가지 성분에 특이적인 모형이 만들어질 수 있다는 것을 증명한다.
파일럿 모형이 극단을 나타내는 표본 (가령. 지방증 0 대 3, 팽창 0 대 2, 그리고 섬유증 0 대 3)으로부터 만들어지긴 했지만, 10x-교차검증된 성과 AUCs (0.97 ± 0.02 및 0.94 ± 0.07)는 상기 모형이 모든 표본을 교차하여 성과를 나타낸다는 것을 증명한다.
실시예 9. 지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및 섬유증에 대한 생물마커 패널의 추가 개발
생물마커 발견은 질환을 대조로부터 식별하는 일도량 KS-거리로 시작되고, 그 이후에 안정성 선별 및 질환 시기 심각도 사이에서 단조 행동에 대한 JT-검증이 뒤를 이었다. 분석 필터링 단계 각각의 요약이 아래에 제공된다. 일단 최종 후보 목록이 "최적" 방식 (특질 선별로부터 비용 함수를 통해)으로부터 1 표준 오차 이내에 마커의 가장 인색한 세트로 축소되면, 특질의 최종 세트가 각 간 질환 성분에 대해 모형을 적합시키는데 이용되었다.
간단히 말하면, 차원수 감소 및 후보 필터링은 아래의 과정을 추종하였다:
1) KS-분석: KS-거리 > 0.4 및 KS-거리 연관된 FDR < 0.05 (5%) 또는
2) 안정성 선별: 지방증, 소엽 염증, 팽창, 섬유증 및 NASHdx 각각에 대해 각각 0.45, 0.45, 0.5, 0.5, 및 0.5보다 큰 최대 선별 확률 (모형에서 진입의 비율)을 갖는 피분석물 그리고
3) JT-분석: JT-시험 연관된 FDR < 0.05 (5%)
4) 대조 피분석물: 음성 대조 피분석물, 예를 들면, 하이브컨트롤 (HybControl), 수푸리오머 (Spuriomer) 및 비인간 표적이 제거되었다
5) 부위 마커: 상이한 부위 또는 연구로부터 표본을 식별하는 마커는 각 성분 목록에서 잠재적 후보로부터 제거되었다
6) 스핀 안정성: 하위 33 백분위수 (%ile)에서 스핀까지 시간 안정성 점수 (표본 취급 실험으로부터 베이지안 모형)를 갖는 피분석물은 제거되었다
7) 재현성: 버전 3 검정 재현성 연구 동안 15%보다 큰 변동 계수 (%CV)를 갖는 것으로 결정된 피분석물은 제거되었다
8) 가우스 분포: 가우스 근사를 위해 임상적 군 (질환 대 대조)에 의해 분할된 분포의 시각적 검사가 수행되었고, 그리고 임상적 군 사이에서 비-가우스, 이정점, 또는 대단히 다른 분산 구조를 갖는 피분석물은 제거되었다.
상기 분석 이후에, 각 간 질환 성분에 대한 후보 마커가 확인되었다. 표 16은 이러한 추가 분석에서 확인된 각 조직학적 범주에 대한 최종 후보를 보여준다.
표 16: 각 조직학적 범주에서 가장 높게 순위매겨진 단백질의 중복
유전자 ID 단백질 (UniProt ID) 지방증 염증 팽창 섬유증
ACY1 아미노아실라아제 1 (Q03154) + + + +
C7 보체 성분 7 (P10643) + +
COLEC11 콜렉틴 (Q9BWP8) + + +
CSF1R 집락 자극 인자 1 수용체 (P07333) + +
DCN 데코린 (P07585) +
ITGA1/ITGB1 인테그린, 알파 1/베타 1 (P56199/P05556) + + + +
KYNU 키뉴레니나아제 (Q16719) + + +
POR P450 시토크롬 산화환원 효소 (P16435) + + + +
THBS2 트롬보스폰딘 2 (P35442) + + + +
FCGR3B 낮은 친화성 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III-B
(O75015.2)		 +
LGALS3BP 갈렉틴-3-결합 단백질
(Q08380.1)		 +
SERPINC1 항트롬빈-III
(P01008.1)		 +
IGFBP7 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 7
(Q16270.1)		 +
PIK3CA/PIK3R1 포스파티딜이노시톨 4,5-비스인산염 3-키나아제 촉매성 아단위 알파 동종형 / 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 조절 아단위 알파
(P42336.2/ P27986.2)		 +
NAGK N-아세틸-D-글루코사민 키나아제
(Q9UJ70.4)		 +
DDC 방향족-L-아미노산 탈카르복실화효소
(P20711.2)		 +
SERPINA7 티록신 결합 글로불린
(P05543.2)		 +
최종 모형은 AUC 및/또는 감수성 + 특이성 비용 함수를 이용한 특질 선별 및 유사한 성과 (피크 -1se)를 유발하는 특질의 최소 세트의 조합을 이용하여 만들어졌다. 도면 29 내지 32는 특질 선별 알고리즘의 검색 진행을 보여준다. AUC를 비용 (다시 말하면, 성과) 계량으로서 이용하여, 특질/생물마커는 어떤 추가 마커가 가장 큰 성과 증가를 유발하는 지에 따라 순차적으로 추가된다. 상자 플롯 (왼쪽) 내에 포인트는 검색 알고리즘의 특정한 런 (run)/폴드 (fold) 조합을 나타낸다. 오른쪽 패널은 특질에 의한 평균 AUC에 근거하여 95% 신뢰 구간에서 동일한 데이터를 보여준다. 적색 포인트/상자는 피크 AUC를 갖는 모형을 나타내고, 그리고 어두운 및 밝은 녹색은 각각, 피크로부터 1 및 2 표준 오차를 나타낸다. 피크로부터 1 표준 오차는 일반적으로, "최고" 성과, 가장 인색한 (다시 말하면, 가장 덜 복잡한) 모형인 것으로 고려된다.
특질 선별 결과에 근거하여, 다음의 마커가 개별 질환에 대한 모형을 위해 선택되었다.
지방증: ACY1
소엽 염증: COLEC11, CSF1R
간세포 팽창: ITGA1/ITGB1, COLEC11, SERPINC1, LGALS3BP
섬유증: C7, THBS2, KYNU, SERPINA7.
실시예 10. NIH 성인 NASH 모형
나이브 베이즈 모형의 상세는 다음의 질환 상태 각각에서 성인에 대한 초기 NIH 데이터의 발견 단계 동안 산출되었다: 지방증, 소엽 염증, 팽창 및 섬유증. 전체 나이브 베이즈 모형 파라미터는 각 특질에 대해 로그 10(RFU)-변환된 피분석물 치수를 갖는 미지의 표본을 고려하여 정규화된 사후 확률 (및 부류 예측)을 어떻게 계산하는 지에 관한 설명과 함께 아래에 도시된다.
나이브 베이즈 모형은 2pk + k 파라미터, 여기서 k는 부류의 숫자이고, p는 특질/단백질의 숫자이고; 각 단백질x부류 조합에 대한 평균 (μ) 및 표준 편차 (σ), 플러스 훈련 부류 발생률에 의해 결정된 부류-특이적 사전분포 (다시 말하면, 무정보적 사전분포)를 내포한다. 나이브 베이즈 모형은 가우스 밀도를 가정하고, 그리고 부류-특이적 파라미터 μ 및 σ를 고려하여 확률 밀도 함수 (PDF)를 통해 계산된다:
Figure pct00012
이러한 방정식 (1)을 이용하여, p 로그10-변환된 (RFU) 단백질 치수 (
Figure pct00013
= x 1 ,…, x p ) 및 k = 2가지 부류 (질환 및 대조)를 갖는 미지의 표본은 방정식 (2)를 통해 분류될 수 있다:
Figure pct00014
정규화된 사후 확률 (Pr)은 예로서, 전체 밀도의 부류-특이적 비율을 계산함으로써 획득되었고:
Figure pct00015
그리고 부류 예측은 단위 라인에 대한 ROC 곡선의 최대 직각 거리에 따라 결정된 결정 컷오프에 의해 만들어졌다.
표 17은 분석에서 이용된 유전자 식별자 및 단백질 명칭 사이에 지도화를 제공한다.
표 17: 유전자 식별자 및 단백질 명칭의 지도화
유전자 명칭 단백질 명칭
ACY1.3343.1.4 아미노아실라아제-1
COLEC11.4430.44.3 콜렉틴-11
CSF1R.2638.12.2 대식세포 집락 자극 인자 1 수용체
ITGA1.ITGB1.3503.4.2 인테그린 알파-I: 베타-1 복합체
SERPINC1.3344.60.4 항트롬빈-III
LGALS3BP.5000.52.1 갈렉틴-3-결합 단백질
C7.2888.49.2 보체 성분 C7
THBS2.3339.33.1 트롬보스폰딘-2
KYNU.4559.64.2 키뉴레니나아제
SERPINA7.2706.69.2 티록신 결합 글로불린
지방증 나이브 베이즈 모형
별개의 예측자에 대한 견고한 나이브 베이즈 분류기
콜:
견고한.나이브베이즈.디폴트 (x = 로그.데이터, y = 데이터세트$반응)
사전 확률:
데이터세트$반응
대조 지방증
0.14815 0.85185
조건부 밀도:
ACY1.3343.1.4.
대조_뮤 3.82550
지방증_뮤 4.18191
대조_시그마 0.23774
지방증_시그마 0.28751
단백질 RFU 치수: x 1 = 로그 10 (ACY 1.3343.1.4.)을 갖는 미지의 표본을 분류하기 위해, 다음이 계산되었다:
Figure pct00016
여기서 지방증 부류에 대한 결정 역치 (컷오프)는 Pr(지방증) > 0.86153이었다.
소엽 염증 나이브 베이즈 모형
별개의 예측자에 대한 견고한 나이브 베이즈 분류기
콜:
견고한.나이브베이즈.디폴트 (x = 로그.데이터, y = 데이터세트$반응)
사전 확률:
데이터세트$반응
대조 소엽 염증
0.75421 0.24579
조건부 밀도:
COLEC11.4430.44.3 CSF1R.2638.12.2
대조_뮤 3.73389 2.71638
소엽 염증_뮤 4.00075 2.83843
대조_시그마 0.17571 0.10198
소엽 염증_시그마 0.25238 0.09696
단백질 RFU 치수: x 1 = 로그 10(COLEC11.4430.44.3) 및 x 2 = 로그 10(CSF1R.2638.12.2)을 갖는 미지의 표본을 분류하기 위해, 다음이 계산되었다:
Figure pct00017
여기서 소엽 염증 부류에 대한 결정 역치 (컷오프)는 Pr(소엽 염증) > 0.22539이었다.
팽창 나이브 베이즈 모형
별개의 예측자에 대한 견고한 나이브 베이즈 분류기
콜:
견고한.나이브베이즈.디폴트 (x = 로그.데이터, y = 데이터세트$반응)
사전 확률:
데이터세트$반응
대조 팽창
0.57912 0.42088
Figure pct00018
단백질 RFU 치수: x 1 = 로그 10(ITGA1.ITGB1.3503.4.2), x 2 = 로그 10(COLEC11.4430.44.3), x 3 = 로그 10(SERPINC1.3344.60.4) 및 x 4 = 로그 10(LGALS3BP.5000.52.1)을 갖는 미지의 표본을 분류하기 위해, 다음이 계산되었다:
Figure pct00019
여기서 팽창 부류에 대한 결정 역치 (컷오프)는 Pr(팽창) > 0.3151이었다.
섬유증 나이브 베이즈 모형
별개의 예측자에 대한 견고한 나이브 베이즈 분류기
콜:
견고한.나이브베이즈.디폴트 (x = 로그.데이터, y = 데이터세트$반응)
사전 확률:
데이터세트$반응
대조 섬유증
0.66892 0.33108
Figure pct00020
단백질 RFU 치수: x 1 = 로그 10(C7.2888.49.2), x 2 = 로그 10(THBS2.3339.33.1), x 3 = 로그 10(KY NU.4559.64.2) 및 x 4 = 로그 10(SERPINA7.2706.69.2)을 갖는 미지의 표본을 분류하기 위해, 다음이 계산되었다:
Figure pct00021
여기서 섬유증 부류에 대한 결정 역치 (컷오프)는 Pr(섬유증) > 0.31707이었다.
실시예 11. 나이브 베이즈 분류기
전반적인 목적은 미지의 표본의 부류를 예측하기 위해 확률적 모형화 프레임워크를 이용하는 것이다. 이런 수학적 모형, 또는 분류기는 훈련 데이터에 근거되고, 그리고 미지의 표본에 관한 부류 예측을 하기 위해 만들어진다 (다시 말하면, 모형 적합화). 이런 목적으로, 베이즈의 정리는 아래의 형태로 일반화될 수 있고:
Figure pct00022
그리고 이후, 확률의 면에서 기재되는데,
Figure pct00023
여기서 용어 P(데이터)는 결과와 무관한 정규화 상수이고, 그리고 종종, 상대적 사후분포가 절대적 사후분포보다 요망되면 무시된다. 방정식 (2)는 이후, 아래와 같이 단순화된다:
Figure pct00024
실시에서 나이브 베이즈
가우스 (다시 말하면, 정규) 분포를 갖는 것으로 가정된 프로테오믹 계측이 개체로부터 취해지고, 그리고 관심되는 사후 확률이 개체가 k 가능한 결과/부류 중에서 한 가지에 속하는 지의 여부인 실례를 고려한다. 가령, k = 2 가능한 부류, 질환 또는 대조 (다시 말하면, 이진 분류기)가 있으면, 이것은 아래와 같이 개정될 수 있다:
Figure pct00025
독립된 것으로 완전히 순진하게 가정되는 p 단백질이 있으면, 이들의 개별 확률은 곱셈되어 누적 확률이 산출될 수 있다. 질환 사후분포의 경우에 이것은 다음을 제공한다:
Figure pct00026
나이브 베이즈 모형은 2pk + k 파라미터, 여기서 k는 부류의 숫자이고, p는 특질/단백질의 숫자이고; 각 단백질 x 부류 조합에 대한 평균 (μ) 및 표준 편차 (σ), 플러스 훈련 부류 비율에 의해 종종 결정되는 부류-특이적 사전분포 (다시 말하면, 무정보적 사전분포)를 내포한다. 나이브 베이즈 모형은 가우스 밀도를 가정하고, 그리고 부류-특이적 파라미터 μ 및 σ를 고려하여 확률 밀도 함수 (PDF)를 통해 계산된다:
Figure pct00027
p 단백질 치수 (
Figure pct00028
= x 1 , …, x p ) 및 k 부류를 갖는 미지의 표본을 분류하기 위해, 다음을 계산한다:
Figure pct00029
본 실시예에서 방정식 (5)의 결과는 각 부류에 대한 확률 밀도를 제공하는데, 이것은 간격 [0, 1]에 구속되지 않는다. 정규화된 사후 확률 (Pr)은 전체 밀도의 부류-특이적 비율을 계산함으로써 획득된다:
Figure pct00030
실례 계산
k = 2가지 부류 (질환 대 대조) 및 p = 2가지 생물마커/특질 실례를 고려하는데, 2pk + k = 10 파라미터이다:
표 18: 2 마커/단백질 나이브 베이즈 모형. 장애/질환에 대한 아래첨자.
Figure pct00031
표 19: 각각 2가지 단백질 치수 (RFU) (로그 10 -변환 → 가우스)를 갖는 5개의 미지의 표본.
Figure pct00032
상기 미지의 표본 1의 경우에, 나이브 베이즈 사후 조건부 확률 밀도는 아래와 같이 본 실시예의 방정식 (5)를 이용하여 계산된다:
대조 사후 밀도:
Figure pct00033
질환 사후 밀도:
Figure pct00034
정규화된 사후 확률: 본 실시예의 방정식 (6)으로부터, 각 밀도의 상대적 비율은 아래와 같다:
Figure pct00035
도면 33a/b는 훈련 데이터로부터 부류-특이적 확률 밀도 (질환 대 대조)를 묘사하고, 그리고 수직 파선은 각각, 단백질 1 및 2에 대한 표본 1의 계측 값을 보여준다. 도면 34a/b는 이들 2가지 단백질의 이변량 플롯을 묘사하는데, 여기서 b는 X로 식별된 5개 미지의 표본의 위치와 함께 질환 및 대조 사이에 결정 경계를 보여준다.
표 20: 5개 미지의 표본에 대한 정규화된 사후 확률. 질환 부류 예측은 Pr(질환) > 0.5의 결정 컷오프에 근거된다 (도면 34a-34b를 또한 참조한다).
Figure pct00036
전술한 구체예 및 실시예는 단지 실례로서 의도된다. 어떤 특정한 구체예, 실시예, 또는 특정한 구체예 또는 실시예의 요소도 청구항 중에서 어느 한 항의 결정적인, 필요한, 또는 필수적인 원소 또는 특질로서 해석되지 않는다. 첨부된 청구항에 의해 규정되는, 본 출원의 범위로부터 벗어나지 않으면서 개시된 구체예에 대한 다양한 변경, 변형, 치환 및 다른 변이가 만들어질 수 있다. 도면 및 실시예를 비롯한 본 명세서는 제한하는 방식보다는 예시적인 방식으로 간주되고, 그리고 모든 이런 변형 및 치환은 본 출원의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 방법 또는 제법 청구항 중에서 어느 한 항에서 언급된 단계는 임의의 실현가능한 단계에서 실행될 수 있고, 그리고 이들 구체예, 실시예 또는 청구항 중에서 어느 한 가지에서 제시된 순서에 한정되지 않는다. 게다가, 전술한 방법 중에서 한 가지에서, 하나 또는 그 이상의 특이적으로 열거된 생물마커는 개별 생물마커로서 또는 임의의 패널로부터 생물마커로서 특정적으로 배제될 수 있다.

Claims (57)

  1. 개체가 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)을 앓는 지를 결정하는 방법에 있어서, 표 15 및 표 16에서 열거된 생물마커 단백질로부터 N 생물마커 단백질을 갖는 생물마커 패널을 형성하고, 그리고 개체로부터 표본 내에 상기 패널의 N 생물마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 N은 최소한 5인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, N은 5 내지 10이거나, 또는 N은 6 내지 10이거나, 또는 N은 7 내지 10이거나, 또는 N은 8 내지 10이거나, 또는 N은 9 내지 10이거나, 또는 N 최소한 6이거나, 또는 N 최소한 7이거나, 또는 N 최소한 8이거나, 또는 N 최소한 9이거나, 또는 N은 5이거나, 또는 N은 6이거나, 또는 N은 7이거나, 또는 N은 8이거나, 또는 N은 9이거나, 또는 N은 10인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 개체가 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)을 앓는 지를 결정하는 방법에 있어서, 개체로부터 표본 내에 ITGA1/ITGB1의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 대조 수준보다 높은 ITGA1/ITGB1의 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 개체가 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)을 앓는 지를 결정하는 방법에 있어서, 개체로부터 표본 내에 HSP90AA1/HSP90AB1의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 대조 수준보다 높은 HSP90AA1/HSP90AB1의 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 개체가 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)을 앓는 지를 결정하는 방법에 있어서, 개체로부터 표본 내에 ITGA1/ITGB1 및 HSP90AA1/HSP90AB1의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 대조 수준보다 높은 ITGA1/ITGB1의 수준 및/또는 HSP90AA1/HSP90AB1의 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 3 내지 5 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체로부터 표본 내에 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, KYNU, POR 및 THBS2에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 또는 최소한 7개의 생물마커의 수준을 검출하는 것을 더욱 포함하고, 여기서 개별 생물마커의 대조 수준보다 높은 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, KYNU, POR 및 THBS2에서 선택되는 최소한 하나의 생물마커의 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 3 내지 6 중에서 어느 한 항에 있어서, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, COLEC11 및 THBS2의 수준을 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 3 내지 7 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체에서 AST 수준을 결정하는 것을 포함하고, 여기서 상승된 AST 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 개체가 비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)을 앓는 지를 결정하기 위한 방법에 있어서, 개체로부터 표본 내에 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 THBS2에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 최소한 10개, 또는 11개의 생물마커의 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 개별 생물마커의 대조 수준보다 높은 ACY1, C7, COLEC11, CSF1R, DCN, HSP90AA1/HSP90AB1, ITGA1/ITGB1, KYNU, POR, FCGR3B, LGALS3BP, SERPINC1, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 THBS2에서 선택되는 최소한 하나의 생물마커의 수준은 개체가 NAFLD를 앓는다는 것을 지시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, HSP90AA1/HSP90AB1 또는 ITGA1/ITGB1, 또는 HSP90AA1/HSP90AB1 및 ITGA1/ITGB1 둘 모두의 수준을 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 개체가 지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및/또는 섬유증을 앓는 지를 결정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 지방증은 경등도, 중등도, 또는 중증도 지방증인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 개체가 비알코올성 지방간염 (NASH)을 앓는 지를 결정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, NASH는 시기 1, 2, 3 또는 4 NASH인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 개체가 지방증을 앓는 지를 결정하는 방법에 있어서, ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 및 CSF1R에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 또는 6개의 생물마커를 포함하는 생물마커 패널을 제공하고; 개체가 지방증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 지방증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 생물마커의 수준을 검출하여 상기 생물마커 패널 내에 생물마커에 상응하는 생물마커 값을 제공하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 개체가 지방증을 앓는 지를 결정하는 방법에 있어서, 개체가 지방증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 지방증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 ACY1, KYNU, ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 및 CSF1R에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 또는 6개의 생물마커의 수준을 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 15 또는 청구항 16에 있어서, 상기 방법은 ACY1, KNYU, 그리고 ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 및 CSF1R에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 또는 4개의 추가 생물마커를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 15 내지 17 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 ACY1, KNYU, 그리고 ITGA1/ITGB1, POR, HSP90AA1/HSP90AB1 및 CSF1R에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 또는 4개의 추가 마커를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 15 내지 18 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, THBS2 및 CSF1R에서 선택되는 최소한 하나의 생물마커를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 15 내지 18 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 ACY1을 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 개체가 소엽 염증을 앓는 지를 결정하는 방법에 있어서, ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B 및 POR에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개 또는 5개의 생물마커를 포함하는 생물마커 패널을 제공하고; 개체가 소엽 염증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 소엽 염증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 이들 생물마커의 수준을 검출하여 상기 생물마커 패널 내에 생물마커에 상응하는 생물마커 값을 제공하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 개체가 소엽 염증을 앓는 지를 결정하는 방법에 있어서, 개체가 소엽 염증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 소엽 염증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 ACY1, THBS2, COLEC11, ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B 및 POR에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개 또는 5개의 생물마커를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 21 또는 청구항 22에 있어서, 상기 방법은 ACY1, THBS2, COLEC11, 그리고 ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B 및 POR에서 선택되는 최소한 1개 또는 2개의 추가 생물마커를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 21 내지 23 중에서 어느 한 항에 있어서, ACY1, THBS2, COLEC11, 그리고 ITGA1/ITGB1, CSF1R, KYNU, FCGR3B 및 POR에서 선택되는 최소한 1개 또는 2개의 추가 생물마커를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 21 내지 24 중에서 어느 한 항에 있어서, ITGA1/ITGB1을 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 21 내지 25 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 COLEC11 및 CSF1R을 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 개체가 간세포 팽창을 앓는 지를 결정하는 방법에 있어서, ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, SERPINC1, C7, POR, LGALS3BP 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개 또는 5개의 생물마커를 포함하는 생물마커 패널을 제공하고; 개체가 간세포 팽창을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 간세포 팽창을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 이들 생물마커의 수준을 검출하여 상기 생물마커 패널 내에 생물마커에 상응하는 생물마커 값을 제공하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 개체가 간세포 팽창을 앓는 지를 결정하는 방법에 있어서, 개체가 간세포 팽창을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 간세포 팽창을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 ACY1, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, SERPINC1, C7, POR, LGALS3BP 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개 또는 5개의 생물마커를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 청구항 27 또는 청구항 28에 있어서, 상기 방법은 ACY1, COLEC11, THBS2, 그리고 ITGA1/ITGB1 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 최소한 1개 또는 2개의 추가 생물마커를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 청구항 27 내지 29 중에서 어느 한 항에 있어서, ACY1, COLEC11, THBS2, 그리고 ITGA1/ITGB1 및 HSP90AA1/HSP90AB1에서 선택되는 최소한 1개 또는 2개의 추가 생물마커를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 청구항 27 내지 30 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 ITGA1/ITGB1, COLEC11, SERPINC1 및 LGALS3BP를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 개체가 섬유증을 앓는 지를 결정하는 방법에 있어서, C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 DCN에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 최소한 10개, 최소한 11개, 최소한 12개, 최소한 13개, 또는 14개의 생물마커를 포함하는 생물마커 패널을 제공하고; 개체가 섬유증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 섬유증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 이들 생물마커의 수준을 검출하여 상기 생물마커 패널 내에 생물마커에 상응하는 생물마커 값을 제공하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 개체가 섬유증을 앓는 지를 결정하는 방법에 있어서, 개체가 섬유증을 앓는 지를 결정하거나 또는 개체가 섬유증을 앓을 가능성을 결정하기 위해, 개체로부터 표본 내에 C7, COLEC11, THBS2, ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1, ACY1, CSF1R, KYNU, POR, IGFBP7, PIK3CA/PIK3R1, NAGK, DDC, SERPINA7 및 DCN에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 최소한 10개, 최소한 11개, 최소한 12개, 최소한 13개, 또는 14개의 생물마커를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 청구항 32 또는 청구항 33에 있어서, 생물마커 패널은 C7, COLEC11, THBS2, 그리고 ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1 및 DCN에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 또는 3개의 추가 생물마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 청구항 32 내지 34 중에서 어느 한 항에 있어서, C7, COLEC11, THBS2, 그리고 ITGA1/ITGB1, HSP90AA1/HSP90AB1 및 DCN에서 선택되는 최소한 1개, 최소한 2개, 또는 3개의 추가 생물마커를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 청구항 32 내지 35 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 C7, THBS2, KYNU 및 SERPINA7을 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 NAFLD가 발달할 위험에 처해있는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 지방증, 소엽 염증, 간세포 팽창 및/또는 섬유증이 발달할 위험에 처해있는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 NASH가 발달할 위험에 처해있는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체는 비만한 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 각 생물마커는 단백질 생물마커인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 개체로부터 표본의 생물마커를 한 세트의 생물마커 포획 시약과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 생물마커 포획 시약의 세트의 각 생물마커 포획 시약은 검출되는 상이한 생물마커에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 청구항 42에 있어서, 각 생물마커 포획 시약은 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 각 생물마커 포획 시약은 앱타머인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 청구항 44에 있어서, 최소한 하나의 앱타머는 느린 오프 레이트 앱타머인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 최소한 하나의 느린 오프 레이트 앱타머는 변형을 갖는 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 또는 최소한 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 청구항 45 또는 청구항 46에 있어서, 각 느린 오프 레이트 앱타머는 ≥ 30 분, ≥ 60 분, ≥ 90 분, ≥ 120 분, ≥ 150 분, ≥ 180 분, ≥ 210 분, 또는 ≥ 240 분의 오프 레이트 (t½)로 이의 표적 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 표본은 혈액 표본인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 청구항 48에 있어서, 표본은 혈청 표본 및 혈장 표본에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체가 NAFLD 또는 NASH를 앓으면, 개체는 체중 감소, 혈당 제어 및 알코올 회피에서 선택되는 섭생이 권장되는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체가 NAFLD 또는 NASH를 앓으면, 개체는 위 우회로 조성술이 권장되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 개체가 NAFLD 또는 NASH를 앓으면, 개체는 피오글리타존, 비타민 E 및 메트포르민에서 선택되는 최소한 하나의 치료적 작용제가 처방되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 의료보험료 또는 생명보험료를 결정하는 목적으로 개체가 NAFLD 또는 NASH를 앓는 지를 결정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 의료보험료 또는 생명보험료를 결정하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 방법으로부터 발생하는 정보를 이용하여 의학적 자원의 활용을 예측하고 및/또는 관리하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 ITGA1 및/또는 ITGB1 및/또는 ITGA1과 ITGB1의 복합체를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 HSP90AA1 및/또는 HSP90AB1을 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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