CN108603887A - 非酒精性脂肪肝疾病(nafld)和非酒精性脂肪性肝炎(nash)生物标记及其用途 - Google Patents

Abstract

提供了用于确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、且更具体来说一种或多种以下相关病状的方法、组合物和试剂盒：脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和纤维化。还提供了用于确定受试者是否患有非酒精性脂肪变性的方法、组合物和试剂盒。还提供了用于确定受试者是否患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法、组合物和试剂盒。

Description

非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 生物标记及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年2月8日提交的美国临时申请号62/292,582和2016年7月13日提交的美国临时申请号62/362,019的优先权权益，这些申请出于任何目的以引用的方式整体并入本文。

发明领域

本申请一般涉及生物标记的检测和非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的表征，例如，以便鉴别患有脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的受试者。在各种实施方案中，本发明涉及用于表征个体中的NAFLD和NASH的一种或多种生物标记、方法、装置、试剂、系统和试剂盒。

背景

以下描述提供了信息概要，并不是承认本文提供的任何信息或本文参考的任何出版物均为本申请的现有技术。

非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)被定义为在酒精史不存在下，存在肝脂肪变性，伴有或不伴有炎症和纤维化。NAFLD被再分成非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。在NAFL中，存在肝脂肪变性，但无明显的炎症证据，而在NASH中，肝脂肪变性与肝脏炎症有关，其在组织学上不能与酒精性脂肪性肝炎相区分。

NAFLD已经在世界范围内流行并且在北美洲是肝脏疾病的主要原因，这是由于肥胖发病率的快速增加。然而，关于NAFL和NASH发病率的基于人群的精确数据是稀疏的，部分是由于诊断需要组织病理学文献。NAFLD的主要风险因素是向心性肥胖、2型糖尿病、血中的高甘油三酯(脂肪)水平和高血压。在美国，NAFLD存在于20-40％的人群中且NASH存在于约25％的肥胖人群中。10至29％的NASH患者发展成肝硬化，且其中4-27％发展成肝癌。

大多数患有NASH的人没有症状。一些人可具有右上部疼痛、肝肿大或非特异性症状，如腹部不适、虚弱、疲劳或不舒服。医生或护士可由常规血液检查结果推测存在NASH。在NAFLD中，肝酶天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)通常较高。

确认NASH的当前黄金标准是肝活组织检查的组织评价，这项检查是昂贵的、侵入性的，且可导致疼痛、出血或甚至死亡。

非常需要能够鉴别并区分各个阶段的NAFLD和NASH的简单血液检查(且由此减少对肝活组织检查的需要)。

发明概述

在一些实施方案中，提供了确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的方法。在一些实施方案中，提供了鉴别患有脂肪变性的受试者的方法。在一些实施方案中，提供了确定脂肪变性的严重程度的方法。

在一些实施方案中，提供了确定受试者是否患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法。在一些实施方案中，提供了鉴别患有NASH的受试者的方法。在一些实施方案中，提供了区分患有NASH的受试者与患有脂肪变性的受试者的方法。在一些实施方案中，提供了确定NASH的严重程度的方法。

在一些实施方案中，本文的方法是用于确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)，包括由表15和/或表16中所列的生物标记蛋白形成具有N种生物标记蛋白的生物标记组，及在来自受试者的样品中检测该组的N种生物标记蛋白中的每一种的水平，其中N为至少5。在一些实施方案中，N为5至10，或N为6至10，或N为7至10，或N为8至10，或N为9至10，或N为至少6，或N为至少7，或N为至少8，或N为至少9。在一些实施方案中，N为5，或N为6，或N为7，或N为8，或N为9，或N为10。

在一些实施方案中，提供了确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样品中的ITGA1/ITGB1的水平，其中高于对照水平的ITGA1/ITGB1的水平表明受试者患有NAFLD。在一些实施方案中，提供了一种确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样品中的HSP90AA1/HSP90AB1的水平，其中高于对照水平的HSP90AA1/HSP90AB1的水平表明受试者患有NAFLD。在一些实施方案中，提供了一种确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样品中的ITGA1/ITGB1和HSP90AA1/HSP90AB1的水平，其中高于对照水平的ITGA1/ITGB1的水平和/或HSP90AA1/HSP90AB1的水平表明受试者患有NAFLD。在一些实施方案中，所述方法还包括在来自受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或至少七种选自以下的生物标记的水平：ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、KYNU、POR和THBS2，其中高于相应生物标记的对照水平的选自ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、KYNU、POR和THBS2的至少一种生物标记的水平表明所述受试者患有NAFLD。在一些实施方案中，所述方法包括检测ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1、ACY1、COLEC11和THBS2的水平。在一些实施方案中，所述方法包括测定受试者中的AST水平，其中升高的AST水平表明所述受试者患有NAFLD。

在一些实施方案中，本文中的方法是用于确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或十一种选自以下的生物标记的水平：ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、HSP90AA1/HSP90AB1、ITGA1/ITGB1、KYNU、POR、FCGR3B、LGALS3BP、SERPINC1、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和THBS2，其中高于相应生物标记的对照水平的至少一种选自ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、HSP90AA1/HSP90AB1、ITGA1/ITGB1、KYNU、POR、FCGR3B、LGALS3BP、SERPINC1、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和THBS2的生物标记的水平表明所述受试者患有NAFLD。在一些实施方案中，所述方法包括检测HSP90AA1/HSP90AB1或ITGA1/ITGB1、或HSP90AA1/HSP90AB1和ITGA1/ITGB1两者的水平。

在本文所述的任一实施方案中，所述方法包括确定受试者是否患有脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和/或纤维化。

在一些实施方案中，本文中的方法是用于确定受试者是否患有脂肪变性，所述方法包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或七种选自以下的生物标记的生物标记组：ACY1、KYNU、ITGA1/ITGB1、POR、HSP90AA1/HSP90AB1、THBS2和CSF1R；检测来自受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定受试者是否患有脂肪变性或确定受试者患脂肪变性的可能性。

在一些实施方案中，本文中的方法是用于确定受试者是否患有脂肪变性，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或七种选自以下的生物标记：ACY1、KYNU、ITGA1/ITGB1、POR、HSP90AA1/HSP90AB1、THBS2和CSF1R，以便确定所述受试者是否患有脂肪变性或确定受试者患脂肪变性的可能性。

在一些实施方案中，所述生物标记组包含ACY1、KNYU及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或五种选自以下的另外的生物标记：ITGA1/ITGB1、POR、HSP90AA1/HSP90AB1、THBS2和CSF1R。

在一些实施方案中，所述方法包括检测ACY1、KNYU及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或五种选自以下的另外的生物标记：ITGA1/ITGB1、POR、HSP90AA1/HSP90AB1、THBS2和CSF1R。在一些实施方案中，所述方法包括检测至少一种选自以下的生物标记：ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1和CSF1R。在一些实施方案中，所述方法包括检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或六种选自以下的生物标记：ACY1、ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1、POR、THBS2和KYNU。

在一些实施方案中，本文中的方法是用于确定受试者是否患有小叶炎症，所述方法包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的生物标记的生物标记组：ACY1、THBS2、COLEC11、ITGA1/ITGB1、CSF1R、KYNU、FCGR3B和POR；检测来自所述受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定所述受试者是否患有小叶炎症或确定受试者患小叶炎症的可能性。

在一些实施方案中，本文中的方法是用于确定受试者是否患有小叶炎症，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的生物标记：ACY1、THBS2、COLEC11、ITGA1/ITGB1、CSF1R、KYNU、FCGR3B和POR，以便确定所述受试者是否患有小叶炎症或确定受试者患小叶炎症的可能性。

在一些实施方案中，生物标记组包含ACY1、THBS2、COLEC11及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或五种选自以下的另外的生物标记：ITGA1/ITGB1、CSF1R、KYNU、FCGR3B和POR。

在一些实施方案中，所述方法包括检测ACY1、THBS2、COLEC11及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或五种选自以下的另外的生物标记：ITGA1/ITGB1、CSF1R、KYNU、FCGR3B和POR。在一些实施方案中，所述方法包括检测ITGA1/ITGB1。

在一些实施方案中，本文中的方法是用于确定受试者是否患有肝细胞气球样变性，所述方法包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的生物标记的生物标记组：ACY1、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、C7、POR、LGALS3BP和HSP90AA1/HSP90AB1；检测来自所述受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定所述受试者是否患有肝细胞气球样变性或确定受试者患肝细胞气球样变性的可能性。

在一些实施方案中，本文的方法是用于确定受试者是否患有肝细胞气球样变性，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的生物标记：ACY1、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、C7、POR、LGALS3BP和HSP90AA1/HSP90AB1，以便确定所述受试者是否患有肝细胞气球样变性或确定受试者患肝细胞气球样变性的可能性。

在一些实施方案中，生物标记组包含ACY1、COLEC11、THBS2及至少一种或两种选自ITGA1/ITGB1和HSP90AA1/HSP90AB1的另外的生物标记。

在一些实施方案中，所述方法包括检测ACY1、COLEC11、THBS2及至少一种或两种选自ITGA1/ITGB1和HSP90AA1/HSP90AB1的另外的生物标记。

在一些实施方案中，本文的方法是用于确定受试者是否患有纤维化，所述方法包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或十四种选自以下的生物标记的生物标记组：C7、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1、ACY1、CSF1R、KYNU、POR、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和DCN；检测来自所述受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定所述受试者是否患有纤维化或确定受试者患纤维化的可能性。

在一些实施方案中，本文的方法是用于确定受试者是否患有纤维化，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或十四种选自以下的生物标记：C7、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1、ACY1、CSF1R、KYNU、POR、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和DCN，以便确定所述受试者是否患有纤维化或确定受试者患纤维化的可能性。

在一些实施方案中，生物标记组包含C7、COLEC11、THBS2及至少一种、至少两种或三种选自以下的另外的生物标记：ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1和DCN。

在一些实施方案中，所述方法包括检测C7、COLEC11、THBS2及至少一种、至少两种或三种选自以下的另外的生物标记：ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1和DCN。

在本文所述的任一实施方案中，所述受试者处于发展脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和/或纤维化的风险中。

在本文所述的任一实施方案中，所述受试者可处于发展NAFLD的风险中。在本文所述的任一实施方案中，所述受试者可处于发展脂肪变性的风险中。在本文所述的任一实施方案中，所述受试者可处于发展NASH的风险中。在本文所述的任一实施方案中，所述受试者可具有选自以下的NAFLD合并症：肥胖、腹部肥胖、代谢综合征、心血管疾病和糖尿病。在本文所述的任一实施方案中，所述受试者可为肥胖的。

在本文所述的任一实施方案中，至少一种生物标记可为蛋白质生物标记。在本文所述的任一实施方案中，每种生物标记可为蛋白质生物标记。在一些实施方案中，一种方法包括使来自所述受试者的样品的生物标记与一组生物标记捕获试剂接触，其中该组生物标记捕获试剂中的每种生物标记捕获试剂特异性地结合至被检测的不同生物标记。在一些实施方案中，每种生物标记捕获试剂为抗体或适体。在一些实施方案中，每种生物标记捕获试剂为适体。在一些实施方案中，至少一种适体为慢解离速率适体。在一些实施方案中，至少一种慢解离速率适体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有修饰的核苷酸。在一些实施方案中，每种慢解离速率适体以如下解离速率(t_1/2)结合至其靶蛋白：≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟。

在本文所述的任一实施方案中，所述样品可为血液样品。在本文所述的任一实施方案中，所述样品可选自血清样品和血浆样品。

在本文所述的任一实施方案中，如果受试者患有NAFLD或NASH，那么可向所述受试者推荐选自减轻体重、控制血糖和避免酒精的方案。在本文所述的任一实施方案中，如果受试者患有NAFLD或NASH，那么可向所述受试者推荐胃旁路手术。在本文所述的任一实施方案中，如果受试者患有NAFLD或NASH，那么可向所述受试者开出至少一种选自吡格列酮、维生素E和二甲双胍的治疗剂的处方。

在一些实施方案中，本文所述的方法是出于确定医疗保险费或人寿保险费的目的。在一些实施方案中，方法还包括确定医疗保险费或人寿保险费。在一些实施方案中，本文所述的方法还包括使用由所述方法得到的信息来预测和/或管理医疗资源的利用。

在一些实施方案中，提供了试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或十一种适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、HSP90AA1/HSP90AB1、ITGA1/ITGB1、KYNU、POR、FCGR3B、LGALS3BP、SERPINC1、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和THBS2。

在一些实施方案中，试剂盒包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或七种适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：ACY1、KYNU、ITGA1/ITGB1、POR、HSP90AA1/HSP90AB1、THBS2和CSF1R。

在一些实施方案中，试剂盒包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：ACY1、THBS2、COLEC11、ITGA1/ITGB1、CSF1R、KYNU、FCGR3B和POR。

在一些实施方案中，提供了一种试剂盒，其中所述试剂盒包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：ACY1、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、C7、POR、LGALS3BP和HSP90AA1/HSP90AB1。

在一些实施方案中，试剂盒包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或十四种选自以下的适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：C7、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1、ACY1、CSF1R、KYNU、POR、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和DCN。在本文的任一实施方案中，每种适体结合至不同的靶蛋白。

在本文所述的任一实施方案中，至少一种适体可为慢解离速率适体。在本文所述的任一实施方案中，每种适体可为慢解离速率适体。在一些实施方案中，至少一种慢解离速率适体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有疏水性修饰的核苷酸。

在一些实施方案中，每种慢解离速率适体以如下解离速率(t_1/2)结合至其靶蛋白：≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟。

在一些实施方案中，提供了组合物。在一些这类实施方案中，组合物包含来自受试者的样品的蛋白质及至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或十一种适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、HSP90AA1/HSP90AB1、ITGA1/ITGB1、KYNU、POR、FCGR3B、LGALS3BP、SERPINC1、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和THBS2。

在一些实施方案中，组合物包含来自受试者的样品的蛋白质及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或七种适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：ACY1、KYNU、ITGA1/ITGB1、POR、HSP90AA1/HSP90AB1、THBS2和CSF1R。

在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含来自受试者的样品的蛋白质及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：ACY1、THBS2、COLEC11、ITGA1/ITGB1、CSF1R、KYNU、FCGR3B和POR。

在一些实施方案中，每种适体结合至不同的靶蛋白。

在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含来自受试者的样品的蛋白质及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：ACY1、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、C7、POR、LGALS3BP和HSP90AA1/HSP90AB1。

在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含来自受试者的样品的蛋白质及至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或十四种选自以下的适体，所述适体特异性地结合至选自以下的靶蛋白：C7、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1、ACY1、CSF1R、KYNU、POR、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和DCN。

在一些实施方案中，每种适体特异性地结合至不同的靶蛋白。

在本文所述的任一实施方案中，所述样品可为血液样品。在本文所述的任一实施方案中，所述样品可选自血清样品和血浆样品。

在本文所述的任一实施方案中，至少一种适体可为慢解离速率适体。在本文所述的任一实施方案中，每种适体可为慢解离速率适体。在一些实施方案中，至少一种慢解离速率适体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有疏水性修饰的核苷酸。在一些实施方案中，每种慢解离速率适体以如下解离速率(t_1/2)结合至其靶蛋白：≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟。

在本文所述的任一实施方案中，每种生物标记可为蛋白质生物标记。在本文所述的任一实施方案中，所述方法可包括使来自所述受试者的样品的生物标记与一组生物标记捕获试剂接触，其中该组生物标记捕获试剂中的每种生物标记捕获试剂特异性地结合至被检测的生物标记。在一些实施方案中，该组生物标记捕获试剂中的每种生物标记捕获试剂特异性地结合至被检测的不同生物标记。在本文所述的任一实施方案中，每种生物标记捕获试剂可为抗体或适体。在本文所述的任一实施方案中，每种生物标记捕获试剂可为适体。在本文所述的任一实施方案中，至少一种适体可为慢解离速率适体。在本文所述的任一实施方案中，至少一种慢解离速率适体可包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述修饰是疏水性修饰。在一些实施方案中，所述修饰是疏水性碱基修饰。在一些实施方案中，一种或多种修饰可选自图11中所示的修饰。在一些实施方案中，每种慢解离速率适体以如下解离速率(t_1/2)结合至其靶蛋白：≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟。

在本文所述的任一实施方案中，所述样品可为血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品选自血清样品和血浆样品。

在本文所述的任一实施方案中，组合物中的样品可为血液样品。在一些实施方案中，所述血液样品选自血清样品和血浆样品。

在本文所述的任一实施方案中，试剂盒或组合物可包含至少一种适体，其为慢解离速率适体。在本文所述的任一实施方案中，试剂盒或组合物的每种适体可为慢解离速率适体。在一些实施方案中，至少一种慢解离速率适体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有修饰的核苷酸。在一些实施方案中，至少一个具有修饰的核苷酸是具有疏水性碱基修饰的核苷酸。在一些实施方案中，每个具有修饰的核苷酸是具有疏水性碱基修饰的核苷酸。在一些实施方案中，每个疏水性碱基修饰独立地选自图11中的修饰。在一些实施方案中，试剂盒中的每种慢解离速率适体以如下解离速率(t_1/2)结合至其靶蛋白：≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟。

附图简述

图1示出了如实施例2中所述的脂肪变性分类器的稳定性选择路径。

图2示出了如实施例2中所述的脂肪变性的九生物标记分类器的ROC曲线。

图3示出了通过针对如实施例2中所述的脂肪变性的九标记随机森林分类器的分类的投票。

图4示出了在如实施例2中所述的脂肪变性的九标记分类器中每种生物标记的累积分布函数。

图5示出了如实施例2中所述的NASH(纤维化)分类器的稳定性选择路径。

图6示出了如实施例2中所述的NASH(纤维化)的四生物标记分类器的ROC曲线。

图7示出了如实施例2中所述在每个受试者组中NASH(纤维化)的四标记分类器的箱形图。

图8示出了在如实施例2中所述的NASH(纤维化)的四标记分类器中每种生物标记的累积分布函数。

图9示出了供本文所述的各种计算机实现方法使用的非限制性示例性计算机系统。

图10示出了可用于检测生物样品中的一种或多种生物标记的非限制性示例性适体测定。

图11示出了可掺入到适体(如慢解离速率适体)中的某些示例性修饰过的嘧啶。

图12示出了如实施例5中所述在每个受试者组中脂肪变性的8标记分类器的箱形图。

图13示出了如实施例5中所述在每个受试者组中纤维化的8标记分类器的箱形图。

图14示出了如实施例5中所述的NASH(纤维化)的四标记分类器中每种生物标记的累积分布函数。

图15示出了如实施例6中所述根据它们的实际样品组，盲测样品在破盲之后的脂肪变性的8标记分类器的箱形图。

图16示出了如实施例6中所述对于发现组和盲测验证组的8标记脂肪变性分类器性能的ROC曲线。

图17示出了如实施例6中所述根据它们的实际样品组，盲测样品在破盲之后的纤维化的8标记分类器的箱形图。

图18示出了如实施例6中所述对于发现组和两个盲测验证组的8标记纤维化分类器性能的ROC曲线。

图19A和B示出了如实施例6中所述，使用(A)8标记脂肪变性分类器和(B)8标记纤维化分类器，20％吾等保持(hold-our)验证组的2500个自举迭代的敏感度和特异度分布。

图20示出了如实施例7中所述，根据它们的实际样品组，在每个儿科样品中的8标记脂肪变性分类器的箱形图。

图21示出了如实施例8中所述来自基线肝活组织检查的组织学和NAS评分的分布。

图22示出了如实施例8中所述的脂肪变性的前6种生物标记的箱形图。

图23示出了如实施例8中所述的小叶炎症的前6种生物标记的箱形图。

图24示出了如实施例8中所述的肝细胞气球样变性的前6种生物标记的箱形图。

图25示出了如实施例8中所述的纤维化的前6种生物标记的箱形图。

图26示出了如实施例8中所述的NAS评分的前6种生物标记的箱形图。

图27示出了如实施例8中所述的NASH诊断的前6种生物标记的箱形图。

图28示出了通过组织学分类和NASH诊断的显著蛋白质生物标记的文氏图。

图29示出了脂肪变性的特征选择。

图30示出了小叶炎症的特征选择。

图31示出了肝细胞气球样变性的特征选择。

图32示出了纤维化的特征选择。

图33A和33B示出了用于拟合蛋白质1(33A)和蛋白质2(33B)的朴素贝叶斯(Bayes)模型的训练数据的概率密度函数(按样品大小缩放)。曲线是由类别来着色且样品1的蛋白质测量是由垂直虚线表示。这以图表示出样品1很可能来自对照分布。

图34A和34B示出了用于拟合两个蛋白质标记朴素贝叶斯模型的训练数据的双变量图。虚线是模型参数的类别特异性方法，点是由类别表示(实心圆是对照，虚线圆是疾病)，且反映p＝0.5截止的非线性贝叶斯判定边界是由曲线表示。绿色“x”表示样品1-5的坐标。

发明详述

虽然本发明将结合某些代表性实施方案来描述，但应当理解本发明是由权利要求书限定并且不受限于那些实施方案。

本领域技术人员将认识到许多与本文所述的那些方法和材料类似或等价的方法和材料，它们可用于本发明的实践中。本发明决不受限于所述方法和材料。

除非另外定义，本文所用的技术和科学术语都具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文所述的类似或等效的任何方法、装置和材料可用于本发明的实践中，但某些方法、装置及材料在本文中有描述。

本文引用的所有出版物、公开的专利文献及专利申请据此以引用的方式并入，其程度如同每个单独的出版物、公开的专利文献或专利申请特别且单独地指明以引用的方式并入一般。

除非上下文另外清楚地指出，如本申请(包括所附权利要求书)中所用，单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括复数形式，并且可与“至少一个(种)”和“一个或多个(种)”互换使用。因此，提到“适体”包括适体的混合物，提到“探针”包括探针的混合物，诸如此类。

如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”及其任何变型旨在涵盖非排他性内含物，以使得包含、包括或含有要素或要素列表的工艺、方法、工艺产品或物质组合物可包括未明确列出的其它要素。

本申请包括用于确定受试者是否患有NAFLD的生物标记、方法、装置、试剂、系统及试剂盒。本申请还包括用于确定受试者是否患有NASH的生物标记、方法、装置、试剂、系统及试剂盒。在一些实施方案中，提供了确定患有NAFLD的受试者是否患有NASH的生物标记、方法、装置、试剂、系统及试剂盒。

如本文所用，术语“ITGA1/ITGB1”用于指代ITGA1和/或ITGB1和/或ITGA1与ITGB1的复合物。因此，如果一种方法包括检测生物标记“ITGA1/ITGB1”，那么所述方法可包括检测ITGA1、ITGB1、ITGA1和ITGB1两者、和/或ITGA1与ITGB1的复合物。特异性地结合ITGA1/ITGB1的生物标记捕获试剂可结合ITGA1和/或ITGB1和/或ITGA1和ITGB1两者和/或ITGA1与ITGB1的复合物。

如本文所用，术语“HSP90AA1/HSP90AB1”用于指代HSP90AA1和/或HSP90AB1。因此，如果一种方法包括检测生物标记“HSP90AA1/HSP90AB1”，那么所述方法可包括检测HSP90AA1、HSP90AB1、或HSP90AA1和HSP90AB1两者。特异性地结合HSP90AA1/HSP90AB1的生物标记捕获试剂可结合HSP90AA1和/或HSP90AB1和/或HSP90AA1和HSP90AB1两者。

在一些实施方案中，提供了一种或多种生物标记，其是单独或以各种组合形式使用以便确定受试者是否患有NAFLD。如下文中详细描述，示例性实施方案包括表15和表16中提供的生物标记，有或没有表3、4、6、7、8和/或9中提供的一种或多种生物标记。

使用基于多重适体的测定鉴别生物标记。表3列出了九种生物标记，其适用于将从正常肥胖个体处获得的样品与来自患有NAFLD的个体的样品相区分。表4列出了四种生物标记，其适用于将从患有脂肪变性的个体处获得的样品与来自患有2期、3期和4期NASH的个体的样品相区分。表8列出了八种生物标记，其适用于将从正常肥胖个体处获得的样品与来自患有NAFLD的个体的样品相区分。表9列出了八种生物标记，其适用于将从患有脂肪变性的个体处获得的样品与来自患有2期、3期和4期NASH的个体的样品相区分。表6和7列出了另外的生物标记，其可以彼此之间任何组合形式和/或与来自表3、4、8和/或9的生物标记一起使用。在一些实施方案中，将来自表3、4、6、7、8和9的生物标记的子集组合成表5中所示的组。

表15和表16列出了适用于表征NASH的组织学分级的生物标记。在一些实施方案中，提供了来自表15和/或表16的一种或多种生物标记，其是单独或以各种组合形式使用以便确定受试者是否患有脂肪变性或确定受试者患NASH的可能性。在一些实施方案中，来自表15和/或表16的一种或多种生物标记适用于确定受试者是否患有脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和/或纤维化。在一些实施方案中，来自表15和/或表16的一种或多种生物标记适用于确定受试者患脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和/或纤维化的可能性。在一些实施方案中，表15和/或表16中所列的一种或多种生物标记适于单独或以各种组合形式使用以便确定受试者是否患有任何阶段的NASH。在一些实施方案中，表15和/或表16中列出的一种或多种生物标记可与选自表3、4、6、7、8和/或9的一种或多种生物标记组合以形成一个组。

在一些实施方案中，表15和表16中列出的一种或多种生物标记适用于鉴别处于发展NASH的风险中的受试者。在一些实施方案中，表15和/或表16中列出的一种或多种生物标记适用于鉴别处于发展脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和/或纤维化的风险中的受试者。在一些实施方案中，提供了一种或多种生物标记，其是单独或以各种组合形式使用以便确定受试者是否患有脂肪变性。在一些实施方案中，受试者是肥胖的。表15和/或表16中的一种或多种生物标记可与来自表3和/或表4和/或表6和/或表7和/或表8和/或表9的一种或多种生物标记组合用于本文所述的方法中。

在一些实施方案中，提供了一种或多种生物标记，其是单独或以各种组合形式使用以便确定受试者是否患有任何阶段的NASH。在一些实施方案中，提供了一种或多种生物标记，其是单独或以各种组合形式使用以便确定受试者是否患有2期、3期或4期NASH。在一些实施方案中，已知受试者患有脂肪变性。如下文中详细描述，示例性实施方案包括表15和/或表16中提供的生物标记，其是使用基于多重适体的测定来鉴别。在一些实施方案中，基于生物标记值的特定组合的敏感度和特异度选择组中的生物标记的数量和身份。术语“敏感度”和“特异度”在本文中是关于基于生物样品中检测到的一种或多种生物标记的水平来准确地将个体划分为患有疾病或不患有疾病的能力而使用。在一些实施方案中，术语“敏感度”和“特异度”在本文中可关于基于生物样品中检测到的一种或多种生物标记的水平来准确地将个体划分为患有脂肪变性或不患有脂肪变性的能力而使用。在这种实施方案中，“敏感度”表示生物标记关于准确地划分患有脂肪变性的个体的性能。“特异度”表示生物标记关于准确地划分不患有脂肪变性的个体的性能。例如，对于用于测试一组对照样品(如来自健康个体或已知不患有脂肪变性的受试者的样品)和测试样品(如来自患有脂肪变性的个体的样品)的生物标记组来说，85％特异度和90％敏感度表示85％的对照样品通过该组被准确地划分为对照样品，且90％的测试样品通过该组被准确地划分为测试样品。

在一些实施方案中，术语“敏感度”和“特异度”在本文中可关于基于生物样品中检测到的一种或多种生物标记的水平来准确地将个体划分为患有NASH(或2期、3期或4期NASH)或患有脂肪变性的能力而使用。“敏感度”表示生物标记关于准确地划分患有NASH(或2期、3期或4期NASH)的个体的性能。“特异度”表示生物标记关于准确地划分不患有NASH(或不患有2期、3期或4期NASH)的个体的性能。例如，对于用于测试一组对照样品(如来自患有脂肪变性的个体的样品)和测试样品(如来自患有NASH、或2期、3期或4期NASH的个体的样品)的生物标记组来说，85％特异度和90％敏感度表示85％的对照样品通过该组被准确地划分为对照样品，且90％的测试样品通过该组被准确地划分为测试样品。

在一些实施方案中，一种或多种生物标记的组的总体性能是由曲线下面积(AUC)值表示。AUC值由接收器工作特征(ROC)曲线导出，其在本文中例示。ROC曲线是测试的真阳性率(敏感度)针对测试的假阳性率(1-特异度)的绘图。术语“曲线下面积”或“AUC”是指接收器工作特征(ROC)曲线的曲线下面积，两者都是本领域中公知的。AUC测量值适用于在完整的数据范围上比较分类器的准确性。具有较大AUC的分类器具有准确地划分两个感兴趣的组(例如，正常个体与患有NAFLD的个体，或患有脂肪变性的个体与患有NASH的个体)之间的未知情况的更强能力。ROC曲线适用于绘制区分两个群的特定特征(例如，本文所述的任何生物标记和/或另外的生物医学信息的任何项目)的性能。通常，基于单一特征值，以升序排列分选整个群中的特征数据。接着，对于该特征的每个值，计算数据的真阳性率和假阳性率。通过计数高于特征值的病例的数目，然后除以总病例数来确定真阳性率。通过计数高于特征值的对照的数目，然后除以总对照数来确定假阳性率。虽然此定义是指在病例中的特征与对照相比升高的情况，但此定义还适用于在病例中的特征与对照相比下降的情况(在这种情况下，将计数低于特征值的样品)。可针对单一特征以及针对其它单一输出生成ROC曲线，例如，可将两种或更多种特征的组合用数学方法结合(例如，相加、相减、相乘等)以提供单一总和值，并将此单一总和值在ROC曲线中绘制。另外，可将多个特征的任何组合(其中所述组合衍生出单一输出值)在ROC曲线中绘制。

在一些实施方案中，一种方法包括在来自受试者的样品中检测表15和/或表16中列出的至少一种生物标记的水平，有或没有表3、4、6、7、8和/或9中列出的至少一种生物标记，以便确定受试者是否患有NAFLD。在一些这类实施方案中，所述方法包括使来自受试者的样品或样品的一部分与至少一种捕获试剂接触，其中每种捕获试剂特异性地结合水平正被检测的生物标记。在一些实施方案中，所述方法包括使样品或来自样品的蛋白质与至少一种适体接触，其中每种适体特异性地结合水平正被检测的生物标记。

在一些实施方案中，一种方法包括确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)，包括由表15和/或表16中所列的生物标记蛋白形成具有N种生物标记蛋白的生物标记组，及在来自受试者的样品中检测该组的N种生物标记蛋白中的每一种的水平，其中N为至少5。在一些实施方案中，N为5至10，或N为6至10，或N为7至10，或N为8至10，或N为9至10，或N为至少6，或N为至少7，或N为至少8，或N为至少9，或N为5，或N为6，或N为7，或N为8，或N为9，或N为10。在一些实施方案中，一种方法包括检测至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或十种选自以下的水平：ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、HSP90AA1/HSP90AB1、ITGA1/ITGB1、KYNU、POR、FCGR3B、LGALS3BP、SERPINC1、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和THBS2，以便确定受试者是否患有NAFLD。

在一些实施方案中，一种方法包括检测来自受试者的样品中的ITGA1/ITGB1的水平，其中高于对照水平的ITGA1/ITGB1的水平表明受试者患有NAFLD。

在一些实施方案中，一种方法包括检测来自受试者的样品中的HSP90AA1/HSP90AB1的水平，其中高于对照水平的HSP90AA1/HSP90AB1的水平表明受试者患有NAFLD。

在一些实施方案中，一种方法包括检测来自受试者的样品中的ITGA1/ITGB1和HSP90AA1/HSP90AB1的水平，其中高于对照水平的ITGA1/ITGB1的水平和/或HSP90AA1/HSP90AB1的水平表明受试者患有NAFLD。

在一些实施方案中，所述方法还包括在来自受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或至少七种选自以下的生物标记的水平：ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、KYNU、POR和THBS2，其中高于相应生物标记的对照水平的选自ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、KYNU、POR和THBS2的至少一种生物标记的水平表明所述受试者患有NAFLD。在一些实施方案中，所述方法包括检测ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1、ACY1、COLEC11和THBS2的水平。在一些实施方案中，一种方法包括测定受试者中的AST水平，其中升高的AST水平表明所述受试者患有NAFLD。

在另一实施方案中，一种方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或十种选自以下的生物标记的水平：ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、HSP90AA1/HSP90AB1、ITGA1/ITGB1、KYNU、POR、FCGR3B、LGALS3BP、SERPINC1、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和THBS2，其中高于相应生物标记的对照水平的至少一种选自ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、HSP90AA1/HSP90AB1、ITGA1/ITGB1、KYNU、POR、FCGR3B、LGALS3BP、SERPINC1、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和THBS2的生物标记的水平表明所述受试者患有NAFLD。在一些实施方案中，一种方法包括检测HSP90AA1/HSP90AB1或ITGA1/ITGB1、或HSP90AA1/HSP90AB1和ITGA1/ITGB1两者的水平。

在一些实施方案中，所述方法包括确定受试者是否患有脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和/或纤维化。在一些实施方案中，所述脂肪变性为轻度、中度或重度脂肪变性。在一些实施方案中，所述方法包括确定受试者是否患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。在一些实施方案中，所述方法包括确定受试者是否患有NASH，如1期、2期、3期或4期NASH。在一些实施方案中，所述受试者处于发展NAFLD的风险中。在一些实施方案中，所述受试者处于发展NASH的风险中。在一些实施方案中，所述受试者处于发展脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和/或纤维化的风险中。在一些实施方案中，所述受试者为肥胖受试者。在一些实施方案中，所述方法包括确定受试者是否患有脂肪变性，和/或确定所述脂肪变性是轻度、中度还是重度的。

在一些实施方案中，提供了一种检测脂肪变性的方法，其包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或六种选自以下的生物标记的生物标记组：ACY1、KYNU、ITGA1/ITGB1、POR、HSP90AA1/HSP90AB1、THBS2和CSF1R；检测来自受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定受试者是否患有脂肪变性或确定受试者患脂肪变性的可能性。

在一些实施方案中，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或六种选自以下的生物标记的水平：ACY1、KYNU、ITGA1/ITGB1、POR、HSP90AA1/HSP90AB1、THBS2和CSF1R，以便确定所述受试者是否患有脂肪变性或确定受试者患脂肪变性的可能性。在一些实施方案中，所述生物标记组包含ACY1、KNYU及至少一种、至少两种、至少三种或四种选自以下的另外的标记：ITGA1/ITGB1、POR、HSP90AA1/HSP90AB1和CSF1R。在一些实施方案中，所述方法包括检测ACY1、KNYU及至少一种、至少两种、至少三种或四种选自以下的另外的标记：ITGA1/ITGB1、POR、HSP90AA1/HSP90AB1和CSF1R。在一些实施方案中，所述方法包括检测至少一种选自以下的生物标记：ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1和CSF1R。

在一些实施方案中，提供了一种用于确定受试者是否患有小叶炎症的方法，所述方法包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的生物标记的生物标记组：ACY1、THBS2、COLEC11、ITGA1/ITGB1、CSF1R、KYNU、FCGR3B和POR；检测来自所述受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定所述受试者是否患有小叶炎症或确定受试者患小叶炎症的可能性。在一些实施方案中，所述方法包括在来自受试者的样品中检测包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的生物标记的生物标记组：ACY1、THBS2、COLEC11、ITGA1/ITGB1、CSF1R、KYNU、FCGR3B和POR，以便确定受试者是否患有小叶炎症或确定受试者患小叶炎症的可能性。在一些实施方案中，生物标记组包含ACY1、THBS2、COLEC11及至少一种或两种选自ITGA1/ITGB1和POR的另外的生物标记。在一些实施方案中，所述方法包括检测ACY1、THBS2、COLEC11及至少一种或两种选自ITGA1/ITGB1和POR的另外的生物标记。在一些实施方案中，所述方法包括检测ITGA1/ITGB1。

在一些实施方案中，提供了一种用于确定受试者是否患有肝细胞气球样变性的方法，所述方法包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的生物标记的生物标记组：ACY1、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、C7、POR、LGALS3BP和HSP90AA1/HSP90AB1；检测来自所述受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定所述受试者是否患有肝细胞气球样变性或确定受试者患肝细胞气球样变性的可能性。在一些实施方案中，所述方法包括在来自受试者的样品中检测包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的生物标记的生物标记组：ACY1、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、C7、POR、LGALS3BP和HSP90AA1/HSP90AB1，以便确定受试者是否患有肝细胞气球样变性或确定受试者患肝细胞气球样变性的可能性。在一些实施方案中，生物标记组包含ACY1、COLEC11、THBS2及至少一种或两种选自ITGA1/ITGB1和HSP90AA1/HSP90AB1的另外的生物标记。在一些实施方案中，所述方法包括检测ACY1、COLEC11、THBS2及至少一种或两种选自ITGA1/ITGB1和HSP90AA1/HSP90AB1的另外的生物标记。

在一些实施方案中，提供了一种用于确定受试者是否患有纤维化的方法，所述方法包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或十四种选自以下的生物标记的生物标记组：C7、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1、ACY1、CSF1R、KYNU、POR、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和DCN；检测来自所述受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定所述受试者是否患有纤维化或确定受试者患纤维化的可能性。在一些实施方案中，所述生物标记组包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或十四种选自以下的生物标记：C7、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1、ACY1、CSF1R、KYNU、POR、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和DCN，以便确定所述受试者是否患有纤维化或确定受试者患纤维化的可能性。在一些实施方案中，所述方法包括检测包含C7、COLEC11、THBS2及至少一种、至少两种或三种选自ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1和DCN的另外的生物标记的生物标记组。在一些实施方案中，所述方法包括检测C7、COLEC11、THBS2及至少一种、至少两种或三种选自ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1和DCN的另外的生物标记。

在一些实施方案中，一种方法包括检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种选自表15和表16中的生物标记的生物标记的水平。在一些实施方案中，高于相应生物标记的对照水平的表15或表16中的生物标记的水平表明受试者患有NAFLD。

本文所鉴别的生物标记提供了关于可用于有效地鉴别NAFLD的生物标记的子集或组的许多选择。本文所鉴别的生物标记提供了关于可用于有效地鉴别脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和/或纤维化的生物标记的子集或组的许多选择。本文所鉴别的生物标记提供关于可用于有效地鉴别NASH的生物标记的子集或组的许多选择。本文所鉴别的生物标记提供了关于可用于有效地鉴别1期、2期、3期或4期NASH的生物标记的子集或组的许多选择。这种生物标记的适当数量的选择可取决于所选生物标记的特定组合。另外，在本文所述的任何方法中，除非其中明确指出，生物标记组可包含表3、4、6、7、8、9或15中未示出的另外的生物标记。

在一些实施方案中，一种方法包括在来自受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或至少十种选自以下的生物标记的水平：ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、HSP90AA1/HSP90AB1、ITGA1/ITGB1、KYNU、POR、FCGR3B、LGALS3BP、SERPINC1、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和THBS2，其中至少一种生物标记的水平表明所述受试者患有NAFLD。

在一些实施方案中，一种方法包括在来自受试者的样品中检测表3、4、6、7、8、9和/或15中列出的至少一种生物标记的水平，以便确定受试者是否患有NASH、或2期、3期或4期NASH。在一些这类实施方案中，所述方法包括使来自受试者的样品或样品的一部分与至少一种捕获试剂接触，其中每种捕获试剂特异性地结合水平正被检测的生物标记。在一些实施方案中，所述方法包括使样品或来自样品的蛋白质与至少一种适体接触，其中每种适体特异性地结合水平正被检测的生物标记。

本文所鉴别的生物标记提供了关于可用于有效地鉴别NASH、或2期、3期或4期NASH的生物标记的子集或组的许多选择。这种生物标记的适当数量的选择可取决于所选生物标记的特定组合。另外，在本文所述的任何方法中，除非其中明确指出，生物标记组可包含表3、4、6、7、8、9或15中未示出的另外的生物标记。

如本文所用，“非酒精性脂肪肝疾病”或“NAFLD”是指在不存在过度饮酒的情况下脂肪沉积在肝脏(肝脂肪变性)中而有或无炎症和纤维化的病状。

如本文所用，“脂肪变性”和“非酒精性脂肪变性”可互换使用且包括在不存在过度饮酒的情况下的轻度、中度和重度脂肪变性，无炎症或纤维化。表1示出了轻度、中度和重度脂肪变性的示例性分类。

如本文所用，“非酒精性脂肪性肝炎”或“NASH”是指在肝脏中存在炎症和/或纤维化的NAFLD。NASH可划分为四个阶段。确定NASH的阶段的示例性方法描述于例如Kleiner等人,2005,Hepatology,41(6):1313-1321及Brunt等人,2007,Modern Pathol.,20:S40-S48中。表1示出了1期、2期、3期和4期NASH的示例性分类。

如本文所用，关于受试者的“肥胖”是指具有30或更大的BMI的受试者。

“生物样品”、“样品”和“测试样品”在本文中可互换使用且指的是获自或以其它方式来源于个体的任何材料、生物流体、组织或细胞。这包括血液(包括全血、白细胞、外周血单核细胞、白细胞层、血浆和血清)、痰液、泪液、粘液、洗鼻液、鼻吸出物、尿液、唾液、腹腔冲洗液、腹水、囊肿液、腺液、淋巴液、支气管抽吸液、滑液、关节抽吸液、器官分泌物、细胞、细胞提取物和脑脊液。这还包括所有上述物质的实验上分离的级分。例如，血液样品可被分级分离为血清、血浆或含有特定类型的血细胞的级分，如红细胞或白细胞(白血球)。在一些实施方案中，样品可为来自个体的样品的组合，如组织与体液样品的组合。术语“生物样品”还包括含有均化的固体材料的材料，如来自粪便样品、组织样品或组织活检。术语“生物样品”还包括来源于组织培养物或细胞培养物的材料。可采用用于获得生物样品的任何合适的方法；示例性方法包括例如静脉切开术、拭子(例如，口腔拭子)及细针抽吸活检。易于细针抽吸的示例性组织包括淋巴结、肺、甲状腺、乳腺、胰脏和肝脏。还可例如通过显微解剖(例如，激光捕获显微解剖(LCM)或激光显微解剖(LMD))、膀胱冲洗、涂片(例如PAP涂片)或导管灌洗来收集样品。获自或来源于个体的“生物样品”包括在从个体处获得之后以任何合适的方法处理的任何这类样品。

此外，在一些实施方案中，生物样品可通过从许多个体处采集生物样品并将它们汇集或将每个个体的生物样品的等分试样汇集而获得。汇集的样品可如本文中对于来自单独个体的样品所述被处理，且例如，如果在汇集的样品中建立不良预后，那么每个个体生物样品可被再测试以便确定哪个(些)个体患有脂肪变性和/或NASH。

“靶标”、“靶分子”和“分析物”在本文中可互换使用且指的是可存在于生物样品中的任何目标分子。“目标分子”包括特定分子的任何微小变化，如在蛋白质的情况下，例如在氨基酸序列、二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰方面的微小变化，如与标记组分的缀合，其基本上未改变分子的身份。“靶分子”、“靶标”或“分析物”是指一种或一类分子或多分子结构的一组拷贝。“靶分子”、“靶标”和“分析物”是指多于一种或一类分子或多分子结构。示例性靶分子包括蛋白质、多肽、核酸、碳水化合物、脂质、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、亲和体、抗体模拟物、病毒、病原体、有毒物质、底物、代谢物、过渡态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养素、生长因子、细胞、组织及任何上述物质的任何片段或部分。在一些实施方案中，靶分子是蛋白质，在此情况下，靶分子可被称为“靶蛋白”。

如本文所用，“捕获剂”或“捕获试剂”是指能够特异性地结合至生物标记的分子。“靶蛋白捕获试剂”是指能够特异性地结合至靶蛋白的分子。非限制性示例性捕获试剂包括适体、抗体、纤连蛋白(adnectin)、锚蛋白、其它抗体模拟物和其它蛋白骨架、自身抗体、嵌合体、小分子、核酸、凝集素、配体结合受体、印迹聚合物、高亲和性多聚体(avimer)、肽模拟物、激素受体、细胞因子受体、合成受体、以及任何上述捕获试剂的修饰和片段。在一些实施方案中，捕获试剂选自适体和抗体。

术语“抗体”是指任何物种的全长抗体及所述抗体的片段和衍生物，包括Fab片段、F(ab')₂片段、单链抗体、Fv片段和单链Fv片段。术语“抗体”还指的是合成来源的抗体，如噬菌体展示来源的抗体和片段、亲和体、纳米抗体等。

如本文所用，“标记”和“生物标记”可互换使用且是指靶分子，其指示或是在个体中或个体的疾病或其它病状中的正常或异常过程的体征。更具体地，“标记”或“生物标记”是与特定生理状态或过程(不管是正常还是异常，且如果是异常的，则不管是慢性还是急性)的存在有关的解剖、生理、生化或分子参数。可通过包括实验室测定和医学成像的多种方法来检测和测量生物标记。在一些实施方案中，生物标记是靶蛋白。

如本文所用，“生物标记水平”和“水平”是指以下测量：使用用于检测生物样品中的生物标记的任何分析方法进行且指示生物样品中的生物标记或对应于所述生物标记的存在、不存在、绝对量或浓度、相对量或浓度、滴度、水平、表达水平、测量水平比率等。“水平”的确切性质取决于用于检测生物标记的具体分析方法的特定设计和组分。

靶分子的“对照水平”是指在来自不患有疾病或病状的个体或来自未怀疑患有疾病或病状的个体的相同样品类型中靶分子的水平。靶分子的“对照水平”无须每次在进行本发明方法时测定，并且可为预先确定的水平，其用作参照或阈值以确定具体样品中的水平是高于还是低于正常水平。在一些实施方案中，本文所述的方法中的对照水平是在一名或多名无NAFLD的受试者中观察到的水平。在一些实施方案中，本文所述的方法中的对照水平是在一名或多名具有NAFLD但无NASH的受试者中观察到的水平。在一些实施方案中，本文所述的方法中的对照水平是平均值或平均水平，任选地加上或减去已在多名正常受试者或具有NAFLD而无NASH的受试者中观察到的统计变差。

如本文所用，“个体”和“受试者”可互换使用且指的是测试受试者或患者。个体可为哺乳动物或非哺乳动物。在各个实施方案中，个体是哺乳动物。哺乳动物个体可为人或非人。在各个实施方案中，个体是人。健康或正常个体是其中未通过常规诊断方法检测到所关注的疾病或病状(如NASH)的个体。

“诊断(Diagnose)”、“诊断(diagnosing)”、“诊断(diagnosis)”及其变化形式是指基于与个体有关的一个或多个体征、症状、数据或其它信息对该个体的健康状态或状况的检测、测定或识别。个体的健康状态可被诊断为健康的/正常的(即，不存在疾病或病状的诊断)或诊断为生病的/异常的(即，存在疾病或病状的诊断，或疾病或病状特征的评估)。术语“诊断(diagnose)”、“诊断(diagnosing)”、“诊断(diagnosis)”等在关于特定疾病或病状时包括疾病的初步检测；疾病的表征或分类；疾病的进展、缓解或复发的检测；以及在向个体施用治疗或疗法之后疾病反应的检测。NAFLD的诊断包括将患有NAFLD的个体与不患有NAFLD的个体相区分。NASH的诊断包括将患有NASH的个体与患有肝脏脂肪变性但非NASH的个体和不患有肝脏疾病的个体相区分。

“预后(Prognose)”、“预后(prognosing)”、“预后(prognosis)”及其变化形式是指对在患有疾病或病状的个体中疾病或病状今后过程的预测(例如，预测患者的存活期)，且这类术语涵盖在向个体施用治疗或疗法之后对疾病反应的评价。

“评价(Evaluate)”、“评价(evaluating)”、“评价(evaluation)”及其变化形式既包括“诊断”也包括“预后”并且还包括关于不患有疾病的个体的疾病或病状今后过程的测定或预测以及关于疾病或病状将在显然疾病已被治愈的个体中复发的可能性的测定或预测。术语“评价”还包括评定个体对疗法的反应，例如，预测个体是否可能对治疗剂反应良好或可能对治疗剂无反应(或例如将经历毒性或其它不良副作用)、选择用于施用于个体的治疗剂或监测或确定个体对已向个体施用的疗法的反应。因此，“评价”NAFLD可包括例如以下任一项：预测个体中NAFLD的今后过程；预测NAFLD是否将进展为NASH；预测NASH的特定阶段是否将进展为NASH的更高阶段；等等。

如本文所用，“检测”或“测定”在关于生物标记水平时包括既使用用于观察和记录对应于生物标记水平的信号的仪器也使用生成信号所需的材料。在各个实施方案中，使用以下任何合适的方法检测水平，包括荧光、化学发光、表面等离子体共振、表面声波、质谱、红外光谱学、拉曼光谱学、原子力显微术、扫描隧道显微术、电化学检测方法、核磁共振、量子点等。

如本文所用，“患有NAFLD的受试者”是指已被诊断患有NAFLD的受试者。在一些实施方案中，在常规检查期间、监测代谢综合征和肥胖时或监测药物(例如，胆固醇降低剂或类固醇)的可能副作用时怀疑有NAFLD。在一些情况下，肝酶如AST和ALT高。在一些实施方案中，根据腹部或胸部成像、肝脏超声或磁共振成像来诊断受试者。在一些实施方案中，已在NAFLD诊断之前排除了其它病状，如过量饮酒、丙型肝炎和威尔逊病。在一些实施方案中，已根据肝活组织检查对受试者进行诊断。

如本文所用，“患有脂肪变性的受试者”和“患有非酒精性脂肪变性的受试者”可互换使用，并且指的是已被诊断患有脂肪变性的受试者。在一些实施方案中，通过通常针对NAFLD的如上所述方法诊断脂肪变性。

如本文所用，“患有NASH的受试者”是指已被诊断患有NASH的受试者。在一些实施方案中，通过如上通常针对NAFLD所述的方法诊断NASH。在一些实施方案中，根据GambinoR,等人Annals of Medicine 2011；43(8):617-49，在患有NAFLD的患者中诊断晚期纤维化。

如本文所用，“处于发展NAFLD的风险中的受试者”是指具有一种或多种以下NAFLD合并症的受试者，如肥胖、腹部肥胖、代谢综合征、心血管疾病和糖尿病。

如本文所用，“处于发展脂肪变性的风险中的受试者”是指没被诊断为患有脂肪变性但具有以下一种或多种NAFLD合并症的受试者，如肥胖、腹部肥胖、代谢综合征、心血管疾病和糖尿病。

如本文所用，“处于发展NASH的风险中的受试者”是指持续具有以下一种或多种NAFLD合并症的患有脂肪变性的受试者，如肥胖、腹部肥胖、代谢综合征、心血管疾病和糖尿病。

“固体支持物”在本文中是指具有分子可通过共价或非共价键直接或间接地连接至的表面的任何底物。“固体支持物”可具有多种物理形式，可包括例如：膜；芯片(例如，蛋白质芯片)；载玻片(例如，玻璃载玻片或盖玻片)；柱；空心、实心、半实心、含孔隙或空隙的颗粒，例如珠粒；凝胶；纤维，包括光学纤维材料；基质；及样品容器。示例性样品容器包括样品孔、试管、毛细管、小瓶以及能够容纳样品的任何其它容器、凹槽或凹口。样品容器可设置在多样品平台上，如微量滴定板、载玻片、微流体装置等。支持物可由天然或合成材料、有机或无机材料构成。捕获试剂连接至其上的固体支持物的组成通常取决于连接方法(例如，共价连接)。其它示例性容器包括微滴和微流体控制的或散装油性/水性乳液，其中可进行测定及相关操作。合适的固体支持物包括例如：塑料、树脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、功能化的玻璃、改性硅、碳、金属、无机玻璃、膜、尼龙、天然纤维(例如像丝、羊毛和棉花)、聚合物等。构成固体支持物的材料可包括反应性基团，例如像羧基、氨基或羟基，其可用于捕获试剂的连接。聚合的固体支持物可包括例如聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、丁基橡胶、苯乙烯-丁二烯橡胶、天然橡胶、聚乙烯、聚丙烯、(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯、聚碳酸酯和聚甲基戊烯。可使用的合适的固体支持物颗粒包括例如编码颗粒，如型编码的颗粒、磁性颗粒和玻璃颗粒。

生物标记的示例性用途

在各个示例性实施方案中，提供了用于确定受试者是否患有NAFLD的方法。在各个实施方案中，提供了一种用于确定受试者是否患有NAFLD的方法，其包括由表15和/或表16中所列的生物标记蛋白形成具有N种生物标记蛋白的生物标记组，及在来自受试者的样品中检测该组的N种生物标记蛋白中的每一种的水平，其中N为至少5。在各个实施方案中，提供了一种用于确定受试者是否患有NAFLD的方法，其包括在来自受试者的样品中检测表15和/或表16中列出的至少一种生物标记的水平以便确定受试者是否患有NAFLD。

在各个实施方案中，提供了用于确定受试者是否患有脂肪变性的方法，其可为轻度、中度或重度脂肪变性。在各个实施方案中，提供了用于确定受试者是否患有NASH的方法，其可为1期、2期、3期或4期NASH，或可为2期、3期或4期NASH。在一些实施方案中，提供了用于确定患有脂肪变性的受试者是否患有NASH的方法，其可为1期、2期、3期或4期NASH，或可为2期、3期或4期NASH。在一些实施方案中，提供了用于表征NASH的组织学分级的方法。在一些实施方案中，提供了用于确定受试者是否患有脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和/或纤维化的方法。所述方法包括通过许多分析方法(包括本文所述的任何分析方法)检测对应于存在于个体循环(如血清或血浆)中的一种或多种生物标记的一个或多个生物标记水平。这些生物标记例如与正常个体(其中正常个体可为肥胖个体)相比以不同水平存在于患有NAFLD的个体中。在一些实施方案中，生物标记与正常个体(其中正常个体可为肥胖个体)相比以不同水平存在于患有NASH(如1期、2期、3期或4期NASH，或2期、3期或4期NASH)的个体中。在一些实施方案中，生物标记与患有脂肪变性(其可为轻度、中度、或重度脂肪变性)的受试者相比以不同水平存在于患有NASH(如1期、2期、3期或4期NASH，或2期、3期或4期NASH)的个体中。

在一些实施方案中，生物标记与正常个体(其中正常个体可为肥胖个体)相比以不同水平存在于患有脂肪变性的个体中。在一些实施方案中，生物标记与正常个体(其中正常个体可为肥胖个体)相比以不同水平存在于患有小叶炎症的个体中。在一些实施方案中，生物标记与正常个体(其中正常个体可为肥胖个体)相比以不同水平存在于患有肝细胞气球样变性的个体中。在一些实施方案中，生物标记与正常个体(其中正常个体可为肥胖个体)相比以不同水平存在于患有纤维化的个体中。

可使用生物标记在个体中的差异水平的检测，以便例如允许确定个体是否患有NAFLD(其可为脂肪变性或NASH)或患有脂肪变性的个体是否已发展NASH。在一些实施方案中，本文所述的任何生物标记都可用于关于NAFLD的发展来监测个体(如肥胖个体)或关于NASH的发展来监测患有脂肪变性的个体。

作为本文所述的任何生物标记可用于确定受试者是否患有NAFLD的方法的一个实例，在未被诊断有NAFLD但具有一种或多种NAFLD合并症的个体中的一种或多种所述生物标记的水平可表明个体与使用侵入性检验(如肝活组织检查)所确定的相比已发展较早期的NAFLD。因为本发明方法是非侵入性的，所以它们可用于监测处于发展NAFLD的风险中的个体(例如像肥胖个体)。通过检测较早期的NAFLD，医疗干预可以更为有效。这种医疗干预可包括但不限于减轻体重、控制血糖和避免酒精。在一些实施方案中，可使用治疗剂，如吡格列酮、维生素E和/或二甲双胍。参见，例如Sanyal等人,2010,NEJM,362:1675-1685。在一些情况下，这种早期干预可延迟或预防肝功能衰竭以及对肝移植的需要。

类似地，作为本文所述的生物标记可用于确定患有脂肪变性的受试者是否发展NASH的方法的另一实例，在患有脂肪变性的个体中的一种或多种所述生物标记的水平可表明所述个体正发展NASH。因为本发明方法是非侵入性的，所以可关于NASH的发展对患有脂肪变性的个体进行监测。通过检测较早期的NASH，医疗干预可以更为有效。这种医疗干预可包括但不限于减轻体重、控制血糖和避免酒精。在一些实施方案中，可使用治疗剂，如吡格列酮、维生素E和/或二甲双胍。参见，例如Sanyal等人,2010,NEJM,362:1675-1685。在一些情况下，这种早期干预可延迟或预防肝功能衰竭以及对肝移植的需要。

另外，在一些实施方案中，一种或多种生物标记在个体中随时间的差异表达水平可表明个体对具体治疗方案的反应。在一些实施方案中，在随访监测期间一种或多种生物标记的表达变化可表明特定疗法是有效的或可提示治疗方案应有某种变化，如更侵入性地控制血糖、更侵入性地追求体重减轻等等。在一些实施方案中，一种或多种生物标记在个体中随时间的恒定表达水平可表明个体的脂肪变性没有恶化或没有发展成NASH。

除作为独立诊断测试来测试生物标记水平之外，生物标记水平也可结合确定单核苷酸多态性(SNP)或其它基因损伤或变异性(其表明疾病的易感风险增加)来进行。(参见，例如Amos等人,Nature Genetics40,616-622(2009))。

除作为独立诊断测试来测试生物标记水平之外，生物标记水平也可结合其它NAFLD筛选法进行，如检测肝脏肿大、血液检查(例如，检测某些肝酶的升高，如ALT和/或AST)、腹部超声和肝活组织检查。在一些情况下，使用本文所述的生物标记的方法可推动医疗和经济合理性，以便于实现NAFLD或NASH的更侵入性治疗、更频繁的随访筛选等等。生物标记也可用于开始处于发展NAFLD的风险中但尚未诊断有脂肪变性(倘若诊断测试表明他们可能发展该疾病)的个体中的治疗。

除结合其它NAFLD诊断方法测试生物标记水平之外，关于生物标记的信息也可结合其它数据类型来评价，特别是指出个体的NAFLD风险的数据。这些不同数据可通过自动方法、如计算机程序/软件来评定，所述计算机程序/软件可用计算机或其它设备/装置来实施。

生物标记和生物标记水平的检测和测定

可使用多种已知分析方法中的任一种来检测本文所述的生物标记的生物标记水平。在一个实施方案中，使用捕获试剂检测生物标记水平。在各个实施方案中，捕获试剂可暴露于溶液中的生物标记或当捕获试剂被固定在固体支持物上时可暴露于生物标记。在其它实施方案中，捕获试剂含有与固体支持物上的第二特征反应的特征。在这些实施方案中，捕获试剂可暴露于溶液中的生物标记，然后可将捕获试剂上的特征结合固体支持物上的第二特征使用以便固定固体支持物上的生物标记。基于有待进行的分析类型来选择捕获试剂。捕获试剂包括但不限于适体、抗体、纤连蛋白、锚蛋白、其它抗体模拟物和其它蛋白骨架、自身抗体、嵌合体、小分子、F(ab')₂片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、核酸、凝集素、配体结合受体、亲和体、纳米抗体、印迹聚合物、高亲和性多聚体、肽模拟物、激素受体、细胞因子受体、和合成受体、以及这些捕获试剂的修饰和片段。

在一些实施方案中，使用生物标记/捕获试剂复合物检测生物标记水平。

在一些实施方案中，生物标记水平衍生自生物标记/捕获试剂复合物并且间接地检测，例如通过生物标记/捕获试剂相互作用之后的反应，但依赖于生物标记/捕获试剂复合物的形成。

在一些实施方案中，由生物样品中的生物标记直接检测生物标记水平。

在一些实施方案中，使用多重模式检测生物标记，其允许同时检测生物样品中的两种或更多种生物标记。在多重模式的一些实施方案中，捕获试剂被直接或间接地、共价或非共价地固定在固体支持物上的离散位置处。在一些实施方案中，多重模式使用离散的固体支持物，其中每个固体支持物具有与固体支持物(例如像量子点)缔合的独特的捕获试剂。在一些实施方案中，将单独的装置用于检测有待在生物样品中检测的多种生物标记中的每一种。单独的装置可被配置来允许生物样品中的每种生物标记被同时处理。例如，可使用微量滴定板，以使得板中的各孔用于分析有待在生物样品中检测的多种生物标记中的一种或多种。

在上述实施方案的一个或多个中，荧光标签可用于标记生物标记/捕获试剂复合物的组分以便能够检测生物标记水平。在各个实施方案中，可使用已知技术将荧光标记缀合至对本文所述的任何生物标记有特异性的捕获试剂上，且接着荧光标记可用于检测相应的生物标记水平。合适的荧光标记包括稀土元素螯合物、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、别藻蓝蛋白、PBXL-3、Qdot 605、丽丝胺、藻红蛋白、德克萨斯红及其它这类化合物。

在一些实施方案中，荧光标记是荧光染料分子。在一些实施方案中，荧光染料分子包括至少一个取代的吲哚鎓(indolium)环系统，其中在吲哚鎓环的3-碳上的取代基含有化学反应性基团或缀合物质。在一些实施方案中，染料分子包括AlexFluor分子，例如像AlexaFluor 488、AlexaFluor 532、AlexaFluor 647、AlexaFluor 680或AlexaFluor 700。在一些实施方案中，染料分子包括第一类型和第二类型的染料分子，例如，两种不同的AlexaFluor分子。在一些实施方案中，染料分子包括第一类型和第二类型的染料分子，并且这两种染料分子具有不同的发射光谱。

可用与广泛多种测定模式相容的多种仪器来测量荧光。例如，分光荧光计已被设计来分析微量滴定板、显微镜载玻片、打印阵列、比色皿等。参见Principles ofFluorescence Spectroscopy,J.R.Lakowicz编著,Springer Science+Business Media,Inc.,2004。参见Bioluminescence&Chemiluminescence:Progress&CurrentApplications；Philip E.Stanley和Larry J.Kricka编著,World Scientific PublishingCompany,2002年1月。

在一个或多个实施方案中，化学发光标签可任选地用于标记生物标记/捕获复合物的组分以便能够检测生物标记水平。合适的化学发光材料包括以下任一种：草酰氯、罗丹明6G、Ru(bipy)₃ ²⁺、TMAE(四(二甲基氨基)乙烯)、连苯三酚(1,2,3-三羟基苯)、光泽精、过草酸酯、草酸芳酯、吖啶酯、二氧杂环丁烷等。

在一些实施方案中，检测方法包括酶/底物组合，其生成对应于生物标记水平的可检测信号。通常，酶催化显色底物的化学变化，可使用包括分光光度测定法、荧光和化学发光的各种技术来测量此化学变化。合适的酶包括例如荧光素酶、荧光素、苹果酸脱氢酶、尿素酶、辣根过氧化酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、尿酸酶、黄嘌呤氧化酶、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。

在一些实施方案中，检测方法可以是以下的组合：荧光、化学发光、放射性核素或生成可测量信号的酶/底物组合。在一些实施方案中，多模式信号可在生物标记测定模式上具有独特且有利的特征。

在一些实施方案中，可使用包括以下的任何分析方法检测本文所述的生物标记的生物标记水平：单倍适体测定、多重适体测定、单倍或多重免疫测定、mRNA表达谱分析、miRNA表达谱分析、质谱分析、组织学/细胞学方法等，如下所论述。

使用基于适体的测定的生物标记水平测定

涉及生理上有意义的分子在生物样品及其它样品中的检测和定量的测定是科学研究和卫生保健领域中的重要工具。一类这种测定涉及微阵列的使用，所述微阵列包括固定在固体支持物上的一种或多种适体。适体各自能够以高度特异性方式且以极高亲和力结合至靶分子。参见，例如标题为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利号5,475,096；也参见，例如美国专利号6,242,246、美国专利号6,458,543和美国专利号6,503,715，其各自的标题为“Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip”。一旦微阵列与样品接触，适体便结合至存在于样品中的其相应的靶分子上且由此使得能够测定对应于生物标记的生物标记水平。

如本文所用，“适体”是指具有针对靶分子的特异性结合亲和力的核酸。认识到亲和力相互作用是程度的问题；然而，在本上下文中，适体对其靶标的“特异性结合亲和力”意指适体通常以与其结合至测试样品中的其它组分相比高得多的亲和力程度结合至其靶标。“适体”是具有特定核苷酸序列的一类或一种核酸分子的一组拷贝。适体可包括任何合适数目的核苷酸，包括任何数目的化学修饰的核苷酸。“适体”是指一个以上这种分子组。不同的适体可具有相同或不同数目的核苷酸。适体可为DNA或RNA或化学修饰的核酸且可为单链、双链或含有双链区域，并且可包括更高的有序结构。适体也可为光适体，其中光反应性或化学反应性官能团包括在适体中以容许该适体与其相应靶标共价连接。本文所公开的任何适体方法可包括两个或更多种适体的使用，这些适体特异性地结合相同靶分子。如下文进一步描述，适体可包括标签。如果适体包括标签，那么该适体的所有拷贝无须具有相同标签。此外，如果不同适体各自包括标签，那么这些不同的适体可具有相同标签或不同标签。

适体可使用任何已知的方法(包括SELEX方法)来鉴别。一旦经鉴别，便可根据包括化学合成方法和酶促合成方法的任何已知方法制备或合成适体。

术语“SELEX”和“SELEX方法”在本文中可互换使用且通常指的是以下组合：(1)以所需方式与靶分子相互作用的适体的选择，例如以高亲和力结合至蛋白质，与(2)那些所选核酸的扩增。SELEX方法可用于鉴别以高亲和力结合至特异性靶标或生物标记的适体。

SELEX通常包括制备候选核酸混合物、候选混合物结合至所期望的靶分子以形成亲和复合物、将亲和复合物与未结合的候选核酸分离、将核酸与亲和复合物分离或隔离、纯化核酸以及鉴别特异性适体序列。该方法可包括多个轮次以进一步改善所选适体的亲和力。该方法可包括在方法中的一个或多个点处的扩增步骤。参见，例如标题为“NucleicAcid Ligands”的美国专利号5,475,096。SELEX方法可用于生成共价地结合其靶标的适体以及非共价地结合其靶标的适体。参见，例如标题为“Systematic Evolution of NucleicAcid Ligands by Exponential Enrichment:Chemi-SELEX.”的美国专利号5,705,337。

SELEX方法可用于鉴别含有修饰的核苷酸的高亲和力适体，所述修饰的核苷酸赋予适体以改善的特征，例如，改善的体内稳定性或改善的递送特征。这种修饰的实例包括在核糖和/或磷酸和/或碱基位置处的化学取代。SELEX方法鉴别的含有修饰的核苷酸的适体描述于标题为“High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing ModifiedNucleotides”的美国专利号5,660,985中，该专利描述了在嘧啶的5'-和2'-位处含有被化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美国专利号5,580,737(参见上文)描述了含有一个或多个用2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟代(2'-F)和/或2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的核苷酸的高特异性适体。也参见标题为“SELEX and PHOTOSELEX”的美国专利申请公布号2009/0098549，其描述了具有扩展的物理和化学特性的核酸文库及其在SELEX和photoSELEX中的用途。

SELEX也可用于鉴别具有所需解离速率特征的适体。参见标题为“Method forGenerating Aptamers with Improved Off-Rates”的美国公布号US 2009/0004667，其描述了用于生成可结合至靶分子的适体的改进的SELEX方法。描述了用于产生具有与其相应的靶分子的慢解离速率的适体和光适体的方法。所述方法涉及使候选混合物与靶分子接触、容许形成核酸-靶标复合物以及进行慢解离率富集过程，其中具有快解离速率的核酸-靶标复合物将解离并且不再重新形成，而具有慢解离速率的复合物将保持完整。另外，所述方法包括在生产候选核酸混合物中使用修饰的核苷酸以产生具有改善的解离速率性能的适体。非限制性示例性修饰的核苷酸包括例如图11中所示的修饰的嘧啶。在一些实施方案中，适体包含至少一个具有修饰(如碱基修饰)的核苷酸。在一些实施方案中，适体包含至少一个具有疏水性修饰(如疏水性碱基修饰)的核苷酸，以便允许与靶蛋白的疏水性接触。在一些实施方案中，这种疏水性接触促成更大的亲和力和/或适体的更慢解离速率结合。具有疏水性修饰的非限制性示例性核苷酸示于图11中。在一些实施方案中，适体包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有疏水性修饰的核苷酸，其中每个疏水性修饰可与其它修饰相同或不同。在一些实施方案中，适体中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个疏水性修饰可独立地选自图11中所示的疏水性修饰。

在一些实施方案中，慢解离速率适体(包括包含至少一个具有疏水性修饰的核苷酸的适体)具有以下解离速率(t_1/2)：≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟。

在一些实施方案中，测定采用包含光反应性官能团的适体，所述官能团能使适体共价地结合或“光交联”其靶分子。参见，例如标题为“Nucleic Acid Ligand DiagnosticBiochip”的美国专利号6,544,776。这些光反应性适体也被称为光适体。参见，例如美国专利号5,763,177、美国专利号6,001,577和美国专利号6,291,184，其各自的标题为“Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment:Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX”；也参见，例如标题为“Photoselection of Nucleic Acid Ligands”的美国专利号6,458,539。在微阵列与样品接触且光适体有机会结合至其靶分子之后，光适体被光活化，且洗涤固体支持物以除去任何非特异性结合分子。可使用苛刻的洗涤条件，因为结合至光适体的靶分子通常不被除去，归因于光适体上的光活化的官能团所制造的共价键。以此方式，所述测定使得能够检测对应于测试样品中的生物标记的生物标记水平。

在一些测定模式中，适体在与样品接触之前被固定在固体支持物上。然而，在某些情况下，适体在与样品接触之前的固定化不能提供最佳测定。例如，适体的预固定化可引起适体与固体支持物表面上的靶分子的低效混合，或许造成过长的反应时间且因此，延长培育期以便允许适体与其靶分子的高效结合。此外，当光适体用于所述测定中且根据所用的材料用作固体支持物时，所述固体支持物可倾向于散射或吸收所用的光以便在光适体与其靶分子之间形成共价键。而且，根据所用方法，结合至其适体的靶分子的检测容易有不精确性，因为固体支持物的表面也可暴露于所用的任何标记因子并受到它们的影响。最终，适体在固体支持物上的固定化通常涉及在适体暴露于样品之前的适体制备步骤(即固定化)，且此制备步骤可影响适体的活性或官能性。

还描述了适体测定，其允许适体捕获在溶液中的其靶标，然后采用分离步骤，该步骤被设计来在检测之前除去适体-靶标混合物的特定组分(参见，标题为“MultiplexedAnalyses of Test Samples”的美国公布号2009/0042206)。所述适体测定法使得能够通过检测和定量核酸(即适体)来检测和定量测试样品中的非核酸靶标(例如，蛋白质靶标)。所述方法形成用于检测和定量非核酸靶标的核酸替代品(即适体)，由此容许将包括扩增的广泛多种核酸技术用于更宽范围的所需靶标，包括蛋白质靶标。

适体可被构建以促进测定组分与适体生物标记复合物(或光适体生物标记共价复合物)的分离且允许分离适体用于检测和/或定量。在一个实施方案中，这些构建体可包括在适体序列内可裂解或可释放的元件。在其它实施方案中，可将另外的官能团引入适体中，例如，标记或可检测的组分、间隔组分或特异性结合标签或固定化元件。例如，适体可包括标签，所述标签经由可裂解部分、标记、分隔标记与可裂解部分的间隔组分连接到适体上。在一个实施方案中，可裂解元件是光可裂解接头。光可裂解接头可连接到生物素部分和间隔区段上，可包括用于胺的衍生化的NHS基团，且可用于将生物素基团引入适体中，由此允许随后在测定法中释放适体。

用在溶液中的所有测定组分进行的均相测定不需要在检测信号之前分离样品与试剂。这些方法快速且易于使用。这些方法基于与其特异性靶标反应的分子捕获或结合试剂生成信号。在本文所述方法的一些实施方案中，分子捕获试剂包括适体或抗体等且特异性靶标可为表3、4、6、7、8和/或9中所示的生物标记。

在一些实施方案中，用于信号产生的方法利用各向异性信号变化，这归因于荧光团标记的捕获试剂与其特异性生物标记靶标的相互作用。当标记捕获与其靶标反应时，增加的分子量造成连接到复合物上的荧光团的旋转运动，以便慢得多地改变各向异性值。通过监测各向异性变化，结合事件可用于定量地测量溶液中的生物标记。其它方法包括荧光偏振测定、分子信标方法、时间分辨的荧光猝灭、化学发光、荧光共振能量转移等。

可用于检测生物样品中的生物标记水平的示例性基于溶液的适体测定包括以下：(a)通过使生物样品与适体接触来制备混合物，所述适体包括第一标签且具有针对生物标记的特异性亲和力，其中当生物标记存在于样品中时，形成适体亲和复合物；(b)将混合物暴露于包括第一捕获元件的第一固体支持物，且容许第一标签与第一捕获元件缔合；(c)除去未与第一固体支持物缔合的混合物的任何组分；(d)使第二标签连接至适体亲和复合物的生物标记组分上；(e)将适体亲和复合物从第一固体支持物上释放；(f)将所释放的适体亲和复合物暴露于包括第二捕获元件的第二固体支持物且容许第二标签与第二捕获元件缔合；(g)通过将非复合的适体与适体亲和复合物分开将任何非复合的适体从混合物中除去；(h)将适体从固体支持物上洗脱；以及(i)通过检测适体亲和复合物的适体组分来检测生物标记。

使用适体检测生物样品中的生物标记的非限制性示例性方法描述于实施例7中。也参见Kraemer等人,PLoS One 6(10):e26332。

使用免疫测定的生物标记水平的测定

免疫测定方法是基于抗体与其相应靶标或分析物的反应且可根据具体的测定模式检测样品中的分析物。为了提高基于免疫反应性的测定法的特异度和敏感度，经常使用单克隆抗体及其片段，这是由于它们的特异性表位识别。多克隆抗体也已成功地用于各种免疫测定中，因为它们与单克隆抗体相比对靶标的增加的亲和力。免疫测定已被设计以便与广泛多种生物样品基质一起使用。免疫测定模式已被设计来提供定性、半定量和定量结果。

通过使用采用已知浓度的有待检测的特定分析物形成的标准曲线产生定量结果。将来自未知样品的反应或信号绘制到标准曲线上，并且建立对应于未知样品中的靶标的量或水平。

已经设计了众多免疫测定模式。ELISA或EIA可为定量的以用于检测分析物。此方法依赖于标记与分析物或抗体的连接并且标记组分直接或间接地包括酶。ELISA测试可被格式化以用于分析物的直接、间接、竞争性或夹心检测。其它方法依赖于标记，例如像放射性同位素(I¹²⁵)或荧光。另外的技术包括例如凝集、浊度测定法、比浊法、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫细胞化学、免疫组织化学、流式细胞术、Luminex测定法等(参见ImmunoAssay:APractical Guide,由Brian Law编著,由Taylor&Francis,Ltd.出版,2005版)。

示例性测定模式包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、荧光、化学发光及荧光共振能量转移(FRET)或时间分辨的FRET(TR-FRET)免疫测定。用于检测生物标记的工序的实例包括生物标记免疫沉淀，接着是容许尺寸和肽水平辨别的定量方法，如凝胶电泳、毛细管电泳、平面电色谱法等。

检测和/或定量可检测的标记或信号生成材料的方法取决于标记的性质。由适当的酶(其中可检测的标记是酶；参见上面)催化的反应的产物可为但不限于荧光的、发光的或放射性的或者它们可吸收可见光或紫外光。适用于检测这种可检测标记的检测器的实例包括但不限于x光片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、色度计、荧光计、光度计和比重计。

任何检测方法可以允许任何合适的制备、处理及反应分析的任何模式进行。这可例如在多孔测定板(例如，96孔或386孔)中或者使用任何合适的阵列或微阵列进行。各种试剂的储备溶液可手动或自动制成，且所有后续的吸移、稀释、混合、分布、洗涤、培育、样品读出、数据收集和分析均可使用可商购获得的分析软件、机器人及能够检测出可检测标记的检测仪器自动地进行。

使用基因表达谱分析的生物标记水平的测定

在一些实施方案中，测量生物样品中的mRNA可用作检测生物样品中的相应蛋白质水平的替代方案。因此，在一些实施方案中，本文所述的生物标记或生物标记组可通过检测适当的RNA来检测。

在一些实施方案中，通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-PCR，接着是qPCR)测量mRNA表达水平。RT-PCR用于从mRNA生成cDNA。cDNA可在qPCR测定中使用以随着DNA扩增过程的进行产生荧光。与标准曲线相比，qPCR可产生绝对测量值，如mRNA的拷贝数/细胞。RNA印迹、微阵列、Invader测定以及与毛细管电泳结合的RT-PCR已全部用于测量mRNA在样品中的表达水平。参见Gene Expression Profiling:Methods and Protocols,RichardA.Shimkets编著,Humana Press,2004。

使用体内分子成像技术的生物标记的检测

在一些实施方案中，本文所述的生物标记可用于分子成像测试中。例如，成像剂可偶联到捕获试剂上，所述捕获试剂可用于体内检测生物标记。

体内成像技术提供了用于确定个体的身体内的具体疾病状态的非侵入性方法。例如，身体的整个部分或甚至整个身体可被看作三维图像，由此提供关于身体内的形态和结构的有价值的信息。这种技术可与本文所述的生物标记的检测相结合以提供关于体内生物标记的信息。

由于技术的各种进步，使得体内分子成像技术的使用得以扩展。这些进步包括新造影剂或标记(如放射性标记和/或荧光标记)的发展，它们可在身体内提供强信号；以及有力的新成像技术的发展，其可以足够的敏感度和精确性检测并分析来自身体外面的这些信号，以便提供有用的信息。造影剂可在适当的成像系统中可见，由此提供造影剂所位于的身体的一个或多个部分的图像。造影剂可结合至或与以下各物缔合：捕获试剂，如适体或抗体；和/或肽或蛋白质、或寡核苷酸(例如用于检测基因表达)、或含有这些物质的任一种与一个或多个大分子的复合物和/或其它颗粒形式。

造影剂也可以充当适用于成像的放射性原子。合适的放射性原子包括锝-99m或碘-123，以用于闪烁显像研究。其它易于检测的部分包括例如用于磁共振成像(MRI)的自旋标记，例如像碘-123(再次)、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。这种标记是本领域中公知的并且可易于由本领域普通技术人员来选择。

标准成像技术包括但不限于磁共振成像、计算机断层摄影扫描、电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层照相(SPECT)等。对于诊断性体内成像，可利用的检测仪器的类型是选择给定造影剂的主要因素，所述造影剂如给定的放射性核素和用于靶向(蛋白质、mRNA等)的特定生物标记。所选的放射性核素通常具有衰变类型，其可由给定类型的仪器来检测。而且，当选择放射性核素用于体内诊断时，半衰期应足够长以便在由靶组织最大摄取之时进行检测，但足够短以使对宿主的放射线伤害最小。

示例性成像技术包括但不限于PET和SPECT，它们是成像技术，其中放射性核素合成性或局部性地施用于个体。随时间测量放射性示踪剂的后续摄取并将其用于获得有关靶组织和生物标记的信息。因为所用的特定同位素的高能(γ-射线)发射及用于检测它们的仪器的灵敏性和精密性，所以放射性的二维分布可由身体外面推断。

PET中常用的正电子发射核素包括例如碳-11、氮-13、氧-15和氟-18。通过电子俘获和/或γ发射衰变的同位素被用于SPECT中并且包括例如碘-123和锝-99m。用锝-99m标记氨基酸的示例性方法是在螯合前体存在下还原高锝酸根离子以形成不稳定的锝-99m-前体复合物，其又与双官能修饰的趋化性肽的金属结合基团反应以形成锝-99m-趋化性肽缀合物。

抗体常常用于这种体内成像诊断方法。用于体内诊断的抗体的制备和使用是本领域中公知的。类似地，适体可用于这种体内成像诊断方法。例如，用于鉴别本文所述的具体生物标记的适体可适当地被标记并注射到个体中以检测体内生物标记。如先前所述，将根据有待使用的成像模态选择所用的标记。适体导向的成像剂与其它成像剂相比具有关于组织渗透、组织分布、动力学、清除、效力和选择性的独特且有利的特征。

这类技术可任选地用标记的寡核苷酸进行，例如用于通过用反义寡核苷酸成像来检测基因表达。这些方法用于原位杂交，例如用荧光分子或放射性核素作为标记。用于检测基因表达的其它方法包括例如报道基因活性的检测。

另一种一般类型的成像技术是光学成像，其中受试者内的荧光信号通过受试者外部的光学装置来检测。这些信号可归因于实际荧光和/或生物发光。在光学检测装置的灵敏度上的改善提高了光学成像对于体内诊断性测定的有效性。

关于其它技术的综述，参见N.Blow,Nature Methods,6,465-469,2009。

使用组织学/细胞学方法的生物标记的测定

在一些实施方案中，本文所述的生物标记可在多种组织样品中使用组织学或细胞学方法来检测。例如，支气管内和经支气管活检、细针吸出、切割针及核芯活检可用于组织学。支气管冲洗、胸膜抽吸及唾液可用于细胞学。本文所鉴别的任何生物标记都可用于对样本进行染色作为疾病的指示。

在一些实施方案中，将对相应的生物标记有特异性的一种或多种捕获试剂用于样品的细胞学评价中并且可包括以下一项或多项：收集细胞样品、固定细胞样品、脱水、清洗、将细胞样品固定在显微镜载玻片上、渗透细胞样品、针对分析物回收的处理、染色、脱色、洗涤、阻断以及在缓冲溶液中与一种或多种捕获试剂反应。在另一实施方案中，细胞样品是由细胞块产生。

在一些实施方案中，将对相应的生物标记有特异性的一种或多种捕获试剂用于组织样品的组织学评价中并且可包括以下一项或多项：收集组织样本、固定组织样本、脱水、清洗、将组织样本固定在显微镜载玻片上、渗透组织样本、针对分析物回收的处理、染色、脱色、洗涤、阻断、再水合以及在缓冲溶液中与一种或多种捕获试剂反应。在另一实施方案中，用冷冻代替固定和脱水。

在另一实施方案中，对相应的生物标记有特异性的一种或多种适体与组织学或细胞学样品反应并且可用作核酸扩增方法中的核酸靶标。合适的核酸扩增方法包括例如PCR、q-β复制酶、滚环扩增、链置换、解旋酶依赖性扩增、环介导的等温扩增、连接酶链反应以及限制和环化辅助的滚环扩增。

在一个实施方案中，将用于组织学或细胞学评价且对相应的生物标记有特异性的一种或多种捕获试剂在可包含以下任一种的缓冲溶液中混合：阻断材料、竞争剂、清洁剂、稳定剂、载体核酸、聚阴离子材料等。

“细胞学方案”通常包括样品收集、样品固定、样品固定化和染色。“细胞制备”可包括样品收集之后的几个处理步骤，包括将一种或多种适体用于所制备细胞的染色。

使用质谱方法的生物标记水平的测定

多种配置的质谱仪可用于检测生物标记水平。几种类型的质谱仪是可获得的或可以各种配置产生。通常，质谱仪具有以下主要部件：样品入口、离子源、质量分析器、检测器、真空系统和仪器控制系统、及数据系统。样品入口、离子源和质量分析器的差异通常界定仪器的类型及其能力。例如，入口可为毛细管柱液相色谱源或可为直接探针或级，如基质辅助的激光解吸中使用的。常用的离子源是例如电喷雾，包括纳米喷雾和微米喷雾或基质辅助的激光解吸。常见的质量分析器包括四极滤质器、离子阱质量分析器和飞行时间质量分析器。另外的质谱方法是本领域中公知的(参见Burlingame等人Anal.Chem.70:647R-716R(1998)；Kinter和Sherman,New York(2000))。

蛋白质生物标记和生物标记水平可通过以下中的任一种来检测和测量：电喷雾电离质谱(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、表面增强的激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、硅上的解吸/电离(DIOS)、二次离子质谱(SIMS)、四极飞行时间(Q-TOF)、串联飞行时间(TOF/TOF)技术(称为ultraflex III TOF/TOF)、大气压化学电离质谱(APCI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS)^N、大气压光电离质谱(APPI-MS)、APPI-MS/MS和APPI-(MS)^N、四极质谱、傅里叶变换质谱(FTMS)、定量质谱及离子阱质谱。

在蛋白质生物标记的质谱表征及生物标记水平的测定之前，将样品制备策略用于标记和富集样品。标记方法包括但不限于用于相对和绝对定量的等压标签(iTRAQ)及在细胞培养中用氨基酸标记稳定的同位素(SILAC)。在质谱分析之前用于选择性地富集候选生物标记蛋白的样品的捕获试剂包括但不限于适体、抗体、核酸探针、嵌合体、小分子、F(ab')₂片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、核酸、凝集素、配体-结合受体、亲和体、纳米抗体、锚蛋白、结构域抗体、替代抗体骨架(例如双抗体等)印迹聚合物、高亲和性多聚体、肽模拟物、类肽、肽核酸、苏糖核酸、激素受体、细胞因子受体、和合成受体、及这些物质的修饰和片段。

以上测定使得能够检测适用于本文所述的方法中的生物标记水平，其中所述方法包括在来自个体的生物样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或至少九种选自表3、4、6、7、8和9中的生物标记的生物标记。在各个实施方案中，所述方法包括检测选自本文所述的任一组生物标记的一种或多种生物标记的水平，如表5中所示的组及表3、4、6、7、8和9中所示的生物标记的子集。因此，虽然所述的一些生物标记可单独有效地用于检测NAFLD和/或NASH，但本文还描述了用于多种生物标记的分组和生物标记子集的方法以形成两种或更多种生物标记的组。根据本文所述的任何方法，生物标记水平可单独检测并分类，或者它们可在一起检测并分类，举例来说，在多重测定模式中。

生物标记的分类和疾病评分的计算

在一些实施方案中，用于给定诊断测试的生物标记“签名(signature)”含有一组生物标记，每种生物标记在所关注的群中具有特征性水平。在一些实施方案中，特征性水平可指的是对于特定组中的个体的生物标记水平的平均数或平均值。在一些实施方案中，本文所述的诊断方法可用于将来自个体的未知样品分配到两个组(NAFLD或正常的)的一个中。在一些实施方案中，本文所述的诊断方法可用于将来自个体的未知样品分配到两个组(NASH或NAFLD)的一个中。在一些实施方案中，本文所述的诊断方法可用于将来自个体的未知样品分配到三个组(正常、有NAFLD而无NASH、和NASH)的一个中。

样品向两个或更多个组的一个中的分配被称为分类，并且用于完成此分配的工序被称为分类器或分类方法。分类方法也可称为评分方法。存在可用于由一组生物标记水平构建诊断分类器的许多分类方法。在一些情况下，使用监督学习技术执行分类方法，其中使用从希望区分的两个(或更多个，对于多重分类状态)不同组的个体处获得的样品收集数据集。由于预先对于每种样品来说，每种样品所属的类别(组或群)是已知的，所以分类方法可被训练以给出所需分类反应。也可能使用无监督学习技术来制造诊断分类器。

用于开发诊断分类器的常见方法包括决策树；袋装(bagging)+提升(boosting)+森林(forest)；基于规则推理的学习；Parzen窗；线性模型；逻辑；神经网络方法；无监督聚类；K-平均值；向上/向下分级；半监督学习；原型方法；最近邻；核密度估计；支持向量机；隐马尔可夫模型；波耳兹曼学习；以及分类器，它们可简单地或以使特定目标函数最小化的方式组合。关于综述，参见，例如Pattern Classification,编者R.O.Duda,等人,John Wiley&Sons,第2版,2001；也参见The Elements of Statistical Learning-Data Mining,Inference,and Prediction,编者T.Hastie,等人,Springer Science+Business Media,LLC,第2版,2009。

为了使用监督学习技术制造分类器，获得一组称为训练数据的样品。在诊断测试的背景下，训练数据包括来自未知样品随后将分配至的不同组(类别)的样品。例如，从对照群的个体及特定疾病群的个体处收集的样品可构成训练数据以开发一种分类器，所述系统可将未知样品(或更具体地，样品所获自的个体)划分为有所述疾病或没有所述疾病。分类器由训练数据的开发被称为训练分类器。关于分类器训练的细节取决于监督学习技术的性质。训练朴素贝叶斯分类器是这种监督学习技术的一个例子(参见，例如PatternClassification,编者R.O.Duda,等人,John Wiley&Sons,第2版,2001；也参见TheElements of Statistical Learning-Data Mining,Inference,and Prediction,编者T.Hastie,等人,Springer Science+Business Media,LLC,第2版,2009)。朴素贝叶斯分类器的训练描述于例如美国公布号2012/0101002和2012/0077695中。

由于通常与训练集中的样品相比存在更多的潜在生物标记水平，所以必须注意避免过度拟合。当统计模型描述随机误差或噪声代替基本关系时，发生过度拟合。过度拟合可以多种方式来避免，包括例如通过限制用于开发分类器的生物标记的数目、通过假设生物标记应答彼此无关、通过限制所用的基本统计模型的复杂性以及通过确保基本统计模型符合数据。

使用一组生物标记开发诊断测试的一个说明性例子包括应用朴素贝叶斯分类器，即一种具有生物标记的严格非依赖性处理的基于贝叶斯定理的简单概率分类器。每种生物标记是由类别依赖性概率密度函数(pdf)来描述，该函数是用于测量每个类别中的RFU值或对数RFU(相对荧光单位)值。假设一个类别中的生物标记组的联合pdf是每种生物标记的单个类别依赖性pdf的乘积。在此情形下训练朴素贝叶斯分类器达到分配参数(“参数化”)以表征类别依赖性pdf。可使用类别依赖性pdf的任何基本模型，但该模型通常应符合训练集中观察到的数据。

朴素贝叶斯分类器的性能取决于用于构建和训练分类器的生物标记的数量和质量。单一生物标记将根据其KS-距离(Kolmogorov-Smirnov)来进行。添加具有良好KS距离(例如>0.3)的后续生物标记通常将提高分类性能，如果随后添加的生物标记与第一生物标记无关。使用敏感度加特异度作为分类器评分，许多高评分分类器可用贪婪算法的变型生成。(贪婪算法是遵循在每个阶段带有发现全局最优值的希望做出局部最优选择的问题解决元启发方法的任何算法。)

描述分类器性能的另一方式是通过接收器工作特征(ROC)或仅通过ROC曲线或ROC绘图。ROC是敏感度或真阳性率对比假阳性率(1-特异度或1-真阴性率)的图形曲线，因为作为其辨别阈的二元分类器是变化的。ROC也可等效地通过对比来自阴性中的假阳性分数(FPR＝假阳性率)绘制来自阳性中的真阳性分数(TPR＝真阳性率)来表示。也称为相对工作特征曲线，因为其是两个工作特征(TPR和FPR)随着标准变化的比较。ROC曲线下面积(AUC)通常用作诊断精确性的简易度量。可采取从0.0至1.0的值。AUC具有重要的统计特性：分类器的AUC等于分类器将对高于随机选择的阴性实例的随机选择的阳性实例分级的概率(Fawcett T,2006.An introduction to ROC analysis.Pattern RecognitionLetters.27:861–874)。这等效于Wilcoxon秩检验(Hanley,J.A.,McNeil,B.J.,1982.Themeaning and use of the area under a receiver operating characteristic(ROC)curve.Radiology 143,29–36.)。

示例性实施方案使用表15和/或表16中列出的任意数目的生物标记，有或没有来自表3、4、6、7、8和/或9的一种或多种生物标记，以各种组合形式，从而产生用于鉴别患有NAFLD的个体的诊断测试。表3、4、6、7、8、9、15和16中列出的生物标记可以许多方式组合以产生分类器。在一些实施方案中，生物标记组包含生物标记的不同集合，这取决于所选的具体诊断性能标准。例如，生物标记的某些组合可产生比其它组合更敏感(或更特异性)的测试。在一些实施方案中，用于鉴别患有NAFLD的个体的生物标记的组选自表5中的组。

示例性实施方案使用表15和/或表16中列出的任意数目的生物标记，有或没有来自表3、4、6、7、8和/或9的一种或多种生物标记，以各种组合形式，从而产生用于鉴别患有脂肪变性的个体的诊断测试。表3、4、6、7、8、9、15和16中列出的生物标记可以许多方式组合以产生分类器。在一些实施方案中，生物标记组包含生物标记的不同集合，这取决于所选的具体诊断性能标准。例如，生物标记的某些组合可产生比其它组合更敏感(或更特异性)的测试。在一些实施方案中，用于鉴别患有脂肪变性的个体的生物标记的组选自表5中的组。在一些实施方案中，用于鉴别患有脂肪变性的个体的生物标记的组包含表3中的生物标记。在一些实施方案中，用于鉴别患有脂肪变性的个体的生物标记的组包含表8中的生物标记。在一些实施方案中，用于鉴别患有脂肪变性的个体的生物标记的组包含至少五种来自表15的生物标记。在一些实施方案中，用于鉴别患有脂肪变性的个体的生物标记的组包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或五种来自表16的生物标记。

示例性实施方案使用表15和/或表16中列出的任意数目的生物标记，有或没有一种或多种另外的生物标记，以各种组合形式，从而产生用于鉴别患有小叶炎症的个体的诊断测试。在一些实施方案中，生物标记组包含生物标记的不同集合，这取决于所选的具体诊断性能标准。例如，生物标记的某些组合可产生比其它组合更敏感(或更特异性)的测试。在一些实施方案中，用于鉴别患有小叶炎症的个体的生物标记的组包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的生物标记：ACY1、THBS2、COLEC11、ITGA1/ITGB1、CSF1R、KYNU、FCGR3B和POR。在一些实施方案中，用于鉴别患有小叶炎症的个体的生物标记的组包含ACY1、THBS2、COLEC11和至少一种或两种选自ITGA1/ITGB1和POR的另外的生物标记。

示例性实施方案使用表15和/或表16中列出的任意数目的生物标记，有或没有一种或多种另外的生物标记，以各种组合形式，从而产生用于鉴别患有肝细胞气球样变性的个体的诊断测试。在一些实施方案中，生物标记组包含生物标记的不同集合，这取决于所选的具体诊断性能标准。例如，生物标记的某些组合可产生比其它组合更敏感(或更特异性)的测试。在一些实施方案中，用于鉴别患有肝细胞气球样变性的个体的生物标记的组包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或八种选自以下的生物标记：ACY1、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、C7、POR、LGALS3BP和HSP90AA1/HSP90AB1。在一些实施方案中，用于鉴别患有肝细胞气球样变性的个体的生物标记的组包含ACY1、COLEC11、THBS2和至少一种或两种选自ITGA1/ITGB1和HSP90AA1/HSP90AB1的另外的生物标记。

示例性实施方案使用表15和/或表16中列出的任意数目的生物标记，有或没有一种或多种另外的生物标记，以各种组合形式，从而产生用于鉴别患有纤维化的个体的诊断测试。在一些实施方案中，生物标记组包含生物标记的不同集合，这取决于所选的具体诊断性能标准。例如，生物标记的某些组合可产生比其它组合更敏感(或更特异性)的测试。在一些实施方案中，用于鉴别患有纤维化的个体的生物标记的组包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或十四种选自以下的生物标记：C7、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1、ACY1、CSF1R、KYNU、POR、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和DCN。在一些实施方案中，用于鉴别患有纤维化的个体的生物标记的组包含C7、COLEC11、THBS2和至少一种、至少两种或三种选自ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1和DCN的另外的生物标记。

示例性实施方案使用表15和/或表16中列出的任意数目的生物标记，有或没有一种或多种另外的生物标记，以各种组合形式，从而产生用于鉴别患有NASH的个体的诊断测试。表3、4、6、7、8、9、15和16中列出的生物标记可以许多方式组合以产生分类器。在一些实施方案中，生物标记组包含生物标记的不同集合，这取决于所选的具体诊断性能标准。例如，生物标记的某些组合可产生比其它组合更敏感(或更特异性)的测试。在一些实施方案中，用于鉴别患有NASH的个体的生物标记的组包含N种来自表15和/或表16中列出的生物标记蛋白的生物标记蛋白，其中N为至少5。

示例性实施方案使用表15和/或表16中列出的任意数目的生物标记，有或没有一种或多种另外的生物标记，以各种组合形式，从而产生用于鉴别患有NAFLD、脂肪变性和/或NASH的个体的诊断测试。表3、4、6、7、8、9、15和16中列出的生物标记可以许多方式组合以产生分类器。在一些实施方案中，生物标记组包含生物标记的不同集合，这取决于所选的具体诊断性能标准。例如，生物标记的某些组合可产生比其它组合更敏感(或更特异性)的测试。在一些实施方案中，用于鉴别患有NAFLD、脂肪变性和/或NASH的个体的生物标记的组选自表5中的组。在一些实施方案中，用于鉴别患有NAFLD、脂肪变性和/或NASH的个体的生物标记的组包含N种来自表15和/或表16中列出的生物标记蛋白的生物标记蛋白，其中N为至少5。

在一些实施方案中，一旦组被限定为包括来自表15和/或表16的生物标记的特定集合，有或没有一种或多种另外的生物标记，且分类器是由一组训练数据构建，便完成诊断测试参数。在一些实施方案中，生物样品在一个或多个测定中运行以产生用于分类的相关定量生物标记水平。所测量的生物标记水平用作分类方法的输入，所述分类方法输出针对样品的分类和任选评分，其反映了类别分配的置信度。

在一些实施方案中，生物样品任选地在多重适体测定中稀释和运行，且数据评定如下。首先，将来自测定的数据任选地归一化并校准，并且将得到的生物标记水平用作贝叶斯分类方案的输入。其次，针对每个测量的生物标记单独计算对数似然比，然后求和以产生最终分类评分，其也被称为诊断评分。可报告所得的分配以及总分类评分。在一些实施方案中，也可报告针对每种生物标记水平计算的单独的对数似然风险因子。

试剂盒

本文所述的生物标记的任何组合可使用合适的试剂盒来检测，如用于执行本文所公开的方法时。此外，任何试剂盒可含有一种或多种如本文所述的可检测的标记，如荧光部分等。

在一些实施方案中，试剂盒包括(a)一种或多种捕获试剂(例如，至少一种适体或抗体)，用于检测生物样品中的一种或多种生物标记；和任选地(b)一种或多种软件或计算机程序产品，用于预测生物样品所获自的个体是否患有NAFLD、脂肪变性和/或NASH(如1期、2期、3期或4期NASH，或2期、3期或4期NASH)。或者，可提供由人手动执行以上步骤的一个或多个说明书来代替一种或多种计算机程序产品。

在一些实施方案中，试剂盒包含固体支持物、捕获试剂和信号生成材料。试剂盒还可包括用于使用装置和试剂、处理样品及分析数据的说明书。此外，试剂盒可与计算机系统或软件一起使用以分析并报告生物样品的分析结果。

试剂盒还可含有一种或多种试剂(例如，增溶缓冲剂、清洁剂、洗涤剂或缓冲剂)用于处理生物样品。本文所述的任何试剂盒还可包括：例如，缓冲剂、阻断剂、质谱基质材料、抗体捕获剂、阳性对照样品、阴性对照样品、软件和信息，如方案、指导及参考数据。

在一些实施方案中，提供了用于分析NAFLD和/或NASH的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于本文所述的一种或多种生物标记的PCR引物。在一些实施方案中，试剂盒还可包括关于生物标记的使用及其与NAFLD和/或NASH预后的相关性的说明书。在一些实施方案中，试剂盒可包括DNA阵列，所述阵列含有本文所述的一种或多种生物标记的补体、用于扩增或分离样品DNA的试剂和/或酶。试剂盒可包括用于实时PCR的试剂，例如TaqMan探针和/或引物、及酶。

例如，试剂盒可包含：(a)包含至少一种捕获试剂的试剂，所述捕获试剂用于测定一种或多种生物标记在测试样品中的水平；和任选地(b)一种或多种算法或计算机程序，用于执行比较在测试样品中定量的每种生物标记的量与一个或多个预定截止值的步骤。在一些实施方案中，算法或计算机程序为基于所述比较定量的每种生物标记分配一个评分值，且在一些实施方案中，将为所定量的每种生物标记分配的评分值合并以获得总评分值。此外，在一些实施方案中，算法或计算机程序比较总评分值与预定评分值，并使用该比较来确定个体是否患有NAFLD、脂肪变性和/或NASH。或者，可提供一个或多个由人手动执行以上步骤的说明书来代替一种或多种算法或计算机程序。

计算机方法和软件

一旦选择生物标记或生物标记组，用于评定个体中的NAFLD的方法便可包括以下：1)收集或以其它方式获得生物样品；2)执行分析方法以检测并测量生物样品中的生物标记或生物标记组；以及3)报告生物标记水平的结果。在一些实施方案中，定性而非定量地报告生物标记水平的结果，例如，提出的诊断(“NAFLD”、“脂肪变性”、“NASH”、“2期、3期或4期NASH”等)或仅仅是阳性/阴性结果(其中限定了“阳性”和“阴性”)。在一些实施方案中，用于评定个体中的NAFLD的方法可包括以下：1)收集或以其它方式获得生物样品；2)执行分析方法以检测并测量生物样品中生物标记或生物标记组；3)执行任何数据归一化或标准化；4)计算每种生物标记水平；以及5)报告生物标记水平的结果。在一些实施方案中，将生物标记水平以某种方式合并，并且报告合并的生物标记水平的单个值。在此方法中，在一些实施方案中，报告值可为由所有生物标记计算值的总和确定的单一数量，其与指示疾病存在或不存在的预设阈值相比。或者，诊断评分可为一系列条形图，其各自代表生物标记值，并且反应模式可与预设模式相比以用于确定疾病的存在或不存在。

本文所述的方法的至少一些实施方案可借助于计算机实施。计算机系统100的一个实例示于图9中。参看图9，示出了系统100，其是由通过总线108电连接的硬件元件构成，所述硬件元件包括处理器101、输入装置102、输出装置103、存储装置104、计算机可读存储介质读取器105a、处理加速的通信系统106(例如DSP或专用处理器)107和存储器109。计算机可读存储介质读取器105a被进一步连接到计算机可读存储介质105b，这种组合全面地代表远程、本地、固定和/或可移动的存储装置加上临时地和/或更长久地携带计算机可读信息的存储介质、存储器等，其可包括存储装置104、存储器109和/或任何其它这种可访问的系统100资源。系统100还包括软件元件(显示为当前位于工作存储器191内)，这些软件元件包括操作系统192及如程序、数据等的其它代码193。

关于图9，系统100具有很大的灵活性和可配置性。因此，例如，可利用单一构架来实现一个或多个服务器，所述服务器可进一步根据目前期望的协议、协议变型、扩展等来配置。然而，本领域技术人员显而易见的是，可以根据更具体的应用要求来利用这些实施方案。例如，一个或多个系统元件可被实现为系统100组件内(例如，通信系统106内)的子元件。定制的硬件也可被利用并且/或特定的元件能以硬件、软件或这二者来实现。此外，尽管可采用与如网络输入/输出装置(未示出)等其它计算装置的连接，但应理解，还可以利用有线、无线、调制解调器和/或其它一种或多种连接方式与其它计算装置连接。

一方面，所述系统可包括数据库，该数据库含有NAFLD和/或NASH所特有的生物标记的特征。可利用生物标记数据(或生物标记信息)作为计算机的输入以用作计算机实现方法的一部分。生物标记数据可包括如本文所述的数据。

一方面，所述系统还包括一个或多个装置，以用于向一个或多个处理器提供输入数据。

所述系统还包括用于储存分等级的数据元素的数据集的存储器。

另一方面，用于提供输入数据的装置包括用于检测数据元素的特征的检测器，例如质谱仪或基因芯片读取器。

所述系统另外可包括数据库管理系统。用户请求或查询可以数据库管理系统所理解的适当语言来格式化，所述数据库管理系统处理查询以从训练集的数据库中提取相关信息。

系统可连接到与网络服务器和一个或多个客户相连的网络上。网络可为局域网(LAN)或广域网(WAN)，如本领域中已知的。优选地，服务器包括运行计算机程序产品(例如软件)所必需的硬件以访问数据库数据用于处理用户请求。

所述系统可包括操作系统(例如，或Linux)，用于执行来自数据库管理系统的指令。一方面，操作系统可在全球通信网络(如因特网)上操作并利用全球通信网络服务器以连接到这种网络上。

所述系统可包括一个或多个包含图形显示界面的装置，所述图形显示界面包含界面元件如按钮、下拉菜单、滚动条、用于输入文本的区域等，如本领域中已知的图形用户界面中常规所见的。进入用户界面的请求可传输到系统中的应用程序以用于格式化，以便在一个或多个系统数据库中搜索相关信息。由用户输入的请求或查询可以任何合适的数据库语言构造。

图形用户界面可由图形用户界面代码生成作为操作系统的一部分并且可用于输入数据和/或显示输入数据。处理过的数据结果可显示于界面中，在与系统通信的打印机上打印，保存于存储装置中和/或经由网络传播或可以计算机可读介质形式提供。

系统可与输入装置通信以便提供关于系统的数据元素的数据(例如，表达值)。一方面，输入装置可包括基因表达谱分析系统，包括例如质谱仪、基因芯片或阵列读取器等。

根据各个实施方案分析生物标记信息的方法和设备可以任何合适的方式，例如使用在计算机系统上操作的计算机程序来执行。可使用常规的计算机系统，其包括处理器和随机存取存储器，如可远程访问的应用服务器、网络服务器、个人计算机或工作站。另外的计算机系统组件可包括存储器装置或信息存储系统，如大容量存储系统和用户界面，例如常规监视器、键盘和跟踪装置。计算机系统可以是独立系统或包括服务器和一个或多个数据库的计算机网络的一部分。

生物标记分析系统可提供功能和操作以完成数据分析，如数据收集、处理、分析、报告和/或诊断。例如，在一个实施方案中，计算机系统可执行计算机程序，其可接收、储存、搜索、分析并报告关于生物标记的信息。计算机程序可包括执行各种功能或操作的多个模块，如用于处理原始数据并生成补充数据的处理模块及用于分析原始数据和补充数据以生成疾病状态和/或诊断的分析模块。鉴别NAFLD、脂肪变性和/或NASH可包括生成或收集任何其它信息(包括另外的生物信息，关于个体相对于疾病的状况)、鉴别其它测试是否可为合乎需要的或以其它方式评价个体的健康状态。

可实施本文所述的一些实施方案以包括计算机程序产品。计算机程序产品可包括具有嵌入在介质中的计算机可读程序代码的计算机可读介质，用于使得在具有数据库的计算机上执行应用程序。

如本文所用，“计算机程序产品”是指自然或编程语言语句形式的有组织的指令集，其包含在任何性质的物理介质(例如，书面、电子、磁性、光学或其它形式)上并且可与计算机或其它一起使用。这种编程语言语句当由计算机或数据处理系统执行时使得计算机或数据处理系统根据语句的具体内容来操作。计算机程序产品包括但不限于：在源和目标代码中的程序和/或嵌入计算机可读介质中的测试或数据文库。此外，使得计算机系统或数据处理设备装置能够以预选方式操作的计算机程序产品可以许多形式来提供，包括但不限于原始源代码、汇编代码、目标代码、机器语言、上述及任何和所有等效物的加密或压缩形式。

一方面，提供了一种计算机程序产品，其指示个体是否患有NAFLD、个体是否患有脂肪变性和/或个体是否患有NASH(如1期、2期、3期或4期NASH，或2期、3期或4期NASH)。计算机程序产品包括包含可由计算装置或系统的处理器执行的程序代码的计算机可读介质，所述程序代码包含：检索归因于来自个体的生物样品的数据的代码，其中所述数据包含对应于本文所述的一种或多种生物标记的生物标记水平；及执行分类方法的代码，所述分类方法指示作为生物标记水平的函数的个体的NAFLD、脂肪变性和/或NASH状态。

虽然各个实施方案已作为方法或设备来描述，但应理解，实施方案可通过与计算机连接的代码来实现，例如，驻留在计算机上或可由计算机访问的代码。例如，可利用软件和数据库来实现以上论述的许多方法。因此，除由硬件完成的实施方案之外，还应注意，这些实施方案可通过使用由计算机可用介质构成的制造物品实现，所述计算机可用介质具有包含在其内的计算机可读程序代码，其能够实现本申请所公开的功能。因此，期望以其程序代码手段实现的实施方案也被认为受本专利的保护。此外，实施方案可作为存储在实际上任何种类的计算机可读存储器中的代码实现，包括但不限于RAM、ROM、磁介质、光介质或磁光介质。甚至更通常，实施方案可以软件或硬件或它们的任何组合来实现，包括但不限于在通用处理器上运行的软件、微代码、可编程逻辑阵列(PLA)或专用集成电路(ASIC)。

还设想，实施方案可作为包含在载波中的计算机信号以及经由传输介质传播的信号(例如，电学和光学)来实现。因此，以上论述的各种信息类型可在如数据结构的结构中被格式化，并且作为电信号经由传输介质进行传输或存储在计算机可读介质上。

治疗方法

在一些实施方案中，在确定受试者患有NAFLD、脂肪变性或NASH之后，所述受试者将接受治疗方案以延迟或预防疾病恶化。用于NAFLD、脂肪变性和/或NASH的非限制性示例性治疗方案包括减轻体重、控制血糖和避免酒精。在一些实施方案中，给予受试者治疗剂，如吡格列酮、维生素E和/或二甲双胍。参见，例如Sanyal等人,2010,NEJM,362:1675-1685。在一些实施方案中，例如，受试者经历胃旁路(或类似)手术，以便促进体重减轻。

在一些实施方案中，提供了监测NAFLD的方法。在一些实施方案中，确定受试者是否患有NAFLD的本发明方法在时间0时进行。在一些实施方案中，再次在时间1和任选时间2和任选时间3等进行所述方法，以便监测NAFLD在受试者中的进展。在一些实施方案中，在不同的时点使用不同的生物标记，这取决于当前个体的疾病状态和/或取决于据信或预测疾病进展的速度。

其它方法

在一些实施方案中，本文所述的生物标记和方法被用于确定医疗保险费和/或人寿保险费。在一些实施方案中，本文所述的方法的结果被用于确定医疗保险费和/或人寿保险费。在一些这种情况下，提供医疗保险或人寿保险的机构请求或以其它方式获得关于受试者的NAFLD或NASH状态的信息并且使用这些信息来确定受试者适当的医疗保险或人寿保险费。在一些实施方案中，测试是由提供医疗保险或人寿保险的机构做出请求并支付。

在一些实施方案中，将本文所述的生物标记和方法用于预测和/或管理医疗资源的利用。在一些这类实施方案中，所述方法不是为了这种预测而进行，但将由该方法获得的信息用于医疗资源利用的这种预测和/或管理中。例如，测试机构或医院可针对许多受试者由本发明方法汇集信息以便在特定的机构或特定的地理区域预测和/或管理医疗资源的利用。

实施例

仅为了说明目的提供以下实施例，并且这些实施例不应被认为限制由所附权利要求限定的本发明的范围。在以下实施例中描述的常规分子生物学技术可如标准实验室手册中所述来进行，如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(2001)。

实施例1.NAFLD研究受试者

用于鉴别生物标记的样品是来自Geisinger Health。收集血清样品并且在为了减轻体重而经历肥胖治疗手术之前对576名肥胖患者进行肝活组织检查。

将样品收集在红顶血清试管中并按方案处理；简言之，容许样品在室温下凝结30分钟，然后在1300xg下离心10分钟并除去顶层并在-80℃下储存。为了等分试样使样品解冻一次，且为了测定，解冻一次。

为了鉴别将患有NAFLD的受试者与正常肥胖受试者相区分的生物标记、和将患有NASH的受试者与患有肝脂肪变性的受试者相区分的生物标记，使用Brunt分类方法，根据肝活组织检查结果将研究受试者分成正常的、三个程度的肝脂肪变性(轻度、中度和重度脂肪变性)、以及四个阶段的NASH(Brunt等人,2007,Modern Pathol.,20:S40-S48)。这些组如表1中所示被细分。

表1：脂肪变性和NASH阶段组的细分

受试者人口统计

在以上论述的每组中的个体的某些特征示于表2中。

表2：受试者人口统计

如表2所示，确定受试者的年龄、体重指数和LDL水平，并且发现在所有组中是平衡的。

实施例2.用于生物标记鉴别的多重适体测定

通过比较病例与对照中与样品处理(如剪切、细胞裂解和补体激活)有关的生物标记的分布来评定以上提及的组中正常、NAFLD和NASH样品的样品质量。样品质量良好，且不存在病例对照偏差。

将多重适体测定用于分析样品和对照以鉴别预测NAFLD和NASH的生物标记。此实验中所用的多重分析包括检测来自小体积样品(～65μl的血清或血浆)的血液中的1129种蛋白质的适体，具有低检测极限(中值1pM)、～7个对数的动态范围及～5％的中值变异系数。多重适体测定描述于例如Gold等人(2010)Aptamer-Based Multiplexed ProteomicTechnology for Biomarker Discovery.PLoS ONE 5(12):e15004；及美国公布号2012/0101002和2012/0077695中。

稳定性选择采取一半数据的许多子集并使用lasso分类器进行生物标记选择，所述分类器是正规化的逻辑回归模型。参见，例如Meinshausen等人,2010,J.RoyalStatistical Soc:Series B(Statistical Methodology),72:417-473。单一生物标记的选择路径是这些子集的比例，在λ范围内针对这些子集由lasso模型选择生物标记。λ是确定有多少生物标记被lasso选择的调整参数。在λ值范围内的最大选择概率是用于选择一组生物标记的最终量度。

通过稳定性选择鉴别候选生物标记，然后将其用于生成随机森林分类器模型。参见，例如Shi等人,J.Comput.Graph.Stat.15(1):118-138(2006)。简言之，随机森林预测器是单独的分类树预测器的集合。参见，例如Breiman,Machine Learning,45(1):5-32(2001)。对于每次观察，每个单独的树为一个类别投票并且森林预测具有多个投票的类别。用户指定随机选择的变量(mtry)的数目以便搜索在每个节点处的最佳分割。Gini指数用作分割标准。参见，例如Breiman等人,Classification and Regression Trees,Chapman andHall,New York,1984。可能的最大的树生长并且没有剪切。森林中的每颗树的根节点含有来自原始数据的自举样品作为训练集。不在训练集中的观察(大致1/3原始数据集)被称为袋外(OOB)观察。可得出如下的OOB预测：对于原始数据中的病例，通过仅涉及不含其相应的自举样品中的病例的那些树的多个投票来预测结果。通过对比这些OOB预测与训练集结果，可得出预测误差率的估计值，其被称为OOB误差率。

使用非参数柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验(KS统计)进行单变量分析，该检验量化了用于表示病例(轻度、中度和重度脂肪变性和/或1-4期NASH)和对照(正常肥胖)的两个参考分布的每种适体的累积分布函数之间的距离。随机森林分类器的性能取决于用于构建和训练分类器的生物标记的数量和质量。根据如本文所例示的其KS-距离及其PCA(主成分分析)值执行单一生物标记。如果分类器性能度量被定义为敏感度(真阳性分数，fTP)与特异度(一减去假阳性分数，1-fFP)的总和，那么完美的分类器将具有为二的评分值，且随机分类器平均起来将具有为一的评分值。使用KS-距离的定义，使cdf(累积分布函数)函数的差最大化的值x^*可通过求解以下方程得到

对于x，得到p(x^*|c)＝p(x^*|d)，即当类别依赖性pdf(概率密度函数)交叉时出现KS距离。将此x^*值代入到KS-距离的表达式中得到以下KS定义

KS距离是一减去总误差分数，使用在x^*处具有截止值的测试，基本上是单个分析物贝叶斯分类器。由于定义了评分值敏感度+特异度＝2-f_FP-f_FN，将KS-距离的以上定义结合起来得到敏感度+特异度＝1+KS。选择具有固有地适于构造分类器的统计资料的生物标记。

添加具有良好KS距离(例如>0.3)的后续生物标记通常将提高分类性能，如果随后添加的生物标记与第一生物标记无关。使用敏感度加特异度作为分类器评分，可生成许多高评分分类器。

A.脂肪变性分类器

基于受试者分类，假设脂肪变性组以及1-4期NASH在肝细胞中具有脂肪。通过比较肥胖正常受试者与所有NAFLD受试者来开发分类器(脂肪变性或肝脏中的脂肪)。

将通过稳定性选择(参见图1)所选的标记提供给随机森林算法以生成模型。提供所得的ROC曲线(参见下文)。

针对NAFLD(脂肪变性)的九标记分类器的ROC曲线示于图2中。曲线下面积(AUC)是0.90+/-0.03。敏感度是92％且特异度是63％，截止值为0.5。

将来自每个分类器的模型的概率评分(即Prob(脂肪变性))针对所有组中的每个个体绘图以评定除二元判定(在该二元判定上构建其)(图3)之外其是否还可用作严重性/监控模型。该绘图示出了在无脂肪变性与脂肪变性之间的明显差别并且概率投票随着脂肪变性的水平而增加。在所有阶段的NASH受试者都具有严重的脂肪变性。

图4示出了对于分类器中的9种生物标记的累积分布函数(CDF)。

表3示出了在该9标记分类器中的生物标记。表3还提供了某些生物标记的别名、基因命名及每种生物标记的UniProt登录号，以及该生物标记与正常群相比是以较高还是较低水平存在于NAFLD群中。

表3：用于NAFLD的九生物标记分类器

图3示出了在每个受试者组(从左到右：正常、轻度脂肪变性、中度脂肪变性、重度脂肪变性、NASH1、NASH2、NASH3、NASH4)中的九生物标记分类器的箱形图。每个箱内的黑线代表数据点的中值(或第50百分位)，且箱本身代表四分位间范围(IQR)，该区域涵盖了从第25百分位到第75百分位的数据点。须状物延伸覆盖箱的顶部和底部的1.5x IQR内的数据点。

B.NASH(纤维化)分类器

患有NASH的所有受试者都具有某种形式的炎症及与纤维化有关的气球样变性。因此比较了所有脂肪变性组与2期、3期和4期NASH。为了确保真正的纤维化生物标记的鉴别，排除了1期NASH组。

将通过稳定性选择(图5)所选的标记提供给随机森林算法以生成模型。所得的ROC在下文中提供。

2期、3期和4期NASH(纤维化)的四标记分类器的ROC曲线示于图6中。曲线下面积(AUC)为0.82+/-0.07，在0.5的截止值下，敏感度为62％且特异度为92％。

将来自每个分类器的模型的概率评分(即Prob(脂肪变性))针对所有组中的每个个体绘图以评定除二元判定(在该二元判定上构建其)(图7)之外其是否还可用作严重性/监控模型。该绘图示出了在无脂肪变性与脂肪变性之间的明显差别并且概率投票随着脂肪变性的水平而增加。在所有阶段的NASH受试者都具有严重的脂肪变性。

表4示出了在该4标记分类器中的生物标记。表4还提供了某些生物标记的别名、基因命名及每种生物标记的UniProt登录号，以及该生物标记与所有NAFLD群相比是以较高还是较低水平存在于2期、3期和4期NASH群中。

表4：2期、3期和4期NASH对比脂肪变性(NAFLD)的四生物标记分类器

图7示出了在每个受试者组(从左到右：正常、轻度脂肪变性、中度脂肪变性、重度脂肪变性、NASH1、NASH2、NASH3、NASH4)中的四生物标记分类器的箱形图。每个箱内的黑线代表数据点的中值(或第50百分位)，且箱本身代表四分位间范围(IQR)，该区域涵盖了从第25百分位到第75百分位的数据点。须状物延伸覆盖箱的顶部和底部的1.5x IQR内的数据点。

图8示出了分类器中的4种生物标记的CDF。

实施例3.用于NAFLD和/或NASH的另外的生物标记和分类器

稳定性选择采取一半数据的许多子集并使用lasso分类器进行生物标记选择，所述分类器是正规化的逻辑回归模型。参见，例如Meinshausen等人,2010,J.RoyalStatistical Soc:Series B(Statistical Methodology),72:417-473。单一生物标记的选择路径是这些子集的比例，在λ范围内针对这些子集由lasso模型选择生物标记。λ是确定有多少生物标记被lasso选择的调整参数。在λ值范围内的最大选择概率是用于选择一组生物标记的最终量度。

使用稳定性选择法，对另外的分类器进行定义以区分个体的各个组。分类器(包括以上论述的分类器)示于表5中。来自比较2和5的标记被用于构建脂肪变性(NAFLD)和纤维化(NASH)的随机森林分类器，如上所论述。

表5.使用稳定性选择获得的分类器

*所有脂肪变性：轻度、中度和重度脂肪变性

表5中的比较1示出了7标记分类器，该系统以86.4％的敏感度和82％的特异度将对照受试者与1至4期NASH相区分。比较3示出了3标记分类器，该系统以76.6％的敏感度和74.4％的特异度将对照受试者与所有脂肪变性(轻度、中度和重度)相区分。

关于在表5中列出但未在以上表3和4中列出的生物标记的更多信息示于表6中。

表6：用于NAFLD和/或NASH的另外的生物标记

通过对照组对比1至4期NASH的单变量KS距离得出的前25种生物标记示于表7中。这些生物标记及这些生物标记的组合可用于将对照受试者(如肥胖受试者)与患有NASH的受试者区分以便区分对照受试者与患有脂肪变性的受试者。

表7：前25种生物标记

实施例4：使用适体的示例性生物标记检测

检测样品中的一种或多种生物标记的示例性方法描述于例如Kraemer等人,PLoSOne 6(10):e26332中，且描述如下。描述了三种不同的定量方法：基于微阵列的杂交、基于Luminex珠粒的方法和qPCR。

试剂

HEPES、NaCl、KCl、EDTA、EGTA、MgCl₂和Tween-20可购自例如Fisher Biosciences。标称分子量8000的葡聚糖硫酸钠盐(DxSO4)可购自例如AIC并且针对去离子水透析至少20小时，有一次更换。KOD EX DNA聚合酶可购自例如VWR。氯化四甲铵和CAPSO可购自例如Sigma-Aldrich且链霉亲和素-藻红蛋白(SAPE)可购自例如Moss Inc。4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)可购自例如Gold Biotechnology。链霉亲和素包被的96孔板可购自例如Thermo Scientific(Pierce链霉亲和素包被板HBC，透明，96孔，产品编号15500或15501)。NHS-PEO4-生物素可购自例如Thermo Scientific(EZ-Link NHS-PEO4-生物素，产品编号21329)，将其溶于无水DMSO中，并可以单用途等分试样冷冻保存。IL-8、MIP-4、脂笼蛋白-2、RANTES、MMP-7和MMP-9可购自例如R&D Systems。抵抗素和MCP-1可购自例如PeproTech，且tPA可购自例如VWR。

核酸

常规(包括胺-和生物素-取代的)寡脱氧核苷酸可购自例如Integrated DNATechnologies(IDT)。Z-Block是序列5’-(AC-BnBn)7-AC-3’的单链寡脱氧核苷酸，其中Bn表示苄基取代的脱氧尿苷残基。Z-block可使用常规的亚磷酰胺化学法来合成。适体捕获试剂也可通过常规亚磷酰胺化学法来合成，且可例如在21.5×75mm PRP-3柱上纯化，在80℃下在Waters Autopurification 2767系统(或Waters 600系列半自动化系统)上操作，使用例如林木线TL-600或TL-150加热器和三乙基碳酸氢铵(TEAB)/ACN的梯度来洗脱产物。在260nm下进行检测且在汇集最佳级分之前在主峰上收集级分。

缓冲液

缓冲液SB18是由40mM HEPES、101mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2和0.05％(v/v)Tween 20(用NaOH调节至pH 7.5)构成。缓冲液SB17是补充有1mM EDTA三钠的SB18。缓冲液PB1是由10mM HEPES、101mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2、1mM EDTA三钠和0.05％(v/v)Tween-20(用NaOH调节至pH 7.5)构成。CAPSO洗脱缓冲液是由100mM CAPSO pH 10.0和1MNaCl组成。中和缓冲液含有500mM HEPES、500mM HCl和0.05％(v/v)Tween-20。Agilent杂交缓冲液是专有制剂，作为试剂盒(Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit)的一部分来供应。Agilent洗涤缓冲液1是专有制剂(Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1，Agilent)。Agilent洗涤缓冲液2是专有制剂(Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2，Agilent)。TMAC杂交溶液是由4.5M氯化四甲铵、6mM EDTA三钠、75mM Tris-HCl(pH 8.0)和0.15％(v/v)Sarkosyl组成。KOD缓冲液(10倍浓缩)是由1200mM Tris-HCl、15mM MgSO4、100mM KCl、60mM(NH4)2SO4、1％v/v Triton-X 100和1mg/mL BSA组成。

样品制备

将血清(在-80℃下以100μL等分试样保存)在25℃水浴中解冻10分钟，然后在样品稀释之前保存于冰上。通过温和的涡旋混合样品8秒。通过稀释到补充有0.6mM MgCl2、1mMEGTA三钠、0.8mM AEBSF和2μM Z-Block的0.94×SB17中来制备6％血清样品溶液。将一部分6％血清储备溶液在SB17中10倍稀释以生成0.6％血清储备液。在一些实施方案中，使用6％和0.6％储备液以分别检测高丰度和低丰度分析物。

捕获试剂(适体)和链霉亲和素板制备

根据其同源分析物(或生物标记)的相对丰度将适体分成2个混合物。对于每种适体，储备浓度为4nM，且每种适体的最终浓度为0.5nM。将适体储备混合物在SB17缓冲液中4倍稀释，加热至95℃并持续5分钟并在使用之前经15分钟时间冷却至37℃。此变性-复性周期旨在归一化适体构象体分布且因此确保可再现的适体活性，尽管有可变的历程。在使用之前，将链霉亲和素板用150μL缓冲液PB1洗涤两次。

平衡和板捕获

将热冷却的2×适体混合物(55μL)与等体积的6％或0.6％血清稀释液合并，产生含有3％和0.3％血清的平衡混合物。将板用硅胶密封垫(Axymat Silicone密封垫，VWR)密封并在37℃下培育1.5h。然后将平衡混合物转移到洗涤的96孔链霉亲和素板的各孔中并在设定在37℃下的Eppendorf Thermomixer上进一步培育，伴随在800rpm下振摇两小时。

手动测定

除非另有规定，通过倾倒除去液体，接着轻敲两下到多层纸巾上。洗涤体积是150μL且所有振摇培育都是在设定在25℃和800rpm下的Eppendorf Thermomixer上完成。通过吸移除去平衡混合物，并且用补充有1mM硫酸葡聚糖和500μM生物素的缓冲液PB1洗涤板两次，持续1分钟，然后用缓冲液PB1洗涤4次，持续15秒。添加1mM NHS-PEO4-生物素在缓冲液PB1(150μL/孔)中刚制备的溶液，并且伴随振摇，培育板5分钟。除去NHS-生物素溶液，并且用补充有20mM甘氨酸的缓冲液PB1洗涤板3次，并用缓冲液PB1洗涤3次。然后将85μL补充有1mMDxSO4的缓冲液PB1添加到各孔中，并且在BlackRay UV灯(标称波长365nm)下间隔5cm的距离照射板20分钟，伴随振摇。将样品转移到新鲜的、洗涤过的链霉亲和素包被的板或现有的、洗涤过的链霉亲和素板的未使用孔中，将高和低样品稀释混合物合并到单个孔中。在室温下伴随振摇培育样品10分钟。除去未吸附的材料并用补充有30％甘油的缓冲液PB1洗涤板8次，每次15秒。然后用缓冲液PB1洗涤板一次。在室温下用100μL CAPSO洗脱缓冲液洗脱适体5分钟。将90μL洗出液转移到96孔HybAid板中并添加10μL中和缓冲液。

半自动化测定

将带有吸附的平衡混合物的链霉亲和素板置于BioTek EL406板垫圈的平台上，对其进行编程以执行以下步骤：通过抽吸除去未吸附的材料，并且用补充有1mM硫酸葡聚糖和500μM生物素的300μL缓冲液PB1洗涤各孔4次。然后用300μL缓冲液PB1洗涤孔3次。添加150μL的1mM NHS-PEO4-生物素于缓冲液PB1中刚制备(由在DMSO中的100mM储备液)的溶液。在振摇下培育板5分钟。吸出液体，并且用补充有10mM甘氨酸的300μL缓冲液PB1洗涤孔8次。添加补充有1mM硫酸葡聚糖的100μL缓冲液PB1。在这些自动化步骤之后，将板从板垫圈处移走并以间隔5cm的距离置于安装在UV光源(BlackRay，标称波长365nm)下的热摇动器上持续20分钟。将热摇动器设定在800rpm和25℃下。照射20分钟之后，将样品手动转移到新鲜的、洗涤过的链霉亲和素板(或现有洗涤板的未使用孔)中。将高丰度(3％血清+3％适体混合物)与低丰度反应混合物(0.3％血清+0.3％适体混合物)在此时于单个孔中合并。将此“Catch-2”板置于BioTek EL406板垫圈的平台上，对其进行编程以执行以下步骤：将板在振摇下培育10分钟。吸出液体，并且将孔用300μL补充有30％甘油的缓冲液PB1洗涤21次。将孔用300μL缓冲液PB1洗涤5次，并且吸出最终洗涤物。添加100μL CAPSO洗脱缓冲液，并且在振摇下洗脱适体5分钟。在这些自动化步骤之后，将板从板垫圈的平台上移走，并且将样品的90μL等分试样手动转移到含有10μL中和缓冲液的HybAid 96孔板的孔中。

杂交至定制的Agilent 8×15k微阵列

将24μL中和洗脱液转移到新的96孔板上并将含有包含10Cy3适体的一组杂交对照的6μL的10×Agilent Block(Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit,LargeVolume,Agilent5188–5380)添加到各孔中。将30μL 2×Agilent杂交缓冲液添加到每个样品中并混合。将40μL所得的杂交溶液手动地移液到杂交衬垫载玻片(HybridizationGasket Slide,8微阵列/载玻片形式,Agilent)的各“孔”中。根据制造商方案将定制的Agilent微阵列载玻片置于衬垫载玻片上，每阵列带有10个与具有20×dT接头的各适体的40个核苷酸随机区互补的探针。夹紧组件(Hybridization Chamber Kit–SureHyb-enabled,Agilent)并在60℃下在20rpm下旋转时培育19小时。

杂交后洗涤

将大约400mL Agilent洗涤缓冲液1置于两个单独的玻璃染色皿的每个中。将载玻片(每次不超过两个)在浸入洗涤缓冲液1中时拆下并分离，然后转移到在也含有洗涤缓冲液1的第二染色皿中的载玻片架上。将载玻片在洗涤缓冲液1中伴随搅拌再培育5分钟。将载玻片转移到预平衡至37℃的洗涤缓冲液2中并在搅拌下培育5分钟。将载玻片转移到含有乙腈的第四染色皿中，并在搅拌下培育5分钟。

微阵列成像

使用Cy3-通道，在5μm分辨率、100％PMT设置及在0.05下实现的XRD选项下，用Agilent G2565CA微阵列扫描器系统使微阵列载玻片成像。使用Agilent特征抽取软件10.5.1.1版，用GE1_105_Dec08方案处理所得的TIFF图像。原始Agilent数据作为补充信息(图S6)获得。

Luminex探针设计

固定于珠粒上的探针具有40个与靶适体的40个核苷酸随机区的3’端互补的脱氧核苷酸。将适体互补区经由具有5’氨基末端的六乙二醇(HEG)接头偶联到Luminex微球体。生物素化的检测脱氧寡核苷酸包含17-21个与靶适体的5’引物区互补的脱氧核苷酸。生物素部分附于检测寡聚物的3’端。

探针与Luminex微球体的偶联

基本上按照制造商说明书将探针偶联到Luminex Microplex微球体上，但有以下修改：氨基末端寡核苷酸量是0.08nMol/2.5×106个微球体，且第二EDC添加是在10mg/mL下的5μL。偶联反应在设定于25℃和600rpm下的Eppendorf ThermoShaker上进行。

微球体杂交

将微球体储备溶液(约40000个微球体/μL)涡旋并在Health Sonics超声波清洁器(型号：T1.9C)中超声处理60秒以使微球体悬浮。将悬浮微球体在1.5×TMAC杂交溶液中稀释至2000个微球体/反应并且通过涡旋混合并超声处理。将每反应33μL的珠粒混合物转移到96孔HybAid板中。将在1×TE缓冲液中的7μL的15nM生物素化的检测寡核苷酸储备液添加到每个反应中并混合。添加10μL中和测定样品并将板用硅帽垫密封件密封。首先将板在96℃下培育5分钟并在50℃下在常规的杂交烘箱中培育过夜，不伴随搅动。将滤板(Durapore,Millipore零件号MSBVN1250，1.2μm孔径)用补充有0.5％(w/v)BSA的75μL 1×TMAC杂交溶液预先湿润。将来自杂交反应的整个样品体积转移到滤板。将杂交板用含有0.5％BSA的75μL 1×TMAC杂交溶液冲洗并将任何剩余材料转移到滤板。在慢真空下过滤样品，经约8秒抽空150μL缓冲液。将滤板用含有0.5％BSA的75μL 1×TMAC杂交溶液洗涤一次并将滤板中的微球体再悬浮于含有0.5％BSA的75μL 1×TMAC杂交溶液中。将滤板避光保存并在1000rpm下在Eppendorf Thermalmixer R上培育5分钟。然后用含有0.5％BSA的75μL 1×TMAC杂交溶液洗涤滤板一次。将在1×TMAC杂交溶液中的75μL的10μg/mL链霉亲和素藻红蛋白(SAPE-100,MOSS,Inc.)添加到各反应中并在25℃下，在1000rpm下在EppendorfThermalmixer R上培育60分钟。将滤板用含有0.5％BSA的75μL 1×TMAC杂交溶液洗涤两次并且将滤板中的微球体再悬浮于含有0.5％BSA的75μL 1×TMAC杂交溶液中。然后将滤板避光保存，在1000rpm下在Eppendorf Thermalmixer R上培育5分钟。然后用含有0.5％BSA的75μL 1×TMAC杂交溶液洗涤滤板一次。将微球体再悬浮于补充有0.5％BSA的75μL 1×TMAC杂交溶液中，并且在运行XPonent 3.0软件的Luminex 100仪器上分析。在高PMT校准及7500至18000的双联鉴别器设置下，为每珠粒类型计数至少100个微球体。

QPCR读出

在水中制备qPCR的标准曲线，范围从108至102个拷贝，其中有10倍稀释液和无模板对照。将中和测定样品40倍稀释到diH2O中。将qPCR主要混合物在2×最终浓度(2×KOD缓冲液、400μM dNTP混合物、400nM正向和反向引物混合物、2×SYBR Green I和0.5U KOD EX)下制备。将10μL的2×qPCR主要混合物添加到10μL稀释的测定样品中。将qPCR在BioRadMyIQ iCycler上运行，在96℃下2分钟，接着是40个以下循环：96℃持续5秒和72℃持续30秒。

实施例5.进一步的NAFLD和NASH分析

使用逻辑回归模型，使针对实施例1中所述的样品的来自实施例2中所述的多重适体测定的数据经历进一步的分析。

稳定性选择采取一半数据的许多子集并使用lasso分类器进行生物标记选择，所述分类器是正规化的逻辑回归模型。参见，例如Meinshausen等人,2010,J.RoyalStatistical Soc:Series B(Statistical Methodology),72:417-473。单一生物标记的选择路径是这些子集的比例，在λ范围内针对这些子集由lasso模型选择生物标记。λ是确定有多少生物标记被lasso选择的调整参数。在λ值范围内的最大选择概率是用于选择一组生物标记的最终量度。

C.脂肪变性分类器

基于受试者分类，假设所有脂肪变性组以及1-4期NASH在肝细胞中具有脂肪。通过比较肥胖正常受试者与所有NAFLD和NASH受试者来开发分类器(脂肪变性或肝脏中的脂肪)。

将标记与逻辑回归模型拟合以生成分类器。

表8示出了8标记脂肪变性(NAFLD)分类器中的生物标记。表8还示出了该模型的逻辑回归系数及系数估计值的95％置信区间。8标记分类器含有表3中所示的9标记分类器的所有标记，除了PLAT之外。

表8：NAFLD的八生物标记分类器

图12示出了每组脂肪变性和NASH受试者的8标记分类器的箱形图。每个箱内的黑线代表数据点的中值(或第50百分位)，且箱本身代表四分位间范围(IQR)，该区域涵盖了从第25百分位到第75百分位的数据点。须状物延伸覆盖箱的顶部和底部的1.5x IQR内的数据点。该绘图示出了在无脂肪变性与脂肪变性之间的明显差别并且概率投票随着脂肪变性的水平而增加。在所有阶段的NASH受试者都具有严重的脂肪变性。

D.NASH(纤维化)分类器

患有NASH的所有受试者都具有某种形式的炎症及与纤维化有关的气球样变性。对于此分析，我们比较了轻度和中度脂肪变性组与2期、3期和4期NASH。为了确保真正的纤维化生物标记的鉴别，排除了1期NASH组。在此分析中忽略患有严重脂肪变性的受试者，因为在这些受试者中的活组织检查样品可丧失一些纤维化。

将标记与逻辑回归模型拟合以生成分类器，从而得到模型。

表9示出了8标记纤维化(NASH)分类器中的生物标记。表9还示出了该模型的逻辑回归系数及系数估计值的95％置信区间。8标记分类器含有表4中所示的4标记分类器的所有标记，加上四种另外的标记。

表9：2期、3期和4期NASH对比轻度至中度脂肪变性(NAFLD)的八生物标记分类器

图13示出了在每个受试者组(从左到右：正常、轻度脂肪变性、中度脂肪变性、重度脂肪变性、NASH1、NASH2、NASH3、NASH4)中的8生物标记纤维化分类器的箱形图。每个箱内的黑线代表数据点的中值(或第50百分位)，且箱本身代表四分位间范围(IQR)，该区域涵盖了从第25百分位到第75百分位的数据点。须状物延伸覆盖箱的顶部和底部的1.5x IQR内的数据点。

表9的纤维化分类器中的四种另外的生物标记示于表10中，连同各生物标记的别名、基因名称及UniProt登录号一起。

表10：在纤维化8生物标记分类器中的另外的生物标记

生物标记/别名	基因名称	UniProt
			磷脂酰肌醇聚糖-5	GPC5	Q8N158
同源结构域相互作用蛋白激酶3	HIPK3	Q9H422
			胰岛素样生长因子结合蛋白7	IGFBP7	Q16270
白介素-3受体α	IL3RA	P26951

图14示出了在用于纤维化的八标记分类器中的四种另外的标记的累积分布函数。

实施例6.盲测样品的破盲

如表2所示，对对照、轻度脂肪变性、中度脂肪变性、重度脂肪变性、1期NASH和2期NASH各自的一组样品进行盲测。使用表8中所示的8标记分类器确定每个盲测样品来自于患有脂肪变性的受试者的概率。图15示出了根据它们的实际样品组，盲测样品在破盲之后的箱形图。

图16示出了发现组及盲测验证组的8标记脂肪变性分类器的性能。上曲线是发现组的ROC曲线，其具有0.927±0.03的曲线下面积(AUC)及在0.5的截止值下92.8％的敏感度和73.3％的特异度。下曲线是盲测验证组的ROC曲线，其具有0.889±0.06的AUC及在0.5的截止值下88％的敏感度和65.8％的特异度。

表10示出了盲测验证组的8标记脂肪变性分类器用于鉴别受试者对于脂肪变性呈阳性或阴性的性能。

表10：用于盲测验证组的8标记脂肪变性分类器的性能

真实性/测试	阴性	阳性	总计
				阴性	27	14	41
阳性	11	81	92
				总计	38	95	133

使用表9中所示的8标记分类器确定每个盲测样品来自于患有纤维化的受试者的概率。图17示出了根据它们的实际样品组，盲测样品在破盲之后的箱形图。

图18示出了发现组及两个不同的盲测验证组的8标记纤维化分类器性能。第二验证组包括第一验证组加上正常组(对疾病呈阴性的个体)。因为模型没有用正常组训练，所以其对于那些样品是原初的，其可揭示假阳性。上曲线(红色)是发现组(对照(轻度+中度脂肪变性)对比2级、3级和4级NASH)的ROC曲线，其具有0.929±0.04的曲线下面积(AUC)及在0.5的截止值下78.8％的敏感度和89.9％的特异度。中间曲线(蓝色)是第一盲测验证组的ROC曲线，其具有0.885±0.11的AUC及在0.5的截止值下66.7％的敏感度和84.6％的特异度。下曲线(青色)是第二盲测验证组的ROC曲线，其具有0.891±0.08的AUC及在0.5的截止值下66.7％的敏感度和89.5％的特异度。

表11和12示出了两个盲测验证组的8标记纤维化分类器用于鉴别受试者对于纤维化呈阳性或阴性的性能。

表11：用于第一盲测验证组的8标记纤维化分类器的性能

真实性/测试	阴性	阳性	总计
				阴性	22	4	26
阳性	4	8	12
				总计	26	12	38

表12：第二盲测验证组的8标记纤维化分类器的性能

真实性/测试	阴性	阳性	总计
				阴性	60	7	67
阳性	4	8	12
				总计	64	15	79

图19示出了使用(A)8标记脂肪变性分类器和(B)8标记纤维化分类器，20％吾等保持验证组的2500个自举迭代的敏感度和特异度分布。示出了经验95％置信区间，以及训练和验证估计值，这两者都在95％置信区间内。

实施例7.儿科受试者中分类器的性能

来自儿童的90个血清样品是由Pediatric Gastroenterology and NutritionDepartment of the Medical College of Wisconsin获得。受试者贡献的样品被分成四组：非肥胖对照(N＝45)、具有正常肝功能检查的肥胖者(N＝20)、具有升高的肝功能检查的肥胖者(N＝7)、以及诊断患有NASH的受试者(N＝18)。使用表8中所示的8标记脂肪变性分类器和表9中所示的8标记纤维化分类器来测试样品。

使用表8中所示的8标记分类器确定每个儿科样品来自于患有脂肪变性的受试者的概率。图20示出了根据它们的实际样品组，儿科样品的箱形图。脂肪变性分类器精确地鉴别患有NASH的儿科受试者。

与脂肪变性分类器不同，8标记纤维化分类器在此实验中不能有效地鉴别患有纤维化的儿科受试者。(数据未示出)

实施例8.用于开发脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和纤维化的生物标记组的生物标记发现

分析总共297个成人血清样品。这些样品来自于三个NASH CRN组群：NAFLD数据库(n＝81)、PIVENS试验(n＝80)和DB2(n＝136)。建立NAFLD和DB2集合以研究NAFLD和NASH自然史。通过NASH CRN进行PIVENS试验(吡格列酮对比维生素E对比安慰剂，用于治疗患有非酒精性脂肪性肝炎的非糖尿病患者)以研究在非糖尿病性NASH患者中的治疗。治疗前收集所有样品，并且具有在血清采集6个月内获得的基线肝活组织检查结果。表13和图21示出了来自基线肝活组织检查的组织学和NAFLD活性评分(NAS评分)的分布。NAS是用于非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的组织学评分系统，描述于例如Kleiner等人,Hepatology 41(6):1313-21(2005)中。它是基于四类肝脏受累，包括脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和纤维化。脂肪变性的评分是从0至3并且基于涉及脂肪变性的表面积百分比。小叶炎症的评分是从0至3并且基于每200x视野的病灶数量。肝细胞气球样变性的评分是从0至2并且基于气球样变性肝细胞的发病率(例如，无、稀少或许多)。纤维化的评分是从0至4并且基于纤维化的程度和位置，直至肝硬化(评分4)。

表13：基线肝活组织检查组织学

*一个样品中缺少纤维化评分

将生物标记水平与由NASH CRN研究者(在数据词典中的nashdx字段)提供的NASH诊断(NASH Dx)相比。为123名研究参与者记录下阳性NASH诊断(诊断代码＝2)。将这些样品与174个来自不患有NAFLD(诊断代码99，n＝31)或患有NAFLD但无NASH(诊断代码0，n＝143)的个体的样品相比。

鉴别候选生物标记

应用Jonckheere-Terpstra检验(JT-检验)来鉴别NASH(脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和纤维化)的个体组织学成分的候选生物标记、NAS评分和NASH Dx。JT检验是基于秩的非参数检验，其可用于确定在顺序自变量(从低到高的组织学评分)与连续因变量(SOMAscan蛋白质测量)之间是否存在统计上显著的趋势。除SOMAscan蛋白质组学测量之外，还包括20个连续临床变量作为此分析中的潜在生物标记。

在对多重比较进行校正之后，显著标记的数目(基于<0.01的Bonferroni校正p值)在27至132的范围内，这取决于组织学成分(表14)。在每个类别中的前6种蛋白质的箱形图示于图22-27中。前6种生物标记中的唯一临床变量是AST(在图中标记clin.ast)。

表14：通过JT检验，Bonferroni的校正p<0.01得到的重要蛋白质的数量

类别	蛋白质数量
		脂肪变性	27
炎症	48
		气球样变性	104
纤维化	132
		NAS	96
NASH Dx	86

如图22所示，生物标记ACY1、KYNU、ITGA1/ITGB1、POR、HSP90AA1/HSP90AB1和CSF1R中的一种或多种可用于确定受试者患脂肪变性的可能性。

如图23所示，生物标记ACY1、THBS2、COLEC11、ITGA1/ITGB1和POR中的一种或多种可用于确定受试者患小叶炎症的可能性。在一些实施方案中，也可以考虑临床AST水平。

如图24所示，生物标记ACY1、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1和HSP90AA1/HSP90AB1中的一种或多种可用于确定受试者患肝细胞气球样变性的可能性。在一些实施方案中，也可以考虑临床AST水平。

如图25所示，生物标记C7、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1和DCN中的一种或多种可用于确定受试者患纤维化的可能性。

在这些类别的最高级别血清蛋白中存在重叠。在不同组织学类别中的疾病严重性可以是相关的。例如，肝细胞气球样变性评分为2的患者也可能具有纤维化。在由组织学类别得到的6个最高级别标记中存在10种独特的蛋白质(表15)。

表15：在每个组织学类别中最高级别蛋白质的重叠

除表15中列出的生物标记之外，临床AST水平形成小叶炎症和肝细胞气球样变性的前六种标记的一部分。使用本领域中已知的常规血液检查测定临床AST水平。

重叠和独特的血清标记的更广泛视图示于图28中，其中比较每个类别中的所有重要(Bonferroni校正的p<0.01)蛋白质。此分析表明可构建如下模型，该模型捕获NASH生物学的多个方面或对一种组分有特异性。

虽然试选模型是由代表极端情形(例如，脂肪变性0对3、气球样变性0对2、及纤维化0对3)的样品构建，但10x交叉验证性能AUC(0.97±0.02和0.94±0.07)表明该模型在所有样品中执行。

实施例9.脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和纤维化的生物标记组的进一步开发

生物标记发现是从区分疾病与对照的单变量KS距离开始，继之以稳定性选择和JT检验以用于疾病阶段严重性中的单调性能。每个分析过滤步骤的概要在下文中提供。一旦最终的候选清单已简化为来自“最佳”模型(经由来自特征选择的成本函数)的一个标准误差内的最简洁的一组标记，那么将最后一组特征用于拟合每个肝脏疾病组分的模型。

简言之，维数约减和候选过滤遵循以下方法：

1)KS-分析：KS-距离>0.4且KS-距离相关FDR<0.05(5％)，或

2)稳定性选择：分析物对于脂肪变性、小叶炎症、气球样变性、纤维化和NASHdx各者分别具有超过0.45、0.45、0.5、0.5和0.5的最大选择概率(模型中的条目比例)，和

3)JT-分析：JT-检验相关FDR<0.05(5％)

4)对照分析物：排除了阴性对照分析物，如HybControls、Spuriomers和非人类靶标

5)位点标记：将区分来自不同位点或研究的样品的标记从每个组分清单中的潜在候选物中排除

6)自旋稳定性：排除了具有在较低的33百分位(％ile)中的自旋稳定性评分(来自样品处理实验的贝叶斯模型)时间的分析物

7)再现性：排除了经测定在版本3测定再现性研究期间具有大于15％的变异系数(％CV)的分析物

8)高斯分布：进行了通过临床组(疾病对比对照)的分布分配的目测检查以用于高斯近似法并且排除了在临床组中具有非高斯的、双峰或截然不同的方差结构的分析物。

根据以上分析，鉴别每个肝脏疾病组分的候选标记。表16示出了在此进一步分析中鉴别的每种组织学类别的最终候选物。

表16：在每个组织学类别中最高级别蛋白质的重叠

使用AUC和/或敏感度+特异度成本函数及产生类似性能(峰-1se)的最小特征组，使用特征的组合构建最终模型。图29至32示出了特征选择算法的搜索进程。使用AUC作为成本(即性能)量度，根据哪个另外的标记造成最大性能提高来依次添加特征/生物标记。箱形图(左)内的点代表搜索算法的特定运行/倍数组合。右图示出了基于通过特征的平均AUC具有95％置信区间的相同数据。红点/箱代表具有峰AUC的模型且深绿和淡绿代表分别来自峰的1和2个标准误差。来自峰的一个标准误差通常被认为是“最佳”执行的、最简洁(即复杂性最低)的模型。

基于特征选择结果，为各个病状的模型选择以下标记。

●脂肪变性：ACY1

●小叶炎症：COLEC11、CSF1R

●肝细胞气球样变性：ITGA1/ITGB1、COLEC11、SERPINC1、LGALS3BP

●纤维化：C7、THBS2、KYNU、SERPINA7。

实施例10.NIH成人NASH模型

在原始NIH数据的发现阶段针对成人的以下各疾病状态生成朴素贝叶斯模型的说明：脂肪变性、小叶炎症、气球样变性和纤维化。以下示出了完整的朴素贝叶斯模型参数以及如何计算归一化的后验概率(及类别预测)的说明，倘若是对于每个特征具有log₁₀(RFU)-转换的分析物测量的未知样品。

朴素贝叶斯模型含有2pk+k个参数，其中k是类别的数目，p是特征/蛋白质的数目；对于每个蛋白质×类别组合的平均值(μ)和标准偏差(σ)，加上类别特异性先验，它是由训练类别发病率(即无信息先验)测定。朴素贝叶斯模型假设高斯密度并且经由概率密度函数(PDF)，假定类别特异性参数μ和σ来计算：

使用此方程(1)，具有p个log₁₀-转换的(RFU)蛋白质测量值 和k＝2个类别(疾病和对照)的未知样品可经由方程(2)来划分：

归一化的后验概率(Pr)是通过计算总密度的类别特异性比例而获得，例如：

并且根据ROC曲线到单位线的最大垂直距离测定的判定截止值来作出类别预测。

表17提供了基因标识符与用于该分析的蛋白质名称之间的定位。

表17：基因标识符和蛋白质名称的映射

脂肪变性朴素贝叶斯模型

为了划分具有蛋白质RFU测量值的未知样品：x₁＝log₁₀(ACY1.3343.1.4)，计算下列：

其中脂肪变性类别的判定阈(截止)是Pr(脂肪变性)>0.86153。

小叶炎症朴素贝叶斯模型

为了划分具有蛋白质RFU测量值的未知样品：x₁＝log₁₀(COLEC11.4430.44.3)，且x₂＝log₁₀(CSF1R.2638.12.2)，计算下列：

其中小叶炎症类别的判定阈(截止)是Pr(小叶炎症)>0.22539。

气球样变性朴素贝叶斯模型

为了划分具有蛋白质RFU测量值的未知样品：x₁＝log₁₀(ITGA1.ITGB1.3503.4.2)，x₂＝log₁₀(COLEC11.4430.44.3)，x₃＝log₁₀(SERPINC1.3344.60.4)，且x₄＝log₁₀(LGALS3BP.5000.52.1)，计算下列：

其中气球样变性类别的判定阈(截止)是Pr(气球样变性)>0.3151。

纤维化朴素贝叶斯模型

为了划分具有蛋白质RFU测量值的未知样品：x₁＝log₁₀(C7.2888.49.2)，x₂＝log₁₀(THBS2.3339.33.1)，x₃＝log₁₀(KY NU.4559.64.2)，且x₄＝log₁₀(SERPINA7.2706.69.2)，计算下列：

其中纤维化类别的判定阈(截止)是Pr(纤维化)＞0.31707。

实施例11.朴素贝叶斯分类器

一般目标是使用概率模型框架来预测未知样品的类别。这种数学模型或分类器是基于训练数据并且被构建(即模型拟合)以作出关于未知样品的类别预测。出于此目的，贝叶斯定理可被一般化为以下形式：

然后依据概率写成，

其中项P(数据)是不依赖于结果的归一化常数，并且经常被忽略，如果相对后验与绝对后验相比是所需的话。方程(2)随后简化为

P(结果|数据)∝P(数据|结果)×P(结果) (3)

实践中的朴素贝叶斯

考虑以下实例，假设具有高斯型(即正常)分布的蛋白质组学测量是来自个体且所关注的后验概率是该个体是否属于k个可能的结果/类别中的一个。例如，如果k＝2个可能的类别，即疾病或对照(即二元分类器)，那么其可被再写成：

P(对照|蛋白质RFU)＝P(蛋白质RFU|对照)×P(对照)，

P(疾病|蛋白质RFU)＝P(蛋白质RFU|疾病)×P(疾病)。

如果存在p种蛋白质，全都被朴素地假定为非依赖性的，那么可以将其个别概率相乘以产生累积概率。对于疾病后验，其给出：

P(对照|蛋白质RFUs)＝P(蛋白质₁|对照)×P(蛋白质₂|对照)×…×P(蛋白质_p|对照)×

＝P(对照)，

P(疾病|蛋白质RFUs)＝P(蛋白质₁|疾病)×P(蛋白质₂|疾病)×…×P(蛋白质_p|疾病)×

＝P(疾病)。

朴素贝叶斯模型含有2pk+k个参数，其中k是类别的数目，p是特征/蛋白质的数目；对于每个蛋白质×类别组合的平均值(μ)和标准偏差(σ)，加上类别特异性先验，它是由训练类别发病率(即无信息先验)测定。朴素贝叶斯模型假设高斯密度并且经由概率密度函数(PDF)，假定类别特异性参数μ和σ来计算：

为了划分具有p个蛋白质测量值和k个类别的未知样品，计算下列：

此实施例中的方程(5)的结果给出每个类别的概率密度，其在间隔[0，1]内不受限制。归一化的后验概率(Pr)是通过计算总密度的类别特异性比例而获得，

实施例计算

考虑：k＝2个类别(疾病对比对照)且p＝2种生物标记/特征实例，具有2pk+k＝10个参数：

表18：2标记/蛋白质朴素贝叶斯模型。下标是关于对照/疾病。

表19：各自具有2个蛋白质测量值(RFU)的5个未知样品(log₁₀-变换→高斯)。

对于以上未知样品1，使用如下此实施例的方程(5)计算朴素贝叶斯后验条件概率密度：

对照后验密度：

P(对照|x₁＝3.79301，x₂＝2.59934)＝P(x₁＝3.79301|对照)×

P(x₂＝2.59934|对照)×

P(对照)

＝P(x₁＝3.79301|μ_c＝3.73389，σ_c＝0.17571)×

P(x₂＝2.59934|μ_c＝2.71638，σ_c＝0.10198)×

(324/(224+73))

＝2.14546×2.02464×0.75421

＝3.27613

疾病后验密度：

P(疾病|x₁＝3.79301，x₂＝2.59934)＝P(x₁＝3.79301|疾病)×

P(x₂＝2.59934|疾病)×

P(疾病)

＝P(x₁＝3.79301|μ_d＝4.00075，σ_d＝0.25238)×

P(x₂＝2.59934|μ_d＝2.83843，σ_d＝0.09696)×

(73/(224+73))

＝1.1265×0.19677×0.24579

＝0.05448

归一化的后验概率：来自此实施例的方程(6)，各密度的相对比例是：

图33A/B描绘了来自训练数据的类别特异性概率密度(疾病对比对照)且垂直虚线示出了分别针对蛋白质1和2的样品1的测量值。图34A/B描绘了2种蛋白质的双变量图，其中B示出了疾病与对照之间的判定边界，具有用X鉴别的5个未知样品的位置。

表20：对于5个未知样品的归一化的后验概率。疾病类别预测是基于Pr(疾病)>0.5的判定截止(也参见图34A-34B)。

上述实施方案和实施例仅意图作为实例。未将具体实施方案、实施例、或具体实施方案或实施例的要素视为任何权利要求的关键、所需或必需要素或特征。可在不背离由所附权利要求所定义的本申请的范围的情况下，对所公开的实施方案作出各种改变、修改、取代及其它变型。说明书(包括附图和实施例)是以例证性而非限制性方式给出，并且所有这些修改和取代都意图包括在本申请的范围内。在方法或过程权利要求的任一项中所述的步骤可以任何可行的顺序进行并且不限于实施方案、实施例或权利要求的任一者中提出的顺序。此外，在上述任何方法中，一个或多个特别列出的生物标记可被明确排除作为单独的生物标记或来自任何组的生物标记。

Claims (57)

1.一种确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的方法，所述方法包括由表15和表16中所列的生物标记蛋白形成具有N种生物标记蛋白的生物标记组，及在来自所述受试者的样品中检测所述组的N种生物标记蛋白中的每一种的水平，其中N为至少5。

2.如权利要求1所述的方法，其中N为5至10，或N为6至10，或N为7至10，或N为8至10，或N为9至10，或N为至少6，或N为至少7，或N为至少8，或N为至少9，或N为5，或N为6，或N为7，或N为8，或N为9，或N为10。

3.一种确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样品中的ITGA1/ITGB1的水平，其中高于对照水平的ITGA1/ITGB1的水平表明所述受试者患有NAFLD。

4.一种确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样品中的HSP90AA1/HSP90AB1的水平，其中高于对照水平的HSP90AA1/HSP90AB1的水平表明所述受试者患有NAFLD。

5.一种确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样品中的ITGA1/ITGB1和HSP90AA1/HSP90AB1的水平，其中高于对照水平的ITGA1/ITGB1的水平和/或HSP90AA1/HSP90AB1的水平表明所述受试者患有NAFLD。

6.如权利要求3至5中任一项所述的方法，还包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或至少七种选自以下的生物标记的水平：ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、KYNU、POR和THBS2，其中高于相应生物标记的对照水平的选自ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、KYNU、POR和THBS2的至少一种生物标记的水平表明所述受试者患有NAFLD。

7.如权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1、ACY1、COLEC11和THBS2的水平。

8.如权利要求3至7中任一项所述的方法，其中所述方法包括测定所述受试者中的AST水平，其中升高的AST水平表明所述受试者患有NAFLD。

9.一种确定受试者是否患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的方法，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种或十一种选自以下的生物标记的水平：ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、HSP90AA1/HSP90AB1、ITGA1/ITGB1、KYNU、POR、FCGR3B、LGALS3BP、SERPINC1、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和THBS2，其中高于相应生物标记的对照水平的至少一种选自ACY1、C7、COLEC11、CSF1R、DCN、HSP90AA1/HSP90AB1、ITGA1/ITGB1、KYNU、POR、FCGR3B、LGALS3BP、SERPINC1、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和THBS2的生物标记的水平表明所述受试者患有NAFLD。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述方法包括检测HSP90AA1/HSP90AB1或ITGA1/ITGB1、或HSP90AA1/HSP90AB1和ITGA1/ITGB1两者的水平。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定受试者是否患有脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和/或纤维化。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述脂肪变性为轻度、中度或重度脂肪变性。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定受试者是否患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述NASH为1期、2期、3期或4期NASH。

15.一种确定受试者是否患有脂肪变性的方法，所述方法包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或六种选自以下的生物标记的生物标记组：ACY1、KYNU、ITGA1/ITGB1、POR、HSP90AA1/HSP90AB1、THBS2和CSF1R；检测来自所述受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于所述生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定所述受试者是否患有脂肪变性或确定所述受试者患脂肪变性的可能性。

16.一种确定受试者是否患有脂肪变性的方法，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或六种选自以下的生物标记：ACY1、KYNU、ITGA1/ITGB1、POR、HSP90AA1/HSP90AB1、THBS2和CSF1R，以便确定所述受试者是否患有脂肪变性或确定所述受试者患脂肪变性的可能性。

17.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述方法包括检测ACY1、KNYU及至少一种、至少两种、至少三种或四种选自以下的另外的生物标记：ITGA1/ITGB1、POR、HSP90AA1/HSP90AB1、THBS2和CSF1R。

18.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测ACY1、KNYU及至少一种、至少两种、至少三种或四种选自以下的另外的标记：ITGA1/ITGB1、POR、HSP90AA1/HSP90AB1和CSF1R。

19.如权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测至少一种选自以下的生物标记：ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1、THBS2和CSF1R。

20.如权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测ACY1。

21.一种确定受试者是否患有小叶炎症的方法，所述方法包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或五种选自以下的生物标记的生物标记组：ACY1、THBS2、COLEC11、ITGA1/ITGB1、CSF1R、KYNU、FCGR3B和POR；检测来自所述受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于所述生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定所述受试者是否患有小叶炎症或确定所述受试者患小叶炎症的可能性。

22.一种确定受试者是否患有小叶炎症的方法，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或五种选自以下的生物标记：ACY1、THBS2、COLEC11、ITGA1/ITGB1、CSF1R、KYNU、FCGR3B和POR，以便确定所述受试者是否患有小叶炎症或确定所述受试者患小叶炎症的可能性。

23.如权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述方法包括检测ACY1、THBS2、COLEC11及至少一种或两种选自以下的另外的生物标记：ITGA1/ITGB1、CSF1R、KYNU、FCGR3B和POR。

24.如权利要求21至23中任一项所述的方法，包括检测ACY1、THBS2、COLEC11及至少一种或两种选自以下的另外的生物标记：ITGA1/ITGB1、CSF1R、KYNU、FCGR3B和POR。

25.如权利要求21至24中任一项所述的方法，包括检测ITGA1/ITGB1。

26.如权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测COLEC11和CSF1R。

27.一种确定受试者是否患有肝细胞气球样变性的方法，所述方法包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或五种选自以下的生物标记的生物标记组：ACY1、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、SERPINC1、C7、POR、LGALS3BP和HSP90AA1/HSP90AB1；检测来自所述受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于所述生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定所述受试者是否患有肝细胞气球样变性或确定所述受试者患肝细胞气球样变性的可能性。

28.一种确定受试者是否患有肝细胞气球样变性的方法，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或五种选自以下的生物标记：ACY1、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、SERPINC1、C7、POR、LGALS3BP和HSP90AA1/HSP90AB1，以便确定所述受试者是否患有肝细胞气球样变性或确定所述受试者患肝细胞气球样变性的可能性。

29.如权利要求27或权利要求28所述的方法，其中所述方法包括检测ACY1、COLEC11、THBS2及至少一种或两种选自ITGA1/ITGB1和HSP90AA1/HSP90AB1的另外的生物标记。

30.如权利要求27至29中任一项所述的方法，包括检测ACY1、COLEC11、THBS2及至少一种或两种选自ITGA1/ITGB1和HSP90AA1/HSP90AB1的另外的生物标记。

31.如权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测ITGA1/ITGB1、COLEC11、SERPINC1和LGALS3BP。

32.一种确定受试者是否患有纤维化的方法，所述方法包括提供包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或十四种选自以下的生物标记的生物标记组：C7、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1、ACY1、CSF1R、KYNU、POR、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和DCN；检测来自所述受试者的样品中的生物标记的水平以得到对应于所述生物标记组中的生物标记的生物标记值，以便确定所述受试者是否患有纤维化或确定所述受试者患纤维化的可能性。

33.一种确定受试者是否患有纤维化的方法，所述方法包括在来自所述受试者的样品中检测至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种或十四种选自以下的生物标记：C7、COLEC11、THBS2、ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1、ACY1、CSF1R、KYNU、POR、IGFBP7、PIK3CA/PIK3R1、NAGK、DDC、SERPINA7和DCN，以便确定所述受试者是否患有纤维化或确定所述受试者患纤维化的可能性。

34.如权利要求32或权利要求33所述的方法，其中所述生物标记组包含C7、COLEC11、THBS2及至少一种、至少两种或三种选自以下的另外的生物标记：ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1和DCN。

35.如权利要求32至34中任一项所述的方法，包括检测C7、COLEC11、THBS2及至少一种、至少两种或三种选自以下的另外的生物标记：ITGA1/ITGB1、HSP90AA1/HSP90AB1和DCN。

36.如权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测C7、THBS2、KYNU和SERPINA7。

37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者处于发展NAFLD的风险中。

38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者处于发展脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变性和/或纤维化的风险中。

39.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者处于发展NASH的风险中。

40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者为肥胖的。

41.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中每种生物标记为蛋白质生物标记。

42.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括使来自所述受试者的样品的生物标记与一组生物标记捕获试剂接触，其中所述一组生物标记捕获试剂中的每种生物标记捕获试剂特异性地结合至被检测的不同生物标记。

43.如权利要求42所述的方法，其中每种生物标记捕获试剂为抗体或适体。

44.如权利要求43所述的方法，其中每种生物标记捕获试剂为适体。

45.如权利要求44所述的方法，其中至少一种适体为慢解离速率适体。

46.如权利要求45所述的方法，其中至少一种慢解离速率适体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有修饰的核苷酸。

47.如权利要求45或权利要求46所述的方法，其中每种慢解离速率适体以如下解离速率(t_1/2)结合至其靶蛋白：≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟。

48.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品为血液样品。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述样品选自血清样品和血浆样品。

50.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中如果所述受试者患有NAFLD或NASH，那么向所述受试者推荐选自以下的方案：减轻体重、控制血糖和避免酒精。

51.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中如果所述受试者患有NAFLD或NASH，那么向所述受试者推荐胃旁路手术。

52.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中如果所述受试者患有NAFLD或NASH，那么向所述受试者开出至少一种选自吡格列酮、维生素E和二甲双胍的治疗剂的处方。

53.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定受试者是否患有NAFLD或NASH，目的在于确定医疗保险费或人寿保险费。

54.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括确定医疗保险费或人寿保险费。

55.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使用由所述方法得到的信息来预测和/或管理医疗资源的利用。

56.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测ITGA1和/或ITGB1和/或ITGA1与ITGB1的复合物。

57.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测HSP90AA1和/或HSP90AB1。