BR112015021992B1 - Método para determinar se um indivíduo tem esteato-hepatite não alcoólica (nash) - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA DETERMINAR SE UM INDIVÍDUO TEM DOENÇA HEPÁTICA GORDUROSA NÃO ALCOÓLICA (NAFLD), SE UM INDIVÍDUO COM ESTEATOSE NÃO ALCOÓLICA TEM ESTEATO- HEPATITE NÃO ALCOÓLICA E PARA MONITORAR UM INDIVÍDUO COM ESTEATOSE NÃO ALCOÓLICA PARA O DESENVOLVIMENTO DE NASH. São fornecidos métodos, composições e kits para de terminar se um sujeito tem doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA). Também são fornecidos métodos, composições e kits para determinar se um sujeito tem esteatose não alcoólica. Também são fornecidos métodos, composições e kits para determinar se um sujeito tem esteatohepatite não alcoólica (EHNA).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] O presente pedido refere-se geralmente para a detecção de biomarcadores e a caracterização da doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), por exemplo, para identificar indivíduos com estea- tose hepática e esteato-hepatite não alcoólica (NASH). Em várias modalidades, a invenção refere-se a um ou mais biomarcadores, métodos, aparelhos, reagentes, sistemas e kits para caracterizar NAFLD e NASH em um indivíduo.

ANTECEDENTES

[0002] A descrição a seguir fornece um resumo, de informação, e não é uma admissão de que qualquer uma das informações fornecidas ou publicações mencionadas neste documento são o estado da técnica para o pedido presente.

[0003] Doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLDA) é definida como a presença de esteatose hepática, com ou sem inflamação e fibrose, na ausência da história do álcool. NAFLD está subdividido na hepática gordurosa não alcoólica (NAFL) e esteato-hepatite não alcoólica (NASH). Na NAFL, esteatose hepática está presente sem evidência da inflamação significativa, considerando que em NASH, es- teatose hepática está associada com inflamação hepática que pode ser histologicamente indistinguível da esteato-hepatite alcoólica.

[0004] NAFLD tornou-se uma epidemia mundial e é a principal causa de doença hepática na América do Norte, em consequência da crescente prevalência de obesidade. No entanto, os dados de base populacional precisos sobre a incidência de NAFL e NASH são escassos, em parte porque o diagnóstico requer documentação histopatoló- gica. Principais fatores de risco para NAFLD são central obesidade, diabetes mellitus tipo 2, níveis elevados de triglicerídeos (gorduras) no sangue e pressão arterial elevada. Nos EUA, NAFLD está presente em 20-40% da população e NASH está presente em cerca de 25% da população de obesa. Dez a vinte e nove por cento dos pacientes de NASH desenvolvem cirrose e 4-27% daqueles desenvolvem câncer hepático.

[0005] A maioria das pessoas com NASH não têm sintomas. Alguns podem ter dor no quadrante superior direito, hepatomegalia ou sintomas inespecíficos, tais como desconforto abdominal, fraqueza, cansaço ou mal-estar. Um médico ou enfermeiro pode suspeitar a presença de NASH dos resultados de exames de sangue de rotina. Em NAFLD, enzimas hepáticas aspartato aminotransferase (AST) e alani- na aminotransferase (ALT) são muitas vezes elevados.

[0006] O padrão de ouro atual para confirmar o NASH é uma avaliação histológica da biópsia do fígado, que é caro, invasivo, e pode causar dor, hemorragia ou mesmo morte.

[0007] Um simples exame de sangue que identifica e distingue os vários estágios de NAFLD e NASH (e, assim, reduzir a necessidade de biópsia hepática) seria altamente desejável.

SUMÁRIO

[0008] Em algumas modalidades, métodos para determinar se um sujeito tem doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) são fornecidos. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de identificação de indivíduos com esteatose hepática. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para determinar a gravidade da esteato- se.

[0009] Em algumas modalidades, métodos para determinar se um sujeito tem tem esteato-hepatite não alcoólica (NASH) são fornecidos. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de identificação de indivíduos com NASH. Em algumas modalidades, são fornecidos mé- todos de os distintivos com NASH de ujeitos com esteatose hepática. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para determinar a gravidade da NASH.

[00010] Em algumas modalidades, métodos para determinar se um sujeito tem doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) são fornecidos. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou onze biomar- cadores selecionados de ACY, SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1 da, SERPINC1, SIGLEC7 e SIGLEC14, em uma amostra do sujeito. Em algumas modalidades , um método que compreende a detecção do nível de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo me-nos sete, pelo menos oito ou nove biomarcadores selecionados a partir de ACY, SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1 e SERPINC1. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de ACY e, opcionalmente, um ou mais de SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1, SERPINC1, SIGLEC7 e SIGLEC14, em uma amostra do sujeito. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de SHBG e, opcionalmente, um ou mais dos ACY, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1, SERPINC1, SIGLEC7 e SIGLEC14, em uma amostra do sujeito. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de ACY e opcionalmente, um ou mais de SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1, SERPINC1, SIGLEC7 e SIGLEC14, em uma amostra do sujeito. Em algumas modalidades, um nível de pelo menos um biomarcador selecionado de ACY, CTSZ, LGALS3BP, SI- GLEC7, SIGLEC14 e PLAT maior do que um nível de controle do respectivo biomarcador indica que o sujeito tem NAFLD. Em algumas modalidades, um nível de pelo menos um biomarcador selecionado de SHBG, MET, GSN, CHL1 e SERPINC1 que é inferior um nível de controle do respectivo biomarcador indica que o sujeito tem NAFLD. Em algumas modalidades, o método compreende determinar se um sujeito tem esteatose. Em algumas modalidades, a esteatose é leve, moderada ou grave esteatose. Em algumas modalidades, e o método compreende detectar pelo menos um, pelo menos dois ou três biomarca- dores selecionados a partir de ACY, SHBG e SIGLEC14. Em algumas modalidades, o método compreende determinar se um sujeito tem es- teato-hepatite não alcoólica (NASH). Em algumas modalidades, o NASH é estágio 1, 2, 3 ou 4 NASH. Em algumas modalidades, o método compreende a detecção de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou sete biomarcadores selecionados a partir de ACY, SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP e SIGLEC7. Em algumas modalidades , um método que compreende a detecção de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito ou nove biomarcadores selecionados a partir de ACY, SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1 e SERPINC1.

[00011] Em algumas modalidades, métodos para determinar se um sujeito com esteatose não alcoólica tem esteato-hepatite não alcoólica (NASH) são fornecidos. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou pelo menos dez biomarcadores selecionados de C7, PPID, IGFBP3, SIGLEC14, AIMP1, TOP1, COLEC11, CA6, STX1A, GPC5, HIPK3, IGFBP7 e IL3RA em uma amostra do sujeito. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove biomar- cadores selecionados de C7, PPID, IGFBP3, SIGLEC14, AIMP1, TOP1, COLEC11, CA6, e STX1A, em uma amostra do sujeito. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de pelo menos um pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito biomarcadores selecionados de C7, PPID, IGFBP3, COLEC11, GPC5, HIPK3, IGFBP7, e IL3RA em uma amostra do sujeito. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de CO- LEC11 e, opcionalmente, um ou mais de C7, PPID, IGFBP3, SI- GLEC14, AIMP1, TOP1, CA6, STX1A, GPC5, HIPK3, IGFBP7 e IL3RA em uma amostra do sujeito. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de C7 e, opcionalmente, um ou mais dos COLEC11, PPID, IGFBP3, SIGLEC14, AIMP1, TOP1, CA6, STX1A, GPC5, HIPK3, IGFBP7 e IL3RA em uma amostra do sujeito. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de PPID e, opcionalmente, um ou mais de C7, COLEC11, IGFBP3, SIGLEC14, AIMP1, TOP1, CA6, STX1A, GPC5, HIPK3, IGFBP7 e IL3RA em uma amostra do sujeito. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de IGFBP3 e, opcionalmente, um ou mais dos COLEC11, PPID, C7, IGLEC14, AIMP1, TOP1, CA6, STX1A, GPC5, HIPK3, IGFBP7 e IL3RA em uma amostra do sujeito. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de C7, COLEC11, PPID e IGFBP3 e opcionalmente um ou mais de SIGLEC14, AIMP1, TOP1, CA6, STX1A, GPC5, HIPK3, IGFBP7 e IL3RA em uma amostra do sujeito. Em algumas modalidades, um nível de pelo menos um biomarcador selecionado de C7, COLEC11, HIPK3, IGFBP7, IL3RA e SIGLEC14 que é maior do que um nível de controle do respectivo biomarcador indica que o sujeito tem NASH. Em algu- mas modalidades, um nível de pelo menos um biomarcador selecionado de IGFBP3, AIMP1, TOP1, CA6, PPID, GPC3 e STX1A que é inferior um nível de controle do respectivo biomarcador, indica que o sujeito tem de NASH. Em algumas modalidades, sujeito tem esteatose leve, moderada ou grave. Em algumas modalidades, o NASH é estágio 1, 2, 3 ou 4 NASH. Em algumas modalidades, o NASH é estágio 2, 3 ou 4 NASH. Em algumas modalidades, o método compreende detectar os níveis de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três ou quatro biomarcadores selecionados a partir de C7, COLEC11, PPID e IGFBP3. Em algumas modalidades, o método compreende detectar os níveis de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou seis biomarcadores selecionados a partir de SIGLEC14, AIMP1, TOP1, COLEC11, CA6, e STX1A.

[00012] Em algumas modalidades, métodos de monitoramento de um sujeito com esteatose hepática não alcoólica para desenvolvimento de NASH são fornecidos. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou pelo menos dez biomarcadores selecionados de C7, PPID, IGFBP3, SIGLEC14, AIMP1, TOP1, COLEC11, CA6, STX1A, GPC5, HIPK3, IGFBP7 e IL3RA em uma amostra do sujeito. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove biomar- cadores selecionados de C7, PPID, IGFBP3, SIGLEC14, AIMP1, TOP1, COLEC11, CA6, e STX1A, em uma amostra do sujeito. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de pelo menos um pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito biomarcadores selecionados de C7, PPID, IGFBP3, COLEC11, GPC5, HIPK3, IGFBP7, e IL3RA em uma amostra do sujeito. Em algumas modalidades, um nível de pelo menos um biomarcador selecionado de C7, COLEC11, e SIGLEC14 que é maior do que um nível de controle do respectivo biomarcador indica que o sujeito tem NASH. Em algumas modalidades, um nível de pelo menos um biomarcador selecionado de IGFBP3, AIMP1, TOP1, CA6, PPID, e STX1A que é inferior um nível de controle do respectivo biomarcador, indica que o sujeito tem de NASH. Em algumas modalidades, sujeito tem esteatose leve, moderada ou grave. Em algumas modalidades, o NASH é estágio 1, 2, 3 ou 4 NASH. Em algumas modalidades, o NASH é estágio 2, 3 ou 4 NASH. Em algumas modalidades, o método compreende detectar os níveis de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três ou quatro biomarcadores selecionados a partir de C7, COLEC11, PPID e IG- FBP3. Em algumas modalidades, o método compreende detectar os níveis de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou seis biomarcadores selecionados a partir de SIGLEC14, AIMP1, TOP1, COLEC11, CA6, e STX1A.

[00013] Em algumas modalidades, métodos para determinar se um sujeito tem NAFLD são fornecidos, em que o método compreender a detecção do nível de biomarcadores de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou pelo menos dez selecionados a partir de biomarcadores na Tabela 7. Em algumas modalidades, o método compreender a formação de um painel de biomarcador com N proteínas biomarcadoras a partir das proteínas biomarcadoras descritas na Tabela 7 e detectar o nível de cada uma das N proteínas biomarcadoras do painel em uma amostra do su-jeito. Em algumas modalidades, N é 1 a 25. Em algumas modalidades, N é 2 a 25. Em algumas modalidades, N é 3 a 25. Em algumas moda-lidades, N é 4 a 25. Em algumas modalidades, N é 5 a 25. Em algumas modalidades, N é 1 a 10. Em algumas modalidades, N é 2 a 10. Em algumas modalidades, N é 3 a 10. Em algumas modalidades, N é 4 a 10. Em algumas modalidades, N é 5 a 10. Em algumas modalidades, pelo menos uma das proteínas do biomarcador N é selecionada ACY e SHBG. Em algumas modalidades, duas as proteínas do bio- marcador N são ACY e SHBG. Em algumas modalidades, um nível de um biomarcador na Tabela 7 exceto SHBG e GSN que é superior um nível de controle do respectivo biomarcador indica que o sujeito tem NAFLD. Em algumas modalidades, um nível de pelo menos um bio- marcador selecionado de SHBG e GSN que é inferior a um nível de controle do respectivo biomarcador indica que o sujeito tem NAFLD. Em algumas modalidades, o método compreende determinar se um sujeito tem NASH.

[00014] Em algumas modalidades, métodos para determinar se um sujeito tem NASH são fornecidos, em que o método compreender a detecção do nível de biomarcadores de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou pelo menos dez selecionados a partir de biomarcadores na Tabela 9. Em algumas modalidades, o método compreender a formação de um painel de biomarcador com N proteínas biomarcadoras a partir das proteínas biomarcadoras descritas na Tabela 9 e detectar o nível de cada uma das N proteínas biomarcadoras do painel em uma amostra do su-jeito. Em algumas modalidades, N é 1 a 8. Em algumas modalidades, N é 2 a 8. Em algumas modalidades, N é 3 a 8. Em algumas modalidades, N é de 4 a 8. Em algumas modalidades, N é 5 a 8. Em algumas modalidades, pelo menos uma das proteínas do biomarcador N é selecionado COLAC11. Em algumas modalidades, pelo menos uma das proteínas do biomarcador N é selecionada de C7, COLEC11, PPID e IGFBP3. Em algumas modalidades, um nível de um biomarcador na Tabela 9 exceto IGFBP3 e GPC3 que é superior um nível de controle do respectivo biomarcador indica que o sujeito tem NASH. Em algumas modalidades, um nível de pelo menos um biomarcador selecionado de IGFBP3 e GPC3 que é inferior um nível de controle do respectivo biomarcador, indica que o sujeito tem de NASH.

[00015] Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o sujeito pode estar em risco de desenvolver a NAFLD. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o sujeito pode estar em risco de desenvolver a esteatose. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o sujeito pode estar em risco de desenvolver a NASH. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o sujeito pode ter uma comorbi- dade NAFLD selecionada da obesidade, obesidade abdominal, sín- drome metabólica, doenças cardiovasculares e diabetes. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o sujeito pode ser obeso.

[00016] Em qualquer uma das modalidades descritas neste documento, pelo menos um biomarcador pode ser um biomarcador de proteína. Em qualquer uma das modalidades descritos neste documento, cada biomarcador pode ser um biomarcador de proteína. Em algumas modalidades, o método compreende colocar os biomarcadores da amostra do sujeito em contato com um conjunto de reagentes de captura do biomarcador, em que cada reagente de captura do biomarca- dor do conjunto de reagentes de captura do biomarcador se liga especificamente a um biomarcador diferente sendo detectado. Em algumas modalidades, reagente de captura de cada biomarcador é um anticorpo ou um aptâmero. Em algumas modalidades, reagente de captura de cada biomarcador é um aptâmero. Em algumas modalidades, pelo menos um aptâmero é um abrandamento da taxa aptâmero. Em algumas modalidades, pelo menos um aptâmero com taxa de dissociação lenta compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos 10 nucleotí- deos com modificações. Em algumas modalidades,cada aptâmero com taxa de dissociação lenta se liga a sua proteína-alvo com uma taxa de dissociação (t/) > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos ou > 240 minutos.

[00017] Em qualquer uma das modalidades descritas neste documento, a amostra pode ser uma amostra de sangue. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a amostra pode ser selecionada de uma amostra de soro e uma amostra de plasma.

[00018] Em qualquer uma das modalidades descritas aqui, se o sujeito tem NAFLD ou NASH, ao sujeito pode ser recomendado um regime selecionado a partir de perda de peso, controle de açúcar no sangue e evitar álcool. Em qualquer uma das modalidades descritas neste documento, se o sujeito tem NAFLD ou NASH, ao sujeito pode ser recomendado para a cirurgia de bypass gástrico. Em qualquer uma das modalidades descritas aqui, se o sujeito tem NAFLD ou NASH, ao ao sujeito pode ser prescrito pelo menos um agente terapêutico selecionado a partir de pioglitazona, vitamina E e metformina.

[00019] Em algumas modalidades, um método descrito aqui é para a determinação de um prêmio de seguro médico ou prêmio de seguro de vida. Em algumas modalidades, um método ainda compreende a determinação de um prêmio de seguro médico ou prêmio de seguro de vida. Em algumas modalidades, um método descrito neste documento ainda compreende usar informações resultantes do método para prever e/ou gerir a uso de recursos médicos.

[00020] Em algumas modalidades, kits são fornecidos. Em algumas modalidades, um kit compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou onze aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionada de ACY, SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP,PLAT, CHL1, SERPINC1, SIGLEC7, e SIGLEC14. Em algumas dessas modalidades, um kit compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, ou oito aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionado de ACY, SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, CHL1, SERPINC1. Em algumas modalidades, um kit compreende um aptâmero que liga especificamente ACY e, opcionalmente, um ou mais aptâmeros que se ligam especificamente a uma ou mais proteínas alvo selecionadas de SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1, SERPINC1, SIGLEC7, e SIGLEC14. Em algumas modalidades, um kit compreende um aptâmero que se liga especificamente a SHBG e, opcionalmente, um ou mais aptâme- ros que se ligam especificamente a uma ou mais proteínas alvo selecionadas de ACY, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1, SER- PINC1, SIGLEC7, e SIGLEC14. Em algumas modalidades, um kit compreende um aptâmero que liga especificamente ACY e um aptâ- mero que se liga especificamente a SHBG um ou mais aptâmeros que especificamente se liga a uma ou mais proteínas selecionadas de CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1, SERPINC1, SIGLEC7, e SIGLEC14.

[00021] Em algumas modalidades, um kit compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou dez aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionada a partir das proteínas na Tabela 7. Em algumas modalidades, um kit compreende N aptâmeros, em que cada aptâmero se liga especificamente a uma proteína do biomarcador listado na Tabela 7. Em algumas modalidades, N é 1 a 25. Em algumas modalidades, N é 2 a 25. Em algumas modalidades, N é 3 a 25. Em algumas modalidades, N é 4 a 25. Em algumas modalidades, N é 5 a 25. Em algumas modalidades, N é 1 a 10. Em algumas modalidades, N é 2 a 10. Em algumas modalidades, N é 3 a 10. Em algumas modalidades, N é 4 a 10. Em algumas modalidades, N é 5 a 10. Em algumas modalidades, pelo menos de N aptâmeros cada vincula especificamente uma proteína do biomarcador diferente selecionada de ACY e SHBG. Em algumas modalidades, dentre os N aptâmeros ligam-se especificamente a ACY e dentre os N aptâmeros ligam-se especificamente à SHBG. Em algumas modalidades, cada aptâmero liga especificamente a uma proteína alvo diferentes.

[00022] Em algumas modalidades, um kit compreende proteínas de uma amostra de um sujeito e pelo menos um, pelo menos dois ou três aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionada de ACY, SHBG e SIGLEC14. Em algumas modalidades, um kit compreende proteínas de uma amostra de um sujeito e pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, ou oito aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionado de ACY, SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, e SIGLEC7. Em algumas des-sas modalidades, um kit compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, ou nove aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionado de ACY, SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1, e SERPINC1.

[00023] Em algumas modalidades, um kit é fornecido, em que o kit compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou pelo menos dez aptâmeros que especificamente ligam a uma proteína alvo selecionados de C7, PPID, IGFBP3, SIGLEC14, AIMP1, TOP1, COLEC11, CA6, STX1A, GPC5, HIPK3, IGFBP7, e IL3RA. Em algumas modalidades, um kit é fornecido, em que o kit compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, ou nove aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionado de C7 PPID, IG- FBP3, SIGLEC14, AIMP1, TOP1, COLEC11, CA6 e STX1A. Em algumas modalidades, um kit é fornecido, em que compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete ou oito aptâmeros que se li-gam especificamente a uma proteína alvo selecionada de C7, PPID, IGFBP3, COLEC11, GPC5, HIPK3, IGFBP7 e IL3RA. Em algumas modalidades, cada aptâmero se liga especificamente a uma proteína alvo diferentes.

[00024] Em algumas modalidades, um kit compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três ou quatro aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionada de C7, CO- LEC11, PPID, e IGFBP3. Em algumas modalidades, um kit compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, ou oito aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionado de SIGLEC14, AIMP1, TOP1, COLEC11, CA6, e STX1A.

[00025] Em algumas modalidades, um kit compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete ou oito aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionada a partir das proteínas na Tabela 9. Em algumas modalidades, um kit compreende ap- tâmeros N, em que cada aptâmero liga especificamente a uma proteína do biomarcador listado na Tabela 9. Em algumas modalidades, N é 1 a 8. Em algumas modalidades, N é 2 a 8. Em algumas modalidades, N é 3 a 8. Em algumas modalidades, N é de 4 a 8. Em algumas modalidades, N é 5 a 8. Em algumas modalidades, pelo menos um dos ap- tâmeros N liga especificamente para COLEC11. Em algumas modalidades, pelo menos de N aptâmeros cada vincula especificamente uma proteína do biomarcador diferente selecionada de C7, COLEC11, PPID e IGFBP3. Em algumas modalidades, quatro de N aptâmeros cada vincula especificamente uma proteína do biomarcador diferente selecionada de C7, COLEC11, PPID e IGFBP3. Em algumas modalidades, cada aptâmero liga especificamente a uma proteína alvo diferentes.

[00026] Em qualquer uma das modalidades da descritos neste documento, pelo menos um aptâmero pode ser um aptâmero a taxa de dissociação lenta. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, cada aptâmero pode ser um aptâmero a taxa de dissociação lenta. Em algumas modalidades, pelo menos um aptâmero com taxa de dissociação lenta compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos 10 nu- cleotídeos com modificações hidrofóbicas. Em algumas modalida- des,cada aptâmero com taxa de dissociação lenta se liga a sua proteína-alvo com uma taxa de dissociação (t/) > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos ou > 240 minutos.

[00027] Em algumas modalidades, composições são fornecidas. Em algumas dessas modalidades, uma composição compreende proteínas de uma amostra de um sujeito e pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou onze aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionada de ACY, SHBG, CTSZ, MET , GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1, SERPINC1, SIGLEC7 e SIGLEC14. Em algumas dessas modalidades, uma composição compreende proteínas de uma amostra de um sujeito e pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, ou oito aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionado de ACY SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, CHL1, SERPINC1. Em algumas dessas modalidades, uma composição compreende proteínas de uma amostra de um sujeito e pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou onze aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionada das proteínas na Tabela 7. Em algumas modalidades, uma composição compreende proteínas da amostra do sujeito e aptâmeros N, em que cada aptâme- ro liga especificamente a uma proteína do biomarcador listado na Tabela 7. Em algumas modalidades, N é 1 a 25. Em algumas modalidades, N é 2 a 25. Em algumas modalidades, N é 3 a 25. Em algumas modalidades, N é 4 a 25. Em algumas modalidades, N é 5 a 25. Em algumas modalidades, N é 1 a 10. Em algumas modalidades, N é 2 a 10. Em algumas modalidades, N é 3 a 10. Em algumas modalidades, N é 4 a 10. Em algumas modalidades, N é 5 a 10. Em algumas modalidades, pelo menos de N aptâmeros cada vincula especificamente uma proteína do biomarcador diferente selecionada de ACY e SHBG. Em algumas modalidades, dentre os N aptâmeros ligam-se especificamente a ACY e dentre os N aptâmeros ligam-se especificamente à SHBG. Em algumas modalidades, cada aptâmero liga especificamente a uma proteína alvo diferentes.

[00028] Em algumas modalidades, uma composição compreende proteínas de uma amostra de um sujeito e pelo menos um, pelo menos dois ou três aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionada de ACY, SHBG e SIGLEC14. Em algumas modalidades, uma composição compreende proteínas de uma amostra de um sujeito e pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, ou oito aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionado de ACY, SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, e SIGLEC7. Em algumas dessas modalidades, uma composição compreende proteínas de uma amostra de um sujeito e pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, ou nove aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionado de ACY, SHBG, CTSZ,MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1, e SERPINC1.

[00029] Em algumas modalidades, a composição é fornecida que compreende a proteína da amostra do sujeito e pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou pelo menos dez aptâmeros que especificamente ligam a uma proteína alvo selecionados de C7, PPID, IGFBP3, SIGLEC14, AIMP1, TOP1, COLEC11, CA6, STX1A, GPC5, HIPK3, IGFBP7, e IL3RA. Em algumas modalidades, uma composição é fornecida que compreende proteínas de uma amostra de um sujeito e pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo me-nos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, ou nove aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionado de C7 PPID, IGFBP3, SIGLEC14, AIMP1, TOP1, COLEC11, CA6 e STX1A. Em algumas modalidades, uma composição é fornecida que compreende proteínas de uma amostra de um sujeito e pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete ou oito aptâmeros que se ligam especifica- mente a uma proteína alvo selecionada de C7, PPID, IGFBP3, CO- LEC11, GPC5, HIPK3, IGFBP7 e IL3RA. Em algumas modalidades, cada aptâmero se liga especificamente a uma proteína alvo diferentes.

[00030] Em algumas modalidades, uma composição é fornecida que compreende proteínas de uma amostra de um sujeito e pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três ou quatro aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionada de C7, CO- LEC11, PPID, e IGFBP3. Em algumas modalidades, uma composição é fornecida que compreende proteínas de uma amostra de um sujeito e pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, ou oito ap- tâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionado de SIGLEC14, AIMP1, TOP1, COLEC11, CA6, e STX1A.

[00031] Em algumas modalidades, uma composição é fornecida que compreende proteínas da amostra de um sujeito e pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete ou oito aptâmeros que se ligam especificamente a uma proteína alvo selecionada a partir das proteínas na Tabela 9. Em algumas modalidades, uma composição é fornecida que compreende proteínas da amostra do sujeito e N aptâme- ros, em que cada aptâmero liga especificamente a uma proteína do biomarcador listado na Tabela 9. Em algumas modalidades, N é 1 a 8. Em algumas modalidades, N é 2 a 8. Em algumas modalidades, N é 3 a 8. Em algumas modalidades, N é de 4 a 8. Em algumas modalidades, N é 5 a 8. Em algumas modalidades, pelo menos um dos aptâme- ros N liga especificamente para COLEC11. Em algumas modalidades, pelo menos de N aptâmeros cada vincula especificamente uma proteína do biomarcador diferente selecionada de C7, COLEC11, PPID e IGFBP3. Em algumas modalidades, quatro de N aptâmeros cada vincula especificamente uma proteína do biomarcador diferente selecio- nada de C7, COLEC11, PPID e IGFBP3. Em algumas modalidades, cada aptâmero liga especificamente a uma proteína alvo diferentes.

[00032] Em qualquer uma das modalidades descritas neste documento, a amostra pode ser uma amostra de sangue. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a amostra pode ser selecionada de uma amostra de soro e uma amostra de plasma.

[00033] Em qualquer uma das modalidades da descritos neste documento, pelo menos um aptâmero pode ser um aptâmero a taxa de dissociação lenta. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, cada aptâmero pode ser um aptâmero a taxa de dissociação lenta. Em algumas modalidades, pelo menos um aptâmero com taxa de dissociação lenta compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos 10 nu- cleotídeos com modificações hidrofóbicas. Em algumas modalida- des,cada aptâmero com taxa de dissociação lenta se liga a sua proteína-alvo com uma taxa de dissociação (t/) > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos ou > 240 minutos.

[00034] Em qualquer uma das modalidades descritos neste documento, cada biomarcador pode ser um biomarcador de proteína. Em qualquer uma das modalidades descritas aqui, o método pode compreende contato com os biomarcadores da amostra do sujeito em contato com um conjunto de reagentes de captura do biomarcador, em que cada reagente de captura do biomarcador do conjunto de reagentes de captura do biomarcador se liga especificamente a um biomar- cador diferente sendo detectado. Em algumas modalidades, cada reagente de captura biomarcador do conjunto de reagentes de captura de biomarcadores se liga especificamente a um biomarcador diferente a ser detectado. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, rea- gente de captura cada biomarcador pode ser um anticorpo ou um ap- tâmero. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, reagente de captura cada biomarcador pode ser um aptâmero. Em qualquer uma das modalidades da descritos neste documento, pelo menos um aptâmero pode ser um aptâmero a taxa de dissociação lenta. Em qualquer das modalidades descritas aqui, pelo menos um aptâmero com taxa de dissociação lenta compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos 10 nucleotídeos com modificações. Em algumas modalidades, as modificações são modificações hidrofóbicas. Em algumas modalidades, as modificações são modificações de bases hidrofóbi- cas. Em algumas modalidades, uma ou mais das modificações podem ser selecionada das modificações mostradas na Figura 11. Em algumas modalidades,cada aptâmero com taxa de dissociação lenta se liga a sua proteína-alvo com uma taxa de dissociação (t/) > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos ou > 240 minutos.

[00035] Em qualquer uma das modalidades descritas neste documento, a amostra pode ser uma amostra de sangue. Em algumas modalidades, a amostra de sangue é selecionada de uma amostra de soro e uma amostra de plasma.

[00036] Em qualquer uma das modalidades descritas neste documento, a amostra na composição pode ser uma amostra de sangue. Em algumas modalidades, a amostra de sangue é selecionada de uma amostra de soro e uma amostra de plasma.

[00037] Em qualquer uma das modalidades da descritos neste documento, um kit ou composição pode compreender pelo menos um aptâmero que é um aptâmero a taxa de dissociação lenta. Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, cada kit ou composição de aptâmero pode ser um aptâmero a taxa de dissociação lenta. Em algumas modalidades, pelo menos um aptâmero com taxa de dissociação lenta compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos 10 nu- cleotídeos com modificações. Em algumas modalidades, pelo menos um nucleotídeo com uma modificação é um nucleotídeo com uma modificação da base hidrofóbica. Em algumas modalidades, cada nucleo- tídeo com uma modificação é um nucleotídeo com uma modificação da base hidrofóbica. Em algumas modalidades, cada modificação da base hidrofóbica é selecionada independentemente da modificação na Figura 11. Em algumas modalidades,cada aptâmero com taxa de dissociação lenta um kit se liga a sua proteína-alvo com uma taxa de dissociação (t/) > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos ou > 240 minutos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00038] A FIG. 1 mostra estabilidade dos caminhos de seleção do classificador de esteatose, conforme descrito no Exemplo 2.

[00039] A FIG. 2 mostra uma curva ROC de um classificador de nove biomarcadores de esteatose, conforme descrito no Exemplo 2.

[00040] A FIG. 3 mostra o voto pela classe para o classificador de floresta aleatória de nove marcadores para esteatose, conforme descrito no Exemplo 2.

[00041] A FIG. 4 mostra as funções de distribuição cumulativa para cada um dos biomarcadores no classificador de nove marcadores para esteatose, conforme descrito no Exemplo 2.

[00042] A FIG. 5 mostra estabilidade dos caminhos de seleção do classificador NASH (fibrose), conforme descrito no Exemplo 2.

[00043] A FIG. 6 mostra uma curva ROC de um classificador de quatro biomarcadores de NASH (fibrose), conforme descrito no Exem-plo 2.

[00044] A FIG. 7 mostra caixa de gráficos para o classificador de quatro marcadores para NASH (fibrose) em cada um dos grupos do sujeito, conforme descrito no Exemplo 2.

[00045] A FIG. 8 mostra as funções de distribuição cumulativa para cada um dos biomarcadores no classificador de quatro marcadores para NASH (fibrose), conforme descrito no Exemplo 2.

[00046] A FIG. 9 ilustra um sistema de computador exemplar não limitante para uso com vários métodos implementadas no computador aqui descritos.

[00047] A FIG. 10 ilustra um ensaio exemplar não limitante de ap- tâmero que pode ser usado para detectar um ou mais biomarcadores numa amostra biológica.

[00048] A FIG. 11 mostra certas modificações de pirimidina exemplares que podem ser incorporadas em aptâmeros, tais como aptâme- ros de dissociação lenta.

[00049] A FIG. 12 mostra caixa de gráficos para o classificador de 8 marcadores para esteatose em cada um dos grupos do sujeito, conforme descrito no Exemplo 5.

[00050] A FIG. 13 mostra caixa de gráficos para o classificador de 8 marcadores para fibrose em cada um dos grupos do sujeito, conforme descrito no Exemplo 5.

[00051] A FIG. 14 mostra as funções de distribuição cumulativa para cada um dos biomarcadores no classificador de quatro marcadores para NASH (fibrose), conforme descrito no Exemplo 5.

[00052] A FIG. 15 mostra uma caixa de gráficos para o classificador de 8 marcadores para esteatose para as amostras cegas depois de ocultação, de acordo com o seu grupo de amostra real, conforme descrito no Exemplo 6.

[00053] A FIG. 16 mostra as curvas ROC para o desempenho do classificador de esteatose de 8 marcadores para o conjunto da descoberta e para o conjunto de validação cega, conforme descrito no Exemplo 6.

[00054] A FIG. 17 mostra uma caixa de gráficos para o classificador de 8 marcadores para fibrose para as amostras cegas depois de ocultação, de acordo com o seu grupo de amostra real, conforme descrito no Exemplo 6.

[00055] A FIG. 18 mostra as curvas ROC para o desempenho do classificador de fibrose de 8 marcadores para o conjunto da descoberta e para dois conjuntos de validação cega, conforme descrito no Exemplo 6.

[00056] A FIG. 19A e B mostram distribuições de sensibilidade e especificidade de 2500 iterações de inicialização de 20% do conjunto de verificação do problema, usando o (A) o classificador de 8 marcadores de esteatose e (B) o classificador de 8 marcadores de fibrose, conforme descrito no Exemplo 6.

[00057] A FIG. 20 mostra uma caixa de gráficos para o classificador de 8 marcadores para esteatose em cada uma das amostras pediátricas de acordo com o seu grupo de amostra real, conforme descrito no Exemplo 7.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00058] Enquanto a invenção será descrita em conjunto com determinadas modalidades representativas, isso será entendido que a invenção é definida pelas reivindicações e não está limitada a essas modalidades.

[00059] Um versado na técnica reconhecerá muitos métodos e materiais similares ou equivalentes aqueles aqui descritos, os quais poderiam ser usados na prática da presente invenção. A presente invenção não é de forma alguma limitada aos métodos e materiais descritos.

[00060] Salvo definição em contrário, os termos técnicos e científi- cos usados neste documento têm o mesmo significado como comu- mente compreendido por um indivíduo versado na técnica à qual pertence esta invenção. Apesar dos métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos neste documento poderem ser usados na invenção, certos métodos, dispositivos e materiais são descritos aqui.

[00061] Todas as publicações, documentos de patentes publicados e pedidos de patente citados aqui estão incorporados neste documento por referência na mesma medida como se cada publicação, documento de patente publicado ou pedido de patente individual fosse indicado especificamente e individualmente para ser incorporado por referência.

[00062] Como usado neste pedido, incluindo as reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" incluem referências no plural, a menos que o conteúdo claramente dite o contrário e podem ser usadas de forma intercambiável com "pelo menos um(a)" e "um(a) ou mais". Assim, a referência a "um aptâmero" inclui misturas de aptâmeros, referência a "uma sonda" inclui misturas de sondas e afins.

[00063] Como usados aqui, os termos "compreende", "compreendendo", "inclui," "incluindo", "contém," "contendo", e quaisquer variações dos mesmos, se destinam a cobrir uma inclusão não exclusiva, tal que um processo, método, produto-por-processo ou composição da matéria que compreende, inclui ou contém um elemento ou a lista de elementos não inclui apenas os elementos não expressamente enunciados.

[00064] O presente pedido inclui biomarcadores, métodos, aparelhos, reagentes, sistemas e kits para determinar se um sujeito tem NAFLD. O presente pedido também inclui biomarcadores, métodos, aparelhos, reagentes, sistemas e kits para determinar se um sujeito tem NASH. Em algumas modalidades, biomarcadores, métodos, aparelhos, reagentes, sistemas e kits são fornecidos para determinar se um sujeito com NAFLD tem NASH.

[00065] Em algumas modalidades, um ou mais biomarcadores são fornecidos para uso sozinho ou em diversas combinações para determinar se um sujeito tem NAFLD. Conforme descrito em detalhes abaixo, modalidades exemplares incluem os biomarcadores fornecidos no ensaio de aptâmero com base nas Tabelas 3, 4, 6, 7, 8 e 9, que foram identificados usando um multiplex. A Tabela 3 lista nove biomarcado- res que são úteis para distintivas amostras provenientes de indivíduos obesos normais de amostras de indivíduos com NAFLD. Tabela 8 lista oito biomarcadores que são úteis para distintivas amostras provenientes de indivíduos obesos normais de amostras de indivíduos com NA- FLD. A Tabela 4 lista quatro biomarcadores que são úteis para distintivas amostras provenientes de indivíduos com esteatose de amostras de indivíduos com estágios de NASH, 2, 3 e 4. Tabela 9 lista oito bio- marcadores que são úteis para distintivas amostras provenientes de indivíduos com esteatose das amostras de indivíduos com estágios 2, 3 e 4 de NASH. Tabelas 6 e 7 listam biomarcadores adicionais que podem ser utilizados em qualquer combinação com o outro e/ou com os biomarcadores das Tabelas 3, 4, 8 e/ou 9. Em algumas modalidades, um subconjunto de biomarcadores das Tabelas 3, 4, 6, 7, 8 e 9 são combinados em um painel que mostram a Tabela 5.

[00066] Em algumas modalidades, um ou mais biomarcadores são fornecidos para uso sozinho ou em diversas combinações para determinar se um sujeito tem esteatose. Em algumas modalidades, o sujeito é obeso. Conforme descrito em detalhes abaixo, modalidades exemplares incluem os biomarcadores fornecidos na Tabela 3 e/ou Tabela 8, que foram identificados usando um multiplex. A Tabela 3 lista quatro biomarcadores que são úteis para distintivas amostras provenientes dos indivíduos obesos das amostras de indivíduos com esteatose. Tabela 8 lista oito biomarcadores que são úteis para distintivas amostras provenientes dos indivíduos obesos das amostras de indivíduos com esteatose. Além disso, um ou mais dos biomarcadores na Tabela 3 e/ou Tabela 8 podem ser usados em combinação com um ou mais bi- omarcadores da Tabela 4 e/ou Tabela 6 e/ou Tabela 7 e/ou Tabela 8 e/ou Tabela 9, com ou sem um ou mais biomarcadores não listados em qualquer uma das Tabelas 3, 4, 6, 7, 8 ou 9 em um método descrito neste documento.

[00067] Em algumas modalidades, um ou mais biomarcadores são fornecidos para uso sozinho ou em diversas combinações para determinar se um sujeito tem NASH e qualquer estágio. Em algumas modalidades, um ou mais biomarcadores são fornecidos para uso sozinho ou em diversas combinações para determinar se um sujeito tem NA- FLD de estágio 2, 3 ou 4. Em algumas modalidades, o sujeito já é conhecido por ter esteatose hepática. Conforme descrito em detalhes abaixo, modalidades exemplares incluem os biomarcadores fornecidos na Tabela 4 e/ou Tabela 9, que foram identificados usando um multiplex. A Tabela 4 lista quatro biomarcadores que são úteis para distintivas amostras provenientes de indivíduos com esteatose de amostras de indivíduos com NASH. Tabela 9 lista oito biomarcadores que são úteis para distintivas amostras provenientes de indivíduos com estea- tose das amostras de indivíduos com NASH. Além disso, um ou mais dos biomarcadores na Tabela 4 e/ou Tabela 9 podem ser usados em combinação com um ou mais biomarcadores da Tabela 3 e/ou Tabela 6 e/ou Tabela 7 e/ou Tabela 8, com ou sem um ou mais biomarcado- res não listados em qualquer uma das Tabelas 3, 4, 6, 7, 8 ou 9 em um método descrito neste documento.

[00068] Em algumas modalidades, o número e a identidade de bio- marcadores em um painel são selecionados com base na sensibilida- de e especificidade para a combinação particular dos valores do bio- marcador. Os termos "sensibilidade" e a "especificidade" são usados aqui no que diz respeito a capacidade de classificar corretamente um indivíduo, com base em um ou mais níveis do biomarcador detectado em uma amostra biológica, como tendo a doença ou não tendo a doença. Em algumas modalidades, os termos "sensibilidade" e a "especificidade" podem ser utilizados neste documento no que diz respeito a capacidade de classificar corretamente um indivíduo, com base em um ou mais níveis do biomarcador detectados em uma amostra biológica, como tendo esteatose ou não tendo esteatose. Em tais modalidades, "sensibilidade" indica o desempenho do biomarcador(es) em relação a classificar corretamente os indivíduos com esteatose. "Especificidade" indica o desempenho do biomarcador(es) em relação a classificar corretamente os indivíduos que não têm esteatose. Por exemplo, sensibilidade de 90% e especificidade de 85% para um painel de biomarcado- res usado para testar um conjunto das amostras de controle (tais como amostras de indivíduos saudáveis ou sujeitos conhecidos por não terem esteatose) e amostras de teste (tais como amostras de indivíduos com esteatose) indica que 85% das amostras de controle foram corretamente classificadas como amostras de controle pelo painel, e 90% das amostras de teste foram corretamente classificadas como amostras de teste pelo painel.

[00069] Em algumas modalidades, os termos "sensibilidade" e a "especificidade" podem ser utilizados neste documento no que diz respeito a capacidade de classificar corretamente um indivíduo, com base em um ou mais níveis do biomarcador detectados em uma amostra biológica, como tendo NASH (ou estágio 2, 3 ou 4 de NASH) ou tendo esteatose. "Sensibilidade" indica o desempenho do biomarcador(es) em relação a classificar corretamente os indivíduos com NASH (ou estágio 2, 3 ou 4 NASH). "Especificidade" indica o desempenho do bio- marcador(es) em relação a classificar corretamente os indivíduos que não têm NASH ( ou não tem estágio 2, 3 ou 4 de NASH). Por exemplo, sensibilidade de 90% e especificidade de 85% para um painel de bio- marcadores usado para testar um conjunto das amostras de controle (tais como amostras de indivíduos com esteatose) e amostras dos testes (tais como amostras dos indivíduos com NASH, ou estágio 2, 3 ou 4 de NASH) indicam que 85% das amostras de controle foram corretamente classificadas como amostras de controle pelo painel, e 90% das amostras de teste foram corretamente classificadas como amostras de teste pelo painel.

[00070] Em algumas modalidades, o desempenho geral de um painel de um ou mais biomarcadores é representado pelo o valor da área- sob-a-curva (AUC). O valor AUC é derivado do receptor de operação da curva característica (ROC), que são exemplificados neste documento. A curva ROC é o plot da verdadeira taxa positiva (sensibilidade) de um teste contra a taxa de falsos positivos (1-especificidade) do teste. O termo "área sob a curva" ou "AUC" refere-se à área sob a curva de um receptor da curva característica (ROC), ambos os quais são conhecidos na técnica de funcionamento. As medidas AUC são úteis para comparar a precisão de um classificador em toda a gama de dados completa. Classificadores com um maior AUC têm uma maior ca-pacidade de classificar incógnitas corretamente entre dois grupos de interesse (por exemplo, indivíduos normais e indivíduos com NAFLD ou indivíduos com esteatose e indivíduos com NASH). Curvas ROC são úteis para plotagem do desempenho de uma característica particular (por exemplo, qualquer um dos biomarcadores aqui descritos e/ou qualquer item de informação biomédica adicional) na distinção entre as duas populações. Normalmente, os dados de recurso através de toda a população são classificados em ordem crescente com base no valor de um único recurso. Então, para cada valor para esse recurso, as verdadeiras taxas positivas e falsas positivas para os dados são calculadas. A verdadeira taxa positiva é determinada pela contagem do número de casos acima do valor para esse recurso e dividindo pelo número total de casos. A taxa de falsas positivas é determinada pela contagem do número de controles acima do valor para esse recurso e dividindo pelo número total de controles. Embora esta definição se refere a cenários em que um recurso é elevado em casos comparados aos controles, esta definição também se aplica aos cenários em que um recurso é menor nos casos em comparação com os controles (em tal cenário, exemplos abaixo do valor para esse recurso poderia ser contado). Curvas ROC podem ser geradas por uma única característica assim como outras saídas únicas, por exemplo, uma combinação de dois ou mais recursos podem ser combinados matematicamente (por exemplo, adicionado, subtraído, multiplicado, etc.) para fornecer um único valor de soma e esse valor de soma simples pode ser plota- do em uma curva ROC. Além disso, qualquer combinação das características múltiplas, em que a combinação deriva de um valor de saída único, pode ser plotada em uma curva ROC.

[00071] Em algumas modalidades, um método compreende detectar o nível de pelo menos um biomarcador listado na Tabela 3, 4, 6, 7, 8 e/ou 9 em uma amostra de um sujeito para determinar se um sujeito tem NAFLD. Em algumas dessas modalidades, o método compreende entrar em contato com a amostra, ou uma parte da amostra do sujeito com a captura de pelo menos um reagente, em que cada reagente de captura especificamente liga um biomarcador cujos níveis estão sendo detectados. Em algumas modalidades, o método compreende entrar em contato com a amostra, ou proteínas da amostra, pelo menos um aptâmero, no qual cada aptâmero especificamente liga um biomarca- dor cujos níveis estão sendo detectados.

[00072] Em algumas modalidades, um método compreende a de- tecção do nível de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez ou onze bio- marcadores selecionados a partir de ACY SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1, SERPINC1, SIGLEC7 e SIGLEC14 em uma amostra de um sujeito, em que um nível de pelo menos um biomarca- dor selecionado a partir de ACY, CTSZ, LGALS3BP, SIGLEC7, SI- GLEC14, e PLAT que seja maior do que um nível de controle do respectivo biomarcador, e/ou um nível de, pelo menos, um biomarcador selecionado a partir de SHBG, MET, GSN, CHL1 e SERPINC1 que seja inferior a um nível de controle do respectivo biomarcador, indica que o sujeito tem NAFLD. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete ou oito biomarcadores selecionados a partir de ACY SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1, SERPINC1, em uma amostra do sujeito, em que um nível de pelo menos um biomar- cador selecionado a partir de ACY, CTSZ e LGALS3BP que seja maior do que um nível de controle do respectivo biomarcador, e/ou um nível de, pelo menos, um biomarcador selecionado a partir de SHBG, MET, GSN, CHL1 e SERPINC1 que seja inferior a um nível de controle do respectivo biomarcador, indica que o sujeito tem NAFLD. Em algumas modalidades, o sujeito é um sujeito obeso. Em algumas modalidades, o método compreende determinar se o sujeito tem esteatose e/ou determinar se a esteatose é leve, moderada ou grave. Em algumas modalidades, e o método compreende detectar o nível de pelo menos um pelo menos dois ou pelo menos três biomarcadores selecionados a partir de ACY, SHBG e SIGLEC14. Em algumas modalidades, o método compreende determinar se um sujeito tem NASH tal como o estágio 1, 2, 3 ou 4 de NASH. Em algumas modalidades, o método compreen- de a detecção dos níveis de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou sete biomarcadores selecionados a partir de ACY, SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP e SIGLEC7. Em algumas modalidades, um método compreende determinar se um sujeito tem NAFLD, que pode ser este- atose ou NASH. Em algumas modalidades, um método que compreende a detecção dos níveis de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito ou nove biomarcadores selecionados a partir de ACY, SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1 e SERPINC1.

[00073] Em algumas modalidades, um método compreende determinar os níveis de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou pelo menos dez biomarca- dores selecionados a partir dos biomarcadores na Tabela 7. Em algumas modalidades, um nível de um biomarcador na Tabela 7 exceto SHBG e GSN que é superior um nível de controle do respectivo bio- marcador e/ou os níveis de pelo menos um biomarcador selecionado de SHBG e GSN que é inferior ao nível do controle do biomarcador respectivo, indica que o sujeito tem NAFLD.

[00074] Os biomarcadores identificados neste documento fornecem um número de escolhas para subconjuntos ou painéis de biomarcado- res que podem ser usados para identificar efetivamente NAFLD. Seleção do número apropriado de tais biomarcadores pode depender de uma combinação específica de biomarcadores escolhidos. Além disso, em qualquer um dos métodos descritos neste documento, exceto onde explicitamente indicado, um painel de biomarcadores pode incluir bio- marcadores adicionais não mostrados na Tabela 3, 4, 6, 7, 8 ou 9.

[00075] Em algumas modalidades, um método de compreender a detecção do nível de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou dez biomarcadores selecionados a partir de C7, PPID, IGFBP3, SIGLEC14, AIMP1, TOP1, COLEC11, CA6, STX1A, GPC5, HIPK3, IGFBP7, e IL3RA em uma amostra do sujeito, em que um nível de pelo menos um biomarcador selecionado a partir de C7, COLEC11, HIPK3, IGFBP7, IL3RA e SI- GLEC14 que seja maior do que um nível de controle do respectivo bi- omarcador, e/ou um nível de, pelo menos, um biomarcador selecionado a partir de IGFBP3, AIMP1, TOP1, CA6, PPID, GPC3, IGFBP3 e STX1A que seja inferior a um nível de controle do respectivo biomar- cador, indica que o sujeito tem NASH. Em algumas modalidades, um método compreende a detecção do nível de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito ou nove biomarcadores selecionados a partir de C7,PPID, IGFBP3, SIGLEC14, AIMP1, TOP1, COLEC11, CA6,e STX1A em uma amostra do sujeito, em que um nível de pelo menos um biomarcador selecionado a partir de C7, CO- LEC11 e SIGLEC14 que seja maior do que um nível de controle do respectivo biomarcador, e/ou um nível de, pelo menos, um biomarca- dor selecionado a partir de IGFBP3, AIMP1, TOP1, CA6, PPID e STX1A que seja inferior a um nível de controle do respectivo biomar- cador, indica que o sujeito tem NASH. Em algumas modalidades, um método de compreender a detecção do nível de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove ou dez biomarcadores selecionados a partir de C7, PPID, IGFBP3, COLEC11, GPC5, HIPK3, IGFBP7, e IL3RAem uma amostra do sujeito, em que um nível de pelo menos um biomarcador selecionado a partir de C7, COLEC11, HIPK3, IGFBP7, e IL3RA que seja maior do que um nível de controle do respectivo biomarcador indica um sujeito com NASH, e/ou um nível de, pelo menos, um biomarcador selecionado a partir de IGFBP3, PPID, e GPC3 que seja inferior a um nível de controle do respectivo biomarcador, indica que o sujeito tem NASH. Em algumas modalidades, o sujeito é obeso. Em algumas modalidades, o sujeito já foi determinado a ter esteatose, que pode ser esteato- se leve, moderada ou grave. Em algumas modalidades, o NASH é estágio 1, 2, 3 ou 4 NASH. Em algumas modalidades, o NASH é estágio 2, 3 ou 4 NASH. Em algumas modalidades, o método compreende detectar os níveis de pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três ou quatro biomarcadores selecionados a partir de C7, COLEC11, PPID e IGFBP3.

[00076] Em algumas modalidades, um método compreende detectar o nível de pelo menos um biomarcador listado na Tabela 3, 4, 6, 7, 8 e/ou 9 em uma amostra de um sujeito para determinar se um sujeito tem NASH, ou o estágio 2, 3 ou 4 de NASH. Em algumas dessas modalidades, o método compreende entrar em contato com a amostra, ou uma parte da amostra do sujeito com a captura de pelo menos um reagente, em que cada reagente de captura especificamente liga um bi- omarcador cujos níveis estão sendo detectados. Em algumas modalidades, o método compreende entrar em contato com a amostra, ou proteínas da amostra, pelo menos um aptâmero, no qual cada aptâme- ro especificamente liga um biomarcador cujos níveis estão sendo de-tectados.

[00077] Os biomarcadores identificados neste documento fornecem um número de escolhas para subconjuntos ou painéis de biomarcado- res que podem ser usados para identificar efetivamente NASH, ou estágio 2, 3 ou 4 de NASH. Seleção do número apropriado de tais bio- marcadores pode depender de uma combinação específica de biomar- cadores escolhidos. Além disso, em qualquer um dos métodos descri- tos neste documento, exceto onde explicitamente indicado, um painel de biomarcadores pode incluir biomarcadores adicionais não mostrados na Tabela 3, 4, 6, 7, 8 ou 9.

[00078] Como usado aqui, "doença hepática gordurosa não alcoólica" ou "NAFLD" refere-se a uma condição em que a gordura é depositada no fígado (esteatose hepática), com ou sem inflamação e fibrose, na ausência de uso excessivo de álcool.

[00079] Como usado aqui, "esteatose" e "esteatose hepática não alcoólica" são usados permutavelmente e incluem a esteatose leve, moderada e severa, sem inflamação ou fibrose, na ausência de uso excessivo de álcool. A Tabela 1 mostra a classificação exemplar de esteatose hepática leve, moderada e severa.

[00080] Como usado aqui, "esteatose hepática não alcoólica" ou "NASH" refere-se a NAFLD em que há inflamação e/ou fibrose no fígado. NASH pode ser dividida em quatro estágios. Métodos exemplares para determinar o estágio de NASH são descritos, por exemplo, em Kleiner et al., 2005, Hepatology,41(6):1313-1321, and Brunt et al., 2007, Modern Pathol., 20: S40-S48. A Tabela 1 mostra a classificação exemplar do estágio 1, 2, 3 e 4 de NASH.

[00081] Como usado aqui, "obeso", com referência a um sujeito se refere a um sujeito com um BMI de 30 ou maior.

[00082] "Amostra biológica", "amostra" e "amostra do teste" são usados permutavelmente aqui para se referir a qualquer material, fluidos biológicos, tecidos ou células obtidas ou outra forma derivada de um indivíduo. Isto inclui sangue (incluindo sangue total, leucócitos, células mononucleares de sangue periférico, creme leucocitário, plasma e soro), escarro, lágrimas, muco, lavagens nasais, aspiração nasal, urina, saliva, lavagem peritoneal, ascite, fluido cístico, fluido glandular, fluido linfático, aspirado brônquico, líquido sinovial, aspirado conjunto, secreções de órgão, células, um extrato celular e líquido cefalorraqui- diano. Isto também inclui frações experimentalmente separadas de todos os anteriores. Por exemplo, uma amostra de sangue pode ser fracionada no soro, plasma, ou em frações que contêm tipos específicos das células do sangue, como glóbulos vermelhos ou glóbulos brancos (leucócitos). Em algumas modalidades, uma amostra pode ser uma combinação das amostras de um indivíduo, tais como uma combinação de um tecido e uma amostra de fluido. O termo "amostra biológica" também inclui materiais contendo material sólido homogeneizado, tal como de uma amostra das fezes, uma amostra de tecido ou uma biópsia do tecido, por exemplo. O termo "amostra biológica" também inclui materiais derivados de uma cultura do tecido ou de uma cultura das células. Todos os métodos adequados para a obtenção de uma amostra biológica podem ser empregados; métodos exemplares incluem, por exemplo, flebotomia, cotonete (por exemplo, zaragatoa bucal) e um procedimento de biópsia de aspiração de agulha fina. Tecidos exemplares sensíveis a aspiração com agulha fina incluem linfo- nodo, pulmão, tireóide, mama, pâncreas e fígado. As amostras podem também ser recolhidas, por exemplo, por microdissecação (por exemplo, microdissecação de captura a laser (LCM) ou microdissecação a laser (LMD)), lavagem da bexiga, esfregaço (por exemplo, um teste de Papanicolaou) ou lavagem ductal. Uma "amostra biológica" obtida ou derivada de um indivíduo inclui qualquer tal amostra que foi processada de forma adequada após ser obtida a partir do indivíduo.

[00083] Além disso, em algumas modalidades, uma amostra biológica pode ser derivada tomando amostras biológicas de um número de indivíduos e reunindo-os, ou agrupando numa alíquota de cada indivíduo da amostra biológica. As amostras podem ser tratadas conforme descritas neste documento para obter um exemplo de um único indivíduo, e, por exemplo, se um mau prognóstico é estabelecido às amostras, então cada amostra biológica individual pode ser re-testada para determinar qual indivíduo(s) tem esteatose e/ou NASH.

[00084] "Alvo", "molécula alvo" e "analito" são usados permutavel- mente neste documento para se referir a qualquer molécula de interesse que possam estar presente em uma amostra biológica. Uma "molécula de interesse" inclui qualquer alteração menor de uma determinada molécula, tais como, no caso de uma proteína, por exemplo, pequenas variações na sequência de aminoácidos, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tais como conjugação com uma componente de marcação, que não altera substancialmente a identidade da molécula. Uma "molécula alvo", "alvo" ou "analito" se refere ao conjunto de cópias de um tipo ou espécie das moléculas ou estrutura multimolecular. "Moléculas-alvo", "alvos" e "analitos" referem- se a mais de um tipo ou espécie de molécula ou estrutura multimolecu- lar. Moléculas-alvo exemplares incluem proteínas, polipeptídeos, ácidos nucleicos, carboidratos, lipídeos, polissacarídeos, glicoproteínas, hormônios, receptores, antígenos, anticorpos, affibodies, anticorpos miméticos, vírus, patógenos, substâncias tóxicas, substratos, metaboli- tos, análogos do estado de transição, cofatores, inibidores, drogas, corantes, nutrientes, fatores de crescimento, células, tecidos e qualquer fragmento ou parte de qualquer um dos anteriores. Em algumas modalidades, uma molécula alvo é uma proteína, em que caso a molécula-alvo pode ser referida como uma proteína "alvo".

[00085] Como usado aqui, um "agente de captura" ou "reagente de captura" se refere a uma molécula capaz de ligar especificamente um biomarcador. Um "reagente da captura da proteína alvo" se refere a uma molécula capaz de ligar especificamente a uma proteína alvo. Reagentes de captura exemplares não limitantes incluem aptâmeros, anticorpos, adnectinas, anquirinas, outro anticorpo mimético e outros andaimes de proteína, autoanticorpos, quimeras, pequenas moléculas, ácidos nucleicos, lectinas, receptores de ligação de ligante, polímeros impressos, avimeros, peptidomiméticos, receptores hormonais, receptores de citocinas, receptores sintéticos e modificações e fragmentos de qualquer um dos reagentes de captura acima mencionados. Em algumas modalidades, um reagente da captura é selecionado de uma aptâmero e um anticorpo.

[00086] O termo "anticorpo" se refere a anticorpos completos de qualquer espécie e fragmentos e derivados de tais anticorpos, incluindo fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, anticorpos de cadeia única, fragmentos de Fv e fragmentos de Fv de cadeia única. O termo "anticorpo" se refere também aos anticorpos derivados sinteticamente, tais como anticorpos derivados de exibição em fagos e fragmentos, affibo- dies, nanobodies, etc.

[00087] Como usado aqui, "marcador" e "biomarcador" são usados indistintamente para se referir a uma molécula-alvo que indica ou é um sinal de um processo normal ou anormal em um indivíduo ou de uma doença ou outra condição em um indivíduo. Mais especificamente, um "marcador" ou "biomarcador" é um parâmetro anatômico, fisiológico, bioquímico ou molecular, associado com a presença de um estado fisiológico específico ou processo, se normal ou anormal e, se anormal, agudo ou crônico. Biomarcadores são detectáveis e mensuráveis por uma variedade de métodos, incluindo ensaios de laboratório e de imagens médicas. Em algumas modalidades, um biomarcador é uma proteína alvo.

[00088] Como usado aqui, "nível do biomarcador" e "nível" referem- se a uma medida que é feita usando qualquer método analítico para detectar o biomarcador em uma amostra biológica e que indica a presença, ausência, quantidade absoluta ou concentração, quantidade relativa ou concentração, sendo o título, um nível, um nível de expressão, uma relação de níveis medidos ou semelhantes, de, para, ou cor- respondente para o biomarcador na amostra biológica. A natureza exata do "nível" varia de acordo com o projeto específico e componentes de determinado método analítico utilizado para detectar o biomar- cador.

[00089] Um "nível de controle" de uma molécula-alvo se refere ao nível da molécula alvo no mesmo tipo de amostra de um indivíduo que não tem a doença ou condição, ou de um indivíduo que não é suspeito de ter a doença ou condição. Um "nível de controle" de uma molécula alvo não precisa ser determinado cada vez que os métodos presentes são realizados e pode ser um nível previamente determinado que é usado como uma referência ou limite para determinar se o nível em uma determinada amostra é superior ou inferior um nível normal. Em algumas modalidades, um nível de controle em um método aqui descrito é o nível que tem sido observado em um ou mais indivíduos sem NAFLD. Em algumas modalidades, um nível de controle em um método aqui descrito é o nível que tem sido observado em um ou mais indi-víduos com NAFLD, mas não de NASH. Em algumas modalidades, um nível de controle em um método aqui descrito é a média ou nível médio, opcionalmente, mais ou menos uma variação estatística, que tem sido observada em uma pluralidade de indivíduos normais, ou indivíduos com NAFLD, mas não de NASH.

[00090] Como usado aqui, "indivíduo" e "sujeito" é usado indistintamente para se referir a um sujeito ou paciente de teste. O indivíduo pode ser um mamífero ou um não mamífero. Em várias modalidades, o indivíduo é um mamífero. Um indivíduo mamífero pode ser um humano ou não humano. Em várias modalidades, o indivíduo é um humano. Um indivíduo saudável ou normal é um indivíduo em que a doença ou condição de interesse (como NASH) não é detectável pelos métodos convencionais de diagnósticos.

[00091] "Diagnosticar", "diagnosticando", "diagnóstico" e suas vari- ações referem a detecção, determinação ou reconhecimento de um estado de saúde ou condição de um indivíduo com base em um ou mais sinais, sintomas, dados ou outras informações referentes a este indivíduo. O estado de saúde de um indivíduo pode ser diagnosticado como saudável/normal (ou seja, um diagnóstico da ausência de uma doença ou condição) ou diagnosticado como doente/anormal (ou seja, um diagnóstico de presença, ou uma avaliação das características, de uma doença ou condição). Os termos "diagnosticar," "diagnosticando", "diagnóstico", etc, abrangem, no que diz respeito uma determinada doença ou condição, a detecção inicial da doença; a caracterização ou classificação da doença; a detecção da progressão, remissão ou recorrência da doença; e a detecção de resposta da doença após a ad-ministração de um tratamento ou terapia para o indivíduo. O diagnóstico de NAFLD inclui distinguir os indivíduos que têm NAFLD dos indivíduos que não o fazem. O diagnóstico de NASH inclui indivíduos distintivos que têm NASH, dos indivíduos que têm esteatose no fígado, mas não de NASH e de indivíduos com doença do fígado.

[00092] "Prognosticar", "prognosticando", "prognóstico" e suas variações referem-se à previsão de um curso futuro de uma doença ou condição de um indivíduo que tem a doença ou condição (por exemplo, prever a sobrevivência do paciente), e tais termos abrangem a avaliação da resposta da doença após a administração de um tratamento ou terapia para o indivíduo.

[00093] "Avaliar", "avaliando", "avaliação" e variações respectivas abrangem "diagnosticar" e "prognosticar" e também englobam as determinações ou previsões sobre o curso futuro de uma doença ou condição de um indivíduo que não tem a doença, bem como as determinações ou previsões referentes à probabilidade de que uma doença ou condição certamente se repetirá em um indivíduo que aparentemente foi curado da doença. O termo "avaliar" engloba também avaliação da resposta do indivíduo para uma terapia, tais como, por exemplo, prevendo um indivíduo é susceptível de responder favoravelmente a um agente terapêutico ou é improvável para responder a um agente terapêutico (ou experimentará tóxico ou outros efeitos colaterais indesejáveis, por exemplo), selecionando um agente terapêutico para a administração de um indivíduo, ou monitorando ou determinando a resposta do indivíduo para uma terapia que tem sido administrada ao indivíduo. Assim, "avaliando" NAFLD pode incluir, por exemplo, qualquer um dos seguintes: prognosticando o curso futuro da NAFLD em um indivíduo; prevendo se a NAFLD progredirá para NASH; prevendo se um estágio particular de NASH progredirá para um estágio mais elevada de NASH; etc.

[00094] Como usado aqui, "detectando" ou "determinando" em relação a um nível do biomarcador inclui o uso de ambos os instrumentos utilizados para observar e registrar um sinal correspondente a um nível do biomarcador e o material/s necessários para gerar o sinal. Em várias modalidades, o nível é detectado usando qualquer método adequado, incluindo a fluorescência, quimioluminescência, ressonância de plasmon de superfície, ondas acústicas de superfície, espectrometria de massa, espectroscopia de infravermelho, Espectroscopia Raman, microscopia de força atômica, microscopia de tunelamento com varredura, métodos de detecção de eletroquímica, ressonância magnética nuclear, pontos quânticos e afins.

[00095] Como usado aqui, um "sujeito com NAFLD" refere-se a um sujeito que tem sido diagnosticado com NAFLD. Em algumas modalidades, NAFLD é suspeito durante uma consulta de rotina, monitoramento de obesidade e síndrome metabólica, ou monitoramento de possíveis efeitos colaterais da droga (por exemplo, agentes ou este- roides para reduzir o colesterol). Em algumas enzimas de instância hepática como AST e ALT estão elevadas. Em algumas modalidades, um sujeito é diagnosticado após imagiologia abdominal ou torácica, fígado ultrassom ou ressonância magnética. Em algumas modalidades, outras condições tais como o consumo excessivo de álcool, hepatite C e a doença de Wilson foram descartadas antes de um diagnóstico NAFLD. Em algumas modalidades, um sujeito foi diagnosticado após uma biópsia do fígado.

[00096] Como usado aqui, um "sujeito com esteatose hepática" e um "sujeito com esteatose hepática não alcoólica" são usados permu- tavelmente e se referem a um sujeito que tem sido diagnosticado com esteatose. Em algumas modalidades, a esteatose é diagnosticada por um método descrito acima para NAFLD em geral.

[00097] Como usado aqui, um "sujeito com NASH" refere-se a um sujeito que tem sido diagnosticado com NASH. Em algumas modalidades, NASH é diagnosticado por um método descrito acima para NA- FLD em geral. Em algumas modalidades, fibrose avançada é diagnosticada em um paciente com NAFLD, por exemplo, de acordo com Gambino R, et.al. Annals of Medicine 2011;43(8):617-49.

[00098] Como usado aqui, um "sujeito em risco de desenvolver NA- FLD" refere-se a um sujeito com uma ou mais comorbidades NAFLD, tais como obesidade, obesidade abdominal, síndrome metabólica, doenças cardiovasculares e diabetes.

[00099] Como usado aqui, um "sujeito em risco de desenvolver a esteatose" refere-se a um sujeito que não tenha sido diagnosticado como tendo a esteatose hepática, mas quem tem uma ou mais comor- bidades de NAFLD, tais como obesidade, obesidade abdominal, sín- drome metabólica, doenças cardiovasculares e diabetes.

[000100] Como usado aqui, um "sujeito em risco de desenvolver NASH" refere-se a um sujeito com esteatose que continua a ter uma ou mais comorbidades NAFLD, tais como obesidade, obesidade abdominal, síndrome metabólica, doenças cardiovasculares e diabetes.

[000101] "Suporte sólido" refere-se aqui qualquer substrato tendo uma superfície para que as moléculas possam ser ligadas, diretamente ou indiretamente, através de um covalente ou não covalentes. Um "suporte" pode ter uma variedade de formatos físicos, o que inclui, por exemplo, uma membrana; um chip (por exemplo, um chip de proteína); um slide (por exemplo, uma lâmina de vidro ou lamela); uma coluna; uma cavidade, sólidos, semi-sólidos, poro- ou cavidade- contendo partículas, tais como, por exemplo, um grânulo; um gel; uma fibra, incluindo um material de fibra óptica; uma matriz; e um recipiente de amostra. Os recipientes de amostra exemplares incluem poços de amostra, tubos, capilares, frascos e qualquer outro recipiente, sulco ou recuo capaz de segurar uma amostra. Um recipiente de amostra pode estar contido em uma plataforma da multi-amostra, como uma placa de mi- crotitulação, slide, dispositivo microfluídico e afins. Um suporte pode ser composto de um material natural ou sintético, um material orgânico ou inorgânico. A composição do sólido de apoio na qual captura os reagentes estão conectados geralmente depende do método de fixação (por exemplo, ligação covalente). Outros recipientes exemplares incluem microgotículas e microfluídico controlados ou emulsões de óleo/aquosa em massa dentro do qual podem ocorrer ensaios e manipulações relacionadas. Suporte sólido apropriado inclui, por exemplo, plásticos, resinas, polissacarídeos, sílica ou materiais à base de sílica, vidro funcionalizado, modificado de silício, carbono, metais, vidros inorgânicos, membranas, nylon, fibras naturais (como, por exemplo, seda, lã e algodão), polímeros e similares. A composição do material do sólido de apoio pode incluir grupos reativos, tais como, por exemplo, carboxi, amino, ou grupos hidroxil, que são utilizados para fixação dos reagentes de captura. Suporte sólido polimérico pode incluir, por exemplo, poliestireno, polietileno glicol tetraftalato, acetato de polivini- lo, cloreto de polivinil, polivinil pirrolidona, poliacrilonitrila, polimetacrila- to de metil, politetrafluoretileno, borracha butílica, borracha de estire- no-butadieno, borracha natural, polietileno, polipropileno, (po- li)tetrafluoroetileno, (poli)vinilidenefluoreto, policarbonato e polimetil- penteno. Partículas de apoio de sólidos adequados que podem ser usadas incluem, por exemplo, partículas codificadas, tais como partículas codificadas tipo Luminex®, partículas magnéticas e partículas de vidro.

Usos de Biomarcadores Exemplares

[000102] Em várias modalidades exemplares, métodos são fornecidos para determinar se um sujeito tem NAFLD. Em várias modalidades, métodos são fornecidos para determinar se um sujeito tem estea- tose, que pode ser esteatose leve, moderada ou grave. Em várias modalidades, métodos são fornecidos para determinar se um sujeito tem NASH, que pode ser o estágio 1, 2, 3 ou 4 de NASH, ou que pode ser o estágio 2, 3 ou 4 de NASH. Em algumas modalidades, métodos fornecidos para determinar se um sujeito com esteatose tem NASH, que pode ser o estágio 1, 2, 3 ou 4 de NASH, ou que pode ser o estágio 2, 3 ou de 4 NASH. Os métodos compreendem a detecção de um ou mais níveis do biomarcador, correspondente a um ou mais biomarca- dores que estão presentes na circulação de um indivíduo, tais como no soro ou plasma, por qualquer número de métodos analíticos, incluindo qualquer um dos métodos analíticos descritos neste documento. Estes biomarcadores são, por exemplo, presente em diferentes níveis nos indivíduos com NAFLD em comparação com indivíduos normais (onde os indivíduos normais podem ser indivíduos obesos). Em algumas modalidades, os biomarcadores estão presentes nos diferentes níveis em indivíduos com NASH (tais como o estágio 1, 2, 3 ou 4 de NASH, ou estágio 2, 3 ou 4 de NASH) em comparação com indivíduos normais (onde os indivíduos normais podem ser indivíduos obesos). Em algumas modalidades, os biomarcadores estão presentes nos diferen- tes níveis em indivíduos com NASH (tais como o estágio 1, 2, 3 ou 4 de NASH, ou estágio 2, 3 ou 4 de NASH) em comparação com indivíduos com esteatose, que pode ser esteatose leve, moderada ou grave,

[000103] A detecção dos níveis diferenciais do biomarcador em um indivíduo pode ser usado, por exemplo, para permitir a determinação de, se, um indivíduo tem NAFLD (que pode ser esteatose ou NASH), ou se um indivíduo com esteatose desenvolveu NASH. Em algumas modalidades, qualquer um dos biomarcadores descritos neste documento pode ser usado para monitorar indivíduos (tais como pessoas obesas) para desenvolvimento de NAFLD, ou monitorar indivíduos com esteatose para desenvolvimento de NASH.

[000104] Como um exemplo da forma em que qualquer um dos bio- marcadores descritos neste documento pode ser usado para determinar se um sujeito tem NAFLD, níveis de um ou mais dos biomarcado- res descritos em um indivíduo que não tem sido diagnosticado com NAFLD, mas tem uma ou mais comorbidades NAFLD, pode indicar que o indivíduo desenvolveu NAFLD em um estágio anterior da que seria determinada pelo uso de um teste invasivo, tal como a biópsia do fígado. Porque os presentes métodos são não invasivos, eles podem ser usados para monitorar os indivíduos em risco de desenvolver NA- FLD (como, por exemplo, pessoas obesas). Detectando NAFLD em um estágio anterior, a intervenção médica pode ser mais eficaz. Tal intervenção médica pode incluir, mas não está limitada a, perda de peso, controle de açúcar no sangue e evitar álcool. Em algumas modalidades, agentes terapêuticos podem ser usados, tais como a pioglita- zona, vitamina E, e/ou metformina. Ver, por exemplo., Sanyal et al., 2010, NEJM, 362: 1675-1685. Em alguns casos, tal intervenção precoce pode atrasar ou impedir a falha do fígado e a necessidade de um transplante de fígado.

[000105] Da mesma forma, como mais um exemplo da forma em que os biomarcadores aqui descritos podem ser usados para determinar se um sujeito que tem esteatose está desenvolvendo NASH, níveis de um ou mais dos biomarcadores descritos em um indivíduo com esteatose podem indicar que o indivíduo está desenvolvendo NASH. Porque os presentes métodos são não invasivos, indivíduos com esteatose podem ser monitorados para desenvolvimento de NASH. Detectando NASH num estágio anterior, a intervenção médica pode ser mais eficaz. Tal intervenção médica pode incluir, mas não está limitada a, perda de peso, controle de açúcar no sangue e evitar álcool. Em algumas modalidades, agentes terapêuticos podem ser usados, tais como a pi- oglitazona, vitamina E, e/ou metformina. Ver, por exemplo., Sanyal et al., 2010, NEJM, 362: 1675-1685. Em alguns casos, tal intervenção precoce pode atrasar ou impedir a falha do fígado e a necessidade de um transplante de fígado.

[000106] Além disso, em algumas modalidades, um nível de expressão diferencial de um ou mais dos biomarcadores em um indivíduo ao longo do tempo pode ser indicativo de resposta do indivíduo a um determinado regime terapêutico. Em algumas modalidades, mudanças na expressão de um ou mais dos biomarcadores durante o acompanhamento do monitoramento podem indicar que uma determinada terapia é eficaz ou pode sugerir que o regime terapêutico deve ser alterado de alguma forma, tal como controle mais agressivo de açúcar no sangue, mais agressivamente buscando a perda de peso, etc. Em algumas modalidades, um nível de expressão constante de um ou mais dos biomarcadores em um indivíduo ao longo do tempo pode ser indi-cativo de que a esteatose do indivíduo não está piorando, ou não está se desenvolvendo no NASH.

[000107] Além de testar os níveis do biomarcador como um teste independente de diagnóstico, níveis do biomarcador também podem ser feitos em conjunto com a determinação de polimorfismos de nucleotí- deo único (SNPs) ou outras lesões genéticas ou variabilidade que são indicativos de um risco aumentado de susceptibilidade de doença. (Veja, por exemplo, Amos et al., Nature Genetics 40, 616-622 (2009)).

[000108] Além de testar os níveis do biomarcador como um teste independente de diagnóstico, níveis do biomarcador também podem ser feitos em conjunto com outro método de triagem NAFLD, tais como a detecção de um aumentado do fígado, exames de sangue (por exemplo, para detectar elevações em certas enzimas hepáticas, tais como o ALT e/ou AST), ecografia abdominal e biópsia do fígado. Em alguns casos, métodos usando os biomarcadores descritos neste documento podem facilitar a justificação médica e econômica para a implementação de tratamentos mais agressivos para NAFLD ou NASH, mais frequente varredura de acompanhamento, etc. Os biomarcadores tam-bém podem ser usados para iniciar o tratamento nos indivíduos em risco de desenvolver o NAFLD, mas que não tenha sido diagnosticado com esteatose, se o teste de diagnóstico indica que eles são propensos a desenvolver a doença.

[000109] Além de testar os níveis do biomarcador em conjunto com outros métodos de diagnóstico de NAFLD, informações sobre os bio- marcadores também podem ser avaliadas em conjunto com outros tipos de dados, dados nomeadamente que indicam um risco para NA- FLD. Vários desses dados podem ser avaliados por métodos automatizados, tais como um programa/software de computador, que pode ser incorporado em um computador ou outro dispositivo/aparelho.

Detecção e Determinação dos Biomarcadores e Níveis do Biomarca- dor

[000110] Um nível do biomarcador para os biomarcadores aqui descritos pode ser detectado usando qualquer uma variedade dos métodos analíticos conhecidos. Em uma modalidade, um nível do biomar- cador é detectado usando um reagente da captação. Em várias moda- lidades, o reagente de captura pode ser exposto para o biomarcador em solução ou pode ser exposto para o biomarcador enquanto o reagente de captura é imobilizado em um suporte sólido. Em outras modalidades, o reagente de captura contém um recurso que é reativo com um recurso secundário sobre um suporte sólido. Nestas modalidades, o reagente de captura pode ser exposto para o biomarcador em solução, e então o recurso sobre o captura do reagente pode ser usado em conjunto com o recurso secundário com o sólido de apoio para imobilizar o biomarcador no suporte sólido. O reagente de captura é selecionado com base no tipo de análise a ser efetuada. Os reagentes de captura incluem mas não são limitados aos aptâmeros, anticorpos, adnectinas, anquirinas, outro anticorpos miméticos e outros andaimes de proteína, autoanticorpos, quimeras, pequenas moléculas, fragmentos de F(ab')2, fragmentos de anticorpos de cadeia única, fragmentos de Fv, fragmentos de Fv de cadeia única, ácidos nucleicos, lectinas, receptores de ligação de ligante, affibodies, nanobodies, polímeros impressos, avimers, peptidomiméticos, receptores hormonais, receptores de citocinas e receptores sintéticos e modificações e fragmentos destes.

[000111] Em algumas modalidades, um nível do biomarcador é detectado usando um reagente do biomarcador/captura complexo.

[000112] Em algumas modalidades, o nível do biomarcador é derivado do reagente de biomarcador/captura complexo e é detectado indiretamente, tais como, por exemplo, como resultado de uma reação que é posterior a interação de reagente do biomarcador/captura, mas é dependente da formação do reagente do biomarcador/captura complexo.

[000113] Em algumas modalidades, o nível do biomarcador é detectado diretamente a partir do biomarcador em uma amostra biológica.

[000114] Em algumas modalidades, biomarcadores são detectados usando um formato multiplexado que permite a detecção simultânea de dois ou mais biomarcadores em uma amostra biológica. Em algumas modalidades do formato multiplexado, reagentes de captura são imobilizados, diretos ou indiretamente, covalentemente ou não ligado covalentemente, em locais discretos sobre um suporte sólido. Em algumas modalidades, um formato multiplexado usa suporte sólido discreto onde cada suporte sólido tem um reagente da captação exclusivo associado com esse suporte sólido, tal como, por exemplo pontos quânticos. Em algumas modalidades, um dispositivo individual é usado para a detecção de cada um dos vários biomarcadores para serem detectados em uma amostra biológica. Dispositivos individuais podem ser configurados para permitir que cada biomarcador da amostra biológica sejam processados simultaneamente. Por exemplo, pode ser usada uma placa de microtitulação, tal que cada poço da placa é usado para analisar um ou mais dos vários biomarcadores para serem detectados em uma amostra biológica.

[000115] Em um ou mais modalidades precedentes, uma etiqueta fluorescente pode ser usada para rotular um componente do reagente biomarcador/captura complexo para permitir a detecção do nível do biomarcador. Em várias modalidades, a etiqueta fluorescente pode ser conjugada com um reagente de captura específico para qualquer um dos biomarcadores descritos neste documento, usando técnicas conhecidas, e a etiqueta fluorescente pode ser usada para detectar o nível correspondente do biomarcador. Etiquetas fluorescentes apropriadas incluem quelatos de terras raras, fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, aloficocianina, PBXL-3, Qdot 605, Lisamina, ficoeritrina, Texas Red e outros tais compostos.

[000116] Em algumas modalidades, a etiqueta fluorescente é uma molécula corante fluorescente. Em algumas modalidades, a molécula corante fluorescente inclui, pelo menos, um sistema de anel substituí- do indolium em que o substituinte sobre o 3-carbono do anel indolium contém um grupo quimicamente reativo ou uma substância conjugada. Em algumas modalidades, a molécula corante inclui uma molécula de AlexFluor, como, por exemplo, AlexaFluor 488, AlexaFluor 532, Alexa- Fluor 647, AlexaFluor 680 ou AlexaFluor 700. Em algumas modalidades, a molécula corante inclui um primeiro tipo e um segundo tipo da molécula do corante, tal como, por exemplo, duas diferentes moléculas de AlexaFluor. Em algumas modalidades, a molécula corante inclui um primeiro tipo e um segundo tipo da molécula do corante, e as moléculas de dois corantes têm diferentes espectros de emissão.

[000117] A fluorescência pode ser medida com uma variedade de instrumentação compatível com uma ampla gama de formatos de ensaio. Por exemplo, espectrofluorimetria tem sido projetado para analisar placas de microtitulação, corrediças do microscópio, matrizes impressas, cubetas, etc. Ver Principles of Fluorescence Spectroscopy, por J.R. Lakowicz, Springer Science + Business Media, Inc., 2004. Ver Bioluminescence & Chemiluminescence: Progress & Current Applications; editores: Philip E. Stanley and Larry J. Kricka, World Scientific Publishing Company, janeiro de 2002.

[000118] Em uma ou mais modalidades, uma etiqueta quimilumines- cência pode ser usada opcionalmente para rotular um componente do reagente biomarcador/captura complexo para permitir a detecção do nível do biomarcador. Materiais adequados quimioluminescente incluem qualquer um dos cloreto de oxil, Rodamin 6G, Ru(bipy)32+ , TMAE(tetrakis(dimetilamino)etileno), Pirogalol (1,2,3-trihidroxibenzeno), Lucigenina, peroxioxalatos, aril oxalatos,, ésteres de acridinio, dioxetanos e outros.

[000119] Em algumas modalidades, o método de detecção inclui uma combinação de enzima/substrato que gera um sinal detectável que corresponde ao nível do biomarcador. Geralmente, a enzima cata- lisa uma alteração química do substrato cromogênico que pode ser medido usando várias técnicas, incluindo a espectrofotometria de fluorescência e quimioluminescência. Enzimas apropriadas incluem, por exemplo, luciferases, luciferina, malato desidrogenase, urease, peroxidase de rábano (HRPO), fosfatase alcalina, beta-galactosidase, glico- amilase, lisozima, glicose oxidase, oxidase de galactose e glicose-6- fosfato desidrogenase, uricase, xantina oxidase, lactoperoxidase, microperoxidase e afins.

[000120] Em algumas modalidades, o método de detecção pode ser uma combinação de fluorescência, quimioluminescência, radionuclí- deos ou enzima/substrato combinações que geram um sinal mensurável. Em algumas modalidades, sinalização multimodal poderia ter características únicas e vantajosas em formatos do ensaio biomarcador.

[000121] Em algumas modalidades, os níveis do biomarcador para os biomarcadores aqui descritos podem ser detectados para usar quaisquer métodos analíticos, incluindo, ensaios de aptâmeros single- plex, ensaios de aptâmeros multiplexados, imunoensaios singleplex ou multiplexado, perfis de expressão de mRNA, perfil de expressão miR- NA, análise de espectrometria de massa, métodos histológi- cos/citológicos, etc, como discutido abaixo.

Determinação dos Níveis do Biomarcador Usando Ensaios Baseados em Aptâmeros

[000122] Os ensaios direcionados para a detecção e quantificação das moléculas fisiologicamente significativas nas amostras biológicas e outras amostras são ferramentas importantes na investigação científica e no campo dos cuidados de saúde. Uma classe de tais ensaios envolve o uso de um microarranjo que inclui um ou mais aptâmeros imobilizados em um suporte sólido. Os aptâmeros são capazes de se ligarem a uma molécula-alvo de maneira altamente específica e com afinidade muito elevada. Veja, por exemplo, Patente U.S. N° 5.475.096 entitulado “Nucleic Acid Ligands”; ver também, por exemplo, Patente U.S. N° 6.242.246, Patente U.S. N° 6.458.543, e Patente U.S. N° 6.503.715, cada um deles é intitulado “Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip”. Uma vez que o microarranjo é contactado com uma amostra, os aptâmeros ligar para suas moléculas-alvo respectivos presentes na amostra e, assim, permitir uma determinação de um nível do biomar- cador correspondente a um biomarcador.

[000123] Como usado neste documento, um "aptâmero" se refere a um ácido nucleico que tem uma afinidade de ligação específica para uma molécula-alvo. É reconhecido que as interações de afinidade são uma questão de grau; no entanto, neste contexto, a "afinidade de ligação específica" de um aptamer para seu alvo significa que o aptamer se liga ao seu alvo geralmente com muito maior grau de afinidade do que se liga a outros componentes em uma amostra de teste. Um "ap- tâmero" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de molécula de ácido nucléico que tem uma seqüência específica de nucleotídeos. Um aptâmero pode incluir qualquer número adequado de nucleotí- deos, incluindo qualquer número de nucleotídeos modificados quimi-camente. "Aptâmeros" se referem a mais de um tal conjunto de moléculas. Aptâmeros diferentes podem ter números iguais ou diferentes de nucleotídeos. Aptâmeros podem ser DNA ou RNA ou ácidos nuclei- cos quimicamente modificados e podem ser cadeias únicas, cadeias duplas, ou contêm regiões de cadeias duplas e podem incluir estruturas superiores ordenadas. Um aptâmero também pode ser um fotoap- tâmero, onde um grupo funcional fotorreativo ou quimicamente reativo é incluído no aptâmero que lhe permita ser covalentemente ligado ao seu alvo correspondente. Qualquer um dos métodos aptâmeros divulgados neste documento podem incluir o uso de dois ou mais aptâme- ros que se ligam especificamente a mesma molécula-alvo. Como ainda descrito abaixo, um aptâmero pode incluir uma etiqueta. Se um ap- tâmero inclui uma etiqueta, todas as cópias do aptâmero não precisam ter a mesma etiqueta. Além disso, se cada aptâmeros diferentes incluem uma etiqueta, estes diferentes aptâmeros podem ter a mesma etiqueta ou uma etiqueta diferente.

[000124] Um aptâmero pode ser identificado usando qualquer método conhecido, incluindo o processo SELEX. Uma vez identificados, um aptâmero pode ser preparado ou sintetizado em conformidade com qualquer método conhecido, incluindo métodos sintéticos químicos e métodos sintéticos enzimáticos.

[000125] Os termos "SELEX" e "processo SELEX" são usados per- mutavelmente neste documento para referir-se geralmente a uma combinação de (1) a seleção dos aptâmeros que interagem com a molécula alvo de forma desejável, por exemplo por ligação com alta afinidade a uma proteína, com (2) a ampliação desses ácidos nucléicos selecionados. O processo SELEX pode ser usado para identificar aptamers com alta afinidade para um biomarcador ou alvo específico.

[000126] SELEX geralmente inclui preparar uma mistura de candidato de ácidos nucleicos, vinculação da mistura candidata para a molécula alvo desejada para formar um complexo de afinidade, separando os complexos de afinidade dos ácidos nucléicos não ligados candidatos, separando e isolando o ácido nucleico do complexo de afinidade. purificando o ácido nucleico e identificando uma seqüência específica de aptamer. O processo pode incluir várias rodadas para refinar ainda mais a afinidade do aptamer selecionado. O processo pode incluir etapas de amplificação em um ou mais pontos no processo. Veja, por exemplo, Patente U.S. N° 5.475.096, intitulada "Nucleic Acid Ligands." O processo SELEX pode ser usado para gerar um aptamer que liga covalentemente seu alvo, bem como um aptamer que liga não cova- lentemente seu alvo. Veja, por exemplo, Patente U.S. N° 5.705.337 intitulada “Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX”.

[000127] O processo SELEX pode ser usado para identificar aptamers de alta afinidade contendo nucleotídeos modificados que conferem características melhoradas ao aptamer, tais como, por exemplo, estabilidade in vivo melhorada ou características melhoradas de entrega. Exemplos de tais modificações incluem substituições químicas na ribose e/ou fosfato e/ou posições de base. Aptamers identificados por processo SELEX contendo nucleotídeos modificados são descritos em Patente U.S. N° 5.660.985, intitulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", que descreve os oligonucleo- tídeos contendo derivados de nucleotídeos modificados quimicamente nas posições 5'- e 2'- de pirimidinas. Patente U.S. N° 5.580.737, ver supra, descreve aptamers altamente específicos, que contém um ou mais nucleotídeos modificados com 2'-amino(2'-NH2), 2'-flúor (2'-F), e/ou 2'-O-metil (2'-OMe). Veja também, Publicação do Pedido de Pa-tente U.S. N° 2009/0098549, intitulada "SELEX e PHOTOSELEX", que descreve bibliotecas de ácido nucleico com propriedades físicas e químicas expandidas e sua uso em SELEX e photoSELEX.

[000128] SELEX também pode ser usado para identificar aptâmeros que possuem características desejáveis de dissociação lenta. Ver Publicação de Patente U.S. N° US 2009/0004667, intitulada "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates", que descreve métodos aperfeiçoados de SELEX para gerar aptâmeros que podem se ligar a moléculas-alvo. São descritos métodos para a produção de aptamers e fotoaptamers com taxas mais lentas de dissociação de suas moléculas alvo correspondentes. Os métodos envolvem pôr em contato a mistura candidata com a molécula alvo, permitindo a formação de complexos de ácido nucleico-alvo ocorrer e realização de um processo de enriquecimento de dissociação lenta onde complexos de ácido nuclei- co-alvo com taxas de dissociação rápida vão dissociar e não se refor- mar, enquanto complexos com taxas de dissociação lenta permanecerão intactos. Além disso, os métodos incluem o uso de nucleotídeos modificados na produção de misturas de ácidos nucleicos candidatas para gerar aptamers com melhor desempenho de dissociação. Os nu- cleotídeos modificados exemplares não limitantes incluem, por exemplo, as pirimidinas modificadas mostradas na Figura 11. Em algumas modalidades, um aptâmero compreende pelo menos um nucleotídeo com uma modificação, como uma modificação da base. Em algumas modalidades, um aptâmero compreende pelo menos um nucleotídeo com uma modificação hidrofóbica, tais como uma modificação de base hidrofóbica, permitindo contatos hidrofóbicos com uma proteína do alvo. Tais contatos hidrofóbicos, em algumas modalidades, contribuem para maior afinidade e/ou ligação da taxa de dissociação mais lenta pelo aptâmero. Os nucleotídeos exemplares não limitantes com modificações hidrofóbicas são mostrados na Figura 11. Em algumas modalidades, um aptâmero compreende pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco anos, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito anos, pelo menos nove ou pelo menos 10 nucleotídeos com modificações hidrofóbicas, onde cada modificação hidrofóbica pode ser a mesma ou diferente das outras. Em algumas modalidades, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos 10 modificações hidrofóbicas em um aptâmero podem ser selecionados independentemente das modificações hidrofóbicas, mostradas na Figura 11.

[000129] Em algumas modalidades, aptâmero de dissociação lenta (incluindo um aptâmero compreendendo pelo menos um nucleotídeo com uma modificação hidrofóbica) com uma taxa de dissociação (ty2) de > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos ou > 240 minutos.

[000130] Em algumas modalidades, um ensaio emprega aptâmeros que incluem grupos funcionais fotorreativos que permitem os aptâme- ros a se ligarem covalentemente ou "fotorreticulado" de suas moléculas-alvo. Veja, por exemplo, Patente U.S. n° 6.544.776, intitulada "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip”. Estes aptâmeros fotorreativos são também referidos como fotoaptâmeros. Veja, por exemplo, Patente US N° 5.763.177, Patente US N° 6.001.577 e Patente US N° 6.291.184, cada um deles é intitulado "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"; Ver também, por exemplo, Patente US N° 6.458.539, intitulado "Photoselection of Nucleic Acid Ligands”. Depois o microarranjo é contactado com a amostra e os fotoaptâmeros tiveram a oportunidade de unir suas moléculas-alvo, os fotoaptâmeros são fotoativados, e o apoio sólido é lavado para remover todas as moléculas não especificamente ligadas. Lavagem de duras condições podem ser utilizadas, desde que as moléculas-alvo estão ligadas aos fo- toaptâmeros geralmente não são removidas, devido as ligações covalentes criadas pelo grupo(s) funcional fotoativado sobre o fotoaptâme- ros. Desta forma, o ensaio permite a detecção de um nível do biomar- cador correspondente a um biomarcador na amostra.

[000131] Em alguns formatos de ensaio, os aptâmeros são imobilizados no suporte sólido antes de ser contactado com a amostra. Em determinadas circunstâncias, no entanto, imobilização dos aptâmeros anteriores entram em contato com a amostra que pode não fornecer um ótimo ensaio. Por exemplo, pre-imobilização dos aptâmeros pode resultar na mistura ineficiente dos aptâmeros com as moléculas-alvo na superfície do sólido de apoio, talvez levando a longos tempos de reação e, portanto, longos períodos de incubação para permitir a ligação eficiente dos aptâmeros de suas moléculas-alvo. Além disso, quando os fotoaptâmeros são empregados no ensaio e dependendo do material utilizado como um suporte sólido, o sólido de apoio tende a espalhar ou absorver a luz usada para efetuar a formação de ligações covalentes entre os fotoaptâmeros e suas moléculas-alvo. Além disso, dependendo do método empregado, a detecção das moléculas-alvo ligam a seus aptâmeros que pode ser sujeito a imprecisão, desde a superfície do sólido de apoio também pode ser exposta e afetada por quaisquer agentes de rotulagem que são usados. Finalmente, a imobilização dos aptâmeros com o sólido de apoio geralmente envolve uma etapa de preparação do aptâmero (ou seja, a imobilização) antes da exposição dos aptâmeros para a amostra, e esta etapa de preparação pode afetar a atividade ou a funcionalidade dos aptâmeros.

[000132] Os ensaios do aptâmero que permitem um aptâmero capturar seu alvo na solução e então empregar medidas de separação que são projetadas para remover componentes específicos da mistura antes da detecção do aptâmero-alvo também têm sido descritos (ver Publicação U.S. N° 2009/0042206, intitulada “Multiplexed Analyses of Test Samples”). Os métodos de ensaio descrito do aptâmero permitem a detecção e quantificação do alvo do ácido não nucleico (por exemplo, uma proteína-alvo) em uma amostra de teste pela detecção e quantificação dos ácidos nucleicos (ou seja, um aptâmero). Os métodos descritos criam um substituto do ácido nucleico (ou seja, o aptâ- mero) para detectar e quantificar um alvo do ácido não nucleico, permitindo, assim, a grande variedade de tecnologias do ácido nucleico, incluindo a amplificação, para ser aplicado para uma ampla gama de alvos desejados, incluindo alvos da proteína.

[000133] Aptâmeros podem ser construídos para facilitar a separação entre os componentes de ensaio de um biomarcador do aptâmero complexo (ou complexo covalente do biomarcador fotoaptâmero) e permitir o isolamento do aptâmero para a deteção e/ou quantificação. Em uma modalidade, essas construções podem incluir um elemento clivável ou liberável dentro da sequência do aptâmero. Em outras modalidades, funcionalidade adicional pode ser introduzida no aptâmero, por exemplo, um componente rotulado ou detectável, um componente do espaçador ou um elemento de imobilização ou da etiqueta da ligação específica. Por exemplo, o aptâmero pode incluir uma etiqueta conectada para o aptâmero através de uma fração clivável, um rótulo, um componente do espaçador separando o rótulo e a fração clivável. Em uma modalidade, um elemento clivável é um ligante do fotoclivá- vel. O ligante fotoclivável pode ser anexado a uma fração de biotina e uma seção do espaçador, pode incluir um grupo de NHS para derivati- zação de aminas e pode ser usado para apresentar um grupo de biotina para um aptâmero, permitindo a libertação do aptâmero posterior num método de ensaio.

[000134] Os ensaios homogêneos, feitos com todos os componentes de ensaio na solução, não requerem separação de amostra e reagentes antes da detecção do sinal. Esses métodos são rápidos e fáceis de usar. Esses métodos geram sinal baseado em uma captura molecular ou reagente de ligação que reage com seu alvo específico. Em algumas modalidades dos métodos descritos neste documento, os reagentes de captura molecular compreendem um aptâmero ou um anticorpo ou coisa parecida e o alvo específico pode ser um biomarcador mostrado na Tabela 3, 4, 6, 7, 8 e/ou 9.

[000135] Em algumas modalidades, um método para a geração de sinal de tira proveito da mudança de sinal da anisotropia devido a interação de um reagente de captura etiquetado com fluoróforo com seu alvo do biomarcador específico. Quando a captura rotulada reage com seu alvo, o aumento de peso molecular faz com que o movimento ro- tacional do fluoróforo anexado ao complexo se torne muito mais lento, alterando o valor de anisotropia. Ao monitorar a mudança de anisotro- pia, os eventos de ligação podem ser utilizados para medir quantitati- vamente os biomarcadores em soluções. Outros métodos incluem ensaios de polarização de fluorescência, métodos moleculares de farol, tempo de fluorescência resolvida têmpera, quimioluminescência, transferência de energia de ressonância de fluorescência e afins.

[000136] Um aptâmero exemplar baseado na solução de ensaio que pode ser usado para detectar um nível do biomarcador em uma amostra biológica inclui o seguinte: (a) preparar uma mistura pelo contato da amostra biológica com um aptâmero que inclui uma primeira etiqueta e tem uma afinidade específica para o biomarcador, onde um aptâmero de afinidade complexa é formado quando o biomarcador está presente na amostra; (b) expor a mistura para um primeiro suporte sólido, incluindo um primeiro elemento de captura e permitir que a primeira etiqueta se associe com o primeiro elemento de captura; (c) remover qualquer dos componentes da mistura não associado com o primeiro apoio sólido; (d) anexar uma segunda etiqueta ao componente do biomarca- dor do complexo de afinidade do aptâmero; (e) liberar o complexo de afinidade do aptâmero do primeiro suporte sólido; (f) expor o complexo de afinidade do aptâmero complexo lançado para um segundo suporte sólido que inclui um segundo elemento de captura e permitindo a segunda etiqueta para associar com o segundo elemento de captura; (g) retirar qualquer aptâmero não complexado da mistura pelo particiona- mento do aptâmero não complexado a partir doo complexo de afinidade do aptâmero; (h) eluir o aptâmero do suporte sólido; e (i) detectar o biomarcador pela detecção do componente docomplexo de afinidade do aptâmero.

[000137] Um método exemplar não limitante para a detecção dos biomarcadores em uma amostra biológica usando aptâmeros é descrito no Exemplo 7. Veja também Kraemer et al., PLoS One 6(10): e26332.

Determinação de Níveis do Biomarcador usando imunoensaios

[000138] Os métodos de imunoensaio baseiam-se na reação de um anticorpo para seu alvo correspondente ou analito e pode detectar o analito em uma amostra, dependendo do formato de ensaio específico. Para melhorar a especificidade e a sensibilidade de um método de ensaio com base na imunorreatividade, anticorpos monoclonais e respectivos fragmentos são usados frequentemente por causa de seu reconhecimento do epítopo específico. Anticorpos policlonais também foram usaram com sucesso em diversos imunoensaios por causa de sua maior afinidade para o alvo em comparação com os anticorpos mono- clonais. Os imunoensaios foram projetados para uso com uma ampla gama de matrizes da amostra biológica. Formatos de imunoensaio foram projetados para fornecer resultados quantitativos, qualitativos e semi-quantitativos.

[000139] Os resultados quantitativos são gerados através da uso de uma curva padrão criada com as concentrações conhecidas do analito específico para ser detectado. A resposta ou o sinal de uma amostra desconhecida é plotada para a curva padrão, e uma quantidade ou nível correspondente ao alvo na amostra desconhecida é estabelecida.

[000140] Numerosos formatos de imunoensaio foram projetados. ELISA ou EIA pode ser quantitativa para a detecção de um analito. Este método baseia-se na fixação de um rótulo para o analito ou o anticorpo e inclui o componente label, direto ou indiretamente, uma enzima. Testes de ELISA podem ser formatados por direto, indireto, com-petitivo, ou sanduíche de detecção do analito. Outros métodos dependem de rótulos, como, por exemplo, radioisótopos (I125) ou fluorescência. Técnicas adicionais incluem, por exemplo, aglutinação, nefelome- tria, turbidimetria, Western blot, imunoprecipitação, imunocitoquímica, imuno-histoquímica, citometria de fluxo, ensaio Luminexe outros (ver ImmunoAssay: A Practical Guide, editado por Brian Law, publicado por Taylor & Francis, Ltd., edição de 2005).

[000141] Os formatos do ensaio exemplar incluem ensaio de imuno- absorção ligado pela enzima (ELISA), radioimunoensaio, fluorescente, quimioluminescência e transferência de energia de ressonância de flu-orescência (FRET) ou imunoensaios resolvidos no tempo-FRET (TR- FRET). São exemplos de procedimentos para detecção de biomarca- dores que inclui imunoprecipitação do biomarcador seguida por métodos quantitativos que permitem tamanho e discriminação do nível de peptídeos, tais como eletroforese em gel, eletroforese capilar, eletro- cromatografia planar, e afins.

[000142] Os métodos de detecção e/ou quantificação de um rótulo detectável ou sinal gerando material dependem da natureza do rótulo. Os produtos de reações catalisadas por enzimas apropriadas (onde o rótulo detectável é uma enzima; veja acima) podem ser, sem limitação, fluorescente, luminescente ou radioativo ou eles podem absorver a luz visível ou ultravioleta. Exemplos de detectores apropriados para detectar tais rótulos detectáveis incluem, sem limitação, película de raio x, contadores de radioatividade, contadores de cintilação, espectrofotô- metros, colorímetros, fluorímetro, luminómetros e densitômetros.

[000143] Qualquer um dos métodos para a detecção pode ser executado em qualquer formato que permite a qualquer preparação adequada, processamento e análise das reações. Isto pode ser, por exemplo, nas placas de ensaio de multi-poços (por exemplo, 96 poços ou 386 poços) ou usando qualquer matriz apropriada ou microarranjo. As soluções para os vários agentes podem ser feitas manualmente ou robo- ticamente e todas as pipetagem subsequentes, diluição, mistura, distribuição, lavagem, incubando, leitura de amostra, coleta de dados e análise podem ser feitos roboticamente usando software de análise disponível comercialmente, robótica e instrumentação de detecção capaz de detectar um rótulo detectável.

Determinação dos Níveis do Biomarcador usando Perfil de Expressão Gênica

[000144] Medição do mRNA em uma amostra biológica pode, em algumas modalidades, ser usado como um substituto para a detecção do nível da proteína correspondente na amostra biológica. Assim, em algumas modalidades, um biomarcador ou painel do biomarcador aqui descrito pode ser detectado através da detecção do RNA apropriado.

[000145] Em algumas modalidades, os níveis de expressão do mRNA são medidos por transcrição reversa quantitativa da reação da cadeia de polimerase (RT-PCR seguido com qPCR). RT-PCR é usado para criar um cDNA de mRNA. O cDNA pode ser usado em um ensaio de qPCR para produzir fluorescência conforme o andamento de processo de amplificação de DNA. Em comparação com uma curva padrão, qPCR pode produzir uma medição absoluta como o número de cópias do mRNA por célula. Os Northern blots, microarranjos, ensaios do invasor e RT-PCR, combinado com a eletroforese capilar foram todos utilizados para medir os níveis de expressão do mRNA em uma amostra. Ver Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004.

Detecção dos Biomarcadores Usando in vivo Tecnologias de Imagem Molecular

[000146] Em algumas modalidades, um biomarcador aqui descrito pode ser usado em testes de imagem moleculares. Por exemplo, um agente de imagem pode ser acoplado a um reagente de captura, que pode ser usado para detectar o biomarcador in vivo.

[000147] In vivo imagem tecnologias fornecem métodos não invasi- vos para determinar o estado de uma determinada doença no corpo de um indivíduo. Por exemplo, partes inteiras do corpo, ou mesmo todo o corpo, podem ser vistos como uma imagem tridimensional, proporcionando informações valiosas sobre a morfologia e estruturas no corpo. Essas tecnologias podem ser combinadas com a detecção dos bio- marcadores aqui descritos para fornecer informações sobre o biomar- cador in vivo.

[000148] O uso das in vivo tecnologias de imagem molecular está se expandindo devido aos diversos avanços na tecnologia. Esses avanços incluem o desenvolvimento de novos agentes de contraste ou rótulos, tais como radiomarcações e/ou etiquetas fluorescentes, que podem fornecer sinais fortes dentro do corpo; e o desenvolvimento da poderosa imagem da nova tecnologia, que pode detectar e analisar esses sinais de fora do corpo, com sensibilidade suficiente e precisão para fornecer informações úteis. O agente de contraste pode ser visualizado em um sistema de imagem adequado, proporcionando assim uma imagem da parte ou partes do corpo em que se encontram o agente de contraste. O agente de contraste pode ser ligado ou associado com um reagente de captura, como um aptâmero ou um anticorpo, por exemplo, e/ou um peptídeo ou proteína, ou um oligonucleotí- deo (por exemplo, para a detecção da expressão do gene) ou um complexo que contém qualquer um destes com uma ou mais macro- moléculas e/ou outras formas das partículas.

[000149] O agente de contraste também pode caracterizar um átomo radioativo que é útil na imagem. Átomos radioativos apropriados incluem tecnécio- 99m ou iodo-123 para estudos de cintilográfica. Outras partes facilmente detectáveis incluem, por exemplo, rótulos de rotação por ressonância magnética (MRI) como, por exemplo, iodo-123 novamente, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigê- nio-17, gadolínio, manganês ou ferro. Esses rótulos são bem conhecidos na técnica e poderiam facilmente ser selecionados por um dos versados na técnica.

[000150] Técnicas de imagem padrão incluem, mas não estão limitadas a ressonância magnética, tomografia computadorizada com varredura, tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia computa- dorizada por emissão de fóton único (SPECT) e similares. Para diagnóstico in vivo de imagem, o tipo de instrumento de detecção disponível é um fator importante na escolha de um agente de contraste determinado, como um determinado radionuclídeo e o biomarcador específico que é utilizado para o alvo (proteína, mRNA e afins). O radio- nuclídeo escolhido normalmente tem um tipo de deterioração que é detectável por um determinado tipo de instrumento. Além disso, ao selecionar um radionuclídeo para diagnóstico in vivo, sua meia-vida deve ser tempo suficiente para ativar a detecção no momento de máxima absorção pelo tecido alvo mas curto o bastante que a radiação deletéria do hospedeiro é minimizada.

[000151] As técnicas de imagem exemplares incluem mas não estão limitadas a PET e SPECT, que são de imagens técnicas, nas quais um radionuclídeo é sinteticamente ou localmente administrado a um indivíduo. A absorção subsequente do radiotraçador é medida ao longo do tempo e usada para obter informações sobre o tecido alvejado e o bi- omarcador. Devido as emissões de alta energia (raios gama) os isótopos específicos empregados e a sensibilidade e a sofisticação dos instrumentos utilizados para detectá-los, pode ser inferida na distribuição bidimensional de radioatividade fora do corpo.

[000152] Os nuclídeos emissores de pósitrons comumente utilizados em PET incluem, por exemplo, carbono-11, nitrogênio-13, oxigênio-15 e flúor-18. Os isótopos que decaem pela captura eletrônica e/ou emissão por gama são usados no SPECT e incluem, por exemplo, iodo-123 e tecnécio- 99m. Um método exemplar para a rotulagem de aminoáci- dos com tecnécio- 99m é a redução do íon está na presença de um precursor quelante para formar o precursor complexo lábil de tecnécio- 99m, que, por sua vez, reage com o grupo de ligação do metal de um peptídeo quimiotático bifuncionalmente modificado para formar um conjugado de peptídeo quimiotático de tecnécio-99m.

[000153] Anticorpos são frequentemente usados para tais métodos diagnósticos de imagem in vivo. A preparação e a uso de anticorpos para diagnóstico in vivo é bem conhecido na técnica. Da mesma forma, os aptâmeros podem ser utilizados para tais métodos diagnósticos de imagem in vivo. Por exemplo, um aptâmero que foi usado para identificar um biomarcador específico aqui descrito pode ser adequadamente rotulado e injetado em um indivíduo para detectar o biomar- cador in vivo. O rótulo utilizado será selecionado em conformidade com a modalidade da imagem a ser usada, conforme descrito anteriormente. Agentes de imagem direcionados pelo aptâmero poderiam ter características únicas e vantajosas, relacionadas com a penetração do tecido, distribuição tecidual, cinético, eliminação, potência e seletividade em comparação com outros agentes da imagem.

[000154] Tais técnicas também opcionalmente podem ser executadas com oligonucleotídeos rotulados, por exemplo, para a detecção da expressão do gene através de imagem com oligonucleotídeos antisenses. Esses métodos são usados para hibridação in situ, por exemplo, com moléculas fluorescentes ou radionuclídeos como o rótulo. Outros métodos para detecção da expressão do gene incluem, por exemplo, a detecção da atividade de um gene repórter.

[000155] Outro tipo geral de tecnologia de imagem é uma imagem óptica, em que os sinais fluorescentes dentro do sujeito são detectados por um dispositivo óptico que é externo ao sujeito. Estes sinais podem ser devido à fluorescência real e/ou a bioluminescência. Melhorias na sensibilidade dos dispositivos de detecção óptica aumentaram a utilidade da imagem latente óptica para ensaios de diagnósticos in vivo.

[000156] Para uma revisão de outras técnicas, consulte N. Blow, Nature Methods, 6, 465-469, 2009.

Determinação de Biomarcadores usando Métodos de Histolo-gia/Citologia

[000157] Em algumas modalidades, os biomarcadores aqui descritos podem ser detectados em uma variedade de amostras de tecidos usando métodos citológicos ou histológicos. Por exemplo, biópsias de endo- e trans-brônquicas, aspirados da agulha fina, agulhas de corte e biópsias podem ser usadas para a histologia. Lavagem brônquica e escovação, aspiração pleural e expectoração, podem ser usadas para ciotologia. Qualquer um dos biomarcadores identificados neste documento pode ser usado para manchar um espécime como uma indicação de doença.

[000158] Em algumas modalidades, um ou mais reagentes de captura específico para biomarcadores correspondentes são utilizados em uma avaliação citológica de uma amostra e pode incluir um ou mais dos seguintes: coletar uma amostra das células, fixação da amostra das células, desidratando, limpando, imobilizando a amostra das células sobre uma lâmina do microscópio, permeabilizando a amostra da célula, tratamento para recuperação de analito, coloração, descoloração, lavagem, bloqueando e reagindo com um ou mais reagentes em uma solução tamponada de captura. Em outra modalidade, a amostra da célula é produzida a partir de um bloco de celas.

[000159] Em algumas modalidades, um ou mais reagentes de captura específico para biomarcadores correspondentes são utilizados numa avaliação histológica de uma amostra do tecido e pode incluir um ou mais dos seguintes: coleta de uma amostra de tecido, fixação da amostra do tecido, desidratando, limpando, imobilizando a amostra do tecido sobre uma lâmina de microscópio, permeabilizando a amostra do tecido, tratamento para recuperação de analito, coloração, descoloração, lavagem, bloqueando e reidratando com um ou mais reagentes em uma solução tamponada de captura. Em outra modalidade, a fixação e desidratação são substituídas pelo congelamento.

[000160] Em outra modalidade, um ou mais aptâmeros específicos para os biomarcadores correspondentes são reagidos com a amostra histológica ou citológica e pode servir como o destino de ácidos nu- cleicos em um método de amplificação dos ácidos nucleicos. Métodos de amplificação apropriados do ácido nucleico incluem, por exemplo, PCR, replicase de q-beta, rolamento de amplificação do círculo, deslocamento de vertente, amplificação dependente de helicase, amplificação isotérmica de loop mediada, reação em cadeia da ligase, e restrição e circularização auxiliado pela amplificação de círculo rolante.

[000161] Em uma modalidade, um ou mais reagentes específicos de captura para os biomarcadores correspondentes para uso na avaliação histológica ou citológica são misturados em uma solução tampo- nada que pode incluir qualquer um dos seguintes: materiais de bloqueio, concorrentes, detergentes, estabilizadores, transportadores de ácidos nucleicos, materiais polianiônicos, etc.

[000162] Um "protocolo de citologia" geralmente inclui a coleta de amostra, fixação de amostra, imobilização de amostra e coloração. "Preparação das células" podem incluir várias etapas de processamento após a coleta da amostra, incluindo o uso de um ou mais aptâmeros para a coloração das células preparadas.

Determinação dos Níveis do Biomarcador usando Métodos de Espec- trometria de Massa

[000163] Uma variedade de configurações de espectrômetros de massa pode ser usada para detectar níveis do biomarcador. Vários tipos de espectrômetros de massa estão disponíveis ou podem ser produzidos com várias configurações. Em geral, um espectrômetro de massa tem os seguintes componentes principais: uma entrada de amostra, uma fonte de íons, um analisador de massa, um detector, um sistema de vácuo e sistema de controle de instrumento e um sistema de dados. Diferença na entrada da amostra, fonte de íon e analisador de massa geralmente definem o tipo de instrumento e as suas capacidades. Por exemplo, uma entrada pode ser uma fonte de cromatogra- fia líquida de coluna capilar ou pode ser uma sonda direta ou tais estágios como usados na dessorção do laser assistida por matriz. Fontes de íons comuns são, por exemplo, eletro-pulverização, incluindo nano- pulverização e micro-pulverização ou dessorção do laser assistida pela matriz. Analisadores de massa comuns incluem um filtro de massa quadrupolar, analisador de massa de íon trap e analisador de massa de tempo-de-voo. Métodos de espectrometria de massas adicionais são bem conhecidos na técnica (ver Burlingame et al. Anal. Chem. 70:647 R-716R (1998); Kinter and Sherman, Nova York (2000)).

[000164] Biomarcadores de proteínas e níveis do biomarcador podem ser detectados e medidos por qualquer um dos seguintes: eletro- pulverização de ionização de espectrometria em massa (ESI-MS), ESI- MS/MS, ESI-MS/(MS)n, ionização de dessorção a laser assistida pela matriz do tempo-de-voo de espectrometria em massa (MALDI-TOF- MS), superfície aprimorada da dessorção a laser/espectrometria de massa por ionização por tempo-de-voo (SELDI-TOF-MS), dessor- ção/ionização em silício (DIOS), espectrometria de massa de íons se- cundários(SIMS), quádruplo de tempo-de-voo (Q-TOF), tecnologia do conjunto tempo-de-voo (TOF-TOF), chamado UltraFlex III TOF / TOF, pressão atmosférica espectrometria de massa de ionização química (APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI-(MS)N, pressão atmosférica da espec- trometria de fotoionização em massa (APPI-MS), APPI-MS/MS e AP- PI-(MS)N, espectrometria de massa quadrupolo, espectrometria de massa transformada em Fourier (MVH), espectrometria de massa quantitativa e espectrometria em massa de íon trap.

[000165] Estratégias de preparação de amostra são usadas para rotular e enriquecer amostras antes da caracterização espectroscópica em massa dos biomarcadores de proteína e níveis do biomarcador de determinação. Métodos de rotulagem incluem mas não estão limitados a etiqueta isobárica para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) e o isótopo estável, etiquetando com aminoácidos na cultura da célula (SI- LAC). Capturar os reagentes utilizados para enriquecer seletivamente amostras para proteínas do biomarcador candidato antes da análise espectroscópica em massa incluir mas não estão limitados aos anticorpos aptâmeros, sondas de ácidos nucleicos, quimeras, moléculas pequenas, um fragmento de F(ab')2, um fragmento de anticorpo de cadeia única, um fragmento de Fv, um fragmento de Fv de cadeia única, um ácido nucleico, uma lectina, um receptor de ligação ligante, affibo- dies, nanobodies, anquirinas, anticorpos de domínio, andaimes de anticorpo alternativos (por exemplo, diabodies, etc.) polímeros impressos, avimers, peptidomiméticos, peptóides, ácidos nucleicos de peptí- deo, ácidos nucleicos de treose, um receptor do hormônio, um receptor de citocina e receptores sintéticos e modificações e fragmentos destes.

[000166] Os ensaios anteriores permitem a detecção dos níveis do biomarcador que são úteis para os métodos descritos neste documento, onde os métodos compreendem detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito ou pelo menos nove biomarcadores selecionados a partir de biomarcadores na Tabelas 3, 4, 6, 7, 8 e 9. Em várias modalidades, os métodos incluem detectar os níveis de um ou mais biomarcadores selecionados a partir de qualquer um dos grupos de biomarcadores descritos neste documento, tais como os painéis mostrados na Tabela 5 e subconjuntos das biomarcadores mostrados nas Tabelas 3, 4, 6, 7, 8 e 9. Assim, enquanto alguns dos biomarcadores descritos podem ser úteis sozinhos para a detecção de NAFLD e/ou NASH, os métodos são também aqui descritos para o agrupamento de vários biomarcadores e subconjuntos dos biomarcadores para formar painéis de dois ou mais biomarcadores. Em conformidade com qualquer um dos métodos descritos neste documento, níveis de biomarca- dor podem ser detectados e classificados individualmente ou podem ser detectados e classificados coletivamente, como, por exemplo, em um formato de ensaio multiplex.

Classificação dos Biomarcadores e Cálculo das Pontuações da Doença

[000167] Em algumas modalidades, uma "assinatura" do biomarca- dor para um determinado teste de diagnóstico contém um conjunto de biomarcadores, cada biomarcador tendo níveis característicos das populações de interesse. Níveis característicos, em algumas modalidades, podem se referir a média ou média dos níveis do biomarcador para os indivíduos de um grupo específico. Em algumas modalidades, um método diagnóstico aqui descrito pode ser usado para atribuir uma amostra desconhecida de um indivíduo em um dos dois grupos, ou NAFLD ou normal. Em algumas modalidades, um método diagnóstico aqui descrito pode ser usado para atribuir uma amostra desconhecida de um indivíduo em um dos dois grupos, ou NASH ou NAFLD. Em algumas modalidades, um método diagnóstico aqui descrito pode ser usado para atribuir uma amostra desconhecida de um indivíduo em um dos três grupos: normal, NAFLD sem NASH e NASH.

[000168] A atribuição de uma amostra em um dos dois ou mais grupos é conhecida como classificação, e o procedimento utilizado para realizar esta tarefa é conhecida como um classificador ou um método de classificação. Métodos de classificação também podem ser referidos como métodos de pontuação. Existem muitos métodos de classificação que podem ser usados para construir um diagnóstico classificador de um conjunto de níveis de biomarcador. Em alguns casos, métodos de classificação são executados usando técnicas de aprendiza- gem supervisionadas no qual um conjunto de dados é coletado usando amostras provenientes de indivíduos dentro de dois (ou mais, por vários estados de classificação) grupos distintos, um desejo para distinguir. Desde que a classe (grupo ou população), ao qual pertence cada amostra é conhecida antecipadamente para cada amostra, o método de classificação pode ser treinado para fornecida resposta a classificação desejada. Também é possível usar técnicas de aprendizado não supervisionado para produzir um classificador de diagnóstico.

[000169] Abordagens comuns para o desenvolvimento de classificadores diagnósticos incluem árvores de decisão; ensacar + estimulação + florestas; inferência de regra com base na aprendizagem; Parzen Windows; modelos lineares; logística; métodos de rede neural; aglomeração sem supervisão; meios de K; hierárquica ascenden- te/descendente; aprendizado semi-supervisionado; métodos de protótipo; vizinho mais próximo; estimativa de densidade de kernel; máquinas de vetor de suporte; modelos de Markov ocultos; Aprendizagem de Boltzmann; e classificadores podem ser combinados ou simplesmente de forma a minimizar funções objetivas particulares. Para uma revisão, ver, por exemplo, Pattern Classification, R.O. Duda, et al., edi-tores, John Wiley & Sons, 2a edição, 2001; ver também The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Has- tie, et al., editores, SpringerScience+Business Media, LLC, 2a edição, 2009.

[000170] Para produzir um classificador usando técnicas de aprendizagem supervisionadas, um conjunto de dados chamado treinamento são obtidos das amostras. No contexto dos testes de diagnóstico, dados de treinamento incluem amostras dos grupos distintos (classes) para que as amostras desconhecidas mais tarde sejam atribuídas. Por exemplo, as amostras coletadas dos indivíduos em um controle de população e indivíduos na população de doença determinada podem re presentar dados de treinamento para desenvolver um classificador que pode classificar amostras desconhecidas (ou, mais particularmente, os indivíduos de quem as amostras foram obtidas) como tendo a doença ou sendo livre da doença. O desenvolvimento do classificador dos dados de treinamento é conhecido como treinamento do classificador. Detalhes específicos sobre a formação de classificador dependem da natureza da técnica de aprendizado supervisionado. Treinar um classificador bayesiano ingênuo é um exemplo de uma tal técnica de aprendizagem supervisionada (ver, por exemplo, Pattern Classification, R.O. Duda, et al., editores, John Wiley & Sons, 2a edição, 2001; ver também The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, et al., editores, SpringerScience+Business Media, LLC, 2a edição, 2009). Formação de um classificador de Bayesian ingênuo é descrita, por exemplo, Publicação US N°: 2012/0101002 e 2012/0077695.

[000171] Uma vez que normalmente existem muitos níveis do bio- marcador mais potenciais do que as amostras de um conjunto de treinamento, o cuidado deve ser usado para evitar excesso de montagem. Excesso de montagem ocorre quando um modelo estatístico descreve erro aleatório ou ruído em vez da relação subjacente. Excesso de montagem pode ser evitado em uma variedade de forma, incluindo, por exemplo, limitar o número de biomarcadores utilizados no desenvolvimento do classificador, por supor que as respostas do biomarca- dor são independentes um do outro, limitando a complexidade do modelo estatístico subjacente empregado e assegurando que o modelo estatístico subjacente está em conformidade com os dados.

[000172] Um exemplo ilustrativo do desenvolvimento de um teste diagnóstico usando um conjunto dos biomarcadores inclui o pedido de um classificador de Bayes ingênuo, um simples classificador probabi- lístico baseado no teorema de Bayes com rigoroso tratamento inde- pendente dos biomarcadores. Cada biomarcador é descrito por uma função de densidade da probabilidade dependente da classe (pdf) para os valores medidos RFU ou log RFU (unidades de fluorescência relativa) valores em cada classe. Os conjunto pdfs para o conjunto dos biomarcadores em uma classe, presume-se ser o produto dos pdfs dependentes da classe individual para cada biomarcador. Formação de um classificador de Bayes ingênuo nesta quantidade de contexto para atribuir parâmetros ("parametrização") para caracterizar os pdfs dependentes da classe. Qualquer modelo subjacente para os pdfs dependentes da classe pode ser usado, mas o modelo geralmente deve conformar-se aos dados observados no conjunto de treinamento.

[000173] O desempenho do classificador de Bayes ingênuo é dependente do número e da qualidade dos biomarcadores usados para construir e treinar o classificador. Um único biomarcador executará em conformidade com a sua distância-KS (Kolmogorov-Smirnov). A adição dos biomarcadores subsequentes com boas distâncias KS (>0,3, por exemplo), em geral, melhorará o desempenho de classificação se os biomarcadores posteriormente adicionados são independentes do primeiro biomarcador. Usando a sensibilidade e especificidade como uma contagem do classificador, muitos classificadores de pontuação elevadas podem ser gerados com uma variação de um algoritmo guloso. (Um algoritmo guloso é qualquer algoritmo que se segue a meta- heurística de fazer a escolha localmente ideal em cada estágio com a esperança de encontrar o ideal global de resolução de problemas).

[000174] Outra maneira de descrever o desempenho de classificador é através de um receptor de funcionamento característico (ROC), ou simplesmente curva ROC ou plot ROC. O ROC é um plot gráfico da sensibilidade, ou taxa positiva verdadeira, vs taxa positiva falsa (1 - especificidade ou 1 taxa negativa verdadeira -), para um sistema de classificador binário como seu limite de discriminação é variado. O ROC também pode ser representado equivalentemente plotando a fração da saída positiva verdadeira dos positivos (TPR = taxa positiva verdadeira) vs a fração de saída positiva falsa dos negativos (FPR = taxa positiva falsa). Também conhecido como uma curva Característica de Operação Relativa, porque é uma comparação de duas características operacionais (TPR & FPR) como as mudanças de critério. A área sob a curva ROC (AUC) é comumente usada como uma medida resumo de acurácia diagnóstica. Isto pode assumir valores de 0,0 a 1,0. A AUC tem uma propriedade estatística importante: a AUC de um classificador é equivalente à probabilidade que o classificador classificará uma instância positiva escolhida aleatoriamente maior do que uma instância negativa escolhida aleatoriamente (Fawcett T, 2006. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters .27: 861874). Isso é equivalente para o teste de Wilcoxon de fileiras (Hanley, J.A., McNeil, B.J., 1982. The meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve. Radiology 143, 29-36.).

[000175] As modalidades exemplares usam qualquer número dos biomarcadores listados nas Tabelas 3, 4, 6, 7, 8 e 9 em várias combinações para produzir testes de diagnóstico para a identificação dos indivíduos com NAFLD. Os biomarcadores listados nas Tabelas 3, 4, 6, 7, 8 e 9 podem ser combinados de várias maneiras para produzir classificadores. Em algumas modalidades, painéis de biomarcadores são compreendidos dos conjuntos diferentes dos biomarcadores dependendo de um critério de desempenho diagnóstico específico que está selecionado. Por exemplo, certas combinações dos biomarcado- res podem produzir testes que são mais sensíveis (ou mais específicas) do que outras combinações. Em algumas modalidades, um painel dos biomarcadores para identificação dos indivíduos com NAFLD é selecionado os painéis na Tabela 5.

[000176] As modalidades exemplares usam qualquer número dos biomarcadores listados nas Tabelas 3, 4, 6, 7, 8 e 9 em várias combinações para produzir testes de diagnóstico para a identificação dos indivíduos com esteatose. Os biomarcadores listados nas Tabelas 3, 4, 6, 7, 8 e 9 podem ser combinados de várias maneiras para produzir classificadores. Em algumas modalidades, painéis de biomarcadores são compreendidos dos conjuntos diferentes dos biomarcadores de-pendendo de um critério de desempenho diagnóstico específico que está selecionado. Por exemplo, certas combinações dos biomarcado- res podem produzir testes que são mais sensíveis (ou mais específicas) do que outras combinações. Em algumas modalidades, um painel dos biomarcadores para identificação dos indivíduos com esteatose é selecionado os painéis na Tabela 5. Em algumas modalidades, um painel dos biomarcadores para identificação dos indivíduos com estea- tose compreende os biomarcadores na Tabela 3. Em algumas modalidades, um painel dos biomarcadores para identificação dos indivíduos com esteatose compreende os biomarcadores na Tabela 8.

[000177] As modalidades exemplares usam qualquer número dos biomarcadores listados nas Tabelas 3, 4, 6, 7, 8 e 9 em várias combinações para produzir testes de diagnóstico para a identificação dos indivíduos com NASH. Os biomarcadores listados nas Tabelas 3, 4, 6, 7, 8 e 9 podem ser combinados de várias maneiras para produzir classificadores. Em algumas modalidades, painéis de biomarcadores são compreendidos dos conjuntos diferentes dos biomarcadores dependendo de um critério de desempenho diagnóstico específico que está selecionado. Por exemplo, certas combinações dos biomarcadores podem produzir testes que são mais sensíveis (ou mais específicas) do que outras combinações. Em algumas modalidades, um painel dos biomarcadores para identificação dos indivíduos com NASH é selecionado os painéis na Tabela 5. Em algumas modalidades, um painel dos biomarcadores para identificação dos indivíduos com NASHcompre- ende os biomarcadores na Tabela 4. Em algumas modalidades, um painel dos biomarcadores para identificação dos indivíduos com NASH compreende os biomarcadores na Tabela 9.

[000178] As modalidades exemplares usam qualquer número dos biomarcadores listados nas Tabelas 3, 4, 6, 7, 8 e 9 em várias combinações para produzir testes de diagnóstico para a identificação dos indivíduos com NAFLD, esteatose e/ou NASH. Os biomarcadores listados nas Tabelas 3, 4, 6, 7, 8 e 9 podem ser combinados de várias maneiras para produzir classificadores. Em algumas modalidades, painéis de biomarcadores são compreendidos dos conjuntos diferentes dos biomarcadores dependendo de um critério de desempenho diagnóstico específico que está selecionado. Por exemplo, certas combinações dos biomarcadores podem produzir testes que são mais sensíveis (ou mais específicas) do que outras combinações. Em algumas modalidades, um painel dos biomarcadores para identificação dos in-divíduos com NAFLD, esteatose e/ou NASH é selecionado dos painéis na Tabela 5.

[000179] Em algumas modalidades, uma vez que um painel é definido para incluir um conjunto específico dos biomarcadores das Tabelas 3, 4, 6, 7, 8 e 9 e um classificador é construído a partir de um conjunto dos dados de treinamento, os parâmetros de teste de diagnóstico estão completos. Em algumas modalidades, uma amostra biológica é executada em um ou mais ensaios para produzir os níveis relevantes do biomarcador quantitativo usados para classificação. Os níveis do biomarcador medidos são usados como entrada para o método de classificação que produz uma classificação e uma pontuação opcional para o exemplo que reflete a confiança da atribuição da classe.

[000180] Em algumas modalidades, uma amostra biológica é opcionalmente diluída e executar um ensaio do aptâmero multiplexado e dados são avaliados como segue. Primeiro, os dados do ensaio são opcionalmente normalizados e calibrados, e os níveis do biomarcador resultante são usados como entrada para um esquema de classificação de Bayes. Em segundo lugar, a relação da probabilidade de log é calculado para cada biomarcador medido individualmente e então somado para produzir uma pontuação de classificação final, que também é referida como uma pontuação diagnóstica. O trabalho resultante, bem como a pontuação geral de classificação pode ser relatada. Em algumas modalidades, os fatores de risco de probabilidade de log individuais calculados para cada nível de biomarcador podem ser reportados também.

Kits

[000181] Qualquer combinação dos biomarcadores aqui descrita podem ser detectadas usando um kit adequado, como para uso na execução dos métodos divulgados neste documento. Além disso, qualquer kit pode conter um ou mais rótulos detectáveis como descritos neste documento, como uma fração fluorescente, etc.

[000182] Em algumas modalidades, um kit inclui (a) um ou mais reagentes de captura (tais como, por exemplo, pelo menos um aptâmero ou anticorpo) para detecção dos biomarcadores de uma ou mais numa amostra biológica e, opcionalmente, (b) um ou mais software ou produtos do programa de computador para prever se o indivíduo de quem obteve-se a amostra biológica tem NAFLD, esteatose e/ou NASH (tal como estágio 1 2, 3, ou 4 de NASH ou estágio 2, 3 ou 4 de NASH). Alternativamente, em vez de um ou mais produtos de programa de computador, uma ou mais instruções para executar manualmente as etapas acima por um ser humano podem ser fornecidas.

[000183] Em algumas modalidades, um kit compreende um suporte sólido, um reagente de captura e um sinal gerando material. O kit também inclui instruções para uso dos dispositivos e reagentes, manipulação da amostra e análise dos dados. Ainda o kit pode ser usado com um sistema de computador ou software para analisar e relatar o resultado da análise da amostra biológica.

[000184] Os kits também podem conter um ou mais reagentes (por exemplo, tampões de solubilização, detergentes, lavagens ou tampões) para processarem uma amostra biológica. Qualquer um dos kits descritos neste documento também podem incluir, por exemplo, amortecedores, agentes de bloqueio, materiais de matriz de espectrometria de massa, agentes de captura dos anticorpos, amostras de controle positivo, amostras do controle negativo, software e informações como dados de referência, orientação e protocolos.

[000185] Em algumas modalidades, os kits são fornecidos para a análise de NAFLD e/ou NASH, em que os kits compreendem iniciadores de PCR para um ou mais biomarcadores aqui descritos. Em algumas modalidades, um kit adicional pode incluir instruções de uso e correlação dos biomarcadores com prognóstico NAFLD e/ou NASH. Em algumas modalidades, um kit pode incluir um ensaio de DNA que contém o complemento de um ou mais dos biomarcadores descritos neste documento, os reagentes e/ou enzimas para amplificar ou isolar a amostra de DNA. Os kits podem incluir reagentes para PCR em tempo real, por exemplo, sondas TaqMan e/ou iniciadores e enzimas.

[000186] Por exemplo, um kit pode compreender (a) reagentes que compreendem a captura de pelo menos um reagente para a determinação do nível de um ou mais biomarcadores em uma amostra de teste e, opcionalmente, (b) um ou mais algoritmos ou programas de computador para executar as etapas de comparar a quantidade de cada biomarcador quantificado na amostra de um ou mais pontos de corte pré-determinado. Em algumas modalidades, um programa de computador ou algoritmo atribui uma pontuação para cada biomarcador quantificado com base na comparação referida e, em algumas modalidades, combina as pontuações atribuídas para cada biomarcador quantificado para obter uma pontuação total. Além disso, em algumas modalidades, um programa de computador ou algoritmo compara a pontuação total, com uma pontuação pré-determinada e usa a comparação para determinar se o indivíduo tem NAFLD, esteatose e/ou NASH. Alternativamente, em vez de um ou mais produtos de programa de computador ou algorítimos, uma ou mais instruções para executar manualmente as etapas acima por um ser humano podem ser fornecidas.

Métodos de Computador e Software

[000187] Uma vez um biomarcador ou painel do biomarcador é selecionado, um método para avaliar NAFLD em um indivíduo pode compreender o seguinte: 1) coletar ou de outra forma obter uma amostra biológica; 2) executar um método analítico para detectar e medir o bi- omarcador ou biomarcadores no painel na amostra biológica; e 3) comunicar os resultados dos níveis do biomarcador. Em algumas modalidades, os resultados dos níveis do biomarcador são relatados qualitativamente do que quantitativamente, tais como, por exemplo, um diagnóstico proposto ("NAFLD," "esteatose", "NASH", "estágio 2, 3 ou 4 de NASH," etc.) ou simplesmente um resultado positivo/negativo onde "positivos" e "negativos" são definidos. Em algumas modalidades, um método para avaliar NAFLD em um indivíduo pode compreender o seguinte: 1) coletar ou de outra forma obter uma amostra biológica; 2) executar um método analítico para detectar e medir o biomarcador ou biomarcadores no painel na amostra biológica; 3) realizar qualquer normalização de dados ou normalização; 4) calcular cada nível do bi- omarcador; e 5) relatar os resultados dos níveis do biomarcador. Em algumas modalidades, os níveis do biomarcador são combinados em uma forma e um valor único para os níveis do biomarcador combinado é relatado. Nesta abordagem, em algumas modalidades, o valor relatado pode ser um único número determinado da soma de todos os cál- culos do biomarcador que é comparado com um valor de limite pré- estabelecido que é uma indicação da presença ou ausência de doença. Ou o resultado do diagnóstico pode ser uma série de barras que representam um valor do biomarcador e o padrão das respostas pode ser comparado a um padrão pré-estabelecido para determinação da presença ou ausência da doença.

[000188] Pelo menos algumas modalidades dos métodos descritos neste documento pode ser implementada com o uso de um computador. Um exemplo de sistema de computação 100 é mostrado na Figura 9. Tendo como referência a Figura 9, o sistema 100 é mostrado compreendido dos elementos de hardware que são eletricamente acoplados através de barreamento 108, incluindo um processador 101, dispositivo de entrada 102, dispositivo de saída de 103, dispositivo de armazenamento 104, leitor de mídia de armazenamento informático 105a, aceleração de processamento do sistema 106 comunicações (por exemplo, DSP ou processadores especiais), 107 e memória 109. Leitor de meios de armazenamento legíveis por computador 105a é ainda acoplado para meios de armazenamento legíveis por computador 105b, dispositivos de armazenamento remoto, local, fixo ou removível exaustivamente representando combinação além de mídia de armazenamento, memória, etc. para temporariamente e/ou mais permanentemente contendo informação legível por computador, que pode incluir dispositivo de armazenamento 104, memória 109 e/ou qualquer outro tal recurso de sistema acessível 100. Sistema 100 também compreende elementos de software (mostrados como sendo localizado atualmente dentro da memória de trabalho 191) incluindo um sistema operacional 192 e outro código 193, tais como programas, dados e afins.

[000189] Com relação a Figura 9, sistema 100 tem extensa flexibilidade e configurabilidade. Assim, por exemplo, uma única arquitetura pode ser utilizada para implementar um ou mais servidores podem ainda ser configurados atualmente em conformidade com protocolos desejáveis, variações do protocolo, extensões, etc. No entanto, será evidente para aqueles versados na técnica que as modalidades bem podem ser utilizadas em conformidade com requisitos mais específicos do pedido. Por exemplo, um ou mais elementos do sistema podem ser implementados como subelementos dentro de um componente de sistema 100 (por exemplo, no sistema de comunicações 106). Hardware personalizado também pode ser utilizado e/ou determinados elementos podem ser implementados em hardware, software ou ambos. Além disso, enquanto a conexão com outros dispositivos de computação tais como dispositivos de entrada/saída de rede (não mostrados) podem ser empregados, é para ser entendido que com fio, sem fio, modem e/ou outra conexão ou conexões com outros dispositivos de computação também podem ser utilizadas.

[000190] Em um aspecto, o sistema pode compreender um banco de dados que contém características da característica de biomarcadores de NAFLD e/ou NASH. Os dados do biomarcador (ou informações do biomarcador) podem ser utilizados como uma entrada para o computador para uso como parte de um método de computador implementado. Os dados do biomarcador podem incluir os dados conforme descrito neste documento.

[000191] Em um aspecto, o sistema ainda compreende um ou mais dispositivos para fornecer dados de entrada para um ou mais processadores.

[000192] O sistema compreende ainda uma memória para armazenar um conjunto de dados dos elementos dos dados classificados.

[000193] Em outro aspecto, o dispositivo para fornecer os dados de entrada compreende um detector para detectar a característica do elemento de dados, por exemplo, como um leitor de chip espectrôme- tro ou gene em massa.

[000194] Além disso, o sistema pode compreender um sistema de gerenciamento do banco de dados. Consultas ou solicitações de usuário podem ser formatadas em um idioma apropriado compreendido pelo sistema de gestão de banco de dados que processa a consulta para extrair as informações relevantes do banco de dados de formação de moda.

[000195] O sistema pode ser conectável a uma rede em que estão conectados a um servidor de rede e um ou mais clientes. A rede pode ser uma rede de área local (LAN) ou uma rede de área ampla (WAN), como é conhecido na técnica. De preferência, o servidor inclui o hardware necessário para a execução de produtos de programa de computador (por exemplo, software) para acesso do banco de dados para o processamento de solicitações do usuário.

[000196] O sistema pode incluir um sistema operacional (por exemplo, UNIX® ou Linux) para a execução das instruções de um sistema de gerenciamento do banco de dados. Em um aspecto, o sistema operacional pode operar em uma rede de comunicações globais, como a internet e utilizar um servidor de rede de comunicação global para se conectar a essa rede.

[000197] O sistema pode incluir um ou mais dispositivos que compreendem uma interface de exibição gráfica compreendendo elementos de interface, tais como botões, menus suspensos, barras de rolagem, campos para inserir texto, e assim como são rotineiramente encontrado na gráfica do usuário interfaces conhecido na técnica. As solicitações que entrou em uma interface de usuário podem ser transmitidas para um programa do pedido no sistema de formatação para pesquisar informações relevantes em um ou mais dos bancos de dados do sistema. Solicitações ou consultas, inseridas pelo usuário podem ser construídas em qualquer linguagem de banco de dados apro- priado.

[000198] A interface gráfica do usuário podem ser geradas por um código de interface gráfica do usuário, como parte do sistema operacional e pode ser usado para dados de entrada e/ou exibir dados introduzidos. O resultado dos dados processados pode ser exibido na interface, impresso em uma impressora na comunicação com o sistema, salvos em um dispositivo de memória, e/ou transmitidos pela rede ou pode ser fornecido sob a forma de meio legível de computador.

[000199] O sistema pode estar em comunicação com um dispositivo de entrada para o fornecimento de dados sobre elementos dos dados para o sistema (por exemplo, valores de expressão). Em um aspecto, o dispositivo de entrada pode incluir um sistema de perfilagem da expressão de gene incluindo, por exemplo, um espectrômetro em massa, leitor ou ensaio de chip de gene e afins.

[000200] Os métodos e aparelhos para análise de informação do bi- omarcador de acordo com as várias modalidades podem ser implementados de forma adequada, por exemplo, usando um programa de computador que operam em um sistema de computador. Um sistema de computador convencional, compreende um processador e uma memória de acesso aleatório, tal como um servidor de aplicativos remotamente acessíveis, servidor de rede, computador pessoal ou estação de trabalho pode ser usado. Componentes do sistema de computador adicionais podem incluir dispositivos de memória ou sistemas de armazenamento de informação, tal como um sistema de armazenamento em massa e uma interface de usuário, por exemplo, um monitor convencional, dispositivo de teclado e rastreamento. O sistema de computador pode ser um sistema independente ou parte de uma rede de computadores, incluindo um servidor e um ou mais bancos de dados.

[000201] O sistema de análise do biomarcador pode fornecer fun- ções e operações para concluir a análise dos dados, tais como dados de coleta, processamento, análise, relatórios e/ou diagnóstico. Por exemplo, em uma modalidade, o sistema de computador pode executar o programa de computador que pode receber, armazenar, pesquisar, analisar e reportar informações relativas aos biomarcadores. O programa de computador pode compreender vários módulos para executar várias funções ou operações, como um módulo de processamento para processamento de dados brutos e gerando dados complementares e um módulo de análise para análise de dados brutos e dados complementares para gerar um estado de doença e/ou diagnóstico. Identificando o NAFLD, esteatose e/ou NASH pode compreender gerar ou coletar outras informações, incluindo a informação biomédica adicional, relativas à condição do indivíduo em relação à doença, identificando ainda se os testes podem ser desejáveis, ou caso contrário, avaliando o estado de saúde do indivíduo.

[000202] Algumas modalidades aqui descritas podem ser implementadas a fim de incluir um produto do programa de computador. Um produto do programa de computador pode incluir um meio legível do computador ter um código do programa legível do computador incorporado no suporte fazendo com que um programa do aplicativo execute um computador com um banco de dados.

[000203] Como usado neste documento, um "produto de programa de computador" se refere a um conjunto organizado de instruções em forma de instruções de linguagem de programação ou naturais que estão contidos em um suporte físico de qualquer natureza (por exemplo, escrito, eletrônico, magnético, óptico ou de outra forma) e que pode ser usado com um computador ou outro sistema de processamento de dados automatizados. Tais instruções de linguagem de programação, quando executado por um computador ou sistema de processamento de dados, com que o sistema de computador ou processamento de dados agem de acordo com o conteúdo específico das demonstrações. Produtos de programa de computador incluem sem limitação: programas nas bibliotecas de dados e/ou o teste ou o código fonte e objeto incorporado em um meio legível do computador. Além disso, o produto de programa de computador que permite que um sistema de computador ou dispositivo de equipamento de processamento de dados agem de maneiras pré-selecionadas podendo ser fornecidas em várias formas, incluindo, mas não se limitando ao código-fonte original, código de conjunto, código de objeto, linguagem de máquina, versões compactadas ou criptografadas dos equivalentes anteriores quaisquer e todos os equivalentes.

[000204] Em um aspecto, um produto de programa de computador é fornecido para indicar se um indivíduo tem NAFLD, se um indivíduo tem esteatose, e/ou se um indivíduo tem NASH (tais como o estágio 1, 2, 3 ou 4 de NASH, ou estágio 2, 3 ou 4 de NASH). O produto do programa de computador inclui um meio legível de computador, que consagra o código do programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa que compreende: código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem os níveis do biomarcador que correspondem a um ou mais dos biomarcadores aqui descritos e o código que executa um método de classificação que indica o NASH, esteatose, e/ou status de NASH do indivíduo como uma função dos níveis do biomarcador.

[000205] Enquanto várias modalidades têm sido descritas como métodos ou aparelhos, deve ser entendido que as modalidades podem ser implementadas por meio do código juntamente com um computador, por exemplo, código residente em um computador ou acessíveis pelo computador. Por exemplo, software e bancos de dados poderiam ser utilizados para implementar muitos dos métodos acima descritos.Assim, além das modalidades realizadas pelo hardware, assinala-se igualmente que essas modalidades podem ser realizadas através do uso de um artigo de fabricação compreendido por um meio utilizável do computador tendo um código de programa legível de computador fixado nele, que capacita as funções divulgadas nesta descrição. Portanto, isso é desejado que as modalidades sejam igualmente protegidas por essa patente no seu código de programa também. Além disso, as modalidades podem ser incorporadas como código armazenadona memória de um suporte informático de praticamente qualquer tipo, incluindo, sem limitação, RAM, ROM, meios magnéticos, meios óticos, ou media magneto-óptica. Ainda mais geralmente, as modalidades po-dem ser implementadas no software ou no hardware, ou qualquer combinação respectiva incluindo, mas não limitado ao software em execução em um processador de propósito geral, microcódigo, matrizes de lógica programável (PLAs) ou circuitos integrados de aplicação específica (ASICs).

[000206] É também previsto que as modalidades podem ser realizadas como sinais de computador incorporados em uma onda trandpor- tadora, bem como sinais (por exemplo, eléricos e ópticos) propagados através de um meio de transmissão. Assim, os vários tipos de informações discutidos acima poderiam ser formatados em uma estrutura, como uma estrutura de dados e transmitidos como um sinal elétrico através de um meio de transmissão ou armazenados num meio legível do computador.

Métodos de T ratamento

[000207] Em algumas modalidades, seguindo uma determinação de que um sujeito tem NAFLD, esteatose ou NASH, o sujeito se submete a um regime terapêutico para retardar ou impedir o agravamento da doença. Os regimes terapêuticos exemplares não limitantes para NA- FLD, esteatose e NASH incluem perda de peso, controle de açúcar no sangue e evitar álcool. Em algumas modalidades, um sujeito é fornecido a um agente terapêutico, tal como pioglitazona, vitamina E, e/ou metformina. Ver, por exemplo., Sanyal et al., 2010, NEJM, 362: 16751685. Em algumas modalidades, um sujeito sofre cirurgia de bypass gástrico (ou similar), por exemplo, a fim de acelerar a perda de peso.

[000208] Em algumas modalidades, métodos de monitorização NA- FLD são fornecidos. Em algumas modalidades, os presentes métodos para determinar se um sujeito tem NAFLD são realizados em um tempo de 0. Em algumas modalidades, o método é realizado novamente em um tempo 1 e opcionalmente, um tempo de 2 e, opcionalmente, um tempo de 3, etc., a fim de monitorar a progressão da NAFLD no sujeito. Em algumas modalidades, biomarcadores diferentes são usados nos pontos de tempo diferentes, dependendo do estado atual da doença do indivíduo e/ou dependendo da taxa em que a doença esteja prevista para o progresso.

Outros métodos

[000209] Em algumas modalidades, os biomarcadores e métodos aqui descritos são usados para determinar um prêmio de seguro médico e/ou um prêmio de seguro de vida. Em algumas modalidades, os resultados dos métodos descritos neste documento são usados para determinar um prêmio de seguro médico e/ou um prêmio de seguro de vida. Em alguns desses casos, uma organização que fornece solicitações de seguro ou de seguro de vida médicas ou caso contrário obtém informações sobre um status do sujeito NAFLD ou NASH e usa essa informação para determinar um prêmio de seguro ou o seguro de vida médico apropriado para o sujeito. Em algumas modalidades, o teste é solicitado por e pago por isso, a organização que fornece o seguro médico ou seguro de vida.

[000210] Em algumas modalidades, os biomarcadores e métodos aqui descritos são usados para prever e/ou gerir a uso de recursos médicos. Em algumas dessas modalidades, os métodos não são realizados com a finalidade de tal previsão, mas as informações obtidas com o método são usadas em tal uma previsão e/ou gestão da uso dos recursos médicos. Por exemplo, uma instalação de teste ou hospital pode reunir informações dos métodos presentes para muitos sujeitos a fim de prever e/ou gerir a uso de recursos médicos em uma instalação particular ou em uma determinada área geográfica.

EXEMPLOS

[000211] Os exemplos a seguir são fornecidos apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o âmbito do pedido, conforme definido pelas reivindicações acrescentadas. Técnicas de rotina biologia molecular descritas nos exemplos a seguir podem ser realizadas conforme descrito nos manuais de laboratório padrão, tais como Sambro- ok et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2001).

Exemplo 1. Sujeitos de Estudo NAFLD

[000212] As amostras utilizadas para identificar os biomarcadores foram do Geisinger Health. Foram coletadas amostras de soro e biópsias hepáticas foram realizadas em 576 pacientes obesos, antes que eles se submetessem à cirurgia bariátrica para perda de peso.

[000213] As amostras foram coletadas em tubos de soro superior vermelho e processadas por protocolo; brevemente, uma amostra foi permitida a coagular durante 30 minutos à temperatura ambiente e em seguida centrifugada a 1300xg por 10 minutos e a camada superior foi removida e armazenada a -80°. As amostras foram descongeladas uma vez para alíquotas e, uma vez, para o ensaio.

[000214] Para identificar os biomarcadores que distinguirão os indivíduos com NAFLD de indivíduos obesos normais e os biomarcadores que distinguirão os indivíduos com NASH de indivíduos com esteatose no fígado, o estudo dos sujeitos foram divididos em normal, três níveis de esteatose hepática (esteatose leve, moderada e severa) e quatro estágios de NASH, de acordo com os resultados da biópsia do fígado, usando o método de classificação de Brunt (Brunt et al., 2007, Modern Pathol., 20: S40-S48). Os grupos foram subclassificados como mostrado na Tabela 1.Tabela 1: Subclassificação de esteatose e grupos de estágio de NASH

[000215] Certas características para os indivíduos em cada um dos grupos acima descritos são mostrados na Tabela 2.Tabela 2: Sujeitos demográficos

[000216] Conforme mostrado na Tabela 2, idade, índice de massa corporal e os níveis de LDL foram determinados para os indivíduos e encontrados para serem equilibrados em todos os grupos.

Exemplo 2. Ensaio de Aptâmero Multiplexo para a Identificação do Bi-omarcador

[000217] A qualidade da amostra das amostras normal, NAFLD e NASH dos grupos acima mencionados foram avaliados comparando distribuições dos biomarcadores associados com o manuseio das amostras, como tesoura, lise celular e ativação de complemento em casos e controles. A qualidade da amostra era boa, e não havia nenhum viés de controle do caso.

[000218] Um ensaio do aptâmero multiplex foi usado para analisar as amostras e controles para identificar os biomarcadores preditivos de NAFLD e NASH. A análise multiplexada usada neste experimento incluiu aptâmeros para detectar proteínas 1129 no sangue dos volumes de amostra pequeno (~65 μl de soro ou plasma), com baixos limites de detecção (mediana de 1 pM), ~7 logs de faixa dinâmica e coeficiente média de ~5% de variação. O ensaio do aptâmero multiplex é descrito, por exemplo, em Gold et al. (2010) Aptamer-Based Multiplexed Prote- omic Technology for Biomarker Discovery. PLoS ONE 5(12): e15004; e Publicações U.S. N°: 2012/0101002 e 2012/0077695.

[000219] Seleção de estabilidade leva muitos subgrupos da metade dos dados e executa a seleção do biomarcador usando o classificador de lasso, que é um modelo de regressão logística regularizada. Ver, por exemplo, Meinshausen et al., 2010, J. Royal Statistical Soc: Series B (Statistical Methodology), 72: 417-473. O caminho de seleção para um único biomarcador é a proporção destes subconjuntos para que o biomarcador seja selecionado pelo modelo do lasso em uma faixa de lambda. Lambda é um parâmetro de ajuste que determina quantos bi- omarcadores são selecionados pelo lasso. A probabilidade de seleção máxima em um intervalo de valores de lambda é a derradeira métrica usada para selecionar um conjunto de biomarcadores.

[000220] Biomarcadores dos candidatos foram identificados pela seleção de estabilidade, que foram então usados para gerar o modelo de classificador de floresta aleatória. Veja, por exemplo, Shi et al., J. Comput. Graph. Stat. 15(1): 118-138 (2006). Brevemente, um preditor da floresta aleatória é um conjunto de preditores da árvore de classificação individual. Ver, por exemplo,, Breiman, Machine Learning, 45(1):: 5-32 (2001). Para cada observação, cada árvore individua vota para uma classe e a floresta prevê a classe que tem a pluralidade de votos. O usuário especifica o número de variáveis selecionadas aleatoriamente (mtry) a ser procurado através da divisão melhor em cada nó. O índice de Gini é usado como critério de divisão. Ver, por exemplo, Breiman et al., Classification and Regression Trees, Chapman and Hall, Nova York, 1984. A maior árvore possível cresceu e não é podada. O nó da raiz de cada árvore da floresta contém uma amostra de inicialização dos dados originais como o conjunto do treinamento. As observações que não estão no conjunto de treinamento, cerca de 1/3 do conjunto dos dados originais, são referidas como observações fora- de-saco (OOB). Um pode chegar a previsões OOB da seguinte maneira: para um caso dos dados originais, prever o resultado pelo voto de pluralidade envolvendo apenas aquelas árvores que não continham o caso em sua amostra de inicialização correspondente. Por estas previsões OOB com os resultados do conjunto de treinamento, um pode chegar a uma estimativa da taxa de erro de previsão, que é referida como a taxa de erro OOB.

[000221] A análise univariada foi realizada com o teste de Kolmogorov-Smirnov não paramétrica (estatística KS), que quantifica a distância entre a função de distribuição cumulativa de cada aptâmero para duas distribuições de referência do caso designado (esteatose leve, moderada e severa e/ou NASH 1-4) e controle (normal obeso). O desempenho do classificador da floresta aleatória é dependente do número e da qualidade dos biomarcadores usados para construir e treinar o classificador. Um biomarcador único executará em conformidade com sua distância KS e seu valor (análise de componentes principais) de PCA como exemplificado neste documento. Se uma métrica de desempenho do classificador é definida como a soma da sensibilidade (fração dos positivos verdadeiros, fTP ) e especificidade (uma fração a menos dos positivos falsos, 1 - fFp), um classificador perfeito terá uma pontuação de dois e um classificador aleatório, em média, terá uma pontuação de um. Usando a definição da distância KS, que valoriza x* o qual maximiza a diferença nas funções de cdf (função de distribuição cumulativa) pode ser encontrada através da resolução

[000222] para x, o qual leva, ou seja, a distância de KS que ocorre onde se cruzam os pdfs da classe dependente (funções de densidade de probabilidade). Substituindo este valor de x* para a expressão para a distância-KS produz a seguinte definição para KS

[000223] a distância KS é uma fração total a menos de erros usando um teste com um corte nox *, essencialmente um único classificador de Bayesian analito. Já definimos uma pontuação de sensibilidade + especificidade = 2- fFP - fFN , combinando a definição acima da distância KS vemos que sensibilidade + especificidade = 1 + KS . Nós seleci- onamos biomarcadores com uma estatística que é inerentemente adequado para classificadores de construção.

[000224] A adição dos biomarcadores subsequentes com boas distâncias KS (>0,3, por exemplo), em geral, melhorará o desempenho de classificação se os biomarcadores posteriormente adicionados são independentes do primeiro biomarcador. Usando a sensibilidade e especificidade como uma contagem do classificador, muitos classificadores de pontuação elevadas podem ser gerados com uma variação de um algoritmo guloso.

A. Classificador de esteatose

[000225] Com base nas classificações do sujeito, nós assumimos que todos os grupos de esteatose bem como estágio 1-4 de NASH tem gordura nas células do fígado. Um classificador (esteatose ou gordura no fígado) foi desenvolvido comparando indivíduos obesos de normais para todos os sujeitos de NAFLD.

[000226] Marcadores escolhidos pela seleção de estabilidade (ver Figura 1) foram fornecidos para um algoritmo aleatório de floresta para gerar um modelo. A curva ROC resultante é fornecida (veja abaixo).

[000227] Uma curva de ROC para um classificador de nove marcadores para NAFLD (esteatose) é mostrada na Figura 2. A área sob a curva (AUC) foi 0,90 +/-0,03. A sensibilidade foi de 92% e a especifici- dade foi de 63%, com um corte de 0,5.

[000228] A pontuação de probabilidade, ou seja, Prob(esteatose), do modelo de cada classificador foi plotado para cada indivíduo através de todos os grupos para avaliar se poderia ser usado como um modelo de severidade e monitoramento, além da decisão binária na qual foi construído (Figura 3). O plot mostra uma clara discriminação entre sem esteatose e esteatose e voto de probabilidade aumenta com o nível de esteatose. Sujeitos de NASH em todos os estágios têm estea- tose severa.

[000229] A Figura 4 mostra as funções de distribuição cumulativa (CDFs) para os 9 biomarcadores no classificador.

[000230] A Tabela 3 mostra os biomarcadores no classificador de 9 marcadores. A Tabela 3 fornece também um nome alternativo para determinados biomarcadores, o nome do gene e o número de adesão UniProt para cada biomarcador e se o biomarcador está presente nos níveis mais alto ou baixo na população NAFLD, em comparação com a população normal.Tabela 3: Classificador de nove biomarcadores para NAFLD

[000231] A Figura 3 mostra a caixa de gráficos para o classificador de nove biomarcadores em cada um dos grupos do sujeito (da esquerda para a direita: normal, esteatose leve, esteatose moderada, esteatose severa, NASH1, NASH2, NASH3 NASH4). A linha preta em cada caixa representa a média (ou 50opercentil) dos pontos dos dados, e a própria caixa representa o intervalo inter-quartil (IQR), as áreas englobam os pontos dos dados a 25o a 75 opercentil. Os traços estendem para cobrir os pontos dos dados dentro de 1,5 x IQR da parte superior e inferior da caixa.

B. Classificador de NASH (fibrose)

[000232] Todos os indivíduos com NASH tem alguma forma de inflamação e balonismo associados com fibrose. Comparamos, portanto, todos os grupos de esteatose, com estágios 2, 3 e 4 de NASh. Para garantir a identificação dos biomarcadores de fibrose de verdade, o grupo de estágio 1 de NASH foi excluído.

[000233] Marcadores escolhidos pela seleção de estabilidade (ver Figura 5) foram fornecidos para um algoritmo aleatório de floresta para gerar um modelo. O ROC resultante é fornecido abaixo.

[000234] Uma curva ROC para o classificador de quatro marcadores dos estágios 2, 3 e 4 de NASH (fibrose) é mostrada na Figura 6. A área sob a curva (AUC) foi 0,82 +/-0,07%, com uma sensibilidade de 62% e uma especificidade de 92% em um corte de 0,5.

[000235] A pontuação de probabilidade, ou seja, Prob(esteatose), do modelo de cada classificador foi plotado para cada indivíduo através de todos os grupos para avaliar se poderia ser usado como um modelo de severidade e monitoramento, além da decisão binária na qual foi construído (Figura 7). O plot mostra uma clara discriminação entre sem esteatose e esteatose e voto de probabilidade aumenta com o nível de esteatose. Sujeitos de NASH em todos os estágios têm estea- tose severa.

[000236] A Tabela 4 mostra os biomarcadores no classificador de 4 marcadores. A Tabela 4 fornece também um nome alternativo para determinados biomarcadores, o nome do gene e o número de adesão UniProt para cada biomarcador e se o biomarcador está presente nos níveis mais alto ou baixo nas populações de 2, 3 e 4 NASH, em comparação com as populações de NAFLD.Tabela 4: Classificador de quatro biomarcadores para os estágios 2, 3 e 4 de NASH contra esteatose (NAFLD)

[000237] A Figura 7 mostra a caixa de gráficos para o classificador de quatro biomarcadores em cada um dos grupos do sujeito (da esquerda para a direita: normal, esteatose leve, esteatose moderada, esteatose severa, NASH1, NASH2, NASH3 NASH4). A linha preta em cada caixa representa a média (ou 50opercentil) dos pontos dos dados, e a própria caixa representa o intervalo inter-quartil (IQR), as áreas englobam os pontos dos dados a 25o a 75 opercentil. Os traços estendem para cobrir os pontos dos dados dentro de 1,5 x IQR da parte superior e inferior da caixa.

[000238] A Figura 8 mostra as CDFs para os 4 biomarcadores no classificador.

Exemplo 3. Biomarcadores Adicionais e Classificadores para NAFLD e/ou NASH

[000239] Seleção de estabilidade leva muitos subgrupos da metade dos dados e executa a seleção do biomarcador usando o classificador de lasso, que é um modelo de regressão logística regularizada. Ver, por exemplo, Meinshausen et al., 2010, J. Royal Statistical Soc: Series B (Statistical Methodology), 72: 417-473. O caminho de seleção para um único biomarcador é a proporção destes subconjuntos para que o biomarcador seja selecionado pelo modelo do lasso em uma faixa de lambda. Lambda é um parâmetro de ajuste que determina quantos bi- omarcadores são selecionados pelo lasso. A probabilidade de seleção máxima em um intervalo de valores de lambda é a derradeira métrica usada para selecionar um conjunto de biomarcadores.

[000240] Usando o método de seleção de estabilidade, classificadores adicionais foram definidos para distinguir vários grupos de indivíduos. Os classificadores (incluindo os classificadores discutidos acima) são mostrados na Tabela 5. Marcadores de comparações 2 e 5 foram usados para construir um classificador de floresta aleatório para estea- tose (NAFLD) e fibrose (NASH), como discutido acima.Tabela 5. Classificadores obtidos usando a seleção de estabilidade *Todas as esteatoses: esteatose leve, moderada e severa

[000241] A comparação 1 na Tabela 5 mostra um classificador de 7 marcadores que distingue sujeitos de controle dos estágios 1 a 4 de NASH, com 86,4% de sensibilidade e especificidade de 82%. Comparação 3 mostra um classificador de 3 marcadores que distingue os indivíduos de controle contra todas as esteatoses (leve, moderada e severa) com 76,6% de sensibilidade e 74,4% de especificidade.

[000242] Para mais informações sobre os biomarcadores listados na Tabela 5 que não estão nas Tabelas 3 e 4 acima, são mostradas na Tabela 6.Tabela 6: Biomarcadores adicionais para NAFLD e/ou NASH

[000243] Os 25 biomarcadores superiores pela distância de KS uni- variada para o grupo de controle versus estágios 1 a 4 de NASH são mostrados na Tabela 7. Estes biomarcadores e combinações destes biomarcadores, podem ser usados para separar sujeitos de controle (tais como indivíduos obesos) dos sujeitos com NASH e/ou separar sujeitos de controle dos indivíduos com esteatose.Tabela 7: 25 biomarcadores superiors

Exemplo 4: Detecção do Biomarcador Exemplar Usando Aptâmeros

[000244] Um método de detecção dos biomarcadores exemplares de uma ou mais numa amostra é descrita, por exemplo, em Kraemer et al., PLoSOne 6(10): e26332, e é descrito abaixo. Três métodos de quantificação diferentes: hibridização baseada em microarranjo, um método baseado no grânulo de Luminex e qPCR, são descritos.

Reagentes

[000245] HEPES, NaCl, KCl, EDTA, EGTA, MgCl2 e Tween-20 podem ser adquiridos, por exemplo, a partir das Biociências de Fisher. Sal de sódio de sulfato de dextrano (DxSO4), nominalmente 8000 peso molecular, pode ser adquirido, por exemplo, da AIC e é dialisado contra água desionizada pelo menos 20 horas com uma troca. Polime- rase de KOD EX DNA pode ser adquirida, por exemplo, da VWR. Cloreto de tetrametilamônio e CAPSO podem ser adquiridos, por exemplo, da Sigma-Aldrich e estreptavidina-ficoeritrina (SAPE) pode ser adquirido, por exemplo, de Moss Inc. cloridrato de-(2-Aminoetil)- benzenosulfonilfluoreto 4 (AEBSF) pode ser adquirido, por exemplo, da biotecnologia de Gold. Estreptavidina-revestida por placas de 96 poços podem ser adquiridas, por exemplo, da Thermo Scientific (Pierce Estreptavidina revestida por placas HBC, claras, 96 poços, número do produto de 15500 ou 15501). NHS-PEO4-biotina pode ser adquirida, por exemplo, da Thermo Scientific (EZ-Link NHS-PEO4-Biotina, número do produto 21329), dissolvidos em DMSO anidra e pode ser armazenado congelados em alíquotas de uso único. IL-8, MIP-4, Lipo- calina-2, RANTES, MMP-7 e MMP-9 podem ser adquiridos, por exemplo, de sistemas de R&D. Resistina e MCP-1 podem ser adquiridos, por exemplo, da PeproTech, e tPA podem ser adquiridos, por exemplo, da VWR.

Ácidos Nucleicos

[000246] Os oligodeoxinucleotídeos convencionais (incluindo amina- e biotina-substituídas) podem ser adquiridos, por exemplo, das Tecnologias de DNA Integrado (IDT). Z-Block é um oligodeoxinucleotídeo de cadeia única da sequência 5'-(AC-BnBn)7-AC-3. ', onde Bn indica um resíduo desoxiuridina de benzil substituídos. O bloco Z pode ser sinte- tizado usando química convencional de fosforamidita. Reagentes de captura do Aptâmero também podem ser sintetizados pela química do fosforamidita convencional e podem ser purificados, por exemplo, em uma coluna de 75mm PRP-3 x 21,5, operando a 80°C em um Águas de autopurificação do sistema 2767 (ou sistema semi-automático de série 600 águas), usando, por exemplo, um aquecedor de TL-600 ou TL-150 Timberline e um gradiente de trietilamônio de bicarbonato (TEAB)/ACN para eluir o produto. Detecção é executada em 260 nm e frações são coletadas através do pico principal antes do pool das melhores fracções.

Tampões

[000247] Tampão de SB18 é composto de 40 mM de HEPES, 101 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 5 mM de MgCl2 e 0,05% de Tween 20 (v/v) ajustados ao pH de 7,5 com NaOH. Tampão de SB17 é SB18 suplementado com 1 mM de EDTA trissódico. Tampão de PB1 é composto de 10 mM de HEPES, 101 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 5 mM de MgCl2 e 1mM de EDTA trissódio e 0,05% de Tween 20 (v/v) ajustados ao pH de 7,5 com NaOH. Tampão de eluição CAPSO consiste de 100 mM de CAPSO de pH 10,0 e 1 M de NaCl. Tampão de neutralização contém de 500 mM de HEPES, 500 mM de HCl e 0,05% de Tween-20 (v/v). Tampão de hibridização da Agilent é uma formulação proprietária que é fornecida como parte de um kit (Kit de hibridação de Oligo aCGH/Chip-no-chip). Tampão de Lavagem da Agilent 1 é uma formulação patenteada (tampão de lavagem 1 de Oligo aCGH/ChIP-no-chip, Agilent). Tampão de Lavagem da Agilent 2 é uma formulação patenteada (Tampão de lavagem 2 de Oligo aCGH/ChIP-no-chip, Agilent). Solução de hibridação TMAC consiste de cloreto de tetrametilamônio de 4,5 M, EDTA trissódico de 6 mM, 75 mM Tris-HCl (pH 8,0) e 0,15% (v/v) Sarkosyl. Tampão de KOD (10-vezes concentrado) consiste de 1200 mM de Tris-HCl, 15mM de MgSO4, 100 mM de KCl, 60 mM de (NH4) 2SO4, 1% de v/v Triton X 100 e 1 mg/mL de BSA.

Preparação de amostras

[000248] Soro (armazenado a -80°C em 100 μl de alíquotas) é descongelado em banho de água de 25°C durante 10 minutos, em seguida, armazenado no gelo antes da diluição da amostra. As amostras são misturadas no vórtice suave durante 8 segundos. Uma solução de amostra de soro 6% é preparada pela diluição em 0,94 x SB17 suplementado com 0,6 de mM MgCl2, 1 mM de EGTA trissódico, 0,8 mM AEBSF e 2 μM do bloco Z. Uma porção da solução de estoque de soro 6% é diluída 10-vezes em SB17 para criar um estoque de soro de 0,6%. Os estoques de 6% e 0,6% são usados, em algumas modalida-des, para detectar analitos de alta e baixa abundância, respectivamente.

O reagente de captura (aptâmero) e preparação da placa de estrepta- vidina

[000249] Os aptâmeros são agrupados em 2 misturas de acordo com a abundância relativa de seus analitos cognatos (ou biomarcadores). As concentrações de estoque são 4 nM para cada aptâmero e a concentração final de cada aptâmero é 0,5 nM. As misturas de estoque de aptâmero são diluídas 4-vezes no tampão de SB17, aquecidas a 95°C por 5 min e resfriadas a 37°C por um período anterior de 15 minutos para uso. Este ciclo de renaturalização por desnaturação destina-se a normalizar as distribuições conformadoras do aptâmero e dessa forma garantir atividades reprodutíveis dos aptâmeros apesar das histórias variáveis. As placas de estreptavidina são lavadas duas vezes com 150 μL do tampão PB1, antes de usar.

Equilibrio e placa de captura

[000250] Calor refrigerado 2 x misturas do aptâmero (55 μL) são combinados com um volume igual de 6% ou 0,6% diluições do soro, produzindo misturas de equilíbrio contendo soro de 3% e 0,3%. As placas são seladas com um Tapete de Vedação de Silicone (Axymat Silicone sealing mat, VWR) e incubadas durante 1,5 h a 37°C. Misturas de equilibração são então transferidas para os poços de uma placa de estreptavidina lavadas por 96 poços e incubadas ainda em um conjunto de Eppendorf Thermomixer a 37°C, com agitação a 800 rpm, durante duas horas.

Manual do ensaio

[000251] A menos que especificado em contrário, o líquido é removido pelo despejo, seguido de dois toques em toalhas de papel em camadas. Volumes de lavagem são 150 μL e todas as incubações agitando são feitas em um conjunto de Eppendorf Thermomixer a 25°C, 800 rpm. Misturas de equilibração são removidas pela pipetagem, e placas são lavadas duas vezes durante 1 minuto com tampão de PB1 suplementado com sulfato de dextrano de 1 mM e 500 μM de biotina e, em seguida, 4 vezes por 15 segundos com tampão de PB1. Uma solução feita recentemente de 1mM de NHS-PEO4-biotina no tampão de PB1 (150 μL/poço) é adicionado, e as caixas são incubadas por 5 minutos, com agitação. A solução de NHS-biotina é removida, e placas lavadas 3 vezes com tampão de PB1 suplementado com glicina de 20 mM e 3 vezes com tampão de PB1. Oitenta e cinco μL do tampão de PB1 suplementado com 1 mM DxSO4 é adicionado para cada poço e placas são irradiadas sob uma lâmpada de UV de BlackRay (comprimento de onda nominal 365 nm) a uma distância de 5 cm para 20 minutos, com agitação. As amostras são transferidas para uma placa fresca, lavada com estreptavidina revestida, ou um poço não utilizado das placas de estreptavidina existentes lavadas, combinando alta e baixa misturas de diluição da amostra em um único poço. As amostras são incubadas à temperatura ambiente com agitação por 10 minutos. O material não adsorvido é removido e as placas lavadas 8 vezes por 15 segundos cada uma com tampão de PB1 suplementado com 30% de glicerol. As placas são então lavadas uma vez com tampão de PB1. Aptâmeros são eluídos por 5 minutos em temperatura ambiente com tampão de eluição de 100 μL CAPSO. 90 μL do eluato é transferido para uma placa de HybAid de 96 poços e tampão de neutralização de 10 μL é adicionado.

Ensaio semi-automático

[000252] As placas de estreptavidina de rolamento adsorvidas pelas misturas de equilibração são colocadas no convés de um lavador de placa BioTek EL406, que está programado para realizar as seguintes etapas: material não adsorvido é removido por aspiração, e poços são lavados 4 vezes com 300 μL de tampão PB1 suplementado com sulfato de dextrano de 1 mM e 500 μM de biotina. Poços são então lavados 3 vezes com tampão de 300 μL de PB1. 150 μL de uma solução recentemente preparada (a partir de um estoque de 100 mM em DMSO) de 1mM NHS-PEO4-biotina no tampão PB1 é adicionada. As placas são incubadas por 5 minutos, com agitação. Líquido é aspirado, e poços são lavados 8 vezes com tampão de 300 μL PB1 suplementado com glicina de 10 mM. Somam-se 100 μL de tampão PB1 suplementado com sulfato de dextrano de 1 mM. Após estas etapas automatizadas, as placas são removidas da máquina de lavar placa e colocadas em um termoagitador montado sob uma fonte de luz UV (BlackRay, comprimento de onda nominal 365 nm) a uma distância de 5 cm por 20 minutos. O termoagitador está situado a 800 rpm e 25°C. Após a irradiação de 20 minutos, as amostras manualmente são transferidas para uma placa de estreptavidina fresca, lavada (ou um poço não utilizado das existentes placas lavadas). Alta-abundância (soro de 3% + 3% da mistura do aptâmero) e misturas de reação de baixa abundância (0,3% serum+0,3% mistura do aptâmero) são combinadas em um único poço neste ponto. Esta placa de "Catch-2" é colocada no convés do lavador de placa BioTek EL406, que está programado para realizar as seguin- tes etapas: a placa é incubada por 10 minutos, com agitação. Líquido é aspirado, e poços são lavados 21 vezes com tampão de 300 μL PB1 suplementado com glicerol de 30%. Poços são lavados 5 vezes com tampão de 300 μL PB1, e a lavagem final é aspirada. Tampão de elui- ção 100 μL CAPSO é adicionado, e aptâmeros são eluídos por 5 minutos, com agitação. Seguindo estas etapas automatizadas, a placa é então removida da plataforma da lavadora da placa e 90 μL alíquotas das amostras são transferidas manualmente aos poços de uma placa de 96 HybAid que contém 10 μL do tampão de neutralização.

Hibridização de microarranjos de Agilent 8x15 k personalizados

[000253] 24 μL do eluato neutralizado é transferido para uma nova placa de 96 poços e 6 μL de 10 x Agilent Block (Kit de hibridação de Oligo aCGH/ChIP-no-chip , grande Volume, Agilent 5188-5380), contendo um conjunto de controles de hibridização compostas de 10 Cy3 aptâmeros é adicionado a cada poço. 30 μL de 2 x tampão de hibridi- zação Agilent é adicionado para cada amostra e misturado. 40 μL da solução resultante da hibridação é pipetado manualmente em cada "poço" da lâmina da gaxeta de hibridação (Lâmina da Gaxeta de Hibri- dação, 8-microarranjos pelo formato da lâmina, Agilent). Lâminas de microarranjos Agilent personalizados, tendo 10 sondas por arranjo complementar para 40 regiões aleatórias de nucleotídeos de cada ap- tâmero com um ligador de dT x 20, são colocados sobre as lâminas da gaxeta de acordo com o protocolo dos fabricantes. O conjunto (Kit de Câmara de Hibridação - SureHyb-habilitado, Agilent) é apertado e incubado durante 19 horas a 60°C enquanto roda a 20 rpm.

Lavagem de pós-hibridação

[000254] Aproximadamente 400 mL de Tampão de Lavagem Agilent 1 é colocado em cada uma das duas placas de coloração de vidro separado. Lâminas (não mais de duas de uma vez) são desmontadas e separadas enquanto submersa em Tampão de Lavagem 1, então transferidos para um suporte para lâminas em uma segunda placa de coloração também contendo Tampão de Lavagem 1. Lâminas são incubadas por mais 5 minutos no Tampão de Lavagem 1 com agitação. Lâminas são transferidas para Tampão de Lavagem 2 pré-incubado a 37°C e incubadas por 5 minutos, com agitação. Lâminas são transferidas para uma quarta placa contendo acetonitrila a coloração e incubadas por 5 minutos, com agitação.

Microarranjo de Imagem

[000255] As rimari de microarranjo são fotografadas com um Sistema de Varredura de Microarranjo G2565CA Agilent, usando o canal de Cy3 em resolução de 5 μm na configuração de PMT de 100%, e a opção de XRD habilitado em 0,05. As imagens TIFF rimaries são processadas usando o software de extração de característica Agilent versão 10.5.1.1 com o rimarie GE1_105_Dec08. Dados rimaries da Agilent estão disponíveis como Informação Suplementar (Figura S6).

Projeto de sonda Luminex

[000256] As sondas imobilizadas para grânulos têm 40 desoxinucleo- tídeos complementares à extremidade 3' da região de 40 nucleotídeos aleatórios do aptâmero alvo. A região do aptâmero complementar é acoplada às Microesferas Luminex através de um ligador de hexaetile- neglicol (HEG), tendo um terminal amino 5'. Deoxioligonucleotídeos de detecção biotinilado compreendem 17-21 desoxinucleotídeos complementares à região 5' da primeira demão dos aptâmeros alvo. Metades de biotina são anexadas às extremidades 3' dos oligos da detecção.

Acoplamento de sondas para Microesferas Luminex

[000257] As sondas são acopladas às Microesferas Luminex Micro- plex essencialmente segundo as instruções do fabricante, mas com as seguintes modificações: quantidades de oligonucleotídeos amino- terminal são 0,08 de nMol por 2,5 x 106 microesferas, e a segunda adição de EDC é de 5 μl a 10 mg/mL. As Reações de acoplamento são executadas em um conjunto de ThermoShaker de Eppendorf a 25°C e 600 rpm.

Hibridização da microesfera

[000258] As Soluções de estoque da microesfera (cerca de 40000 microesferas/μl) são vórtice e sonicados em um Limpador ultrassônico de Sônico Saudável (Modelo: T1.9C) por 60 segundos para suspender as microesferas. Microesferas suspensas são diluídas de microesferas de 2000 pela reação em 1,5 x soluções de hibridização TMAC e mixa- das por um Vórtice e sonicação. Trinta e três μL pela reação da mistura do grânulo são transferidos na placa de HybAid de 96 poços. 7 μL de 15 nM da detecção biotinilada do estoque de oligonucleotídeo no tampão de 1 x TE são adicionados para cada reação e misturado. São adicionados 10 μL da amostra de ensaio neutralizados e a placa é selada com um selo de esteira de tampão de silicone. A placa é primeiro incubada a 96°C por 5 minutos e incubada a 50°C, sem agitação durante a noite em um forno convencional da hibridação. Uma placa de filtro (Dura poro, Millipore número de peça MSBVN1250, tamanho de poro de 1,2 μm) é pré molhada com 75 μL de 1 x solução de hibrida- ção de TMAC, suplementado com 0,5% (p/v) BSA. O volume da amos-tra inteira da reação de hibridização é transferido para a placa do filtro. A placa de hibridização é lavada com solução de hibridação TMAC 1 x 75 μL contendo 0,5% de BSA e qualquer material restante é transferido para a placa do filtro. As amostras são filtradas sob vácuo lento, com 150 μL do tampão evacuado durante cerca de 8 segundos. A placa do filtro é lavada uma vez com 75 μl de 1 x solução de hibridização de TMAC contendo 0,5% de BSA e as microesferas na placa de filtro são ressuspensas em 75 μL de 1 x na solução de hibridização TMAC contendo 0,5% de BSA. A placa do filtro é protegida da luz e incubada em Eppendorf Thermalmixer R durante 5 minutos a 1000 rpm. A placa do filtro é então lavada uma vez com 75 μL 1x solução de hibridação do TMAC contendo 0,5% de BSA. 75 μL de ficoeritrina de estreptavidi- na de 10 μg/mL (SAPE-100, MOSS, Inc.) na 1x solução de hibridação TMAC é adicionada para cada reação e incubada em Eppendorf Thermalmixer R a 25°C a 1000 rpm durante 60 minutos. A placa do filtro é lavada duas vezes com 75 μl de 1 x solução de hibridização de TMAC contendo 0,5% de BSA e as microesferas na placa de filtro são ressuspensas em 75 μL de 1 x na solução de hibridização TMAC contendo 0,5% de BSA. A placa do filtro é então protegida da luz e incu-bada em Eppendorf Thermalmixer R durante 5 minutos a 1000 rpm. A placa do filtro é então lavada uma vez com 75 μL 1x solução de hibri- dação do TMAC contendo 0,5% de BSA. Microesferas são ressuspe- sas em 75 μL de 1 x solução de hibridização TMAC suplementada com 0,5% BSA e analisadas em um instrumento de 100 Luminex executando o software 3,0 XPonent. Pelo menos 100 microesferas são contadas por tipo de grânulo sob alta calibração de PMT e um discri- minador de definição de 7500 para 18000.

Leitura QPCR

[000259] As curvas padrão para qPCR são preparadas em água variando de 108 a 102 cópias com diluições de 10 vezes e um controle de não modelo. As amostras de ensaio neutralizadas são diluídas 40 vezes em diH2O. A mistura de master qPCR é preparada na concentração final de 2 x (2 x tampão de código, mistura de dNTP 400 μM, mistura do iniciador de frente e verso 400 nM, 2 x SYBR Green I e 0,5 U KOD EX). 10 μL de 2 x master mistura qPCR é adicionado a 10 μL da amostra de ensaio diluído. O qPCR é executado em um iCycler de BioRad MyIQ com 2 minutos a 96°C, seguida de 40 ciclos de 96°C por 5 segundos e 72°C por 30 segundos.

Exemplo 5. Análises adicionais de NAFLD e NASH

[000260] Os dados de ensaio do aptâmero multiplex descrito no Exemplo 2, para as amostras descritas no Exemplo 1 foram submetidos a uma análise mais aprofundada, usando um modelo de regressão logística.

[000261] Seleção de estabilidade leva muitos subgrupos da metade dos dados e executa a seleção do biomarcador usando o classificador de lasso, que é um modelo de regressão logística regularizada. Ver, por exemplo, Meinshausen et al., 2010, J. Royal Statistical Soc: Series B (Statistical Methodology), 72: 417-473. O caminho de seleção para um único biomarcador é a proporção destes subconjuntos para que o biomarcador seja selecionado pelo modelo do lasso em uma faixa de lambda. Lambda é um parâmetro de ajuste que determina quantos bi- omarcadores são selecionados pelo lasso. A probabilidade de seleção máxima em um intervalo de valores de lambda é a derradeira métrica usada para selecionar um conjunto de biomarcadores.

C. Classificador de esteatose

[000262] Com base nas classificações do sujeito, nós assumimos que todos os grupos de esteatose bem como estágio 1-4 de NASH tem gordura nas células do fígado. Um classificador (esteatose ou gordura no fígado) foi desenvolvido comparando indivíduos obesos normais para todos os sujeitos de NAFLD e NASH.

[000263] Marcadores foram ajustados com modelos de regressão logística para gerar classificadores.

[000264] A Tabela 8 mostra os biomarcadores no classificador de esteatose de 8 marcadores (NAFLD). A Tabela 8 também mostra os coeficientes de regressão logística para o modelo e o intervalo de confiança de 95% para a estimativa do coeficiente. O classificador de 8 marcadores contém todos os marcadores dos 9 marcadores classificados mostrados na Tabela 3, exceto para PLAT.Tabela 8: Classificador de oito biomarcadores para NAFLD

[000265] A Figura 12 mostra a caixa de gráficos para o classificador de 8 marcadores para cada conjunto de esteatose e sujeitos de NASH. A linha preta em cada caixa representa a média (ou 50opercentil) dos pontos dos dados, e a própria caixa representa o intervalo inter-quartil (IQR), as áreas englobam os pontos dos dados a 25o a 75 opercentil. Os traços estendem para cobrir os pontos dos dados dentro de 1,5 x IQR da parte superior e inferior da caixa. O plot mostra uma clara discriminação entre sem esteatose e esteatose e voto de probabilidade aumenta com o nível de esteatose. Sujeitos de NASH em todos os estágios têm esteatose severa.

D. Classificador de NASH (fibrose)

[000266] Todos os indivíduos com NASH tem alguma forma de inflamação e balonismo associados com fibrose. Para esta análise, comparamos os grupos de esteatose leve e moderada paro estágios 2, 3 e 4 de NASH. Para garantir a identificação dos biomarcadores de fibrose de verdade, o grupo de estágio 1 de NASH foi excluído. Sujeitos com esteatose grave foram omitidos nesta análise pela amostragem de biópsia em sujeitos que poderiam ter perdido alguma fibrose.

[000267] Marcadores foram ajustados com modelos de regressão logística para gerar classificadores para gerar um modelo.

[000268] A Tabela 9 mostra os biomarcadores no classificador de fibrose de 8 marcadores (NASH). A Tabela 9 também mostra os coeficientes de regressão logística para o modelo e o intervalo de confiança de 95% para a estimativa do coeficiente. O classificador de 8 marcadores contém todos os marcadores dos 4 marcadores classificados, mostrados na Tabela 4, além dos quatro marcadores adicionais.Tabela 9: Classificador de oito biomarcadores para os estágios 2, 3 e 4 de NASH contra esteatose leve a moderada (NAFLD)

[000269] A Figura 13 mostra a caixa de gráficos para o c assificador de 8 biomarcadores em cada um dos grupos do sujeito (da esquerda para a direita: normal, esteatose leve, esteatose moderada, esteatose severa, NASH1, NASH2, NASH3 NASH4). A linha preta em cada caixa representa a média (ou 50opercentil) dos pontos dos dados, e a própria caixa representa o intervalo inter-quartil (IQR), as áreas englobam os pontos dos dados a 25o a 75 opercentil. Os traços estendem para cobrir os pontos dos dados dentro de 1,5 x IQR da parte superior e inferior da caixa.

[000270] Os quatro biomarcadores adicionais no classificador de fibrose na Tabela 9 são mostrados na Tabela 10, juntamente com nomes alternativos, nomes de gene e o número de adesão UniProt de cada biomarcador.Tabela 10: Biomarcadores adicionais na fibrose de 8 classificadores do biomarcador

[000271] A Figura 14 mostra as funções de distribuição cumulativa para os quatro marcadores adicionais no classificador de oito marcadores para fibrose.

Exemplo 6. Desocultação das amostras cegas

[000272] Conforme mostrado na Tabela 2, um conjunto de amostras em cada um do controle, esteatose leve, esteatose moderada, estea- tose severa, estágio 1 de NASH e estágio 2 de NASH estavam cegos. A probabilidade que cada uma das amostras cegas era de um sujeito com esteatose foi determinada utilizando o classificador de 8 marcadores mostrado na Tabela 8. A Figura 15 mostra a caixa de gráficos para as amostras cegas depois da ocultação, de acordo com o seu grupo de amostra real.

[000273] A Figura 16 mostra o desempenho do classificador de este- atose de 8 marcadores para o conjunto da descoberta e para o conjunto de validação cega. A curva superior é a curva ROC para o conjunto de descoberta, que tem uma área-sob-curva (AUC) de 0,927 ± 0,03 e uma sensibilidade de 92,8% e especificidade de 73,3% em um corte de 0,5. A curva inferior é a curva ROC para o conjunto de validação cega, que como um AUC de 0,889 ± 0,06 e uma sensibilidade de 88% e uma especificidade de 65,8% em um corte de 0,5.

[000274] A Tabela 10 mostra o desempenho do classificador de es- teatose de 8 marcadores para o conjunto de validação cega para a identificação de um sujeito como por esteatose positiva ou negativa.Tabela 10: Desempenho de 8 classificadores de esteatose marcador para cegar a validação definida

[000275] A probabilidade que cad a uma das amosl tras cegas era de um sujeito com fibrose foi determinada utilizando o classificador de 8 marcadores mostrado na Tabela 9. A Figura 17 mostra a caixa de gráficos para as amostras cegas depois da ocultação, de acordo com o seu grupo de amostra real.

[000276] A Figura 18 mostra o desempenho do classificador de fibrose de 8 marcadores para o conjunto da descoberta e para o conjunto de duas validações cegas. O segundo conjunto de validação inclui o primeiro conjunto de validação mais o grupo normal (indivíduos negativos para doença). Porque o modelo não foi treinado com o grupo normal, é ingênuo àquelas amostras, que podem revelar positivos falsos. A curva superior (vermelho) é a curva ROC para o conjunto de descoberta (controle (esteatose suave + moderada) versus notas 2, 3 e 4 de NASH), que tem uma área-sob-curva (AUC) de 0,929 ± 0,04 e uma sensibilidade de 78,8% e especificidade de 89,9%, em um corte de 0,5. A curva média (azul) é a curva ROC para o primeiro conjunto de validação cega, que ten um AUC de 0,885 ± 0,11 e uma sensibilidade de 66,7% e uma especificidade de 84,6% em um corte de 0,5. A curva inferior (ciano) é a curva ROC para o segundo conjunto de validação cega, que tem um AUC de 0,891 ± 0,08 e uma sensibilidade de 66,7% e uma especificidade de 89,5% em um corte de 0,5.

[000277] As Tabelas 11 e 12 mostram o desempenho do classifica- dor de fibrose de 8 marcadores para o segundo conjunto de validação cega para a identificação de sujeitos como por fibrose positiva ou negativa.Tabela 11: Desempenho dos classificadores de 8 marcadores de fibrose para cegar a primeira validação definidaTabela 12: Desempenho dos classil se para cegar a segunda validação ficadores de 8 marcadores de fibro- definida

[000278] A Figura 19 mostram distribuições de sensibilidade e especificidade de 2500 iterações de inicialização de 20% do conjunto de verificação do problema, usando o (A) o classificador de 8 marcadores de esteatose e (B) o classificador de 8 marcadores de fibrose. Os intervalos de confiança empírica de 95% são mostrados, bem como as estimativas de formação e validação, os quais encontram os intervalos de confiança de 95%.

Exemplo 7. Desempenho do Classificador nos Sujeitos Pediátricos

[000279] 90 amostras de soro de crianças foram obtidas do Depar tamento de Nutrição e da Gastroenterologia Pediátrica da Medical College de Wisconsin. Os sujeitos contribuindo amostras caíram em quatro grupos: controles de não obesos (N=45), obesas com testes de função hepática normal (N=20), obesas com testes de função hepática elevadas (N=7) e sujeitos diagnosticados com NASH (N=18). As amostras foram testadas usando o classificador de esteatose de 8 marcadores mostrado na Tabela 8 e o classificador de fibrose de 8 marcadores mostrado na Tabela 9.

[000280] A probabilidade que cada uma das amostras pediátricas era de um sujeito com esteatose foi determinada utilizando o classificador de 8 marcadores mostrado na Tabela 8. A Figura 20 mostra a caixa de gráficos para as amostras pediátricas depois da ocultação, de acordo com o seu grupo de amostra real. O classificador de esteatose identificado com precisão nos sujeitos pediátricos com NASH.

[000281] Ao contrário do classificador de esteatose, o classificador de fibrose de 8 marcadores não efetivamente identificou sujeitos pediátricos com fibrose neste experimento. (Dados não mostrados)

[000282] As modalidades precedentes e exemplos destinam-se apenas como exemplos. Nenhuma modalidade particular, exemplo ou elemento de uma modalidade particular ou exemplo é para ser interpretado como um elemento essencial, necessário ou crítico ou recurso de qualquer das reivindicações. Várias alterações, modificações, substituições e outras variações podem ser feitas para as modalidades divulgadas sem partir do âmbito do presente pedido, que é definido pelas reivindicações acrescentadas. A especificação, incluindo as ilustrações e os exemplos, está a ser considerada em uma forma ilustrativa, ao invés de uma restritiva, e todas essas modificações e substituições são destinadas a ser incluída dentro do escopo do pedido. As etapas recitadas em qualquer método ou reivindicações de processo podem ser executadas em qualquer ordem viável e não estão limitadas a um pedido apresentado em qualquer das modalidades, dos exemplos ou das reivindicações. Além disso, em qualquer um dos métodos acima mencionados, um ou mais biomarcadores especificamente listados podem ser especificamente excluídos tanto um biomarcador individual ou como um biomarcador de qualquer painel.

Claims (17)

1. Método para determinar se um indivíduo tem esteato- hepatite não alcoólica (NASH), caracterizado pelo fato de que compreende a formação de um painel de biomarcador com N proteínas biomarcadoras a partir das proteínas biomarcadoras descritas na Tabela 7 e a detecção do nível de cada uma das N proteínas biomar- cadoras do painel em uma amostra de sangue, plasma, soro ou urina do indivíduo, em que N é de 1 a 10, ou N é de 2 a 10, ou N é de 3 a 10, ou N é de 4 a 10, ou N é de 5 a 10, ou N é de 1 a 5, ou N é de 2 a 5, ou N é de 3 a 5, e em que pelo menos uma dentre as N proteínas biomarca- dores é aminoacilase-1 (ACY1).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dentre as N proteínas biomarcado- ras é SHBG.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção do nível de ACY1 e uma ou mais dentre SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1, SERPINC1, SIGLEC7, e SIGLEC14.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende determinar se um indivíduo tem esteatose, em que a esteatose é uma esteatose leve, moderada ou grave.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende detectar ACY1, SHBG e SIGLEC14.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que NASH é NASH de fase 1, 2, 3 ou 4.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção de ACY1 e uma ou mais dentre SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, e SIGLEC7.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção de ACY1 e uma ou mais dentre SHBG, CTSZ, MET, GSN, LGALS3BP, PLAT, CHL1, e SERPINC1.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está em risco de desenvolver a NAFDL, ou o indivíduo está em risco de desenvolver este- atose, ou o indivíduo está em risco de desenvolver NASH.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma comorbidade na NAFDL selecionada dentre obesidade, obesidade abdominal, síndrome metabólica, doenças cardiovasculares e diabetes.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende colocar os biomarcadores da amostra do indivíduo em contato com um conjunto de reagentes de captura de biomarcador, em que cada reagente de captura de biomarcador do conjunto de reagentes de captura de bio- marcador se liga especificamente a um biomarcador diferente sendo detectado.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que cada reagente de captura de biomarcador é um anticorpo ou um aptâmero.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que cada reagente de captura de biomarcador é um aptâmero.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que pelo menos um aptâmero é um aptâmero com taxa de dissociação lenta, em que pelo menos um aptâmero com taxa de dissociação lenta compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez nucleotídeos com modificações.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que cada aptâmero com taxa de dissociação lenta se liga à sua proteína-alvo com uma taxa de dissociação (t/) > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos ou > 240 minutos.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que se o indivíduo tem NASH, é recomendado ao indivíduo um regime selecionado dentre perda de peso, controle de açúcar no sangue e evitar álcool; e/ou é recomendado ao indivíduo uma cirurgia de desvio gástrico; e/ou é prescrito ao indivíduo pelo menos um agente terapêutico selecionado dentre piogli- tazona, vitamina E e metformina.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende determinar se um indivíduo tem NASH para a determinação de um seguro médico ou seguro de vida.