CN101218341A

CN101218341A - Nk细胞抑制作用用于促进定植的mhc-i阴性细胞持续存在的用途

Info

Publication number: CN101218341A
Application number: CNA2005800509754A
Authority: CN
Inventors: B·布拉扎; J·多拉尔; C·M·维尔法伊
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 2005-05-05
Filing date: 2005-05-05
Publication date: 2008-07-09
Also published as: EP1877540A1; JP5572650B2; WO2006121428A1; AU2005331559A1; CA2607213A1; CN101346155A; US20080317740A1; JP2012107062A; EP1877436A4; AU2005331559B2; JP2014005294A; EP1877436A2; EP1877436B1; CN101346155B

Abstract

本发明涉及用于抑制NK细胞功能的手段在提高MHC－I阴性细胞例如MAPC的持续存在和/或定植中的用途。

Description

NK细胞抑制作用用于促进定植的MHC-I阴性细胞持续存在的用途

相关申请的交叉引用

本申请是2002年2月1日提交的流水号为10/048,757的美国申请的部分继续申请，该美国申请为于2000年8月4日提交的PCT/US00/21387的美国国家阶段申请，并于2001年2月15日作为WO 01/11011以英文公布。依据35 U.S.C 119(e)，该国家阶段申请要求以于1 999年8月5日提交的流水号为60/147,324和于1999年11月10日提交的流水号为60/164,650的美国临时申请作为优先权基础，上述申请的申请文本及公开文本在此通过引用的方式纳入本说明书中。

本申请还是2003年8月11日提交的流水号为10/467,963的美国申请的部分继续申请，该美国申请为于2002年2月14日提交的PCT/US02/04652的美国国家阶段申请，并于2002年8月22日作为WO 02/064748以英文公布。依据35 U.S.C 119(e)，该国家阶段申请要求以于2001年2月14日提交的流水号为60/268,786、于2001年2月15日提交的流水号为60/269,062、于2001年8月7日提交的流水号为60/310,625以及于2001年10月25日提交的流水号为60/343,836的美国临时申请作为优先权基础，上述申请的申请文本及公开文本在此通过引用的方式纳入本说明书中。

政府权利声明

本项目受美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的美国政府基金No.R01-HL49997和R01-DK58295的资助。政府对本发明享有一定的权利。

技术领域

本发明涉及用于抑制NK细胞功能的手段在提高MHC-I阴性细胞例如多能成体祖细胞(MAPC)的持续存在(persistence)和/或定植中的用途。

背景技术

A.细胞疗法

近几十年来，医学领域在寻找针对某些常见的致人衰弱疾病的有效治疗方法方面已经取得了长足的进步。近十年来已经获得较大进展的领域为细胞疗法。通过利用干细胞、骨髓移植和治疗性克隆，研究人员和临床医师们已经探索了多种方法用健康的、功能正常的细胞最终取代患病细胞或功能障碍的细胞。然而，由于诸如免疫排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD)等的并发症，细胞疗法依然存在一定的局限性。细胞疗法的成功通常取决于宿主对所引入的细胞及其增殖和分化潜能的免疫耐受性。因此，需要能够克服由宿主的免疫反应性引起的细胞疗法的局限性的方法。

B.干细胞

胚胎干(ES)细胞可以无限地自我更新，并可分化成为所有的组织类型。ES细胞来源于植入后胚胎的胚泡或原始生殖细胞的内细胞团(胚胎生殖细胞即EG细胞)。ES细胞和EG细胞已经从小鼠中得到，最近还从非人灵长类和人类中获得。当ES细胞被引入小鼠胚泡或其他动物胚泡中时，它可以分化为该小鼠(动物)的所有组织。

可以采用针对SSEA 1(小鼠)和SSEA 4(人)的抗体通过阳性染色方法识别ES(和EG)细胞。在分子水平上，ES细胞和EG细胞表达许多特异性针对这些未分化细胞的转录因子。其中包括Oct-4和rex-1。还有LIF-R(小鼠中)和转录因子sox-2和rox-1。Rox-1和sox-2也在非ES细胞中表达。ES细胞的一个标志是存在端粒酶，这种酶使得ES细胞具有体外无限自我更新的能力。

Oct-4(下文中称为Oct 3/4)是在原肠形成前期胚胎、分裂早期胚胎、胚泡内细胞团细胞和胚胎肿瘤(EC)细胞中表达的转录因子(Nichols J.et al.1998)。当细胞在体外被诱导分化时，Oct-4下调。一些研究表明，Oct-4是维持ES细胞的未分化表型所必需的，并且在确定胚胎发育和分化的早期步骤中起重要作用。Oct-4同Rox-1一起引起了锌指蛋白rex-1的转录活化，rex-1也是维持ES处于未分化状态所必需的(Rosfjord E and Rizzino A.1997；Ben-Shushan E，et al.1998)。同样，也需要sox-2与Oct-4一起维持ES/EC的未分化状态(Uwanogho D.et a l.1995)以及维持鼠(非人)ES细胞。

Oct-4基因(人中为Oct 3)在人体内被转录为至少两种剪接变体Oct3A和Oct 3B。Oct3B剪接变体存在于许多分化细胞中，而Oct3A剪接变体(之前也被称为Oct3/4)据报道是未分化胚胎干细胞所特有的(Shimozaki et al.2003)。

已在大多数组织中鉴定出成体干细胞。造血干细胞来源于中胚层，并且已基于细胞表面标记物和功能特征而被纯化。造血干细胞分离自骨髓、血液、脐带血、胎儿肝脏和卵黄囊，它是再次引发受血者生命所需的造血作用和生成多个造血谱系的祖细胞。造血干细胞可以重造(repopulate)红细胞、嗜中性粒细胞-巨噬细胞、巨核细胞和淋巴造血细胞池。而仅分化形成造血谱系的干细胞则无法提供用于修复其他受损组织例如心脏的细胞源。

神经干细胞最初在胎儿大脑的脑室下区和嗅球中被鉴定出来。几项对啮齿类动物的研究以及最近对非人灵长类和人类的研究表明，干细胞继续在成年个体的大脑中存在。这些干细胞可在体内增殖，并可在体内继续再生出至少一部分的神经细胞。活体外培养时，神经干细胞可被诱导增殖，也可被诱导分化为不同类型的神经元和神经胶质细胞。神经干细胞被移植入大脑后，它们可定植并生成神经细胞和神经胶质。

间充质干细胞(MSC)最早来源于胚胎中胚层并分离自成体骨髓，这种干细胞可分化形成肌肉、骨骼、软骨、脂肪、骨髓基质和腱。中胚层也可分化为脏壁中胚层，脏壁中胚层可生成心肌、平滑肌或由内皮和造血祖细胞组成的血岛。众多已经被报道的间充质干细胞全部均具有有限的分化能力，只能分化形成通常被认为是间充质源的分化细胞。到目前为止，已经报道的特征最为清楚的间充质干细胞是由Pittenger，et al.(1999)和美国专利No.5,827,740分离出的细胞(SH2⁺SH4⁺CD29⁺CD44⁺CD71⁺CD90⁺CD106⁺CD120a⁺CD124⁺CD14^-CD34^-CD45^-)。该细胞能够分化成为多种间充质源的细胞类型，但是在分化成间充质谱系细胞的潜能方面明显受到局限。

发明内容

天然杀伤(NK)细胞的特点部分为，针对不显著表达I型主要组织相容性复合物(MHC)分子的细胞——例如MAPC和胚胎干(ES)细胞——具有溶胞活性。由主要组织相容性复合物的成簇基因(clustered gene)编码的MHC家族蛋白在所有高等脊椎动物的细胞中表达。它们首先在小鼠中被证实，并被命名为H-2抗原(组织相容性-2抗原)。在人体内，由于它们首先在白细胞中被证实，因此它们有时也被称为HLA抗原(人白细胞相关抗原)。

MAPC是能够分化成全部三个原生殖层(外胚层、内胚层和中胚层)细胞类型的“多能成体祖细胞”(一种非ES、非EG、非生殖细胞的细胞)的首字母缩写。与ES细胞的未分化态相关的基因也存在于MAPC中(例如端粒酶、Oct 3/4、rex-1、rox-1、sox-2)。端粒酶或Oct 3/4可被认为是未分化状态的主要产物的基因。端粒酶是自我更新所必需的。

与MSC在生物学上和抗原性上所不同的是，MAPC是一种比MSC更为原始的祖细胞群，它具有分化成包括上皮、内皮、神经、成肌、造血、成骨、成肝、软骨形成和脂肪形成谱系的能力(Verfaillie，C.M.2002；Jahagirdar，B.N.et al.2001)。因此，MAPC是一类新的非胚胎干细胞，其广泛的生物可塑性类似于ES细胞，还能够保留使非胚胎细胞具有研究价值的其他特征。例如，MAPC能够被无限地培养而不损失分化潜能，并且在NOD-SCID小鼠中针对多种发育谱系表现出有效而长期的定植和分化，而没有证据显示会形成畸胎瘤(Reyes，M.and C.M.Verfaillie 2001)。

胚胎干细胞来源于胚胎，是本领域能够得到的。具体而言，胚胎干细胞来源于体外受精卵所发育成的胚胎。获得人胚胎干细胞的胚胎通常为四日龄或五日龄，是一种被称为胚泡的中空的微小细胞球。胚泡包括三个结构：滋养层(胚泡周围的细胞层)、囊胚腔(胚泡内的中空腔)以及内细胞团(囊胚腔一端的一群约30个细胞)。

通过将内细胞团转移到装有培养基的培养皿中而分离出人胚胎干细胞。细胞分裂并在培养皿的表面扩散。培养皿的内表面通常覆盖有一层饲养层。近来，科学家们已经开始设计出不采用小鼠饲养细胞就能使胚胎干细胞生长的方法。

经过几天的时间，内细胞团细胞增殖并开始挤满培养皿。当这一情形发生时，将它们小心地移出并平铺在数个新的培养皿中。将重新平铺细胞的步骤重复多次并持续数月，这一方法被称为传代培养。传代培养细胞的每一次循环被称为一次传代。六个月或更长时间后，最初的30个内细胞团细胞产生出数百万个胚胎干细胞。细胞培养中增殖六个月或更多个月而未分化的胚胎干细胞是多能的，并且遗传表现正常的这种干细胞被称为胚胎干细胞系(Thomson，J.A.et al.Science 1998；282：1145，该文献通过引用的方式纳入本说明书)。干细胞的具体介绍可在以下网站中找到：

http://stemcells.nih.gov/info/basics。

本发明的一个实施方案提供了一种提高MHC-I阴性细胞的持续存在的方法，包括向受试者给予一群MHC-I阴性细胞和有效量的用于抑制天然杀伤细胞功能的手段，从而使得MHC-I阴性细胞的持续存在相比于未给予该抑制手段的方法而言得以提高。

本发明的一个实施方案提供了一种提高MHC-I阴性细胞的定植的方法，包括向受试者给予一群MHC-I阴性细胞和有效量的用于抑制天然杀伤细胞功能的手段，从而使得MHC-I阴性细胞的定植相比于未给予该抑制手段的方法而言得以提高。

另一个实施方案提供了一种提高受试者对MHC-I阴性细胞的免疫耐受性的方法，包括向受试者给予一群MHC-I阴性细胞和有效量的用于抑制天然杀伤细胞功能的手段，从而使得对MHC-I阴性细胞的免疫耐受性相比于未给予该抑制手段的方法而言得以提高。

又一个实施方案提供了一种抑制对MHC-I阴性细胞的排斥的方法，包括将一群MHC-I阴性细胞和有效量的用于抑制天然杀伤细胞功能的手段给予有此需要的受试者，从而使得对MHC-I阴性细胞的排斥相比于未给予该抑制手段的方法而言得以抑制(例如诸如一部分所给予细胞群等的细胞在受试者体内不被排斥或存活更长一段时间)。

本发明的一个实施方案提供了一种治疗受试者疾病或损伤的方法，包括向受试者给予有效量的一群MHC-I阴性细胞和有效量的用于抑制天然杀伤细胞功能的手段。

在一个实施方案中，MHC-I阴性细胞为非ES、非EG、非生殖细胞，其中所述非ES、非EG、非生殖细胞可以分化为外胚层、内胚层和中胚层细胞类型，例如为MAPC。这种细胞可表达端粒酶和/或Oct 3/4。

本发明的另一方面，MHC-I阴性细胞对受试者(接受者)而言是自体的、同种异体的或异种的。在本发明的一个实施方案中，非ES、非EG、非生殖细胞对受试者(接受者)而言是自体的、同种异体的或异种的。在本发明的另一个实施方案中，ES细胞对受试者(接受者)而言是同种异体的和/或异种的。

在另一个实施方案中，MHC-I阴性细胞为胚胎干(ES)细胞。

在另一个实施方案中，MHC-I阴性细胞通过以下途径或通过在外科手术中直接施用于组织表面或伤口上给予：局部注射、导管给予、全身注射、腹膜内注射、肠胃外给予、口服给予、颅内给予、动脉内注射、静脉内注射、心室内输注、胎盘内注射、子宫内注射、外科心肌内注射、经心内膜(transendocardial)注射、冠状动脉内注射、经脉管注射、肌内注射。

在本发明的一个实施方案中，用于抑制天然杀伤细胞功能的手段为抗天然杀伤细胞抗体或其活性片段，包括多克隆抗体或单克隆抗体、或其活性片段。在另一个实施方案中，用于抑制天然杀伤细胞功能的手段为药物，例如化合物。在一个实施方案中，用于抑制天然杀伤细胞功能的手段为蛋白质，例如生长因子。另一个实施方案提供了全身照射作为抑制NK细胞功能的手段，包括非致死剂量的照射(例如，不需要重建造血系统的照射)。在一个实施方案中，用于抑制NK细胞功能的手段通过给予下述MHC-I阴性细胞提供，所述MHC-I阴性细胞包括能表达抑制NK细胞功能的物质的表达载体或转基因。在另一个实施方案中，(单独或共同)给予用于抑制NK细胞功能的手段的组合。

在一个实施方案中，抑制天然杀伤细胞功能的手段在给予非ES、非EG、非生殖细胞之前、之间和/或之后给予。在另一个实施方案中，抑制天然杀伤细胞功能的手段在定植部位局部给予和/或全身给予。

本发明的另一个实施方案包括给予骨髓和/或二次移植或其组合，所述二次移植例如心、肺、肾、肝移植。

在一个实施方案中，受试者患有疾病或损伤。疾病包括但不限于心脏病、癌症、自身免疫疾病、遗传病或血液病。损伤包括但不限于由全身照射、化学放射性疗法或物理外伤引起的损伤。

本发明的一个实施方案提供了一种组合物，包括用于抑制NK细胞功能的手段、MHC-I阴性细胞和可药用载体。本发明的另一个实施方案提供了一种组合物，包括提供用于抑制NK细胞功能的手段的MHC-I阴性细胞和可药用载体。

本发明的一个实施方案提供了用于抑制天然杀伤细胞(NK)功能的手段在制备用于提高MHC-I阴性细胞的持续存在、提高其定植、提高其免疫耐受性和/或降低其排斥的药物中的用途。另一个实施方案提供了MHC-I阴性细胞和用于抑制天然杀伤细胞功能的手段在制备用于提高MHC-I阴性细胞的持续存在、提高其定植、提高其免疫耐受性、降低其排斥和/或治疗疾病和/或损伤的药物中的用途。药物可任选地包括生理学可接受的载体。

附图说明

图1A-B.MAPC在体外不刺激T细胞应答。将(A)BALB/c CD4⁺T细胞或(B)BALB/c CD4⁺加CD8⁺T细胞与经照射的未处理的C57BL/6 MAPC混合或与经照射并用1000 IU/ml IFN-γ预处理48小时的MAPC混合，进行T细胞增殖实验。在一些孔中，将T细胞单独培养或与经照射的T细胞缺乏的C57BL/6脾细胞一起培养。在第5天通过³H-胸苷摄入法测量T细胞增殖，表示为平均值±SEM。

图2.MAPC在体外易受NK介导的溶胞作用的影响。为确定MAPC是否为易受NK介导的杀伤作用影响的目标，在铬释放实验中，将来自于经poly I∶C处理的C57BL/6小鼠的脾细胞与Yac-1细胞混合或与MAPC混合。

图3A-E.C57BL/6、Rag2^-/-和Rag2^-/-/IL-2Rγc^-/-小鼠对MAPC的免疫抗性。(A)采用萤火虫荧光素酶生物发光测定法的全身影像(WBI)在第4天和第3 0天实时监测供体MAPC DL的生物分布情况。在有免疫力的C57BL/6小鼠(N＝5)中，第4天检测到MAPC DL，而第30天未检测到。(B)NK的耗尽并未增加C57BL/6小鼠(N＝5)体内的MAPC DL数量。(C)在T细胞和B细胞缺陷的Rag2^-/-小鼠(N＝5)中，整个30天期间均检测到MAPC DL，(D)甚至在给予抗NK1.1单克隆抗体的小鼠(N＝5)中也是如此。在IV注射的损伤部位和肺中检测到MAPC DL，在腹内部位和整个长骨上也检测到，如右侧红圈所示。(E)在T、B和NK缺陷的Rag2^-/-/IL-2Rγc^-/-小鼠(N＝6)中，从第4天至第30天MAPC DL持续存在，并且6只小鼠中有2只的MAPC DL数量增加。例如，在从左数第3只小鼠中，第4天至第30天荧光素酶信号增强了5倍(红色椭圆)，与供体的MAPC增殖情况一致。C：对照。

图4.MAPC在肺中持续存在，并分化为I型肺细胞样细胞。在小鼠死后，在包括肺、肝和脾在内的多个组织中检测到MAPC。图中显示的是输注30天后BLI最高的Rag2^-/-/IL-2Rγc^-/-小鼠肺中的供体MAPC。左图，供体MAPC由于天然DsRed2荧光而呈红色，核被DAPI染成蓝色。右图，组织冷冻切片用抗水通道蛋白5抗体(以鉴别1型肺细胞)和DAPI共同染色。该图表明，供体MAPC不仅在肺中定植，而且还分化为肺泡1型肺细胞，如箭头所示。

图5.TBI克服了MAPC抗性。为确定MAPC能否在同种异体造血干细胞移植条件下持续存在，对B10.BR小鼠进行致死照射并给予含有MAPC DL或不含有MAPC DL的C57BL/6骨髓。显示了6只代表性动物(BLI相似)中的2只。第4天至第28天，在胸、腹、头和四肢中一直发现数量较多的供体MAPC。这表明全身照射(TBI)处理克服了免疫抗性，使得MAPC普遍归巢(homing)。C：对照组。

图6.动脉内输注MAPC使生物分布情况得以增强和多样化。为检测静脉内和动脉内送递后MAPC的生物分布情况，将MAPC DL(10⁶)通过尾静脉(N＝3)或左心室输注到Rag2^-/-/IL-2Rγc^-/-小鼠(N＝3)体内。示出了每组的一只代表性动物在静脉内(A)或动脉内(B)输注后10周的WBI。动脉内输注使得MAPC的归巢更为多样化，并产生了高出约10倍的全身生物发光信号(数据未显示)。

具体实施方式

可以在本发明的方法中使用MHC-I阴性细胞，例如MAPC和ES细胞。MAPC能够在体外和体内再生出全部的原生殖层(外胚层、内胚层和中胚层)。本说明书中，它们等同于胚胎干细胞，并区别于同样分离自骨髓的间充质干细胞。MAPC的生物学潜能已经在多种动物模型上得到证实，包括小鼠、大鼠，以及人干细胞在大鼠或NOD/SCID小鼠中的异种定植(Reyes，M.and C.M.Verfaillie 2001；Jiang，Y.et al.2002)。在该细胞群的克隆潜能的一个较好的证明实验中，将单个带遗传标记的MAPC注射到小鼠胚泡、植入后的胚泡和发育足月的胚胎中(Jiang，Y.et al.2002)。对高度嵌合动物的出生后分析表明包括肝脏在内的全部组织和器官的重建。在上述任一只动物中均未检测到畸形或器官功能障碍。

定义

如本说明书所使用，以下术语定义为下述含义：

“MAPC”为“多能成体祖细胞”的首字母缩写。它是指可分化为全部三个生殖层谱系(即外胚层、中胚层和内胚层)细胞的非胚胎干细胞。类似于胚胎干细胞，MAPC表达Oct 3/4(即Oct-3A)、rex-1、rox-1、sox-2和端粒酶。MAPC可表达SSEA-4和nanog。术语“成体”涉及到MAPC时是非限制性的。它是指非胚胎体细胞。

MAPC组成性表达Oct 3/4和高水平的端粒酶(Jiang，Y.et al.2002)。来自于人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物的MAPC，似乎是迄今为止已知的唯一的即使在晚期传代细胞中仍表达极高水平端粒酶的正常的非恶性体细胞(即非生殖细胞)。端粒在MAPC中延伸并且为正常核型。由于注射到哺乳动物中的MAPC可迁移到多个器官中并被吸收于其中，因此MAPC是自我更新的干细胞。因此，它们也可以与目的器官相容的自我更新状态或分化状态应用于器官的重造中。它们能够取代原本已受损、死亡或原本已由于遗传性疾病或获得性疾病而功能异常的细胞类型，或者，如下文所公开，它们可有助于组织中健康细胞的维护或新细胞的产生。

“多能”涉及到MAPC时是非限制性的。它是指能够通过分化产生出具有全部三个原生殖层谱系(即外胚层、中胚层和内胚层)的细胞的能力。

术语“祖”在首字母缩写“MAPC”中使用时并不限定这些细胞为特定的细胞谱系。

“自我更新”是指能够产生复制子代干细胞的能力，所述子代干细胞具有与其所来源的细胞相同的分化潜能。本说明书中采用的类似术语为“增殖”。

“扩增”是指没有分化的一个或多个细胞的繁殖。

“定植”是指细胞在体内与已存在的目的部位接触并进入其中的过程。

持续存在是指细胞在体内抵抗排斥作用、并且其数量随时间(例如，几天、几周、几个月、几年)保持不变和/或增加的能力。

术语“分离的”是指一个或多个细胞不与在体内与该一个或多个细胞相关联的一个或多个细胞或者一个或多个细胞组分相关联。“富集群”是指目的细胞(例如MAPC)相对于一个或多个其他细胞类型(例如非MAPC细胞类型)而言在体内或原代培养中数量的相对增加。

“细胞因子”是指诱导或增强细胞运动的细胞因子，所述细胞运动例如MAPC或其他干细胞、祖细胞或分化细胞的归巢。细胞因子也可刺激这些细胞分裂。

“分化因子”是指诱导谱系定向分化的细胞因子，优选生长因子或血管生成因子。

“受试者”为脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于人、家畜、竞技动物和宠物。

本说明书中所使用的“治疗”、“处理”或“疗法”包括治疗、预防、改善或抑制损伤或疾病相关病症和/或损伤或疾病相关病症的症状。

“有效量”通常是指提供所需局部或全身效果的量，例如提供改善性能的量。例如，有效剂量为足以实现有益的或所需的临床结果的量。所述剂量可一次或多次给予，并且可包括任何预选量的细胞。有效剂量的精确确定可根据每个受试者的个体因素进行，包括他们的体型、年龄、损伤和/或疾病或所治疗的损伤、以及从损伤产生或疾病开始时的时间长短。本领域技术人员，特别是医师，应当能够确定构成有效剂量的细胞数量。

“共同给予”可包括同时和/或序贯给予两种或更多种药剂。

所给予的MHC-I阴性细胞，例如MAPC，可通过在体内分化为各种细胞而有助于新组织的生成。替代地或附加地，所给予的细胞也可通过分泌辅助内源MAPC或其他干细胞、或其他分化细胞的归巢和募集的细胞因子而有助于新组织的生成。替代地或附加地，所给予的细胞也可分泌在目标组织中作用于内源干细胞或祖细胞、使其在目标部位分化，从而改善功能的因子。此外，所给予的细胞也可分泌在目标组织中作用于干细胞、祖细胞或分化细胞，使其分裂的因子。因此，所给予的细胞可通过营养作用提供益处。营养作用的实例包括，限制炎性损伤、限制脉管通透性、改善细胞在损伤部位的存活或修复细胞向损伤部位的归巢。此外，所给予的细胞也可通过提高毛细血管密度和刺激血管生成而提供益处。这可以通过产生血管生成因子(例如VEGF)来实现，或通过MAPC或其他干细胞的分化及包含在新的血管组织中来实现，或通过二者来实现。治疗益处可通过上述途径的结合来实现。

“免疫耐受”是指外源(例如同种异体的或异种的)组织、器官或细胞在受试接受者体内的存活(表示为数量和/或时间长短)。上述存活通常是由于抑制了移植接受者进行免疫应答的能力，所述免疫应答原本会针对外源细胞的引入而发生。免疫耐受可包括数天、数周、数月或数年的持续的免疫抑制。免疫耐受的定义中包括NK介导的免疫耐受。

“抑制NK细胞功能”包括但不限于抑制(包括降低或消除)NK细胞介导的活性(例如NK细胞介导的溶胞作用及细胞死亡)，降低或消除NK细胞细胞因子的产生和/或释放，降低或消除NK细胞穿孔蛋白、粒酶和蛋白聚糖的产生和/或应用，使NK细胞失活，降低或消除NK细胞的激活，耗尽或降低来自于一群细胞的NK细胞(例如，使NK细胞死亡或例如通过降低或消除NK细胞分裂而抑制新的NK细胞产生)，降低或消除NK细胞迁移性(例如防止它们离开淋巴结)和/或降低或消除NK细胞识别目标(例如配体)的能力。

术语“包括”等可具有它们在美国专利法中所具有的含义，并且可表示“包含”等含义。如本说明书所使用，“包含”或类似用语表示非限制性地包含。

MAPC

人MAPC记载于美国专利申请10/048,757(PCT/US00/21387(以WO01/11011公开))及10/467,963(PCT/US02/04652(以WO 02/064748公开))中，上述申请的内容基于其有关MAPC的记载而通过引用的方式纳入本说明书。MAPC已在其他哺乳动物中鉴定出来。例如，鼠MAPC也记载于PCT/US00/21387(以WO 01/11011公开)和PCT/US02/04652(以WO 02/064748公开)中。大鼠MAPC也记载于WO 02/064748中。

MAPC的分离和生长

人和小鼠的MAPC分离方法为本领域已知。上述方法记载于PCT/US00/21387(以WO 01/11011公开)中，针对大鼠的方法记载于PCT/US02/04652(以WO 02/064748公开)中，这些方法及上述申请中公开的MAPC的特征通过引用的方式纳入本说明书。

MAPC最初分离自骨髓，但随后也从包括脑和肌肉在内的其他组织中分离得到(Jiang，Y.et al.2002)。因此，MAPC可从多种来源中分离，包括骨髓、胎盘、脐带和脐带血、肌肉、脑、肝、脊髓、血液或皮肤。例如，MAPC可来源于骨髓抽吸物，骨髓抽吸物可通过本领域技术人员已知的标准方法获得(参见例如Muschler，G.F.et al.1997；Batinic，D.et al.1990)。因此，本领域技术人员现在可以获得骨髓抽吸物、脑或肝脏活组织样本以及其他器官，并通过采用本领域技术人员已知的正选择或负选择技术而分离出这些细胞，所述正选择或负选择技术有赖于在这些细胞中所表达(或不表达)的基因(例如通过功能或形态学分析法，例如上述申请中公开的此类分析法，上述申请通过引用的方式纳入本说明书)。

如PCT/US00/21 387所述的来自于人骨髓的MAPC

从骨髓抽吸物中获得骨髓单核细胞，骨髓抽吸物通过本领域技术人员已知的标准方法获得(参见例如Muschler，G.F.et al.1997；Batinic，D.et al.1990)。多能成体干细胞存在于骨髓(或其他器官，例如肝或脑)中，但并不表达白细胞共有的抗原CD45或成红血细胞特异性血型糖蛋白A(Gly-A)。将混合的细胞群进行Ficoll Hypaque分离。然后采用抗CD45抗体和抗Gly-A抗体对细胞进行负选择，耗尽CD45⁺和Gly-A⁺细胞群，然后回收剩余的约0.1％的骨髓单核细胞。也可将细胞平铺在包被有纤连蛋白的孔中，并按下述方式培养2-4周以耗尽CD45⁺细胞和Gly-A⁺细胞。

或者，也可利用正选择通过细胞特异性标记物的组合来分离细胞。正选择和负选择技术均是本领域技术人员已知的，并且适用于负选择目的的众多的单克隆和多克隆抗体也是本领域已知的(参见例如Leukocyte Typing V，Schlossman，et al.Eds.(1995)Oxford University Press)，可从许多来源购得。

从细胞群混合物中分离出哺乳动物细胞的技术亦记载于Schwartz，et al.的美国专利No.5,759,793(磁分离)、Basch et al.1983(免疫亲和层析法)和Wysocki and Sato，1978(荧光激活细胞分选法)中。

将回收的CD45^-/GlyA^-细胞平铺在包被有5-115ng/ml(约7-10ng/ml可被利用)血清纤连蛋白或其他适合的基质包被物的培养皿中。将细胞维持在Dulbecco’s Minimal Essential Medium(DMEM)或其他适合的细胞培养基中，添加1-50ng/ml(约5-15ng/ml可被利用)血小板源生长因子-BB(PDGF-BB)、1-50ng/ml(约5-15ng/ml可被利用)表皮生长因子(EGF)、1-50ng/ml(约5-15ng/ml可被利用)胰岛素样生长因子(IGF)或100-10,000 IU(约1,000 IU可被利用)LIF，添加10^-10至10^-8M地塞米松(或其他适合的类固醇)、2-10μg/ml亚油酸和0.05-0.15μM抗坏血酸。其他适合的培养基包括例如MCDB、MEM、IMDM和RPMI。细胞可以在不含血清、存在1-2％胎牛血清的条件下维持，或者，也可在例如1-2％人AB血清或自体血清中维持。

每3天以2×10³细胞/cm²重新接种时，常规可获得＞40次的细胞倍增，有些群经历＞70次的细胞倍增。起初20-30次细胞倍增的细胞倍增时间为36-48小时。之后，细胞倍增时间延长到长达60-72小时。

来自于5个供体(年龄约2岁至约55岁)、并且以2×10³细胞/cm²的重新接种密度经过23-26次细胞倍增而培养的MAPC的端粒长度为11-13KB。这比由相同供体获得的血液淋巴细胞的端粒长度长3-5KB。分别在23次和25次细胞倍增后评估来自于2个供体的细胞的端粒长度，并在35次细胞倍增后再次评估，端粒长度没有变化。这些MAPC的核型正常。

PCT/US00/21387所述条件下的人MAPC的表型

利用FACS对22-25次细胞倍增后获得的人MAPC进行免疫表型分析表明，上述细胞不表达CD31、CD34、CD36、CD38、CD45、CD50、CD62E和-P、HLA-DR、Muc18、STRO-1、cKit、Tie/Tek；表达低水平的CD44、HLA-I类和β2-微球蛋白，并且表达CD10、CD13、CD49b、CD49e、CDw90、Flk1(N＞10)。

一旦细胞在培养中以约2×10³/cm²重新接种并经历＞40次的倍增，表型就会变得更加同质，且没有细胞会表达I型HLA或CD44(n＝6)。当细胞以更高的汇合度生长时，它们会表达高水平的Muc18、CD44、HLA I类和β2-微球蛋白，这与MSC的表型(N＝8)相似(Pittenger，1999)。

免疫组织化学表明，以约2×10³/cm²接种密度培养的人MAPC表达EGF-R、TGF-R1和-2、BMP-R1A、PDGF-Rla和-B，并且少部分(1至10％)MAPC亚群可被抗SSEA4抗体染色(Kannagi，R，1983)。

利用Clontech cDNA方法确定以约2×10³/cm²的接种密度、经历22和26次细胞倍增而培养的人MAPC的表达基因概况：

A.MAPC不表达CD31、CD36、CD62E、CD62P、CD44-H、cKit、Tie，IL1、IL3、IL6、IL11、G CSF、GM-CSF、Epo、Flt3-L或CNTF的受体，以及低水平的HLA I类、CD44-E和Muc-18 mRNA。

B.MAPC表达细胞因子BMP1、BMP5、VEGF、HGF、KGF、MCP1的mRNA，细胞因子受体Flk1、EGF-R、PDGF-R1α、gp130、LIF-R、活化素-R1和-R2、TGFR-2、BMP-R1A，黏着受体CD49c、CD49d、CD29，以及CD10。

C.MAPC表达hTRT和TRF1的mRNA，POU结构域转录因子Oct-4、sox-2(与Oct-4一起，是维持ES/EC未分化状态所需的，Uwanogho D.1995)、sox 11(神经发育)、sox 9(软骨形成)(Lefebvre V.1998)，同源结构域转录因子：Hoxa4和-a5(颈和胸骨骼特化；呼吸道的器官形成)(Packer AI，2000)，Hox-a9(成髓作用)(Lawrence H，1997)、D1x4(前脑和头外周结构的特化)(Akimenko MA，1994)、MSX1(胚胎中胚层、成体心脏和肌肉、软骨形成和生骨)(Foerst-PottsL.1997)、PDX1(胰腺)(Offield MF，1996)。

D.通过RT-PCR确证Oct-4、LIF-R和hTRT mRNA的存在。

E.此外，RT-PCR表明Rex-1 mRNA和Rox-1 mRNA在MAPC中表达。

Oct-4、Rex-1和Rox-1在来自于人和鼠骨髓以及来自于鼠肝脏和脑的MAPC中表达。人MAPC表达LIF-R，并可被SSEA-4阳性染色。最终，发现Oct-4、LIF-R、Rex-1和Rox-1 mRNA水平在超过30次细胞倍增而培养的人MAPC中升高，使得产生表型更为同质的细胞。相反地，以较高密度培养的MAPC会失去这些标记物的表达。这是由于40次细胞倍增前的老化以及细胞无法分化为除成软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞之外的细胞所致。因此，Oct-4的存在以及Rex-1、Rox-1和sox-2，与MAPC培养物中存在最原始的细胞相关。

如PCT/US00/21387所述培养MAPC

如本说明书所述分离的MAPC可采用本说明书及PCT/US00/21387中所公开的方法培养，上述申请基于这些方法而通过引用的方式纳入。

简言之，为了培养MAPC，优先在血清含量低或无血清的培养基中培养，以维持细胞的未分化状态。如本说明书所述，在用于培养细胞的无血清培养基中添加表1所述物质。人MAPC不需要LIF。

表1

胰岛素	10-50μg/ml(10μg/ml)*
胰岛素	10-50μg/ml(10μg/ml)*	转铁蛋白	0-10μg/ml(5.5μg/ml)
硒	2-10ng/ml(5ng/ml)	转铁蛋白	0-10μg/ml(5.5μg/ml)
硒	2-10ng/ml(5ng/ml)	牛血清白蛋白(BSA)	0.1-5μg/ml(0.5μg/ml)
亚油酸	2-10μg/ml(4.7μg/ml)	牛血清白蛋白(BSA)	0.1-5μg/ml(0.5μg/ml)
亚油酸	2-10μg/ml(4.7μg/ml)	地塞米松	0.005-0.15μM(.01μM)
L-抗坏血酸2-磷酸盐	0.1mM	地塞米松	0.005-0.15μM(.01μM)

低葡萄糖DMEM(DMEM-LG)	40-60％(60％)
低葡萄糖DMEM(DMEM-LG)	40-60％(60％)	MCDB-201	40-60％(40％)
胎牛血清	0-2％	MCDB-201	40-60％(40％)
胎牛血清	0-2％	血小板源生长因子	5-15 ng/ml(10ng/ml)
表皮生长因子	5-15 ng/ml(10ng/ml)	血小板源生长因子	5-15 ng/ml(10ng/ml)
表皮生长因子	5-15 ng/ml(10ng/ml)	胰岛素样生长因子	5-15 ng/ml(10ng/ml)
白血病抑制因子	10-10,000 IU(1,000 IU)	胰岛素样生长因子	5-15 ng/ml(10ng/ml)

*优选浓度表示在括号中。

向人MAPC中加入10ng/mL LIF并不会对短期的细胞生长产生影响(前25次细胞倍增的细胞倍增时间相同，Oct-4(Oct3/4)表达水平相同)。与人细胞中所观察到的情况相反，当将新的鼠骨髓单核细胞(第0天时耗尽CD45⁺细胞)平铺于MAPC培养物中时，未观察到生长。当将鼠骨髓单核细胞平铺并且所培养的细胞在14天后耗尽CD45⁺细胞时，出现形态及表型与人MAPC相似的细胞。这表明需要造血细胞分泌的因子来维持鼠MAPC的初始生长。当仅用PDGF-BB和EFG培养时，细胞倍增缓慢(＞6天)，并且培养无法维持超过10次的细胞倍增。添加10ng/mL LIF显著促进了细胞生长。

一旦细胞在培养物中建立起来，即可采用含40％FCS和10％DMSO的DMEM将细胞冷冻并作为冷冻母液储存起来。其他制备培养细胞的冷冻母液的方法亦为本领域技术人员可获得的。

因此，MAPC可在本领域可获得的培养基中维持及扩增。上述培养基包括但不限于Dulbecco’Modified Eagle’s Medium(DMEM)、DMEM F12培养基、Eagle’s Minimum Essential Medium、F-12K培养基、Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium和RPMI-1640培养基。许多培养基作为含有或不含丙酮酸钠的低葡萄糖制剂也是可得到的。

予以考虑的还有在细胞培养基中添加哺乳动物血清。血清通常包含成活和扩增所必需的细胞因子和组分。血清的实例包括胎牛血清(FBS)、牛血清(BS)、小牛血清(CS)、胎小牛血清(FCS)、新生小牛血清(NCS)、山羊血清(GS)、马血清(HS)、人血清、鸡血清、猪血清、绵羊血清、兔血清、血清替代物及牛胚胎液。应当知晓的是，认为必要时可在55-65℃下使血清热灭活，以使补体级联系统的组分失活。

也可有利地使用其他添加物以提供给细胞最优生长和扩增所必需的微量元素。上述添加物包括胰岛素、转铁蛋白、钠硒及其组合。这些组分可包含在盐溶液中，所述盐溶液例如但不限于Hanks平衡盐溶液(HBSS)、Earle盐溶液、抗氧剂添加物、MCDB-201添加物、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、抗坏血酸及抗坏血酸-2-磷酸盐、以及附加的氨基酸。许多细胞培养基已经包含氨基酸，但有些需要在培养细胞前加入。所述氨基酸包括但不限于L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。确定这些添加物的适当的浓度在本领域技术人员的能力范围内。

抗生素亦常用于细胞培养中以减轻细菌、支原体和真菌污染。通常，所用的抗生素或抗霉菌化合物为青霉素/链霉素的混合物，但是也可包括但不限于两性霉素(Fungizone)、氨苄西林、艮他霉素、博来霉素、潮霉素、卡那霉素、丝裂霉素、麦考酚酸、萘啶酸、新霉素、制霉菌素、巴龙霉素、多粘菌素、嘌呤霉素、利福平、大观霉素、四环素、泰乐菌素和博来霉素(zeocin)。抗生素和抗霉菌添加剂可以根据所要起的作用类型而予以一些考虑。一种可能出现的情况是这样一种含有抗生素的培养基，其中细菌仍然存在于培养基中，但抗生素的作用是作为抑菌而不是杀菌机制。此外，抗生素也可干扰某些细胞类型的代谢。

也可有利地在细胞培养中使用激素，激素包括但不限于D-醛固酮、己烯雌酚(DES)、地塞米松、β-雌二醇、氢化可的松、胰岛素、促乳素、孕酮、促生长素抑制素/人生长激素(HGH)、促甲状腺激素、甲状腺素和L-甲腺原氨酸。

也可根据细胞类型和分化细胞的命运使用脂质和脂质载体添加到细胞培养基中。上述脂质和载体可包括但不限于环糊精(α、β、γ)、胆固醇、与白蛋白缀合的亚油酸、与白蛋白缀合的亚油酸和油酸、未缀合的亚油酸、与白蛋白缀合的亚油-油-花生四烯酸、未与白蛋白缀合的油酸和与白蛋白缀合的油酸，以及其它脂类。

予以考虑的还有使用饲养细胞层。将饲养细胞用于维持不易培养的细胞的生长，特别是ES细胞的生长。饲养细胞是已用γ-辐照失活的正常细胞。在培养中，饲养层充当其他细胞的基底层并提供细胞因子，而其本身不会进一步生长或分裂(Lim，J.W.and Bodnar，A.2002)。饲养层细胞的实例通常为人二倍体肺细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、Swiss小鼠胚胎成纤维细胞，但也可以是任何有丝分裂期后的、能够提供有利于实现干细胞最优生长、存活和扩增的细胞组分和因子的细胞。在多数情况下，饲养细胞层并不是使ES细胞处于未分化的增殖状态所必需的，因为白血病抑制因子(LIF)具有抗分化特性。因此，可使用含有LIF的添加物来维持某些物种中MPAC的未分化状态。

可以将培养物中的细胞维持在悬浮液中或附着在固体支撑物上，如细胞外基质组分以及合成的或生物聚合物。干细胞通常需要能促使它们附着在固体支撑物上的附加因子，如I型、II型和IV型胶原、刀豆素A、硫酸软骨素、纤连蛋白、“超纤连蛋白”和纤连蛋白样聚合物、明胶、层粘连蛋白、聚D赖氨酸和聚L-赖氨酸、凝血酶敏感素和玻璃粘连蛋白。

干细胞的维持环境也可包含使干细胞(例如MAPC)维持在未分化形式的细胞因子。当细胞必须维持在自我更新的未分化状态时，培养基可有利地包含表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、白血病抑制因子(LIF；在选定的物种中)及其组合。本领域技术人员显而易见的是，使细胞自我更新但不分化的添加物必须在分化前从培养基中去除。

干细胞系和其他细胞可从与另一种细胞类型的共同培养中获益。所述共同培养的方法基于这样一种现象，即某些细胞可提供尚未识别的、使干细胞分化成为特定细胞系或细胞类型的细胞因子。这些细胞因子也可诱导细胞表面受体的表达，其中一些受体可以很容易地被单克隆抗体识别。一般而言，用于共同培养的细胞的选择，应基于本领域技术人员希望诱导的细胞系的类型，并且选择适合的用于共同培养的细胞也在本领域技术人员能力范围内。

识别分化细胞然后将其与未分化的相应部分分离的方法可通过本领域已知的方法进行。已被诱导分化的细胞可在分化细胞数目多于未分化细胞的情况下通过选择性培养细胞来识别。类似地，分化细胞可通过形态的改变和未存在于其未分化相应部分中的特征来识别，所述特征例如细胞大小、细胞过程的数目(即树突和/或分支的形成)以及细胞内细胞器分布的复杂程度。予以考虑的还有通过分化细胞的特异性细胞表面标记物表达来识别分化细胞的方法，所述细胞表面标记物例如细胞受体和跨膜蛋白。可使用针对这些细胞表面标记物的单克隆抗体识别分化细胞。可通过荧光激活细胞分选法(FACS)和酶联免疫吸附测定(ELISA)实现对这些细胞的检测。从特定基因转录上调的观点来看，分化细胞通常表现出与未分化细胞不同的基因表达水平。也可利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)监测响应于分化的基因表达的变化。此外，利用微阵列技术的全基因组分析也可识别分化细胞。

因此，一旦识别出分化细胞，就可在需要的情况下将它们与其未分化的相应部分分离。以上详述的识别方法也提供了分离方法，例如FACS、优选细胞培养方法、ELISA、磁珠及其组合。本发明一个优选实施方案预想了基于细胞表面抗原表达而采用FACS识别及分离细胞。

其他培养方法

在其他实验中，发现MAPC的培养密度可在约100个细胞/cm²或约150个细胞/cm²至约10,000个细胞/cm²之间变化，包括约200个细胞/cm²至约1500个细胞/cm²至约2000个细胞/cm²。密度可随物种而改变。此外，也可根据培养条件和细胞来源改变最优密度。确定针对一组给定的培养条件和细胞的最优密度在普通技术人员的技能范围内。

而且，也可在培养物中MAPC的分离、生长及分化过程中的任何时间采用低于约10％、包括约3-5％的有效大气氧浓度。

天然杀伤细胞功能

天然杀伤(NK)细胞是作为细胞毒性细胞的大颗粒淋巴细胞的一个亚类。NK细胞占人白细胞的约15％，其特征在于针对不表达I型主要组织相容性复合物(MHC)分子的细胞(例如肿瘤细胞或受病毒感染的细胞)具有溶胞活性。它们利用穿孔蛋白、粒酶和蛋白聚糖杀死(溶解)靶细胞。它们被称为“天然”杀手是因为它们在溶解细胞之前不需要识别特异性抗原。NK细胞没有免疫记忆，与适应性免疫系统无关。

NK细胞活性和NK细胞数并不相同。NK细胞可以足够的数目存在，但除非它们被激活否则它们是无效的。NK细胞的一个功能为排斥外来物质，例如组织不相容性骨髓、干细胞移植物(例如多能的、肌肉、神经、肝及其他干细胞类型)和器官移植物，从而导致接受者的身体无法接受被移植的细胞或组织或器官。被激活的NK细胞也可产生各种细胞因子，包括干扰素(IFN-γ)、白细胞介素、TNF(肿瘤坏死因子，例如TNF-α)、造血细胞生长因子及其他生长因子。

本发明提供了抑制NK细胞介导的功能以促进细胞定植和/或持续存在(包括MAPC定植)的多种手段。抑制NK细胞功能包括抑制(包括降低或消除)NK细胞介导的活性(例如NK细胞介导的溶胞作用及细胞死亡)。抑制NK细胞功能还包括但不限于，降低或消除NK细胞细胞因子的产生和/或释放，降低或消除NK细胞穿孔蛋白、粒酶和蛋白聚糖的产生和/或应用，使NK细胞失活，降低或消除NK细胞的激活，耗尽来自于一群细胞的NK细胞(例如，使NK细胞死亡或者降低或消除新的NK细胞的产生)，降低或消除NK细胞分裂，降低或消除NK细胞迁移性(例如防止它们离开淋巴结)和/或降低或消除NK细胞识别目标(例如配体)的能力。

本领域技术人员可获得许多测试方法来测定NK细胞活性的抑制情况，包括在体外细胞毒性试验后对死细胞进行锥虫蓝染色以确定NK细胞特异性靶细胞(例如Yac-1细胞)的细胞溶解的终止。

A.抑制NK细胞功能的手段

本发明的一个实施方案中，给予了至少一种抑制NK细胞功能——包括抑制NK细胞介导的细胞毒性——的手段。可利用遗传手段(NK细胞缺乏的接受者)或表观遗传(epigenetic)(在体内采用例如抗NK抗体使其耗尽/失活)手段通过耗尽NK细胞来消除NK细胞功能。任何能够抑制NK细胞功能的物质均可采用(例如在T细胞或NK细胞表面与P-选择蛋白糖蛋白1(PSGL-1)结合的多聚化合物(美国专利公开文本No.2004/0116333)或调节含SH2的肌醇磷酸酶(SHIP)表达或功能(美国专利公开文本No.2002/0165192))。包括但不限于以下的任何手段/试剂均可用于抑制NK细胞功能：化学物质(例如化合物，包括但不限于药品、药物、小分子)、蛋白(例如抗NK细胞抗体)、肽、微生物、生物制剂、核酸(包括编码重组蛋白或抗体的基因)或基因构建体(例如载体，例如表达载体，包括但不限于使针对NK细胞活性的拮抗物表达的表达载体)。

此外，也可利用可使LAIR-1分子在NK细胞上交联的手段(例如试剂)抑制NK细胞功能。而且，也可利用照射(致死性、亚致死性和/或局部照射)抑制NK细胞功能。一个实施方案中，抑制NK细胞功能的手段为一种与天然杀伤细胞反应的抗体。此外，抑制NK细胞功能的手段还可包括调节免疫系统的试剂，例如为免疫抑制开发的上述试剂(进一步的论述见下文)。应当注意的是，上述任一手段/试剂均可单独或结合使用。

1.抗NK细胞抗体

本领域中可获得多种抑制NK细胞功能的抗体，包括但不限于抗人胸腺细胞球蛋白(ATG；美国专利No.6,296,846)、TM-β1(抗IL-2受体β链Ab)、抗脱唾液酸GM1(免疫原为糖脂GA1)、抗NK1.1抗体或抗NK细胞单克隆抗体(5E6；Pharmingen，Pi scataway，NJ)。此外，针对例如天然细胞毒性受体(NCR)(包括例如NKp46)的抗体、或针对白细胞相关Ig样受体家族(包括例如LAIR-1)的抗体、或针对杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)家族成员(包括例如KIR2DL1、KIR2DL2或KR2DL3)的抗体是本领域技术人员能够获得的，或可通过本领域技术人员可获得的方法制备，它们可用于本发明中。

识别NK细胞表达的抗原的多克隆或单克隆抗体、或其活性片段的制备及应用也在本发明的范围内，上述多克隆或单克隆抗体或其活性片段包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)₂片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗Id)抗体、以及任一上述的表位结合片段，它们识别NK细胞抗原例如细胞表面标记物。此外，也可使抗体与毒素偶联。可使用针对NK细胞抗原的抗体特异性地抑制NK细胞功能。上述抗体可与给予MAPC、照射(包括亚致死性照射)和/或细胞毒性药物和/或免疫抑制药物相结合使用。

所有的抗体分子均属于一个被称为免疫球蛋白的血浆蛋白质家族，它们的基本结构片段(block)——免疫球蛋白的折叠区或结构域——以各种形式用于免疫系统和其他生物识别系统的许多分子中。通常免疫球蛋白具有四条多肽链，包括被称为可变区的抗原结合区和被称为恒定区的不可变区。

天然抗体及免疫球蛋白通常为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链结合，不同的免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键数量不同。每条重链和轻链还具有位置规则的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，紧接着是数个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，在另一端具有恒定结构域。轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对准，轻链的可变结构域与重链的可变结构域对准。特定的氨基酸残基被认为构成了轻链和重链可变结构域之间的界面(Clothia et al.1985；Novotnyand Haber，1985)。

免疫球蛋白依据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，可归属为不同的类。至少有五种主要的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的一些又可进一步划分为多个亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4，IgA-1和IgA-2。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被命名为α、δ、ε、γ和μ。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基序列，可归属为被命名为κ和λ的两种明显不同的型中的其中一种。不同类的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象是公知的。

抗体可变结构域中的术语“可变”是指可变结构域的某些部分在各抗体中序列显著不同。可变结构域是结合部位，决定了每种特定的抗体针对其特定抗原的特异性。然而，可变性并非在抗体的可变结构域上平均分布。它集中于轻链和重链可变结构域上被称为互补决定区(CDR)的三个区段，互补决定区也被称为高变区。

可变结构域上更为高度保守的部分被称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各包括四个FR区，这四个FR区大部分为β片层构象，由三个CDR连接，三个CDR构成环形连接，某些情况下构成β片层结构的一部分。每条链上的CDR通过FR区紧密集中在一起，并与其他链上的CDR一起辅助抗体的抗原结合部位的形成。恒定结构域并不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出各种效应子功能，例如以抗体依赖性细胞毒性形式的抗体的参与。

因此，予以考虑用于本发明中的抗体可以是任何形式，包括完整免疫球蛋白、诸如Fv、Fab及类似片段等的抗体片段、包括可变结构域互补决定区(CDR)的单链抗体等等形式，上述全部均归属于本说明书所使用的广义术语“抗体”中。本发明考虑利用多克隆或单克隆抗体的任一特异性，而不局限于识别特异性表位并与其发生免疫反应的抗体。

术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，通常为抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)₂和Fv片段。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个完全相同的被称为Fab片段的抗原结合片段和一个残余的“Fc”片段，其中每个Fab片段均具有单一的抗原结合部位，而“Fc”片段之所以被如此命名是因为它能够容易地结晶。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合片段的F(ab’)₂片段和一个残余的其它片段(被称为pFc’)，其中F(ab’)₂片段能与抗原交联。其他片段可包括双特异性抗体、线性抗体、单链抗体分子和由多个抗体片段形成的多特异性(multispecific)抗体。如本说明书使用，“功能片段”与抗体相关时是指Fv、F(ab)和F(ab’)₂片段。

抗体片段保留了某些与其抗原或受体选择性结合的能力，其定义如下：

(1)Fab为包含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段。可通过木瓜蛋白酶对完整抗体的消化产生完整的轻链和一条重链的一部分，从而产生Fab片段。

(2)Fab’为可通过用胃蛋白酶处理抗体、然后还原、得到完整的轻链和一部分重链而获得的抗体分子的片段。每个抗体分子得到两个Fab’片段。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于，在其重链CH1结构域的羧基端另外具有几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。

(3)F(ab’)₂为可通过用胃蛋白酶处理完整抗体、然后不经过还原而得到的抗体的片段。F(ab’)₂是两个Fab’片段通过两个二硫键连接在一起的二聚体。

(4)Fv为含有完整抗原识别及结合部位的最小抗体片段。该区是由紧密的、非共价键连接的一条重链和一条轻链可变结构域的二聚体(V_H-V_L二聚体)所组成。正是在这一构象中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，形成V_H-V_L二聚体表面的抗原结合部位。六个CDR共同使抗体具有抗原结合特异性。然而，即使一个可变结构域(或半个Fv，仅由三个对抗原特异的CDR构成)也具有识别及结合抗原的能力，但其亲和力比整个结合部位低。

(5)单链抗体(“SCA”)定义为这样的一种遗传工程分子，它包含轻链的可变区和重链的可变区，两个区通过合适的多肽接头连接起来，成为遗传融合的单链分子。上述单链抗体也被称为“单链Fv”或“sFv”抗体片段。一般而言，Fv多肽进一步包括VH和VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头可使sFv形成抗原结合所需的结构。关于sFv的论述参见Pluckthun，Pharmacologyof Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburg and Moore eds.Springer-verlag，N.Y.pp.269-315(1994)。

术语“双特异性抗体”是指具有两个抗原结合部位的小抗体片段，该片段包括与同一多肽链(VH-VL)上的轻链可变结构域(VL)相连的重链可变结构域(VH)。通过利用短得无法使同一链上的两个结构域配对的接头，使得该两个结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合部位。双特异性抗体被更全面地记载于例如EP 404,097、WO 93/11161和Hollingeret al.1993中。

多克隆抗体的制备为本领域技术人员已知。参见例如Green，et al.Production of Polyclonal Antisera，Immunochemical Protocols(Manson，ed.)，page 1-5(Humana Press)；Coligan，et al.Production of PolyclonalAntisera，Rabbits，Rats Mice and Hamsters，Current Protocols in Immunology，section 2.4.1(1992)，上述文献通过引用的方式纳入。例如，为了制备多克隆抗体，可通过注射纯化的或部分纯化的NK细胞或其相关蛋白来对各种宿主动物进行免疫接种。可根据宿主物种种类使用各种佐剂以提高免疫应答，包括但不限于Freund(完全及不完全)佐剂、无机凝胶例如氢氧化铝、表面活性剂例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳化佐剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚、以及可能有用的人用佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(corynebacterium parvum)。

单克隆抗体的制备同样也是常规的。参见例如Kohler&Milstein，1975；Coligan，et al.sections 2.5.1-2.6.7；和Harlow，et al.Antibodies： A Laboratory Manual，page 726(Cold Spring Harbor Pub.(1988))，上述文献通过引用的方式纳入。单克隆抗体的体内及体外操作方法也是本领域技术人员可以得到的。例如，可用于本发明的单克隆抗体可通过首次由Kohlerand Milstein(1975)报道的杂交瘤方法制备，或者它们也可通过例如记载于美国专利No.4,816,567中的重组方法制备。也可利用Clackson et al.(1991)和Marks et al.(1991)所述的技术从抗体文库中分离出可用于本发明的单克隆抗体。

可通过各种已经建立的技术从杂交瘤培养物中分离并纯化出单克隆抗体。这种分离技术包括利用蛋白A琼脂糖进行亲和层析、尺寸排阻层析及离子交换层析。参见例如Coligan et al.sections 2.7.1-2.7.12 and sections2.9.1-2.9.3；Barnes，et al.Purification of Immunoglobulin G(IgG)，Methods in Molecular Biology，Vol.10，pages 79-104(Humana Press(1992))。

另一种生成抗体的方法包括选择淋巴细胞抗体方法(SelectedLymphocyte Antibody Method，SLAM)。SLAM技术使得可不经过杂交瘤生成步骤就能生成、分离出单克隆抗体并对其进行操作。该方法主要包括：抗体形成细胞的生长、特别选择的抗体形成细胞的物理筛选、编码抗体的基因的分离以及随后对上述基因进行的克隆和表达。

更具体而言，用某一特异性抗原来源对动物进行免疫接种。动物可以是兔、小鼠、大鼠、或任何其他常规动物。免疫接种可由天然或重组形式的经纯化的蛋白质、肽、编码目的蛋白的DNA或表达目的蛋白的细胞组成。一段适当的时间(在此期间可在该动物的血清中检测出抗体，通常为数周至数月)后，从该动物身上采集血液、脾或其他组织。从血液中分离出淋巴细胞，并在特定条件下培养以生成抗体形成细胞，分泌出的抗体进入培养基中。通过数种方法(携带抗原的细胞的补体介导溶胞作用、荧光检测或其他方法)中的任一种对这些细胞进行检测，然后利用显微操作技术分离。然后加工各个抗体形成细胞进行最终单细胞PCR，以获得编码特异性抗体的被表达的重链及轻链基因。一旦获得这些基因并测序后，克隆这些基因进入适合的表达载体，并在异种细胞系统中产生重组的单克隆抗体。然后通过标准方法，例如采用蛋白A亲和柱，对这些抗体进行纯化。此类方法进一步记载于Babcook，et al.1996、美国专利5,627,052和Schrader的PCT WO 92/02551中。

另一种方法包括通过重组手段对单克隆抗体进行人源化处理，以生成含有人特异性可识别序列的抗体。有关论述见Holmes，et al.(1997)和Vaswani，et al.(1998)。

本说明书中单克隆抗体特别地包括这样一种“嵌合”抗体(免疫球蛋白)和该抗体的片段，其中一部分重链和/或轻链与来自于特定物种或属于特定抗体类或亚类抗体的相应序列相同或同源，而该链的其余部分与来自于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性即可(美国专利4,816,567)；Morrison et al.Proc.Natl.Acad Sci.81，6851-6855(1984)。

制造抗体片段的方法也是本领域已知的(参见例如Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，(1988)，通过引用的方式纳入)。本发明的抗体片段可通过对该抗体的蛋白水解或通过编码该片段的DNA在大肠杆菌(E.coli)中的表达制备。可通过对完整抗体进行胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化常规方法获得抗体片段。例如，可采用胃蛋白酶进行抗体酶裂解以得到5S片段(表示为F(ab’)₂)，从而生成抗体片段。可利用硫醇还原剂以及任选地、二硫键断裂所产生的巯基的保护基团进一步切割该片段，产生3.5S Fab单价片段。或者，通过胃蛋白酶的酶裂解直接产生两个单价Fab’片段和Fc片段。这些方法记载于例如美国专利4,036,945和4,331,647及其所包含的参考文献中。这些专利通过全文引用的方式纳入本说明书。

也可采用使抗体裂解的其他方法，例如分离重链以形成单价的轻-重链片段、进一步裂解片段或其他酶、化学或遗传技术，只要片段与完整抗体所识别的抗原结合即可。例如，Fv片段包括连接的V_H和V_L链。上述连接可能是非共价键的，或者，可变的链可通过分子间二硫键连接或通过化学品(例如戊二醛)交联。优选地，Fv片段包括以肽接头连接的V_H和V_L链。通过构建包括有编码V_H和V_L结构域的DNA序列的结构基因制备这些单链抗原结合蛋白(sFv)，所述V_H和V_L结构域以寡核苷酸连接。将结构基因插入表达载体中，随后将该表达载体引入宿主细胞例如大肠杆菌中。重组的宿主细胞合成出具有连接这两个V结构域的接头肽的单一多肽链。产生sFv的方法记载于例如Whitlow，etal.Methods：a Companion to Methods in Enzymology，Vol.2，page 97(1991)；Bird et al.(1998)；Ladner，et al，美国专利4,946,778和Pack，et al.(1993)中。

抗体片段的另一种形式是编码为单一互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单元”)可通过构建编码目的抗体的CDR的基因而获得。这类基因可通过例如以下方法制备：利用聚合酶链反应由抗体生成细胞的RNA合成出可变区。参见例如Larrick，et al.Methods：a Companion to Methods in Enzymology，Vol.2，page 106(1991)。

本发明还考虑了人和人源化形式的非人(例如鼠)抗体。这类人源化抗体可以是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或它们的片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂或抗体的其他抗原结合子序列)。就绝大部分而言，人源化抗体是这样一种人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中受体互补决定区(CDR)上的残基被具有所需特异性、亲和力及能力的诸如小鼠、大鼠或兔等的非人物种(供体抗体)CDR上的残基取代。

某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人源残基取代。而且，人源化抗体可能还包括既不存在于接受者抗体中也不存在于所引入的CDR或框架序列中的残基。进行这种修饰以进一步改进及优化抗体性能。一般而言，人源化抗体可包括基本全部的至少一个、通常为两个可变结构域，其中全部或基本全部的CDR区对应非人免疫球蛋白的CDR区，而全部或基本全部的Fv区为人免疫球蛋白共有序列的Fv区。人源化抗体最好还包括至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白恒定区。更详细的论述见：Jones et al.(1986)、Reichmann et al.(1988)、Presta(1992)、Holmes(1997)和Vaswani，et al.(1998)、美国专利4,816,567和6,331,415、PCT/GB84/00094、PCT/US86/02269、PCT/US89/00077、PCT/US88/02514和WO91/09967，上述每一篇文献通过全文引用的方式纳入本说明书。

本发明还提供了使抗体突变以优化其亲和力、选择性、结合强度或其他想要的性能的方法。突变抗体指的是抗体的氨基酸序列变体。一般而言，突变抗体的一个或多个氨基酸残基与参照抗体中存在的有所不同。这类突变抗体与参照氨基酸序列的序列同一性或相似性必须小于100％。一般而言，突变抗体与参照抗体重链或轻链可变结构域的氨基酸序列的氨基酸序列同一性或相似性为至少75％。优选地，突变抗体与参照抗体重链或轻链可变结构域的氨基酸序列的氨基酸序列同一性或相似性为至少80％、更优选至少85％、尤其优选至少90％、最优选至少95％。

本发明的抗体为分离的抗体。分离的抗体是已被识别并从其所产生的环境中分离和/或回收的抗体。一般而言，本发明的分离的抗体基本上不含至少部分的来自于其所产生的环境的污染组分。其所产生环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括细胞、酶、激素、及其他蛋白质或非蛋白质溶质。术语“分离的抗体”还包括重组细胞内的抗体，因为至少一种抗体天然环境的组分将不存在。然而，通常分离的抗体经过至少一步纯化步骤制得。

如果需要，本发明的抗体可通过任何已知方法纯化。例如，可通过使抗体制剂与其上结合有用于募集抗体的抗原的固体支持物结合，从而对抗体进行亲和纯化。洗去污染物后，可通过已知的方法将抗体洗脱。本领域技术人员应当知晓免疫学领域中用于纯化和/或浓缩多克隆抗体以及单克隆抗体的各种常规技术(参见例如Coligan，et al.Unit 9，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991，通过引用的方式纳入)。

在一些实施方案中，将抗体纯化为通过至少三种不同方法可测量的程度：1)按Lowry法测定高于抗体的95重量％，最优选高于99重量％；2)达到足以利用旋杯式测序仪(spinning cup sequenator)测量为N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或3)使用考马斯亮蓝或优选银染色在还原性或非还原性条件下SDS-PAGE测定为同质。

此外，还可通过连接毒性试剂来修饰抗NK抗体或其活性片段，以使得得到的分子可用于杀死表达相应抗原的细胞或使上述细胞失活。本领域任何可获得的方法均可用于偶联抗体至毒性试剂上，包括通过DNA技术生成融合蛋白。

2.免疫抑制途径

A.移植物排斥的病理学及免疫学

器官移植伴随着一系列复杂的免疫应答。它们通常被划分为炎症、免疫性以及受损组织的组织修复和结构强化。移植部位的炎症通过巨噬细胞、T细胞和促炎介质(例如IL-2)介导。紧接着是生物化学级联系统(例如经典补体级联系统)的激活，从而产生诸如C3a和C5a等生物活性中间产物。供体细胞被免疫系统识别及排斥后，巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞开始促进受损细胞的修复和结构强化。

当病理性及炎性应答出现或无法进行组织修复及重建时，产生排斥作用。在超急性排斥反应中，移植患者对同种异体抗原产生血清预敏化(presensitize)反应(即，移植物抗原被识别为外源性的)。超急性排斥反应可在移植物植入的数分钟至数小时内出现。

在急性排斥反应中，移植物同种异体抗原遇到T细胞，引起细胞因子(并且可能还有抗体)释放从而导致组织畸变、血管不足和细胞损坏。这些过程可在移植物植入后24小时内出现，并持续数天至数周。

在慢性排斥反应中，出现病理性组织重建和强化。血液流动减少，从而导致局部组织缺血、纤维化和细胞死亡。

控制急性排斥反应已成为免疫抑制、进而使组织修复进行的最主要目标。组合免疫抑制疗法的应用已发展多年。

B.本发明中所用免疫抑制药物的实例

硫唑嘌呤是6-巯基嘌呤的衍生物。它作为降低DNA和RNA合成的抗代谢药物起作用，用于维持免疫抑制。

皮质类固醇阻止巨噬细胞产生白细胞介素(IL)-1和IL-6，并抑制全部阶段的T细胞激活。该药物用于诱导、维持免疫抑制以及急性排斥反应。

环孢菌素是真菌源的11个氨基酸的多肽，对辅助T细胞具有活性，通过抑制钙依赖磷酸酶(calcineurin)(结合到亲环蛋白(cyclophilin protein)上)阻止IL-2的产生。该药物用于诱导和维持免疫抑制。

他克莫司是大环内酯类抗生素，对辅助T细胞具有活性，通过抑制钙依赖磷酸酶(结合到他克莫司结合蛋白而不是亲环蛋白上)阻止IL-2的产生。该药物用于维持免疫抑制并用于对环孢菌素治疗下具有难治性排斥的患者的救援疗法中。

霉酚酸酯抑制肌苷一磷酸脱氢酶(鸟苷合成所需的)并减少B细胞和T细胞增殖，使其他快速分裂的细胞免遭破坏(spare)(由于其他细胞中存在鸟苷补救途径)。该药物用于维持免疫抑制及慢性排斥反应。

西罗莫司是与FK结合蛋白结合的大环内酯类抗生素，但其作用机制是通过“瑞帕霉素(Rapamune)靶体”或TOR。它抑制G1至S期细胞分裂，进而抑制细胞增殖。该药物用于维持免疫抑制和慢性排斥反应。

C.本发明所采用的介导免疫抑制的生物制剂的实例

多克隆抗体(例如抗胸腺细胞球蛋白)：这类试剂通过向动物注射人淋巴细胞、然后采集所得到的抗体并纯化而获得。多克隆抗体诱导淋巴细胞的补体溶胞以及网状内皮系统对淋巴细胞的摄取，并遮蔽淋巴细胞表面受体。制剂包括马抗胸腺细胞球蛋白(Atgam)和兔抗胸腺细胞球蛋白(Thymoglobulin)。

Muromonab-CD3：是针对T细胞受体CD3部分的免疫球蛋白2A克隆的鼠单克隆抗体。它阻断T细胞功能，并与其他组织或细胞具有有限的反应。该试剂用于诱导和急性排斥反应(一级处理或类固醇抗性)。

Basiliximab(Simulect)和daclizumab(Zenapax)：是以IL-2受体为靶标的人源化单克隆抗体。临床上，两种试剂极为相似，二者均用于诱导免疫抑制。

MHC-I阴性细胞和抑制NK细胞活性的手段的治疗用途

抑制NK细胞活性的手段可用于提升干细胞(例如MAPC)定植、持续存在和/或供体特异性耐受，以提高移植的成功率或结果。提升干细胞定植、持续存在和/或耐受性不仅是细胞移植中的课题——即提升移植接受者对细胞的接受能力，而且还是各种疾病和损伤治疗中的课题。

诸如MAPC和ES细胞等的MHC-I阴性细胞和抑制NK细胞活性的手段可用于临床前情境中，例如用于大型动物的疾病或损伤模型，也可用于临床情境中，例如治疗和处置(分离自人和小鼠的MAPC的应用记载于PCT/US0021 387(以WO 01/11011公布)中，分离自大鼠的MAPC的应用记载于PCT/US02/04652(以01/11011公布)中，这些应用通过引用的方式纳入本说明书)。

例如，MAPC和ES细胞可分化形成全部三个生殖细胞层。例如，MAPC可被诱导分化为软骨细胞、肝细胞、内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和神经细胞。同样地，MAPC、ES细胞或来源于它们的子代也可用于治疗任何哺乳动物物种(优选人)中的几乎任何损伤或疾病，特别是易于通过细胞、组织或器官移植治疗、与器官或组织生理或形态上的病理改变有关的疾病。所给予的MAPC或ES细胞通过体内分化可有助于新组织的生成。例如，可通过直接注射到组织损伤部位或通过全身注射、然后使细胞向组织或器官归巢，从而将MAPC用于重造缺乏或受损的心肌细胞、或任何其他器官或组织的细胞。这种方法在与血管生成方法相结合时特别有效。两种注射方法及促进血管生成的方法均是本领域技术人员已知的。

可通过基于MHC-I阴性细胞疗法治疗的疾病包括但不限于肾病、胰脏疾病、心脏病、肝病、血液病、遗传疾病、肺病、脑部疾病、胃肠疾病、肌肉疾病、肺部疾病、内分泌疾病、神经系统疾病、代谢疾病、皮肤病、整容类疾病(cosmetic disease)、眼科疾病和血管疾病。

可采用MHC-I阴性细胞或其子代治疗的肾病的实例包括但不限于急性肾衰竭、急性肾炎综合征、镇痛剂肾病、动脉粥样硬化栓塞肾病、慢性肾衰竭、慢性间质性肾炎、先天性肾病综合征、晚期肾病、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture’s syndrome)、IgM系膜增生性肾小球性肾炎、间质性肾炎、肾癌、肾损害、肾感染、肾损伤、肾结石、狼疮肾炎、I型膜性增生性肾小球肾炎、II型膜增殖性肾小球肾炎、膜性肾病、坏死性肾小球肾炎、肾胚细胞瘤、肾钙沉着症、肾性尿崩症、IgA介导肾病、肾变病、肾病综合征、多囊肾病、链球菌感染后肾小球肾炎、逆流性肾病、肾动脉栓塞、肾动脉狭窄、肾乳头坏死、I型肾小管性酸中毒、II型肾小管性酸中毒、肾灌注不足(renalunderperfusion)和肾静脉血栓形成。

可采用MHC-I阴性细胞或其子代治疗的肺部疾病的实例包括但不限于环境性肺病、职业肺病(例如mesothioloma)、哮喘、BOOP、慢性支气管炎、COPD(慢性阻塞性肺病)、肺气肿、间质性肺病、肺纤维化、结节病、石棉沉着病、曲霉肿、曲霉病、急性侵袭性曲霉病、肺膨胀不全、嗜酸细胞性肺炎、肺癌、转移性肺癌、坏死性肺炎、胸腔积液、尘肺病、肺囊虫病、肺炎、免疫缺陷患者的肺炎、气胸、肺放线菌病、肺泡蛋白沉积、肺炭疽、肺动静脉畸形、肺水肿、肺栓子、肺组织细胞增多病X(嗜酸细胞肉芽肿)、肺动脉高血压、肺奴卡菌病、肺结核、肺静脉闭塞性疾病和类风湿性肺病。这些疾病均可对肺组织造成损害/损伤。

可采用MHC-I阴性细胞或其子代治疗的胰脏疾病的实例包括但不限于I型或II型糖尿病。

可采用MHC-I阴性细胞或其子代治疗的肝病的实例包括但不限于丙型肝炎感染、肝硬化、原发性硬化性胆管炎、NASH、肝细胞癌、酒精性肝病和乙型肝炎。

就心脏病而言，可采用MHC-I阴性细胞或其子代治疗的疾病包括但不限于心肌炎、心肌病、心力衰竭、由心脏病发作引起的损害、高血压、动脉粥样硬化或心瓣膜异常。子代可包括重造受损组织的心肌细胞、或使该组织进行新血管形成的内皮细胞。

也可给予MHC-I阴性细胞，以为由于物理或疾病相关损害而丧失血管形成和/或功能的受试者提供脉管系统。具有血管形成和/或功能丧失这一特征的、且可从本发明方法中获益的疾病状况包括血管病症，例如局部缺血(包括局部缺血-再灌注损伤)、充血性心力衰竭、外周脉管系统异常、冠状血管疾病、糖尿病性溃疡、压迫性溃疡、高血压、中风、动脉瘤、血栓症、心律失常、心动过速或者手术或物理(例如致伤性)创伤。

一个实施方案中，基于MHC-I阴性细胞的疗法可用于治疗由以下疾病状况所引起的损害，所述疾病状况包括但不限于充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、心肌梗塞、心肌缺血、动脉粥样硬化或高血压的后果、心肌病、心律失常、感染性心肌炎、超敏感性心肌炎、自身免疫性心内膜炎和先天性心脏病。

例如，心脏损伤(例如MI)增强通过利用植入的MAPC增强肌形成的组织应答。因此，给予MAPC可例如降低疤痕形成程度、增强心室功能以及补偿削弱的心肌，进而改善心脏功能。从而在梗塞的心肌区段中产生新的肌肉。优选地，MHC-I阴性细胞，例如MAPC或ES细胞，可直接渗入梗塞组织区域。优选的实施方案中，MHC-I阴性细胞的定植出现在急性心肌梗塞的心肌内。

就退行性心肌疾病而言，MHC-I阴性细胞可实现肌细胞替代及刺激血管生成。改善的心功能可通过例如增加的灌注来体现。该疗法可作为单独疗法使用，或者也可与再血管化疗法相结合使用。MHC-I阴性细胞，例如MAPC或ES细胞，也可提供形成血管结构从而向新生心脏肌肉群供应和供给血液的优点。

基于MHC-I阴性细胞的疗法并非仅局限于改善心肌病状，而是可拓展到其主要病理是丧失横纹肌群和/或功能的任何类型的肌肉病症。这可包括但不限于肌肉退化、线粒体疾病、肌阵挛、发作性疾病、震颤、肌营养不良、创伤、重症肌无力和毒素诱导的肌肉异常。由此，在另一个实施方案中，本发明包括了通过使合适量的MHC-I阴性细胞与已有的横纹肌组织接触并产生可存活的横纹肌群从而增加横纹肌群的方法。

可采用MHC-I阴性细胞或其子代治疗的血液病和/或遗传疾病的实例包括但不限于凝结障碍/凝结因子缺陷，例如血友病、地中海贫血、慢性肉芽肿性疾病和溶酶体贮积病/酶缺乏例如戈谢病。

在一个实施方案中，造血系统疾病包括但不限于：

-白血病(白血病是一种血液免疫系统癌症，该系统的细胞被称为白血球或白细胞)，包括但不限于急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性双表型白血病、急性未分化白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴性白血病(CLL)、幼年型慢性粒细胞白血病(JCML)、幼年型粒-单核细胞性白血病(JMML)；

-骨髓增生异常综合征(骨髓发育不良有时也被称为白血病前期)，包括但不限于顽固性贫血(RA)、环形铁粒幼红细胞性顽固性贫血(RARS)、未成熟细胞过多的顽固性贫血(RAEB)、转化中的未成熟细胞过多的顽固性贫血(RAEB-T)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)；

-淋巴瘤(淋巴瘤是一种在血管和淋巴管中循环的白血球的癌症)，包括但不限于何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤；

-遗传性红细胞(红血球)异常(红细胞含有血红蛋白并将氧运载到身体)，包括但不限于重度β地中海贫血(也被称为库利氏贫血)、布-戴二氏贫血综合征、纯红细胞再生障碍、镰状细胞病；

-其他血细胞增殖障碍，包括但不限于贫血(贫血是红细胞缺乏或畸形)包括但不限于重度再生障碍性贫血、先天性红细胞生成不良性贫血和范可尼贫血、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)，

-遗传性血小板异常(血小板是凝血所需的小血细胞)，包括但不限于巨核细胞缺乏/先天性血小板过少、格兰兹曼氏血小板机能不全、骨髓增生障碍、急性骨髓纤维化、特发性髓细胞外化生(骨髓纤维化)、真性红细胞增多症、特发性血小板增多症；

-遗传性免疫系统障碍——重度联合免疫缺陷病(SCID)，包括但不限于腺苷脱氨酶缺陷性SCID(ADA-SCID)、X-连锁的SCID、T&B细胞缺乏性SCID、B细胞正常但T细胞缺乏的SCID、Omenn综合征；

-遗传性免疫系统障碍——嗜中性白细胞减少症，包括但不限于婴儿型遗传性粒细胞缺乏症、先天性骨髓粒细胞缺乏症；

-其他遗传性免疫系统障碍，包括但不限于共济失调性毛细血管扩张症、裸淋巴细胞综合征、普通可变型免疫缺陷症、迪格奥尔格综合征、白细胞粘附缺陷；

-淋巴增生性障碍(LPD)，包括但不限于X-连锁的淋巴增生性障碍(也被称为爱泼斯坦-巴尔病毒易感性(Epstein-Barr Virus Susceptibility))、威斯科特-奥尔德里奇综合征；

-吞噬细胞障碍(吞噬细胞是能够吞食并杀死外来生物的免疫系统细胞)，包括但不限于切-东二氏综合征、慢性肉芽肿病、中性粒细胞肌动蛋白缺陷、网状细胞发育不全；

-骨髓中的癌症(浆细胞障碍)，包括但不限于多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、特发性巨球蛋白血症；以及

-其他癌症(非起源于血液系统)，包括但不限于成神经细胞瘤。

可采用MHC-I阴性细胞或其子代治疗的神经系统疾病的实例包括但不限于帕金森氏病、ALS和亨廷顿氏舞蹈病。

可使用本发明方法的其他疾病或疾病症状的实例包括但不限于癌症，包括淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤)、急慢性白血病(例如慢性髓细胞性白血病)或其他血液病/病症(例如再生障碍性贫血、镰状细胞贫血、地中海贫血)、实体器官、组织或细胞移植、免疫缺陷、糖尿病、多发性硬化、镰状细胞贫血和其他自身免疫性疾病状况、移植物抗宿主病(GVHD)或遗传缺陷或损害(例如胡尔勒氏综合征、范可尼贫血(FA))。

可采用MHC-I阴性细胞治疗的损伤包括但不限于由疾病、物理(伤口)或手术创伤引起的损伤，以及使其能对造血干细胞移植适应而用化学疗法或照射受损的组织。

MHC-I阴性细胞和抑制NK细胞功能的手段的给予

A.MHC-I阴性细胞的给予

可通过本领域可获得的各种方法将诸如MAPC或ES细胞等的MHC-I阴性细胞或其分化子代给予受试者，所述方法包括但不限于局部注射、导管给予、全身注射、腹膜内注射、肠胃外给予、口服给予、颅内给予、动脉内注射(如下实施例部分所述，动脉内注射可提供比静脉内注射更多样化的归巢/更广泛的生物分布)、静脉内注射、心室内输注、胎盘内注射、子宫内注射、外科心肌内注射、经心内膜注射、经脉管注射、冠状动脉内注射、经脉管注射、肌内注射、向目的组织进行手术注射或通过直接施用于组织表面(例如在外科手术中或在伤口上)。

静脉内注射是最简便的细胞给予方法；然而，干细胞能否到达目的组织(例如肺)在很大程度上依赖于其归巢情况。小心控制的给药可改善这种给予方法，上述给药是本领域技术人员容易确定的。

MHC-I阴性细胞可通过循环系统外周给予或局部给予。干细胞向受损组织的“归巢”会使植入的细胞集中在有利于其生长和作用的环境。用细胞因子预治疗患者以促进归巢是本发明方法所考虑的另一种替代方案。当归巢信号不强时，向肺部直接注射细胞可能会产生更有利的效果。某些细胞因子(例如诱导或增强细胞运动的细胞因子，所述细胞运动例如MHC-I阴性细胞、子代细胞或分化细胞的归巢，MHC-I阴性细胞例如MAPC或其他干细胞)可增强MHC-I阴性细胞或其相应的分化细胞向受损肺组织部位的迁移。细胞因子包括但不限于基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)、干细胞因子(SCF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。细胞因子还包括任何可促使有助于归巢过程的内皮黏着分子(例如ICAM、VCAM和其他分子)表达的细胞因子。

MHC-I阴性细胞分化为具有所需组织特征的表型在采用分化因子例如促使所需肺组织形成的因子时可得以增强。

新形成组织的存活能力可通过血管生成得以增强。促使血管生成的因子包括但不限于VEGF、aFGF、血管生成素、血管紧张素-1和-2、β细胞素(betacellulin)、bFGF、X和Xa因子、HB-EGF、PDGF、血管调节素(angiomodulin)、促血管素、血管生成素-1、前列腺素E1和E2、类固醇、肝素、1-丁酰丙三醇、烟酰胺。

减少凋亡的因子也可促进新组织例如肺上皮的形成。减少凋亡的因子包括但不限于β受体阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、AKT、HIF、卡维地洛、血管紧张素II型1受体拮抗剂、半胱天冬酶抑制剂、卡立泊来德和依尼泊胺。

外源因子(例如细胞因子、分化因子(例如细胞因子、优选诱导谱系定向分化的生长因子或血管生成因子)、血管生成因子和抗凋亡因子)可在MHC-I阴性细胞或其分化子代(例如肺泡II型上皮或上皮样细胞)之前、之后或共同给予。例如一种共同给予的形式包括给予前在MAPC或ES细胞悬浮培养基中添加目的因子。给予剂量是可变的，并且可包括初始给予、紧接着是随后给予。

一种有可能能够提高细胞存活率的方法为将MHC-I阴性细胞(例如MAPC、ES细胞或其他目的细胞)掺入生物聚合物或合成聚合物中。根据患者的情况，注射部位可能会由于伤痕或其他障碍的存在而被证明是不适于细胞接种和生长的。生物聚合物的实例包括但不限于与下列物质混合的细胞：纤连蛋白、血纤蛋白、血纤蛋白原、凝血酶、胶原和蛋白聚糖。这可在采用或不采用所包括的细胞因子、分化因子、血管生成因子和/或抗凋亡因子的情况下建立。此外，这些也可以是悬液形式。另一种替代品是细胞包埋于细胞生物聚合物混合物的间隙中的三维凝胶。同样地，细胞因子、分化因子、血管生成因子和/或抗凋亡因子也可包括在该凝胶中。它们均可通过本说明书所述的各种注射途径、通过导管或其他手术方法使用。

在目前针对人类自身单核骨髓细胞研究中，已采用了范围为1×10⁷至4×10⁷细胞的经验剂量。然而，不同的情形可能需要优化注射入目的组织的细胞量。因此，待给予的细胞量会根据被治疗的受试者而改变。在一个优选实施方案中，可给予人类受试者10⁴至10⁸、更优选10⁵至10⁷、最优选3×10⁷的MHC-I阴性细胞，以及任选地每天50至500μg/kg的细胞因子。然而，可能会依据每个患者的个体因素而精确确定认为有效的剂量，所述个体因素包括他们的体型、年龄、疾病或损伤、损害尺寸、从损害产生时的时间长短和与送递方式有关的因素(直接注射-较低剂量，静脉内注射-较高剂量)。

一个与干细胞应用有关的问题是干细胞群的纯度。例如，骨髓细胞包括混合的细胞群，它可被纯化到足够产生所需效果的程度。本领域技术人员利用各种公知的方法，例如荧光激活细胞分选法(FACS)，能够很容易地确定MAPC、ES细胞或其他MHC-I阴性细胞在一个细胞群中所占的百分比。包括有MHC-I阴性细胞(例如MAPC或ES细胞)或其分化子代的细胞群的优选纯度范围为50-55％、55-60％和65-70％。更优选地，该纯度为70-75％、75-80％、80-85％；最优选地，该纯度为85-90％、90-95％和95-100％。然而，较低纯度的群可能也是有用的，例如约＜25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％和45-50％。诸如MAPC等的纯度可根据一个群中的基因表达概况而定。剂量可由本领域技术人员容易地调整(例如，纯度降低可能会需要增加剂量)。

技术人员可容易地确定组合物中的以及本发明方法中待给予的细胞和任选的添加剂、运载体和/或载体的量。通常，任何添加剂(除活性干细胞和/或细胞因子之外)的存在量为溶于磷酸盐缓冲盐水的0.001至50 wt％溶液，活性成分以微克至毫克的量级存在，例如约0.0001至约5wt％、优选约0.0001至约1wt％、最优选约0.0001至约0.05wt％，或者为约0.001至约20wt％、优选约0.01至约10wt％，以及最优选约0.05至约5wt％。当然，对于任何待给予动物或人的组合物，以及对于任何特定的给予方法，优选地应确定：毒性，例如通过在适合的动物模型(例如啮齿类动物，例如小鼠)中测定致死剂量(LD)和LD50；以及组合物的剂量、其中组分的浓度和给予组合物的时机，这些都会引发适合的响应。

当给予本发明的治疗组合物时，通常将其配制为可注射的单位剂量形式(溶液、悬液、乳液)。适于注射的药物制剂包括无菌水溶液和分散系。载体可以是含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、液体聚乙烯醇等)和它们的适合的混合物的分散介质或溶剂。

此外，也可加入增强组合物稳定性、无菌度和等渗性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧剂、螯合剂和缓冲剂。通过各种抗细菌和抗真菌试剂可确保防止微生物的作用，所述抗细菌和抗真菌试剂例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等。在许多情况下，包括诸如糖、氯化钠等的等渗剂是理想的。可通过使用延缓吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来使可注射药物形式的吸收时间延长。然而，根据本发明，所使用的任何赋形剂、稀释剂或添加剂都应当是与细胞相容的。

无菌注射溶液可根据需要通过将实施本发明所用的细胞掺入所需量具有不同量其它成分的适合溶剂中来制备。

一个实施方案中，可起初先给予MHC-I阴性细胞，例如MAPC或ES细胞，然后再通过进一步给予MHC-I阴性细胞来维持。例如，可通过一种注射方法给予MHC-I阴性细胞，然后通过不同或相同类型的方法来进一步给予MHC-I阴性细胞。例如，可通过手术注射给予MAPC或ES细胞，以使肺功能达到适当的水平。然后，可通过例如静脉内注射维持患者的水平，然而也可根据患者的状况采用其他的给予形式。

应当注意的是，人受试者的治疗时间通常要比犬类或其他实验动物长，以使得治疗的时间长度与疾病过程和效力的时间长度成比例。剂量可以是单剂量或数天时间的多剂量。因此，本领域技术人员通过本公开内容和其中所引述文献的技术及本领域的公知常识，不需要过多的实验就可从动物实验(例如大鼠、小鼠、犬类等)按比例扩大到人。治疗的时间长度通常与疾病过程和药物效力的时间长度以及所治疗的受试者成比例。

包含有MHC-I阴性细胞或其分化子代的组合物的实例包括：用于给予的液体制剂，包括悬液；和用于直接或静脉内给予(例如可注射的给予)的制剂，例如无菌悬液或乳液。这种组合物可与适合的载体、稀释剂或赋形剂(例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物也可以是经低压冻干的。根据给药途径和所需制剂，组合物可包含辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝或增粘添加剂、防腐剂、芳香剂、颜料等。可参考标准教科书例如“REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE”，17^th edition，1985(通过援引纳入本文)，以便在不采用过多实验的情况下制备合适的制剂。

本发明的组合物可方便地以液体制剂的形式来提供，例如等渗水溶液、悬液、乳液或粘稠组合物，所述制剂可被缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘稠组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物在一定程度上更容易给药，特别是通过注射的方式。另一方面。粘稠组合物可在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织的更长的接触期。

适合载体和其他添加剂的选择取决于确切的给药途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，是否将组合物配制为溶液、悬液、凝胶或其他液体形式，例如随时间释放形式或液体充填形式)。

除细胞外，溶液、悬液和凝胶通常主要包含水(优选无菌纯水)。也可存在少量的其他成分，例如pH调节剂(例如碱，例如NaOH)、乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐剂、湿润剂和胶凝剂(例如甲基纤维素)。组合物可以是等渗的，即它们可具有与血液和泪液相同的渗透压。

本发明组合物所需的等渗性可通过使用氯化钠或其它可药用试剂来实现，所述可药用试剂例如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其他无机或有机溶质。对于含钠离子的缓冲液来说，氯化钠为特别优选的。

需要时，可使用可药用的增稠剂将组合物的粘度维持在选定的水平。优选甲基纤维素，因为它容易购得且容易使用。其他适合的增稠剂包括，例如，黄胞胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。优选的增稠剂浓度取决于所选择的试剂和所需粘度。通常通过加入这类增稠剂由溶液来制备粘稠组合物。

可使用可药用防腐剂或细胞稳定剂来延长组合物的寿命。优选地，如果必须使用防腐剂，那么以本领域技术人员的能力完全能够选择不会影响本发明所述细胞的生存力或效力的组合物。

可通过医学和兽医学领域技术人员可获得的技术和剂量、在考虑到诸如具体患者的年龄、性别、体重和身体状况以及用于给药的组合物形式(例如固体对液体)等因素的情况下给予组合物。

适于首次给予及进一步给药或者序贯给药的方案也是可变的，可包括首次给予接着是序贯给药。

B.预防免疫排斥反应的其他移植方法

在一些实施方案中，可能需要在移植/给予前对MHC-I阴性细胞(例如MAPC、ES细胞或其分化子代)进行处理或以其它方式调整，以降低激发宿主针对移植细胞产生免疫应答的风险。任何本领域已知的降低激发宿主产生免疫应答的风险的方法均可采用。以下提供了一些此类方法的实例：

1.通用供体细胞：MAPC和ES细胞具有能够避免免疫识别的细胞表面概况，它们在天然状态下可能不激发免疫致敏和排斥。即使在其子代会成熟为通常被免疫识别和排斥的细胞的情况下，它们也可作为天然的通用供体细胞。

或者，MHC-I阴性细胞(例如MAPC或ES细胞)也可被处理成为通用供体细胞。尽管未分化的MAPC和ES细胞不表达MHC-I或MHC-II抗原，但一些分化的子代可能表达上述抗原的一种或两种。可通过以下方式修饰MAPC，使其成为通用供体细胞：消除MHC-I或MHC-II抗原、并且潜在地引入来自预期接受者的MHC抗原，从而使细胞成为不易受NK介导的杀伤作用的目标、或不易受无限的病毒复制和/或恶性转化的影响。MHC抗原的消除可通过同源重组或通过在启动子区域引入点突变或通过在抗原的起始外显子中引入点突变以引入终止子(如用嵌合体(chimeroplast))来实现。宿主MHC抗原的传递可通过反转录病毒、慢病毒、腺伴随病毒或其它病毒转导或者通过用MHC抗原cDNA转染靶细胞来实现。

2.子宫内移植以防止发生免疫识别：

MAPC或ES细胞可在子宫内移植处置中使用以修正遗传异常，或在免疫系统发育前引入可被宿主耐受的细胞。这是一种在动物中大量制备人细胞的方法，或者它也可用作一种通过移植产生正确蛋白或酶的细胞来修正人胚胎遗传缺陷的方法。

3.免疫识别和耐受：

A.免疫识别

免疫应答受T细胞上的受体(T细胞受体即TCR)与体细胞组织(I型和II型MHC)之间分子识别事件的控制。TCR/MHC相互作用是免疫应答的抗原特异性组成部分，使得能够识别自身抗原和外来抗原。由于免疫反应仅在T细胞识别外来抗原即非自身抗原之后才会进行，因此需要额外的信号事件来起到预防意外的或自身免疫应答的作用(Buckley，2003)。

免疫识别可划分为两个阶段，致敏和二次应答。致敏通过T细胞的一个亚类即T辅助细胞与被称为树突细胞的一个特定免疫细胞群的相互作用来完成。T辅助细胞识别这些树突细胞或抗原呈递细胞(APC)上的I I型MHC复合物所呈递的抗原，这对于启动抗体或溶细胞性T细胞应答是非常关键的。仅有限数量的细胞才会表达II型MHC受体，这些“专门的”APC的特征在于它们不仅能用非自身抗原致敏T辅助细胞，而且还可表达细胞因子级联系统，所述细胞因子级联系统调控T细胞的增殖并控制体液免疫应答和溶细胞性免疫应答。B细胞、巨噬细胞、朗格汉斯细胞(Langherhans cell)和其他树突细胞类构成了APC部分。因此，只有特定的细胞类型才能发送免疫应答信号，包括同种异体反应活性。

两类MHC受体(I型和II型)具有在细胞内与短肽区段关联的结构基序，所述短肽区段源自细胞内表达的所有基因。这种与细胞表面MHC受体相结合的肽复合物是可被TCR识别的分子复合物，因此提供了T细胞抗原性识别的特异性(类似于锁钥机制)。一旦免疫系统被致敏并触发，免疫系统细胞就会增殖直至抗原被消除，然后处于静息状态或记忆状态，以在再次遇到该抗原时应答。

免疫反应活性的控制通过级联方式完成。除T辅助细胞与APC之间的非自身肽的初次识别外，第二阶段是用病原体相关刺激物对APC进行所需的刺激，所述病原体相关刺激物为例如细菌细胞壁组分例如LPS、在B细胞上与表面Ig交联的病毒颗粒，与病毒感染相关的双链RNA或由物理创伤或脉管系统受损产生的炎性细胞因子，所有这些刺激物都提供了保证免疫应答发生的非抗原特异性确认。通过刺激不同的细胞因子级联系统，这些起始信号的性质也会触发APC调控体液和细胞应答。

B.耐受

调节免疫系统的另一种级联反应为通过消除自体反应性T细胞来限制对自身抗原的应答。对于B细胞和T细胞免疫性，上述过程是通过调控T辅助细胞群的所有组成成分来完成的，因为这一细胞群决定了致敏反应中的反应活性。T细胞产生于骨髓中，并循环到胸腺以接受“教导”，从而区分自身抗原和非自身抗原。可识别自身组织的T细胞在胸腺的个体发育过程中被耗尽，以确保循环系统中不再有带有能与自身抗原反应的T细胞受体复合体(TCR)的T细胞。这被称为中枢性耐受，当其它被破坏时可导致自身免疫疾病。

可诱导被称为外周耐受的另一种类型的耐受。当已通过胸腺的T细胞遇到非自身抗原、但不接受来自于APC的触发辅助细胞功能或溶细胞功能所需的二次信号或共刺激信号时，可完成外周耐受。当APC通过II型MHC受体表达抗原、但未收到由感染或病原体攻击引起的附属信号、从而APC未表达应答所需的细胞因子级联时，可能会发生这种情况。以这种方式被部分刺激的T细胞成为无反应性的或凋亡的。导致体液应答或溶细胞性应答所需的T辅助细胞群的耗尽。

当溶细胞性T细胞在大多数体细胞上的I型MHC复合物中遇到表达非自身抗原的细胞时，产生另一种形式的外周耐受。当这些T细胞的TCR在没有共刺激受体结合(例如，CD28/CD86相互作用)的情况下与I型MHC结合时，这些T细胞成为无活性的或凋亡的。由于存在提供所述第二信号所必需的并且能够提供所述第二信号的一组第二共刺激受体相互作用，因此细胞的表面表型能够较强地预测免疫刺激或无反应性。

许多肿瘤细胞已通过下调I型MHC表达而成为免疫系统T细胞模式不能识别的细胞，从而展现出从溶细胞性识别中逃逸的途径。许多病毒已进化出了干扰细胞表面MHC受体表达的特殊机制，以逃避免疫应答。免疫系统已经进化出另一种模式来清除肿瘤细胞、或具有降低MHC表达这一特性的被病毒感染的细胞。一群被称为天然杀伤细胞或NK细胞的细胞具有针对I型MHC阴性细胞的溶细胞活性。该活性是负调控的。NK细胞通过与被称为杀伤抑制受体(KIR)的受体相互作用而与靶细胞结合，接着进行杀伤，除非其与I型MHC相互作用而被关闭。

C.造血嵌合和耐受诱导

癌症治疗中，当化疗药剂和/或照射疗法导致宿主免疫系统的髓细胞被清除(myeloablation)时，就必须进行骨髓移植。然后患者可通过骨髓移植物中的造血干细胞重建免疫功能，进而从骨髓供体中获得免疫系统的细胞组分和分子组分。供体免疫系统的重建伴随着个体发育中曾出现的自身抗原及非自身抗原教导的重现，借此使供体免疫系统为宿主组织所耐受。供体免疫系统重建的另一个方面为：宿主现能够接受来自于原始供体的器官或组织移植物而不产生排斥。

当较不严格的髓细胞清除处理用于骨髓移植时，宿主的免疫系统可能未被完全耗尽，而且，通过适当的免疫抑制处理，可能会重建起同时包含供体和宿主免疫细胞的嵌合免疫系统。这种情形下，宿主可耐受供体和宿主两者的细胞组分和分子组分，并且能接受来自于骨髓供体的器官或组织移植物而不产生排斥。针对宿主对供体骨髓的排斥和由供体骨髓产生的移植物抗宿主应答的临床处理，是这种治疗方法能否成功的关键。而移植物抗宿主应答的临床风险，是使该方法成为移植标准方法中的一个非常重要但却尚未完全解决的问题。这些临床方案近来已受到重视(Waldmann，2004)。

通过使用能够重建免疫系统又不会带来移植物抗宿主应答风险的干细胞可获得显著的益处。移植物抗宿主反应是由于骨髓移植物中本来存在的T细胞污染物而产生的。尽管从骨髓中纯化造血干细胞是常规作法，然而，它们在患者体内的成功定植需要辅助T细胞的伴随。因此，必须在T细胞的有益定植量和移植物抗宿主应答的有害效果之间达到精确的平衡。

MAPC和ES细胞代表了一群不产生移植物抗宿主反应风险的可被送递的干细胞群，因为它们可在无造血干细胞(包括T细胞)的情况下扩增。这极大降低了临床风险。在细胞送递急性期中，暂时消除NK细胞活性将原始干细胞定植和造血系统重建的频率提高到临床有用的阈值，并避免了长期免疫抑制的风险。

当MAPC或ES定植并辅助造血时，新形成的T细胞经历与上述宿主T细胞一致的胸腺及外周的自身与非自身教导。新形成的供体来源及宿主来源的幼稚T细胞的相互接触导致反应活性细胞的相互消除，进而可实现对来自MAPC或ES供体的T细胞表达同种异体抗原的耐受。因此，患者可具有对MAPC或ES供体免疫系统的细胞组分和分子组分的耐受性，并且可接受细胞、组织或器官移植物而不产生排斥。

D.MAPC和其他干细胞类型

上述这种耐受性诱导的机制是能够重建造血功能的细胞类型所特有的。尽管已证实同样来自于骨髓的间充质干细胞具有低免疫原性，并可在同种异体移植情形下持续存在，然而，却没有实现对供体免疫组分的耐受。其他的谱系定向干细胞系也没有表现出造血功能重建的能力。这包括神经干细胞、脂肪源干细胞、肝脏干细胞等等。

用ES细胞诱导对随后接受移植物的耐受性的能力已被Fandrich(2002)证实。这种情形下，伴随鼠ES细胞类型送递的非清除处理使得动物能够接受心脏同种异体移植物而不产生排斥。因此，包括造血功能重建在内的ES细胞和MAPC所共有的谱系再生特性可实现移植耐受。MAPC是ES细胞临床上用于移植耐受的替代品。

因此，给予MAPC或ES细胞以及它们分化为各种血液细胞类型可使二次器官或组织移植接受者具有或备有与MAPC或ES细胞相匹配的组织相容性。例如，可用从例如干细胞库得到的细胞治疗糖尿病受试者。之后产生耐受性，然后可向该糖尿病受试者提供从与干细胞相同来源获得的或源于此的同种异体胰岛细胞，从而使成熟的胰岛细胞不被接受者排斥。这一方法适用于任何的二次移植物(例如器官、组织和/或细胞移植物)，包括但不限于心、肝、肺、肾和/或胰。

4.包封：在一些实施方案中，MHC-I阴性细胞(例如MAPC或ES细胞)被包封起来。包封作为细胞疗法的主要目的是保护同种异体的和异种的细胞移植物免受宿主免疫应答的破坏，从而消除或减少对免疫抑制性药物治疗的需要。细胞的微囊化技术为本领域技术人员已知(参见例如，Chang，P.et al.1999；Matthew，H.W.et al.1991；Yanagi，K.et al.1989；Cai Z.H.et al.1988；Chang，T.M.1992)。用于细胞微囊化的材料包括，例如聚合物胶囊、藻酸盐-聚-L-赖氨酸-藻酸盐微囊、聚-L-赖氨酸藻酸钡胶囊、藻酸钡胶囊、聚丙烯腈/聚乙烯氯(PAN/PVC)中空纤维和聚醚砜(PES)中空纤维。例如，美国专利5,639,275记载了用含有遗传工程细胞的生物相容性胶囊长期稳定地表达生物活性分子的改进的设备和方法。

此外，也可在植入前用膜包封MHC-I阴性细胞。包封提供了对宿主免疫系统的屏障，抑制了移植排斥和炎症。予以考虑的是，任何可获得的多种细胞包封方法均可采用。某些情况下，细胞被单独包封。其他情况下，许多细胞被包封在同一膜内。在植入后细胞被去除的实施方案中，单一膜内包封许多细胞的较大尺寸的结构为植入细胞的取出提供了方便。一些细胞包封的方法是本领域可获得的，例如记载于下述文献中的方法：欧洲专利公开文本301,777、或美国专利4,353,888、4,744,933、4,749,620、4,814,274、5,084,350、5,089,272、5,578,442、5,639,275和5,676,943，上述文献均通过引用的方式纳入本说明书。

C.抑制NK细胞功能的手段的给予

可将一种或多种抑制NK细胞功能的手段制成药物组合物，所述抑制NK细胞功能的手段例如抗NK细胞抗体或化合物(例如，药物、药品、小分子或其他化合物等)、微生物、蛋白、肽、生物制剂、化学制剂或核酸(包括载体，例如表达载体(例如，可对MHC-I阴性细胞例如MAPC或ES细胞进行遗传修饰，以得到能够抑制NK细胞功能的试剂；这可在移植的MHC-I阴性细胞的临近区域获得对NK功能的抑制，因此该试剂不会影响接受者的所有NK细胞)。本发明的一种药物组合物包括抑制NK细胞功能的手段和可药用载体。

抑制NK细胞功能的手段可通过任何适合的途径给予，例如口服、局部给予，或者静脉内或动脉内、皮下、肌内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、胃内、气管内或肺内注射。给予途径的选择取决于多个参数，例如抑制NK细胞功能的手段的性质和待治疗的疾病或损伤。

抑制NK细胞功能的手段的给予可单剂量进行，或者可以一段时间内一次或数次重复的剂量进行。适当的剂量根据各种参数而变化。这些参数包括接受治疗的个体(成人或儿童)、手段本身、给予的方式和频率，这些都可由本领域技术人员确定。

本发明的药物组合物可制备成多种形式，包括片剂、硬胶囊或软胶囊、水性溶液、悬液、和脂质体以及其他缓释制剂，例如成型聚合凝胶。口服液体药物组合物可以是例如水性或油性悬液、溶液、乳液、糖浆或酏剂的形式，或者，也可以使用前用水或其他适合的运载体溶解的干产品形式存在。上述液体药物组合物可包含常规添加剂，例如助悬剂、乳化剂、非水性运载体(可包括食用油)或防腐剂。

可配制口服剂型，从而使手段在经过胃部后被释放到肠中。这种制剂记载于美国专利6,306,434及其所包含的参考文献中。

口服液体药物组合物可以是例如水性或油性悬液、溶液、乳液、糖浆或酏剂的形式，或者，也可以使用前用水或其他适合的运载体溶解的干产品形式存在。上述液体药物组合物可包含常规添加剂，例如助悬剂、乳化剂、非水性运载体(可包括食用油)或防腐剂。

抑制NK细胞功能的手段可配制为肠胃外给予(例如，通过注射，例如快速浓注或连续输注)的形式，并且可以单位剂型形式存在于安培瓶、载药注射器、小剂量输注容器或含有加入的防腐剂的多剂量容器中。药物组合物可以是例如油性或水性运载体中的悬液、溶液或乳液形式，并且可包含配制助剂(formulatory agent)例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抑制NK细胞功能的手段也可以为粉剂形式，该粉剂由溶液经冻干获得，在使用前用适合的运载体(例如无菌盐水)溶解。

适于直肠给予的药物组合物可制备成单位剂量栓剂。适合的载体包括盐水溶液和其他本领域中常用的材料。

对于吸入式给药，抑制NK细胞功能的手段可方便地由吹入器、喷雾器或加压包装或其他便于送递气溶胶喷雾的工具来送递。加压包装可包括适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过采用送递计量量的阀来确定。

或者，对于吸入式或吹入式给药，抑制NK细胞功能的手段也可以是干粉组合物的形式，例如调节剂(modulator)和适合的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末状混合物。粉末组合物可以单位剂型形式存在于例如胶囊或药筒或者例如明胶包装或泡包装中，其中粉末可借助吸入器或吹入器从其中给药。对于鼻内给药，抑制NK细胞功能的手段可例如通过塑料瓶喷雾器由液体喷雾给予。

本发明的药物组合物也可含有其他成分，例如调味剂、着色剂、抗微生物剂、抗炎剂或防腐剂。应该理解的是，治疗所需的抑制NK细胞功能的手段的量不仅随着所选的具体载体而变化，而且还随着给予途径、所治疗的疾病或损伤的严重程度和患者的年龄和状况而变化。最终，护理医疗提供者可确定适当的剂量。

一般而言，给予抑制NK细胞功能的手段的量通常应足以基本上耗尽受试者的活性天然杀伤细胞、防止受试者的天然杀伤细胞被激活或以其他方式抑制受试者的天然杀伤细胞活性。该量会根据选定的动物和抑制NK细胞功能的手段的种类而变化。例如，尽管每种抗体的有效剂量必须单独滴定，但大多数抗体都可在0.1mg/kg-20mg/kg体重的剂量范围内使用。

抗体或其他抑制天然杀伤细胞的手段的给予，可在向受试者给予MHC-I阴性细胞之前进行、与MHC-I阴性细胞序贯给予受试者或者在向受试者给予上述细胞后进行。在一个实施方案中，抑制NK功能的手段的给予可在给予MHC-I阴性细胞之前的足够长的时间(例如，约1-4周)进行，从而在NK细胞亚群数量或其活性/功能方面获得有利的改变。通过这种方式，抑制NK的有益效果可在给予MHC-I阴性细胞之前获得，从而降低移植细胞被排斥的几率。

当照射以覆盖整个身体的方式进行时，被称为全身照射(TBI)。照射可穿透身体的所有区域。这使得治疗可到达甚至是疤痕组织内或较深的身体隐窝内的细胞。照射影响通常针对生长迅速的细胞和/或修复功能弱的细胞。为了利用这一点，全身照射通常分多次进行，在2至5天内每天2至3次。

体内最敏感的细胞为血细胞，包括淋巴细胞、嗜中性粒细胞、血小板和红细胞。作为骨髓移植的一部分的标准或高剂量TBI治疗，破坏了这些细胞或它们的前体干细胞，这些细胞随后必须采用治疗前从患者身上获得的或从另一个人(供体)身上获得的储存的骨髓或血干细胞输回。低剂量TBI有时用于治疗血细胞障碍，例如轻度淋巴瘤，并且不需要骨髓移植物或干细胞。本发明范围内予以考虑的还包括低剂量TBI(例如亚致死性TBI)或局部照射(照射局限于身体内的特定区域或组织)。

其他敏感组织包括肺、胃肠道、皮肤、肝、肾和眼部的晶状体。在一个实施方案中，本发明的方法用于治疗由照射引起的损害。然而，依据TBI剂量和所治疗的疾病，有时也使用部分遮蔽(partial blocking)以帮助防止产生任何肺部损害。上述遮蔽通过利用治疗计划时获得的特殊的X射线而实现。为了能够均匀地送递全身照射，获得患者的测量数据，并且可能还需要特殊的“组织补偿物”来弥补身体厚度的不同。

因此，治疗根据患者个体而确定。需要考虑所使用的设备和治疗室的物理设置以及具体的疾病过程和患者特征(体型、厚度和肺容量)。由于儿童正处于生长活跃期，因此他们的正常组织通常对照射更敏感，并且TBI治疗的毒性对他们可有所不同；甚至可能会随着儿童的年龄而变。

同样，可代替TBI或与其相结合使用的各种药物和非髓细胞清除性方案也在本发明的范围内。

在一个实施方案中，骨髓给予与TBI和MHC-I阴性细胞给予相结合，并且任选地与另一种抑制NK细胞功能的手段或者其他制止或抑制免疫功能的试剂的给予相结合。骨髓移植(BMT)通常是针对患有癌症或其他可影响骨髓的疾病的患者的疗法。骨髓移植包括：获取正常存在于骨髓中的细胞，例如造血干细胞；将这些细胞过滤；以及把它们回送给患者或另一人。BMT的目的在于，在某个人其自身不健康的骨髓被清除之后将健康的骨髓细胞输送回该人体内。外周血干细胞移植(PBSCT)是另一种替换被医学治疗和/或疾病破坏的造血细胞的方法(例如，循环血中的未成熟血细胞与骨髓中的未成熟血细胞类似，将它们给予治疗后的患者以帮助骨髓恢复及继续产生健康的血细胞)。这种移植包括微型移植(mini-transplant)(使用剂量较低的、剂量毒性较小的化学疗法和/或照射以使患者为移植作好准备)和连续移植(tandemtransplant)(采用高剂量化学疗法和细胞移植两个连续的过程)。

可通过BMT或PBSCT治疗的疾病和/或病症包括但不限于白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、实体瘤(包括成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤和/或脑瘤)、再生障碍性贫血(范康尼氏贫血(FA)是一种导致骨髓衰竭的遗传性贫血症(再生障碍性贫血))、免疫缺陷(包括重度联合免疫缺陷症或威-奥二氏综合征)、镰状细胞病、地中海贫血、布-戴二氏贫血、代谢/贮积病(包括胡尔勒氏综合征或脑白质肾上腺萎缩症)、以及乳房、卵巢和肾脏的癌症。

D.给予MHC-I阴性细胞后对受试者的监测

移植后，可监测所给予的MHC-I阴性细胞或分化子代的生长和/或分化情况、以及MHC-I阴性细胞或子代的治疗效果。例如，可通过分析血清葡萄糖水平来监测给予的MHC-I阴性细胞治疗胰脏疾病的功能性。给予MHC-I阴性细胞后糖尿病患者血清中血清葡萄糖水平的正常化，说明具有功能性。

MHC-I阴性细胞治疗心脏病的功能性可通过各种已知技术来监测，例如闪烁扫描术、心肌灌注图像、门控心血池显像、首次通过法心室造影术、右向左分流检测、正电子发射断层摄影术、单光子发射计算机断层摄影术、磁共振影像、谐波相磁共振影像、超声心动描记术、心电描记术、受试者血清中心脏功能特异性蛋白分析和心肌灌注储备影像。

给予后，受试者对MHC-I阴性细胞或其子代的免疫耐受性可通过本领域已知的用于评测受试者对MHC-I阴性细胞或其子代的免疫耐受性的各种方法检测。当受试者对MHC-I阴性细胞或其子代的耐受性不是最理想时(例如受试者的免疫系统排斥外源MAPC时)，可对受试者进行治疗性辅助免疫抑制治疗(therapeutic adjunct immunosuppressive treatment)，该治疗为本领域已知。

经遗传修饰的MHC-I阴性细胞

可对诸如MAPC或ES细胞等的MHC-I阴性细胞或其分化子代进行活体外遗传改造，消除一种最显著的基因治疗的障碍。例如，获得受试者的骨髓抽吸物，并从该抽吸物中分离出MAPC。然后对MAPC进行遗传改造以表达一种或多种所需的基因产物。然后可对MAPC进行活体外筛选或选择，鉴别出已被成功改造的细胞，然后将这些细胞引入受试者体内或者使其分化再引入受试者体内，引入可局部或全身进行。或者，也可在给予之前使诸如MAPC或ES细胞等的MHC-I阴性细胞分化，然后对分化细胞进行遗传改造。

任何情况下，移植细胞均能提供可表达所需基因产物的转染稳定的细胞源。经遗传修饰的MHC-I阴性细胞(例如MAPC或ES细胞)或其遗传修饰的分化子代可用于本发明的方法，例如可用于治疗遗传病症，包括但不限于粘稠物阻塞症(囊性纤维化)和纤毛不能移动综合征，或者可用于向所需组织(例如肺组织)提供基因产物。

A.遗传工程改造MHC-I阴性细胞的方法

可通过采用本领域技术人员已知的各种方法将DNA或RNA(例如外源核酸)引入细胞，从而对MHC-I阴性细胞(例如MAPC或ES细胞)进行遗传修饰。这些方法通常分为四种主要的类型：(1)病毒转移，例如包括使用DNA或RNA病毒载体，例如反转录病毒(包括慢病毒)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、辛德比斯病毒和牛乳头瘤病毒；(2)化学转移，包括磷酸钙转染和二乙氨乙基葡聚糖转染法；(3)膜融合转移，例如采用负载有DNA的膜小泡，例如脂质体、血红细胞影泡和原生质体；以及(4)物理转移技术，例如显微注射、电穿孔术、核转染(nucleofection)或直接的“裸”DNA转移。细胞可通过以下方式被遗传改造：插入预先选定的分离的DNA，用预先选定的分离的DNA替换细胞基因组的区段，或者使至少一部分细胞基因组缺失或失活。使至少一部分细胞基因组缺失或失活可通过各种方法实现，包括但不限于例如基因重组、反义技术(可包括采用肽核酸即PNA)或核酶技术。插入一个或多个预先选定的DNA序列可通过同源重组实现，或通过将病毒整合入宿主细胞基因组来实现。非同源重组的方法也是本领域已知的，例如记载于美国专利6,623,958、6,602,686、6,541,221、6524,824、6,524,818、6,410,266、6,361,972中，上述文献通过引用其与非同源重组方法相关的全部公开内容的方式特别纳入本说明书。

也可利用质粒表达载体和核定位序列将所需的基因序列掺入细胞中，特别是掺入其细胞核中。将多核苷酸导入细胞核的方法在本领域中已有记载。遗传物质可利用启动子引入，所述启动子能够使目的基因通过利用某种化学物质/药物实现正向或反向诱导、能使目的基因在给予给定的药物/化学物质后予以消除，或者遗传物质可被标记而能被化学物质诱导(包括但不限于他莫昔芬响应性突变雌激素受体)表达于特定的细胞区室(包括但不限于细胞膜)中。

可利用依赖于质粒DNA/钙离子沉淀的磷酸钙转染，将含有目标基因或多核苷酸的质粒DNA引入分离的或培养的MHC-I阴性细胞中。简言之，使质粒DNA混合溶入氯化钙溶液，然后加至已进行过磷酸盐缓冲的溶液中。一旦形成沉淀，即将溶液直接加至培养的细胞中。可通过DMSO或甘油处理提高转染效率，并可通过双-羟基乙基氨基乙磺酸盐(BES)提高稳定转染的水平。磷酸钙转染系统为商购可得(例如Promega Corp.Madison，WI的ProFection)。

当需要瞬时转染时，DEAE-葡聚糖转染可能优于磷酸钙转染，因为它通常效率更高，这种转染方法也是本领域技术人员已知的。

微注射对于向细胞内转移遗传物质特别有效。简言之，将细胞置于光学显微镜的载物台上。借助显微镜的放大作用，引导玻璃微量吸管向细胞核注射DNA或RNA。这种方法的益处在于它能够使所需的遗传物质直接送递至细胞核，避免了所注射的多核苷酸的胞质降解和溶酶体降解。这一技术已被有效地用于实现转基因动物的种系修饰。

也可利用电穿孔遗传修饰细胞。将目标DNA或RNA加至培养的细胞悬液中。把DNA/RNA-细胞悬液置于两个电极之间接受电脉冲，使细胞外膜产生瞬间的穿透，这种穿透表现为出现跨膜的孔。目标多核苷酸通过膜上的开孔进入细胞，当电场中断时，开孔在约1至30分钟后关闭。

为遗传修饰细胞所进行的DNA或RNA脂质体送递可采用阳离子脂质体进行，该阳离子脂质体与多核苷酸形成稳定的复合物。为使脂质体复合物稳定，可加入二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)或二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)。推荐用于脂质体转移的试剂为市售的Lipofectin(Life Technologies，Inc.)。Lipofectin，举例来说，是阳离子脂质N-[1-(2，3-二油酰基氧)丙基]-N-N-N-三甲基氯化铵与DOPE的混合物。线性DNA、质粒DNA或RNA的送递可采用脂质体体外或体内送递完成，脂质体送递可能是优选的方法，因为脂质体可携带较大的DNA片段，通常可保护多核苷酸以防降解，并且可靶向至特定的细胞或组织。基于脂质体技术的多种其他送递系统也是市售可得的，包括Effectene^TM(Qiagen)、DOTAP(Roche Molecular Biochemicals)、FuGene6^TM(Roche Molecular Biochemicals)和Transfectam(Promega)。阳离子脂质介导的基因转移效率的提高可通过在Abe，A.et al.1998的方法中引入纯化的病毒或细胞被膜组分，例如纯化的水泡性口膜炎病毒被膜的G糖蛋白(VSV-G)。

经证明可有效地利用脂多胺(lipopolyamine)包被的DNA将DNA送递至原代哺乳动物细胞系和已建立的哺乳动物细胞系的基因转移技术，可用于将目标DNA引入本发明的MHC-I阴性细胞中。该技术被全面记载于Loeffler，J.and Behr，J.1993中。

裸质粒DNA可直接注射至分化细胞(例如本发明的血管内皮细胞)所形成的组织块中。已证实该技术可有效地将质粒DNA转移至骨骼肌组织，其中单次肌内注射后可观测到在小鼠骨骼肌中的表达超过19个月。分裂较快的细胞摄入裸质粒DNA的效率更高。因此，可有利地在用质粒DNA处理之前刺激细胞分裂。

也可采用微粒基因转移以在体外或体内将基因转移至细胞中。微粒基因转移的基本步骤记载于J.Wolff的“Gene Therapeutics”(1994)(第195页)中。简言之，将编码目标基因的质粒DNA包被在微珠(通常为1-3微米的金颗粒或钨颗粒)上。将经包被的颗粒放在载物片上，载物片插到放电室上方。一旦放电，载物片即被加速移向阻滞筛。阻滞筛形成了一道可阻止载物片的进一步运动的屏障，同时使得多核苷酸包被的颗粒向目标表面(例如由分化MAPC构成的组织块)推进(通常是被氦气流推进)。微粒注射技术之前已有记载，方法为本领域技术人员已知(参见Johnson，S.A.et al.1993；Williams，R.S.et al.1991；Yang，N.S.et al.1990)。

可将信号肽连接于质粒DNA上，如Sebestyen，et al.(1998)所述，以将DNA引导至细胞核从而获得更有效的表达。

病毒载体可用于遗传改造MHC-I阴性细胞及其子代。如前述物理方法，病毒载体可用于将一个或多个例如目标基因、多核苷酸、反义分子、或核酶序列送递至细胞中。病毒载体和使用它们将DNA送递至细胞的方法为本领域技术人员已知。可用于遗传改造本发明细胞的病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、反转录病毒载体(包括慢病毒载体)、α病毒载体(例如辛德比斯载体)和疱疹病毒载体。

反转录病毒载体可有效转导快速分裂的细胞，然而，也已开发出多种可用于有效转移DNA至非分裂细胞的反转录病毒载体(Mochizuki，H.et al.1998)。反转录病毒载体的包装细胞系是本领域技术人员已知的。包装细胞系提供病毒载体的壳体产生和病毒体成熟所需的病毒蛋白。这通常包括gag、pol和env反转录病毒基因。适当的包装细胞系从可产生同向性、异向性或兼向性反转录病毒载体、针对反转录病毒载体系统具有一定程度特异性的已知细胞系中选择。

反转录病毒DNA载体通常与包装细胞系一起使用，以在细胞内产生所需的目标序列/载体组合。简言之，反转录病毒DNA载体是含有两个反转录病毒LTR的质粒DNA，这两个LTR位于多克隆位点和SV40启动子附近，从而第一LTR对SV40启动子而言位于5’方向，SV40启动子与克隆到多克隆位点的目标基因序列有效连接，紧接着是3’方向的第二LTR。一旦形成，即可通过前述磷酸钙介导的转染将反转录病毒DNA载体转移至包装细胞系中。病毒产生约48小时后，采集现已含有目标基因序列的病毒载体。

反转录病毒载体向特定细胞类型的靶向已被Martin，F.et al.(1990)证实，他们用针对与兼向性鼠白血病病毒被膜相融合的表面糖蛋白高分子量黑素瘤相关抗原的单链可变抗体片段来打靶载体，从而将目标基因送递至黑素瘤细胞。当需要靶向送递时，例如当所需的遗传改造对象为分化细胞时，与抗体片段融合的反转录病毒载体可用于实现向这些细胞的靶向送递，所述抗体片段针对由例如MAPC或ES细胞分化成的每种细胞系表达的特异性标记物。

慢病毒载体也可用于遗传改造MHC-I阴性细胞。许多此类载体已记载于文献中并为本领域技术人员已知(Salmons，B.and Gunzbur，W.H.1993)。这些载体已有效地用于遗传改造人造血干细胞(Sutton，R.et al.1998)。用于慢病毒载体的包装细胞系已有记载(见Kafri，T.et al.1999；Dull，T.et al.1998)。

重组疱疹病毒，例如I型疱疹单纯病毒(HSV-1)，已成功地用于使DNA送递靶向于表达红细胞生成素受体的细胞(Laquerre，S.et al.1998)。这些载体也可用于遗传改造MHC-I阴性细胞。

腺病毒载体具有较高的转导效率，可包含最高达8Kb的DNA插入物，并可感染复制细胞和分化细胞。多种腺病毒载体已记载于文献中并为本领域技术人员已知(参见例如Davidson，B.L.et al.1993；Wagner，E.et al.1992)。将目标DNA插入腺病毒载体的方法是基因治疗领域技术人员已知的，使用重组腺病毒载体将目标DNA引入特定细胞类型中的方法也为其所知(参见Wold，W.Adenovirus Methods and Protocols，Humana Methods in MolecularMedicine(1998)，Blackwell Science，Ltd.)。某些细胞类型的结合亲和力已通过修饰病毒载体纤维序列证实。能使基因转移中的蛋白表达可调的腺病毒载体系统已有记载(Molin，M.et al.1998)。一种使具有遗传修饰受体特异性的腺病毒载体繁殖、从而提供给特定细胞类型转导靶向的系统也已有记载(Douglas，J.et al.1999)。近来报道的羊腺病毒载体甚至表现出通过现有的体液免疫性干扰成功基因转移的潜能(Hofmann，C.et al.1999)。

通过分子缀合物载体提供定向基因转移和稳定基因表达的腺病毒载体也是可获得的，这种分子缀合物载体载体由含目标基因的质粒DNA与聚赖氨酸缩合而成，并且所述聚赖氨酸连接到无复制能力的腺病毒上(Schwarzenberger，P.et al.1997)。

α病毒载体，特别是辛德比斯病毒载体，也可用于转导本发明的细胞。这种载体可市售购得(Invitrogen，Carlsbad，CA)并记载于例如美国专利5,843,723以及Xiong，C.et al，1989；Bredenbeek，P.J.et al.1993；和Frolov，I.et al.1996中。

此外，MAPC还具有通过Robbins，et al.(1997)所述的eGFP-MND慢病毒载体和eGFP-MGF载体进行转导的良好的潜能。通过该方法，与含有增强型绿色荧光蛋白(eGFP)载体、于PA3-17包装细胞((来源于NIH 3T3成纤维细胞的兼向性包装细胞系，由Miller，A.D.and C.Buttimore(1986)报道))中制备得到、混有鱼精蛋白(8mg/ml)的上清液短暂接触4.6小时后，可转导30-50％的MAPC或任何MHC-I阴性细胞。eGFP在未分化MAPC的整个培养过程中持续表达。此外，利用lipofectamine来转染也已成功地用于在MAPC中引入转基因，并可用于向任何MHC-I阴性细胞中引入转基因。

目标细胞的成功转染或转导可通过本领域技术人员已知技术中的基因标记物来证实。已证实例如维多利亚水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白是一种可有效鉴别和追踪遗传修饰造血干细胞的标记物(Persons，D.et al.1998)。替代的可选择的标记物包括β-Gal基因、截短型的神经生长因子受体、药物可选择性标记物(包括但不限于NEO、MTX、潮霉素)。

也可采用上述任一种技术将转录调节序列引入MHC-I阴性细胞中，以激活所需的内源基因。这可通过同源重组(例如美国专利5,641,670)或非同源重组(例如美国专利6,602,686)完成。这些文献基于教导同源或非同源重组以及特别是内源基因激活的一般方法通过引用的方式纳入本文。

实施例

为证实及进一步示例说明本发明的某些实施方案和某些方面，提供以下实施例，这些实施例不应被理解为限制本发明的范围。

实施例1

材料和方法

小鼠品系

C57BL/6和重组酶活化基因-2缺陷型(Rag2^-/-)小鼠分别从JacksonLaboratory(Bar Harbor，ME)和Taconic Farms(Germantown，NY)获得。重组酶活化基因2和共同细胞因子受体突变的小鼠(Rag2^-/--IL-2Rγc^-/-)由Dr.Stephen Jameson(University of Minnesota)赠送。所有小鼠在无特异性病原体的条件下饲养，按照University of Minnesota Research AnimalResources原则随意喂食，并在6-12周龄时使用。

NK耗尽

为耗尽体内NK细胞，MAPC输注前3天向一些小鼠注射抗NK1.1单克隆抗体(杂交瘤PK136，大鼠IgG_2a；由Dr.Koo，Rahway，NJ提供)，然后每周注射两次，持续30天。

骨髓移植

在移植含有或不含有10⁶MAPC DL(H2^b)的20×10⁶C57BL/6(H2^b)骨髓细胞的前一天，用8.0 Gy X射线对B10.BR小鼠(H2^d)进行致死照射。

MAPC培养、标记和注射

从成年C57BL/6J-rosa26(H2^b，lacZ和NeoR基因转基因小鼠)骨髓中分离出MAPC，在包被有纤连蛋白(Sigma Chemical Corporation，St Louis，MO)的培养瓶中以低密度培养，然后如前人所述(Jiang et al.2002a)体外诱导分化为神经元、肝细胞和内皮细胞。用Sleeping Beauty转座子制得稳定表达DsRed2和萤火虫荧光素酶的MAPC源单一克隆(Ivics et al.1997)。

对于静脉内注射，通过尾静脉输注MAPC。动脉内注射如下进行：一般麻醉条件下，在上腹部中线处切一小口，露出膈底部。在可直接看到心尖之后，穿过膈和左心室壁缓慢注射10⁶MAPC(于10微升PBS中)。

流式细胞术

在缓冲液(PBS+2％牛血清+0.15％叠氮化钠)中制备MAPC的单细胞悬液。4℃下将沉淀得到的细胞(pelleted cell)与0.4μg抗Fc受体单克隆抗体(mAb；克隆2.4G2，大鼠IgG_2b)孵育15分钟以防止Fc结合。在用1,000单位IFNγ/mL(R&D System Inc.Minneapolis，MN)刺激24小时之前和之后，用直接缀合的(异硫氰酸荧光素FITC或藻红蛋白PE)mAb进行流式细胞术，以评测MAPC的细胞表面抗原表达情况。加入最佳浓度直接缀合的mAb至总体积为100至130μL，并在4℃下孵育1小时。由Pharmingen(San Diego，CA)获得的mAb包括：抗H2^b特异性mAb(克隆EH-144，小鼠IgG_2a)、抗IA^b特异性mAb(克隆AF6-120.1，小鼠IgG_2a)、抗CD80特异性mAb(克隆16-10A1，仓鼠IgG₂)、抗CD86特异性mAb(克隆GL1，大鼠IgG_2a)、抗ICAM-1特异性mAb(克隆3E2，仓鼠IgG₁)和抗CD40特异性mAb(克隆HM40-3，仓鼠IgM_k)。用Cell Quest软件在FACScalibur(Becton Dickinson，Palo Alto，CA)上分析所有样本。用前向角和90度侧向角散射鉴别活MAPC群并对其进行设门。检测最少10,000个事件。

混合淋巴细胞反应(MLR)培养

为测定MAPC刺激同种异体T细胞应答的潜能，用分离自BALB/c小鼠的腋淋巴结细胞、腹股沟淋巴结细胞和肠系膜淋巴结细胞的单细胞悬液制备纯化的CD4⁺T细胞或全部T细胞。通过用单克隆抗体包被和过山羊抗大鼠Ig包被的柱(Cedarlane Laboratories，Hornby，ON，Canada)，对于全细胞样本而言耗尽淋巴结细胞中的天然杀伤(NK)细胞，对于CD4⁺细胞样本而言为耗尽CD8⁺T细胞(杂交瘤2.43，大鼠IgG_2b；由Dr.Sachs，Charlestown，MA提供)。以10⁵个纯化T细胞和10³个经照射(3000cGy，用¹³⁷Cs照射)MAPC/孔将细胞接种于96孔圆底平板中，并于37℃和10％CO₂下在含如下物质的DMEM(BioWhittaker，Walkersville，MD)中培养5天：10％FCS(Hyclone，Logan，UT)、50mM 2-巯基乙醇(2-ME；Sigma)、10mM HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸)缓冲液、1mM丙酮酸钠(Life Technologies，Grand Island，NY)、氨基酸添加剂(1.5mM L-谷氨酰胺、L-精氨酸L-天冬酰胺)(Sigma)和抗生素(100U/mL青霉素；100mg/mL链霉素)(Sigma)。开始检测前用1,000 IU IFN-γ将一些MAPC预处理48小时。从C57BL/6小鼠中制备经照射的、T细胞耗尽的脾细胞，作为T细胞增殖的阳性对照。培养第5天时，用氚标胸苷(1μCi/孔)(Amersham Life Science，Buckinghamshire，United Kingdom)对各孔脉冲处理18小时，然后采集并在无闪烁液的情况下用β板计数器(PackardInstrument Company，Meriden，CT)计数。每组分析四个孔。

NK溶胞

为诱导效应细胞的NK活性，向C57BL/6小鼠腹膜内注射poly I∶C(120μg/小鼠)，48小时后采集脾细胞。如前人所述(Kim et al.2002)，实验前1小时，用⁵¹Cr标记目标细胞(MAPC或Yac-1细胞)并冲洗3次。96孔板中，被标记的MAPC或Yac-1细胞(约5,000/孔)与来自经poly I∶C注射的小鼠的脾细胞以不同比例(200∶1至0.8∶1)混合。将细胞在室温下培养4小时，离心(500rpm×5分钟)收集。为测定细胞的溶胞潜能，测定上清液中的γ放射性，表示为每分钟计数(cpm)。总共进行三次检测。按以下方式计算相对目标细胞溶胞作用：(样本cpm-自发释放)/(最大释放-自发释放)×100％。自发释放低于1.5％。

MAPC的体内成像

MAPC输注后30天，用Nembutol(0.1cc/10mg体重)麻醉实验小鼠，刮去其腹部和胸部的毛。向小鼠腹膜内注射150mg/kg荧光素储液(30mg/ml，Xenogen，Alameda，CA)。从小鼠的该部位取得灰度参照图像后，测定荧光素酶活性。荧光素注射后5分钟，通过采用冷却的电荷耦合设备(CCD)照相机(IVIS100，Xenogen)的体内影像系统测定生物发光信号，积分时间2分钟。将显示生物发光信号强度的伪彩色图像(蓝色为最小强度，红色为最大强度)重叠在灰度参照图像上。伪彩色强度图的标尺显示在图像上。

荧光素酶表达的体外定量

离心收集肺样本的组织匀浆物，将其与10μL荧光素储液(30mg/mL，Xenogen)混合，并立即在Chameleon 425-100多标记计数器(Hidex，Turku，Finland)上测定生物发光活性。平均相对发光值表示为计数/秒，并标准化为总蛋白(Dojindo Molecular Technologies，Gaithersburg，MD)。

组织的免疫组织化学以确定MAPC定位及分化

-80℃下，在最佳切割温度(OCT)培养基(Sakura Finetek，Torrence，CA)中冷藏接受动物的组织样本。将6微米厚的新鲜冷冻切片固定于载玻片上，室温下用丙酮固定10分钟，在同种型血清中孵育20分钟。冷冻切片用核染料4’，6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI(Molecular Probes，Eugene，OR)染色，用共聚焦荧光显微镜(Olympus AX70，Olympus optical Co.LTD，Japan)检测DsRed2的天然荧光。为测定肺泡I型肺细胞的组织学定位，还将肺切片用1∶250的兔抗水通道蛋白5一抗(Chemicon International，Temecula，CA)染色，并在室温下孵育1小时。载玻片在PBS中清洗两次，加入1∶1000稀释的驴抗兔IgG二抗(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，室温下孵育1小时。用共聚焦荧光显微镜检测载玻片。

结果

体外评估发现MAPC为T细胞和NK细胞免疫应答的靶标

A.流式细胞术分析

免疫分型分析表明，MAPC的I型和II型MHC、共刺激分子(CD80、CD86、CD40)和黏着分子ICAM-1(C54)较少/为阴性(表1)。用干扰素γ(IFN-γ)刺激24小时后，I型MHC和ICAM-1表达上调，而II型MHC、CD80、CD86和CD40的表达依然较少。由于I型MHC表达较少/为阴性，MAPC可能是NK介导的消除的良好靶标。

表1.MAPC的流式细胞术分析

IFN-γ	抗原	平均值	SD	P值
IFN-γ	抗原	平均值	SD	P值	无	H2^b	9.3	0.5
有		99.0	1.4	0.00	无	H2^b	9.3	0.5
有		99.0	1.4	0.00	无	Ia^b	4.5	2.1
有		4.0	1.1	0.78	无	Ia^b	4.5	2.1
有		4.0	1.1	0.78	无	CD80	10.7	2.0
有		7.9	1.0	0.17	无	CD80	10.7	2.0
有		7.9	1.0	0.17	无	CD86	0.1	0.1
有		0.1	0.0	0.40	无	CD86	0.1	0.1
有		0.1	0.0	0.40	无	ICAM-1	2.9	1.6
有		35.9	10.7	0.01	无	ICAM-1	2.9	1.6
有		35.9	10.7	0.01	无	CD40	2.0	1.2
有		1.8	1.0	0.86	无	CD40	2.0	1.2

数值表示为占门内全部细胞的百分比(％)。IU：国际单位；h：小时，SD：标准差。

B.MAPC在体外不刺激T细胞应答

为确定MAPC能否刺激T细胞，以BALB/c CD4⁺T细胞或BALB/c CD4⁺T细胞加CD8⁺T细胞(H2^d)作为响应细胞、C57BL/6 MAPC(H2^b)作为刺激细胞进行同种异体T细胞增殖实验。未处理的MAPC和为上调I型MHC表达而用IFN-γ预处理48小时的MAPC(数据未显示，表1)在体外均不刺激仅CD4⁺(图1A)或全部T细胞的同种异体应答(alloresponse)(图1B)。

C.MAPC在体外易受NK介导的溶胞作用的影响

在4小时铬释放试验中，将经poly I∶C(NK活性的诱导物)处理的C57BL/6小鼠的脾细胞与NK敏感靶标Yac-1(H2^a)、NK敏感靶标或MAPC混合。效应细胞与靶标的比值表明，MAPC易受NK溶胞作用的影响，但受影响程度低于Yac-1细胞(图2)。

对MAPC的体内免疫抗性的实时量化

为测定对MAPC的体内免疫应答，向具有不同程度免疫能力的小鼠输注MAPC。为进行标记，用Sleeping Beauty转座子构建体对MAPC进行核穿孔(nucleoporate)以驱动DsRed2和萤火虫荧光素酶的表达，从而获得双转基因的MAPC DL(DsRed2，荧光素酶)。为连续跟踪MAPC在动物活体内的归巢、迁移和持续存在，用荧光素酶介导的生物发光影像(BLI)进行全身影像(WBI)。向成体C57BL/6或T细胞和B细胞缺乏的Rag2^-/-小鼠中静脉内注射一百万个MAPC DL。其他C57BL/6或Rag2^/-小鼠组给予抗NK1.1单克隆抗体以耗尽NK细胞(MAPC输注前3天给药，随后一周两次)。MAPC DL输注后第4、14和第30天进行连续BLI分析，将上述数据与T细胞、B细胞和NK细胞缺乏的Rag2^-/-/IL-2Rγc^-/-小鼠比较。

C57BL6小鼠中，第4天在肺和注射部位(尾静脉)检测到MAPC DL，但在第14或第30天未检测到(图3A)。Rag2^-/-小鼠中，全部30天时间均检测到MAPCDL(图3C)。尽管B6小鼠的BLI量化显示NK耗尽并没有显著提高MAPC DL的数量，但Rag2^-/-第30天的数据表明NK耗尽显著提高了MAPC DL的数量(图3B和3D)。

Rag2^-/-/IL-2Rγc^-/-小鼠中，MAPC DL持续存在，且第4天至第30天在约50％小鼠中的数量有所提高。上述数据共同表明，内源NK细胞抵抗MAPC DL。B6小鼠中，NK细胞的耗尽不足以克服MAPC DL抗性。Rag2^-/-小鼠较B6小鼠具有更高的NK活性(Prlic et al，2001)，Rag2^-/-小鼠表现出低水平的MAPC DL定植，除非它们体内的NK细胞被耗尽(表2)。

因此，NK细胞抵抗MCH I低水平/阴性的MAPC。由于MAPC在仅耗尽NK但T细胞和B细胞仍有活性的小鼠中没有定植，而且在T细胞和B细胞功能耗尽但NK细胞完整的小鼠中表现低水平定植(图3，表2)，因此本说明书中给出的数据也表明，T细胞(或B细胞)在对MAPC定植的体内免疫抗性中也起到了一定的作用。

这种对MAPC的抗性可能是由于对MAPC DL表达的多种外源报道蛋白(DsRed2、荧光素酶、新霉素磷酸转移酶、β半乳糖苷酶)产生的免疫应答(这可被全身照射(TBI)处理除去(图5)，全身照射结果能导致MAPC的普遍归巢)。

表2.MAPC在具有不同程度免疫能力小鼠中的持续存在

	基因型	体内耗尽	免疫缺陷	平均值	范围
	基因型	体内耗尽	免疫缺陷	平均值	范围	1	C57BL/6	无	34	27-45
2	C57BL/6	NK1.1 mAb	NK	40	31-63	1	C57BL/6	无	34	27-45
2	C57BL/6	NK1.1 mAb	NK	40	31-63	3	Rag2^/	T，B	180	37-436
4	Rag2^/	NK1.1 mAb	T，B，NK	584	99-795	3	Rag2^/	T，B	180	37-436
4	Rag2^/	NK1.1 mAb	T，B，NK	584	99-795	5	Rag2^-/-/γC^-/	T，B，NK	762	146-3010
6	对照	N/A	无	43	28-58	5	Rag2^-/-/γC^-/	T，B，NK	762	146-3010

输注后第30天用BLI技术对MAPC DL接受者中的荧光素酶信号量化。六组由遗传或表观遗传缺陷导致具有不同免疫能力的小鼠的MAPC DL持续存在表示为每组的荧光素酶活性的平均值和范围(光子/秒/cm²)。对照：注射未标记MAPC的小鼠；mAb：单克隆抗体；N/A：未施用。

供体MAPC在肺、肝和脾中的定植

为实现对供体MAPC定植的检测，MAPC DL输注后第30天检测代表性C57BL/6(10只中取N＝2)、Rag2^-/-(10只中取N＝2)和Rag2^-/-/IL-2Rγc^-/-接受者(6只中取N＝2)的肺、肝和脾。组织的免疫组织化学显示，除C57BL/6野生型小鼠外全部小鼠的全部三种组织中均存在MAPC DL细胞(数据未显示)。在肺中，MAPC源细胞不仅以较高的数量定植，还分化为肺泡I型肺细胞(图4)。

全身照射克服了MAPC排斥

还确定了TBI处理后MAPC能否持续存在。对B10.BR小鼠进行致死性照射，并给予含有或不含有10⁶ MAPC DL的C57BL/6骨髓细胞。第4天至第28天，在小鼠接受者的胸、腹、头和四肢中检测到供体MAPC源细胞的生物发光信号(图5)。这表明，用全身照射来为造血干细胞移植作准备可克服NK细胞和T细胞介导的抗性，并对MAPC的长期存活和普遍归巢有益。

MAPC动脉内输注改善生物分布

由于输注MAPC DL的大部分生物发光在胸上部检测到，因此推测静脉内(IV)送递后MAPC被捕获在肺血管系统中可能会降低MAPC实际送递至其他内脏器官的细胞量。为比较静脉内和动脉内(IA)送递后MAPC的生物分布情况，通过尾静脉或通过左心室向Rag2^-/-/IL-2Rγc^-/-小鼠输注MAPC DL(10⁶)。IV或IA输注后10周的WBI显示，不仅MAPC的归巢更为多样化，而且IA送递后全身的生物发光信号比IV输注相同剂量MAPC DL后所观测到的生物发光信号高出约10倍(数据未显示，图6)。

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上述全部的出版物、专利和专利申请在此通过引用的方式纳入本说明书。尽管本发明在说明书的前述部分中已经针对某些优选实施方案加以描述，并且为了示例说明目的而述及许多细节，然而本领域技术人员应当显而易见的是，本发明也容许其他实施方案，并且本说明书中所述的某些细节在不偏离本发明基本原则的条件下也可显著改变。

Claims

1.提高MHC-I阴性细胞的持续存在的方法，包括向受试者给予一群MHC-I阴性细胞和有效量的用于抑制天然杀伤细胞功能的手段，从而使得MHC-I阴性细胞的持续存在相比于未给予该抑制手段的方法而言得以提高。

2.提高MHC-I阴性细胞的定植的方法，包括向受试者给予一群MHC-I阴性细胞和有效量的用于抑制天然杀伤细胞功能的手段，从而使得MHC-I阴性细胞的定植相比于未给予该抑制手段的方法而言得以提高。

3.提高受试者对MHC-I阴性细胞的免疫耐受性的方法，包括向受试者给予一群MHC-I阴性细胞和有效量的用于抑制天然杀伤细胞功能的手段，从而使得对MHC-I阴性细胞的免疫耐受性相比于未给予该抑制手段的方法而言得以提高。

4.抑制对MHC-I阴性细胞的排斥的方法，包括将一群MHC-I阴性细胞和有效量的用于抑制天然杀伤细胞功能的手段给予有此需要的受试者，从而使得对MHC-I阴性细胞的排斥相比于未给予该抑制手段的方法而言得到抑制。

5.治疗受试者疾病或损伤的方法，包括向受试者给予有效量的一群MHC-I阴性细胞和有效量的用于抑制天然杀伤细胞功能的手段。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述MHC-I阴性细胞为非ES、非EG、非生殖细胞，其中所述非ES、非EG、非生殖细胞可分化为外胚层、内胚层和中胚层细胞类型。

7.权利要求6的方法，其中所述非ES、非EG、非生殖细胞对受试者而言是自体的、同种异体的或异种的。

8.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述MHC-I阴性细胞为胚胎干细胞。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述MHC-I阴性细胞通过以下途径或通过在外科手术中直接施用于组织表面或伤口上给予：局部注射、导管给予、全身注射、腹膜内注射、肠胃外给予、口服给予、颅内给予、动脉内注射、静脉内注射、心室内输注、胎盘内注射、子宫内注射、外科心肌内注射、经心内膜注射、冠状动脉内注射、经脉管注射、肌内注射。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述用于抑制天然杀伤细胞功能的手段为抗天然杀伤细胞抗体或其活性片段。

11.权利要求10的方法，其中所述抗体为多克隆抗体。

12.权利要求10的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。

13.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述用于抑制天然杀伤细胞功能的手段为药物。

14.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述用于抑制天然杀伤细胞功能的手段为蛋白。

15.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述用于抑制天然杀伤细胞功能的手段为全身照射。

16.权利要求15的方法，其中所述全身照射以非致死剂量给予。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述用于抑制天然杀伤细胞功能的手段在给予MHC-I阴性细胞之前、之间、之后给予或以上述组合方式给予。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述用于抑制天然杀伤细胞功能的手段在定植部位局部给予、全身给予或以上述组合方式给予。

19.权利要求1-18中任一项的方法，进一步包括给予骨髓。

20.权利要求1-18中任一项的方法，进一步包括二次移植。

21.权利要求20的方法，其中所述二次移植为心、肺、肾、肝、骨髓移植或上述的组合。

22.权利要求1-4和6-21中任一项的方法，其中所述受试者患有疾病或损伤。

23.权利要求5或22的方法，其中所述疾病为心脏病、癌症、自身免疫疾病、遗传病或血液病。

24.权利要求5或22的方法，其中所述损伤为由全身照射、化学放射性疗法或物理外伤引起的损伤。

25.一种组合物，包括用于抑制NK细胞功能的手段、一群MHC-I阴性细胞和可药用载体。

26.用于抑制天然杀伤细胞功能的手段在制备用于提高MHC-I阴性细胞的持续存在、提高其定植、提高其免疫耐受性和/或降低其排斥的药物中的用途。

27.MHC-I阴性细胞和用于抑制天然杀伤细胞功能的手段在制备用于提高MHC-I阴性细胞的持续存在、提高其定植、提高其免疫耐受性、抑制其排斥和/或治疗疾病和/或损伤的药物中的用途。

28.权利要求26或27的用途，其中所述药物包括生理学上可接受的载体。