JP2022513372A

JP2022513372A - シアリルルイスａを標的とするキメラ抗原受容体およびその使用

Info

Publication number: JP2022513372A
Application number: JP2021547039A
Authority: JP
Inventors: マイケルサデレイン，; ジェイ．デイビッドハンセン，
Original assignee: メモリアルスローンケタリングキャンサーセンター; バイオエヌテックリサーチアンドデベロップメント，インコーポレイテッド
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2019-10-18
Publication date: 2022-02-07
Also published as: WO2020081988A1; US20210246221A1; CN113454115A; EP3867279A4; EP3867279A1

Abstract

本開示の主題は、がん（例えば、膵臓がん（pancratic cancer））を処置するための方法および組成物を提供する。本開示の主題は、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）を特異的に標的とする抗原認識性受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））およびこのようなＣＡＲを含む免疫応答性細胞に関する。本開示のシアリルルイスＡ特異的ＣＡＲは、抗腫瘍活性を含む免疫活性化特性が増強されている。本開示の主題は、がん（例えば、膵臓がん）を処置するための方法および組成物を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月１９日に出願された米国仮出願第６２／７４８，１９８号の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が組み込まれ、かつ、優先権が主張される。

導入
本開示の主題は、がん（例えば、膵臓がん）を処置するための方法および組成物を提供する。本開示の主題は、シアリルルイスＡを特異的に標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。本開示の主題は、このようなＣＡＲを含む免疫応答性細胞、ならびにがん（例えば、膵臓がん）を処置するためにこのようなＣＡＲおよびこのような細胞を使用する方法をさらに提供する。

細胞ベースの免疫療法は、がんの処置のための治癒の可能性を有する療法である。Ｔ細胞および他の免疫細胞は、選択された抗原に対して特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれる、抗原の人工または合成受容体をコードする遺伝物質の導入によって、腫瘍抗原を標的とするように改変され得る。ＣＡＲを使用する標的化Ｔ細胞療法は、血液悪性腫瘍の処置において最近の臨床成功を示した（Dunbar et al., Science (2018);359）。固形腫瘍を標的とするＣＡＲ療法に対する応答は、今日まで、比較的に乏しいものであった（Sadelain et al., Nature (2017);545:423-431）。すべてのがん、特に、固形腫瘍における克服する課題のうちの１つは、抗原不均一性である。すべてまたはほとんどのＢ細胞悪性腫瘍がＣＤ１９を発現するのに対し（Brentjens et al., Nat Med (2003); 9:279-286）、多数の潜在的ＣＡＲ標的は、患者内のすべての腫瘍細胞のうちのほんの一部のみで発現され、抗原逃避のリスクをもたらす。低レベル抗原発現はまた、ＣＡＲ療法に対する耐性をもたらす可能性がある（Fry et al., Nat Med (2018); 24:20-28）。２つまたはそれより多い抗原を標的とすることが、定義された逃避集団またはクローンの事象において実行され得る（Wilkie et al., J Clin Immunol (2012); 32:1059-1070、Kloss et al., Nat Biotechnol (2013); 31:71-75、Ruella et al., J Clin Invest (2016); 126:3814-3826、Hegde et al., J Clin Invest (2016); 126:3036-3052、Zah et al., Cencer Immunol Res 2016; 4:498-508）が、より大きな、または定義されていない標的不均一性を克服するために他のアプローチが必要とされる。したがって、固形腫瘍細胞において高度に発現される抗原を標的とするＣＡＲを設計する新規治療戦略および最小の毒性で強力な抗がん効果を誘導可能な戦略が必要である。

Dunbar et al., Science (2018);359 Sadelain et al., Nature (2017);545:423-431 Brentjens et al., Nat Med (2003); 9:279-286 Fry et al., Nat Med (2018); 24:20-28 Wilkie et al., J Clin Immunol (2012); 32:1059-1070 Kloss et al., Nat Biotechnol (2013); 31:71-75 Ruella et al., J Clin Invest (2016); 126:3814-3826 Hegde et al., J Clin Invest (2016); 126:3036-3052 Zah et al., Cencer Immunol Res 2016; 4:498-508

本開示の主題は、概して、シアリルルイスＡを標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡへの結合について、参照抗体またはその抗原結合性部分と交差競合する。一部のこのような実施形態では、シアリルルイスＡに結合する参照抗体またはその抗原結合性部分は、１、２または３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３）含む重鎖可変領域ならびに１、２または３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含み、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、その内容が参照によりその全体が組み込まれる米国特許第９，４７５，８７４号において開示される抗体のうちいずれか１つの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３から選択される。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡへの結合について、参照抗体またはその抗原結合性部分と交差競合し、参照抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインは、参照抗体またはその抗原結合性部分と同一または重複する、シアリルルイスＡ上のエピトープに結合し、参照抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡに特異的に結合し、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３またはその保存的改変および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３またはその保存的改変を含む。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２またはその保存的改変および配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２またはその保存的改変を含む。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１またはその保存的改変および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１またはその保存的改変を含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡに特異的に結合し、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡに特異的に結合し、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡに特異的に結合し、配列番号７と少なくとも約８０％相同（例えば、少なくとも約８０％同一）であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡに特異的に結合し、配列番号８と少なくとも約８０％相同（例えば、少なくとも約８０％同一）であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡに特異的に結合し、
ａ）配列番号７と少なくとも約８０％相同（例えば、少なくとも約８０％同一）であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
ｂ）配列番号８と少なくとも約８０％相同（例えば、少なくとも約８０％同一）であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号７と少なくとも約８０％相同（例えば、少なくとも約８０％同一）であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８と少なくとも約８０％相同（例えば、少なくとも約８０％同一）であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトｓｃＦｖを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、必要に応じて架橋されるＦａｂを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、Ｆ（ａｂ）_２を含む。ある特定の実施形態では、ｓｃＦＶ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）_２のうち１つまたは複数が、異種配列との融合タンパク質中に含まれて、細胞外抗原結合性ドメインを形成する。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、細胞外抗原結合性ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間にリンカーを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、細胞外抗原結合性ドメインの５’末端に共有結合によって繋がれるシグナルペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、ＣＤ４ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＣＴＬＡ－４ポリペプチド、ＰＤ－１ポリペプチド、ＬＡＧ－３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、ＢＴＬＡポリペプチド、合成ペプチド（免疫応答と関連するタンパク質をベースとしない）またはそれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、細胞内ドメインは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＤＡＰ－１０ポリペプチドまたはそれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、野生型ＣＤ３ζポリペプチドまたは改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。一部の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、（ａ）少なくとも１つもしくは複数の（例えば、１、２もしくは３つの）免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のすべてもしくは一部を欠き、ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ１、ＩＴＡＭ２、および／もしくはＩＴＡＭ３であり得るか、またはそれを含み、ならびに／または（ｂ）少なくとも１つもしくは複数の（例えば、１、２もしくは３つの）塩基性豊富ストレッチ（basic-rich stretch）（ＢＲＳ）領域のすべてもしくは一部を欠き、ＢＲＳ領域は、ＢＲＳ１、ＢＲＳ２およびＢＲＳ３であり得るか、またはそれを含む。ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメイン中に含まれる改変されたＣＤ３ζポリペプチは、以下の特徴のうち少なくとも１つまたは複数を含む：
ａ）ＩＴＡＭ２もしくはその部分を欠き、必要に応じて、ｉ）ＩＴＡＭ３もしくはその部分および／またはｉｉ）ＩＴＡＭ１もしくはその部分をさらに欠き、
ｂ）ＩＴＡＭ１もしくはその部分を欠き、必要に応じて、ＩＴＡＭ３もしくはその部分をさらに欠き、
ｃ）ＩＴＡＭ３もしくはその部分を欠き、
ｄ）ＩＴＡＭ２もしくはその部分の欠失を含み、必要に応じて、ｉ）ＩＴＡＭ３もしくはその部分の欠失および／またはｉｉ）ＩＴＡＭ１もしくはその部分の欠失をさらに含み、
ｅ）ＩＴＡＭ１もしくはその部分の欠失を含み、必要に応じて、ＩＴＡＭ３もしくはその部分の欠失をさらに含み、ならびに／または
ｆ）ＩＴＡＭ３もしくはその部分の欠失を含む。

ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメイン中に含まれる改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、以下の特徴のうち少なくとも１つまたは複数を含む：
ａ）ＢＲＳ２もしくはその部分を欠き、必要に応じて、ｉ）ＢＲＳ３もしくはその部分および／またはｉｉ）ＢＲＳ１もしくはその部分をさらに欠き、
ｂ）ＢＲＳ１もしくはその部分を欠き、必要に応じて、ＢＲＳ３もしくはその部分をさらに欠き、
ｃ）ＢＲＳ３もしくはその部分を欠き、ならびに／または
ｄ）ＢＲＳ１もしくはその部分、ＢＲＳ２もしくはその部分およびＢＲＳ３もしくはその部分を欠き、
ｅ）ＢＲＳ２もしくはその部分の欠失を含み、必要に応じて、ｉ）ＢＲＳ３もしくはその部分の欠失および／またはｉｉ）ＢＲＳ１もしくはその部分の欠失をさらに含み、
ｆ）ＢＲＳ１もしくはその部分の欠失を含み、必要に応じて、ＢＲＳ３もしくはその部分の欠失をさらに含み、
ｇ）ＢＲＳ３もしくはその部分の欠失を含み、ならびに／または
ｈ）ＢＲＳ１もしくはその部分、ＢＲＳ２もしくはその部分およびＢＲＳ３もしくはその部分の欠失を含む。

ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメイン中に含まれる改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＩＴＡＭ２、ＩＴＡＭ３、ＢＲＳ２およびＢＲＳ３を欠くか、または、ＩＴＡＭ２、ＩＴＡＭ３、ＢＲＳ２およびＢＲＳ３の欠失を含む。

ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、ＣＤ４ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＣＤ１６６ポリペプチド、ＣＤ１６６ポリペプチド、ＣＤ８ａポリペプチド、ＣＤ８ｂポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＩＣＡＭ－１ポリペプチド、ＣＴＬＡ－４ポリペプチド、ＣＤ２７ポリペプチド、ＣＤ４０／Ｍｙ８８ペプチド、ＮＫＧＤ２ペプチドまたはそれらの組合せからなる群から選択される分子の天然または改変された膜貫通ドメインであるか、またはそれを含む。

ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲは、ヒンジ／スペーサー領域を、例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインおよび膜貫通ドメインの間にさらに含む。一部の実施形態では、このようなヒンジ／スペーサー領域は、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、ＣＤ４ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＣＤ１６６ポリペプチド、ＣＤ１６６ポリペプチド、ＣＤ８ａポリペプチド、ＣＤ８ｂポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＩＣＡＭ－１ポリペプチド、ＣＴＬＡ－４ポリペプチド、ＣＤ２７ポリペプチド、ＣＤ４０／Ｍｙ８８ペプチド、ＮＫＧＤ２ペプチドまたはそれらの組合せからなる群から選択される分子の天然または改変されたヒンジ／スペーサー領域であるか、またはそれを含む。

ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲは、膜貫通ドメインおよびヒンジ／スペーサー領域を含み、その両方とも同一分子に由来する。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲは、
ａ）ＣＤ２８ポリペプチドのヒンジ／スペーサー領域およびＣＤ２８ポリペプチドの膜貫通ドメイン、
ｂ）ＣＤ８４ポリペプチドのヒンジ／スペーサー領域およびＣＤ８４ポリペプチドの膜貫通ドメイン、
ｃ）ＣＤ１６６ポリペプチドのヒンジ／スペーサー領域およびＣＤ１６６ポリペプチドの膜貫通ドメイン、
ｄ）ＣＤ８ａポリペプチドのヒンジ／スペーサー領域およびＣＤ８ａポリペプチドの膜貫通ドメイン、または
ｅ）ＣＤ８ｂポリペプチドのヒンジ／スペーサー領域およびＣＤ８ｂポリペプチドの膜貫通ドメイン
を含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１６６ポリペプチドのヒンジ／スペーサー領域およびＣＤ１６６ポリペプチドの膜貫通ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲは、膜貫通ドメインおよびヒンジ／スペーサー領域を含み、各々は、異なる分子に由来する。例えば、ある特定の実施形態では、このようなＣＡＲは、ＣＤ２８ポリペプチドのヒンジ／スペーサー領域およびＩＣＯＳポリペプチドの膜貫通ドメインを含み得る。

ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲは、組換え発現されるか、またはベクターから発現される。ある特定の実施形態では、このようなベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、γ－レトロウイルスベクター）である。

本開示の主題は、本明細書において開示されるＣＡＲを含む免疫応答性細胞をさらに提供する。ある特定の実施形態では、このような免疫応答性細胞は、本明細書において記載されるＣＡＲを含むベクターを用いて形質導入される。ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲは、免疫応答性細胞の表面で構成的に発現される。本開示に従って有用である免疫応答性細胞の例として、それだけには限らないが、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ヒト胚性幹細胞、リンパ球様前駆細胞、Ｔ細胞前駆体細胞（T cell-precursor cell）および多能性幹細胞（例えば、リンパ球様細胞が分化し得る）が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲを含む免疫応答性細胞は、Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、このようなＴ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞およびセントラルメモリーT細胞からなる群から選択される。

本開示の主題はまた、本明細書において開示されるＣＡＲをコードする核酸分子を提供する。

本開示の主題は、各々本明細書において開示される核酸分子を含むベクターをさらに提供する。ある特定の実施形態では、このようなベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、γ－レトロウイルスベクター）である。

本開示の主題はまた、本明細書において開示されるようなＣＡＲをコードする核酸配列を含む核酸分子を発現する宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態では、このような宿主細胞は、Ｔ細胞である。

さらに、本開示の主題は、シアリルルイスＡに結合する免疫応答性細胞を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、このような方法は、免疫応答性細胞中に、本明細書において開示されるＣＡＲをコードする核酸配列を導入することを含む。

さらに、本開示の主題は、シアリルルイスＡに結合する免疫応答性細胞（例えば、本明細書において開示されるもの）を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態では、このような組成物は、シアリルルイスＡに結合する免疫応答性細胞（例えば、本明細書において開示されるもの）および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。

さらに、本開示の主題は、対象において悪性成長を処置および／または防止する方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、対象に有効量の本明細書において開示される免疫応答性細胞または本明細書において開示される組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態では、悪性成長は、膵臓がんである。ある特定の実施形態では、方法は、対象において腫瘍負荷を低減または根絶する。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。

本開示の主題はまた、悪性成長を処置および／または防止するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、本明細書において開示される免疫応答性細胞を含む。ある特定の実施形態では、キットは、新生物を有する対象を処置するために免疫応答性細胞を使用するための指示書（written instruction）をさらに含む。ある特定の実施形態では、悪性成長は、膵臓がんである。

例として与えられるが、本発明を記載される具体的な実施形態に限定することを意図したものではない以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて理解することができる。

図１Ａ～１Ｆは、放射線療法（ＲＴ）が標的抗原発現に影響を及ぼすことなく膵臓がんをＣＡＲＴ細胞による殺滅に対して感受性にすることを示す図である。図１Ａは、様々な線量の放射線への曝露の４８時間後の腫瘍細胞生存率を示すグラフである。図１Ｂは、低線量ＲＴ（２Ｇｙ）に曝露させ、４８時間後にＣＡＲＴ細胞とともに示された比で１８時間インキュベートし、その後殺滅パーセントを決定したＣａｐａｎ２膵臓がん細胞を示すグラフである。図１Ｃは、標的抗原発現レベルがＲＴの４８時間後に不変であったことを示す図である。図１Ｄは、ＲＴの６時間後の標的細胞のトランスクリプトーム解析が有意に影響を受けたいくつかのアポトーシス経路を明らかにすることを示す図である。図１Ｅは、標的抗原（シアリルルイスＡ（Ｌｅ^Ａ）発現ｃａｐａｎ２細胞）への曝露後のＣＡＲＴ細胞の培地におけるＴＲＡＩＬｍＲＮＡ発現およびタンパク質レベルを示すグラフである。図１Ｆは、標的抗原を発現するかまたは発現しない標的細胞において成長させたＬＢＢｚおよびＬ（ｄｅｌ）ＣＡＲＴ細胞の培地において定量したＴＲＡＩＬタンパク質を示すグラフである。ＬＦＣ＝ｌｏｇ２倍率変化、Ｅ：Ｔ＝エフェクター：標的。同上。図２Ａ～２Ｃは、活性化ＣＡＲＴ細胞によって発現したＴＲＡＩＬが低線量放射線に曝露された異種腫瘍集団（heterogeneous tumor population）における抗原陰性腫瘍細胞に対して機能的に有意であることを示す図である。図２Ａは、ＣＡＲ活性化Ｔ細胞が放射線増感抗原陽性および抗原陰性腫瘍細胞に作用するＴＲＡＩＬを産生することを示す図である。図２Ｂ～２Ｃは、Ａｇ^＋細胞をルシフェラーゼ発現Ａｇ^－細胞と７５：２５の比で混合し、低線量ＲＴに曝露させ、示されたＣＡＲＴ細胞と４日間共培養し、続いてＡｇ^－細胞殺滅の定量を行ったことを示すグラフである。図３Ａ～３Ｂは、増感ＲＴ（sensitizing RT）が膵臓がん細胞をＴＲＡＩＬ誘導死に関して転写プライミングすることを示す図である。図３Ａは、生存および遊走、腫瘍支持炎症、ネクロプトーシス、アポトーシス、ならびにデスレセプターエンドサイトーシスを含む様々なＴＲＡＩＬ応答を媒介することが公知のシグナル伝達分子のＲＮＡ発現レベルを、Ｃａｐａｎ２膵臓がん細胞へのＲＴ曝露の前後のＲＮＡｓｅｑによって３回の生物学的反復で定量したことを示す図である。有意に誘導された分子および下方調節した分子をそれぞれ赤色および緑色で示し、程度を色勾配によって表す。灰色の分子は有意には変化しなかった。図３Ｂは、ＣＴＶ標識Ａｇ^－細胞を、非標識Ａｇ^＋細胞、アネキシンＶ５９５、およびＴＲＡＩＬ^－／－またはＴＲＡＩＬ^ｗｔＣＡＲＴ細胞との共培養の２日前にＲＴに曝露させたことを示す図である。培養を生ビデオ顕微鏡検査によってモニタリングし、Ａｇ^－細胞アポトーシスを経時的に定量した。同上。図４Ａ～４Ｍは、増感ＲＴによりＣＡＲＴ細胞がｉｎｖｉｖｏにおいて異種ＰＤＡＣを排除することが可能となることを示す図である。図４Ａは、７５：２５のＬｅＡ（＋）：（－）で混合され、次いでＮＳＧマウスの膵臓に注射されたＣａｐａｎ２腫瘍細胞を示す図である。腫瘍を９日間定着させた後、マウスにＲＴとそれに続くＣＡＲＴ細胞とを投与した。図４Ｂは、異なる処置群間の死亡時の腫瘍体積変化のウォーターフォールプロットを示す。図４Ｃ～４Ｈは、ＢＬＩを毎週実施したことを例証するグラフである。図４Ｉ～４Ｋは、ＣＡＲまたはＲＴ＋ＣＡＲ処置マウスからの腫瘍のＴ細胞浸潤を、初めの１９日間にわたるＢＬＩＴ細胞イメージング（形質導入されたＴ細胞におけるＧ－Ｌｕｃを検出する）を使用して（図４Ｉ）、および２１日目に屠殺したマウスからのＩＨＣによって（図４Ｊ～４Ｋ、すべてｎｓ）決定したことを示す図である。図４Ｌは、進行したマウスにおける腫瘍が経時的に減少した標的抗原発現を表すことをＦＡＣＳによって示す図である。図４Ｍは、ＲＴ＋Ｌ（ｄｅｌ）またはＲＴ＋Ｌ（ｄｅｌ）－ＴＲＡＩＬＣＡＲＴ細胞を用いて処置したマウスのＢＬＩを示すグラフである。同上。同上。同上。同上。図５Ａ～５Ｇは、緩和的ＲＴおよびＣＡＲＴ細胞を用いて処置した、異種腫瘍を有するＤＬＢＣＬ患者の転帰を示す図である。図５Ａは、総身または局所ＲＴを、画像誘導放射線を使用して膵臓の異種腫瘍を保有するマウスに送達し、続いてＣＡＲＴ細胞を送達したことを示す図である。図５Ｂ～５Ｄは、腫瘍負荷をＢＬＩによってモニタリングしたことを示すグラフである。図５Ｅ～５Ｆは、ＣＤ１９に関してＩＨＣ（図５Ｅ）およびフローサイトメトリー（図５Ｆ）によって検査した、ＣＡＲＴ細胞処置前の患者生検を例証する図である。図５Ｇは、緩和的下肢ＲＴおよび全身１９２８ｚＣＡＲＴ細胞の前、ならびに１、２および６か月後のＦＤＧ－ＰＥＴスキャンを示す図である。同上。同上。図６Ａ～６Ｃは、ＬｅＡを標的とするＣＡＲがＬｅＡを発現する細胞を特異的に溶解することを示す図である。図６Ａは、イメージングのための膜結合Ｇ－Ｌｕｃを含有するＬＢＢｚＣＡＲＴ細胞設計を示す図である。図６Ｂは、ＰＣ３、Ｃａｐａｎ２およびＢｘＰＣ３細胞における内因性ＬｅＡ発現をフローサイトメトリーによって検査したことを示す図である。図６Ｃは、ＬＢＢｚもしくはＬ２８ｚＣＡＲＴ細胞または形質導入されていないＴ細胞と様々なエフェクター：標的比で１８時間混合し、続いて標的細胞殺滅の定量を行ったＰＣ３、Ｃａｐａｎ２またはＢｘＰＣ３細胞を例証するグラフである。同上。同上。同上。図７は、Ｃａｐａｎ２細胞をＬｅＡ^＋およびＬｅＡ^－集団にＦＡＣＳ選別し、次いで７５：２５のＬｅＡ＋／－腫瘍細胞の比で混合したことを示す図である。ＬｅＡ^－に選別されたＣａｐａｎ２細胞は経時的にＬｅＡ^－のままである。図８は、ＴＲＡＩＬ^ｗｔまたはＣＲＩＳＰＲノックアウトＣＡＲＴ細胞を標的において刺激し、次いでＴＲＡＩＬｍＲＮＡを定量してｗｔ非刺激ＣＡＲＴ細胞と比較して表したグラフである。図９は、生存および遊走、腫瘍支持炎症、ネクロプトーシス、アポトーシス、ならびにデスレセプターエンドサイトーシスを含む様々なＴＲＡＩＬプロセスを媒介することが公知の分子の低線量ＲＴ後のｍＲＮＡの倍率変化を示す表である。０．０５未満の調整ｐ値を有する分子が示される。図１０は、ＣＡＲ形質導入およびＴＣＲノックアウト後かつｉｎｖｉｖｏ注射前の典型的なＴ細胞プロファイルを示す図である。図１１は、ＣＴＺＴ細胞生物発光イメージングによって経時的に定量したＣＡＲＴ細胞腫瘍浸潤により、ＴＲＡＩＬノックアウトＬＢＢｚＣＡＲＴ細胞とＬ（ｄｅｌ）ＣＡＲＴ細胞の両方が膵臓腫瘍に経時的に蓄積することが示されることを示すグラフである。図１２Ａ～１２Ｂは、ＣＡＲＴ細胞がｉｎｖｉｖｏにおいて存続し、腫瘍に侵入し、異種Ａｇ＋／－膵臓がんを保有するマウスにおけるＡｇ^＋腫瘍細胞を減少させることを示す図である。図１２Ａは、６週前にＣＡＲＴ細胞を用いて処置したマウス由来の血液、脾臓および腫瘍から単離した細胞をＣＡＲＴ細胞含量に関して分析したことを示す図である（純粋なＴ細胞集団対照は下に示す）。図１２Ｂは、ＣＡＲＴ細胞処置後の異なる時点における膵臓腫瘍からのＬｅＡ発現のＩＨＣを示す図であり、療法全体にわたって標的抗原発現腫瘍細胞の減少を示す。同上。同上。図１３は、総身または局所ＲＴを用いて処置したマウスの腫瘍におけるＴ細胞蓄積を示すグラフである。膵臓腫瘍におけるＬＢＢｚＣＡＲＴ細胞を、局所ＲＴ、総身ＲＴ（ＴＢＩ）またはＲＴ無しと、それに続くＣＡＲＴ細胞とを用いて処置したマウスにおいて、生物発光イメージングを使用して経時的に定量した。

本開示の主題は、シアリルルイスＡを標的とする抗原結合性タンパク質、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

本開示の主題はまた、ルイスＡ標的化ＣＡＲおよび／またはそれをコードする核酸（複数可）を含む免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、セントラルメモリーT細胞など）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ヒト胚性幹細胞、リンパ球様前駆細胞、Ｔ細胞前駆体細胞およびリンパ球様細胞がそれから分化し得る多能性幹細胞）ならびに腫瘍、例えば、膵臓がんを処置および／または防止するためにこのような免疫応答性細胞を使用する方法も提供する。

Ｉ．ある特定の定義
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される用語の多くの一般的な定義を有する技術のうち１つを提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)、The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)、The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)、およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、別に記載されない限り、以下のそれらに帰する意味を有する。

本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定されるような特定の値の許容される誤差範囲内を意味し、これは、幾分かは、値が測定または決定される方法、すなわち、測定システムの制限に依存する。例えば、「約」は、当技術分野における慣例によって、３もしくは３を超える標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは、最大１０％、より好ましくは、最大５％、より好ましくは、さらに最大１％の範囲を意味する場合もある。あるいは、特に、生物システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは、５倍以内、より好ましくは、２倍以内を意味し得る。

本明細書で使用される場合、「細胞集団」という用語は、同様または異なる表現型を発現する少なくとも２個の細胞の集団を指す。限定されない例では、細胞集団は、同様または異なる表現型を発現する少なくとも約１０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、少なくとも約８００個、少なくとも約９００個、少なくとも約１０００個の細胞を含み得る。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、無傷抗体分子だけでなく、免疫原結合能を保持する抗体分子の断片も意味する。このような断片も当技術分野で周知であり、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏの両方で常用される。したがって、本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性断片Ｆ（ａｂ’）_２およびＦａｂも意味する。無傷抗体のＦｃ断片を欠く、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦａｂ断片は、循環からより迅速に除去され、無傷抗体より非特異的組織結合が少ない可能性がある（Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)）。本発明の抗体は、天然抗体全体、二重特異性抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、一本鎖Ｖ領域断片（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチドおよび非従来型の抗体を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、ジスルフィド結合によって内部接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｈと略される）および重鎖定常（Ｃ_Ｈ）領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｌと略される）および軽鎖定常Ｃ_Ｌ領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、Ｃ_Ｌから構成される。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲ：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４から構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の構成成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への結合を媒介し得る。

本明細書で同義的に使用される場合、抗体の「抗原結合性部分」、「抗原結合性断片」または「抗原結合性領域」という用語は、抗原に結合し、抗体に抗原特異性を付与する抗体の領域または部分を指し、抗原結合性タンパク質、例えば、抗体の断片は、抗原（例えば、ペプチド／ＨＬＡ複合体）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を含む。抗体の抗原結合性機能は、全長抗体の断片によって実施され得るということが示されている。抗体の「抗体断片」という用語内に包含される抗原結合性部分の例として、Ｆａｂ断片、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_ＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、Ｆ（ａｂ）_２断片、ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、Ｖ_ＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一アームのＶ_ＬおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖ断片、Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。

さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらを、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が対となって一価分子を形成する単一タンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって組換え法を使用して結合し得る。これらは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である、例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426、およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照されたい。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して得られ、断片は、無傷抗体と同一の方法で有用性についてスクリーニングされる。

本明細書で使用される場合、「一本鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」という用語は、Ｖ_Ｈ：：Ｖ_Ｌヘテロ二量体を形成するように共有結合によって連結された免疫グロブリン（例えば、マウスまたはヒト）の重鎖（Ｖ_Ｈ）および軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変領域の融合タンパク質である。重鎖（Ｖ_Ｈ）および軽鎖（Ｖ_Ｌ）を、直接的に結合するか、またはＶ_ＨのＮ末端とＶ_ＬのＣ末端を、もしくはＶ_ＨのＣ末端とＶ_ＬのＮ末端を接続するペプチドをコードするリンカー（例えば、約１０、１５、２０、２５個のアミノ酸）によって結合する。リンカーは、普通、可動性のためにグリシンに富み、溶解性のためにセリンもしくはトレオニンに富む。リンカーは、細胞外抗原結合性ドメインの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を連結できる。ある特定の実施形態では、リンカーは、以下に提供されるような配列番号１１に示される配列を有するアミノ酸を含む。
GGGGSGGGGSGGGGS［配列番号１１］

ある特定の実施形態では、配列番号１１のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、以下に提供される配列番号１２に示される：
GGCGGCGGCGGATCTGGAGGTGGTGGCTCAGGTGGCGGAGGCTCC［配列番号１２］

定常領域の除去およびリンカーの導入にかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。一本鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Huston, et al.(Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)によって記載されるような、Ｖ_Ｈをコードする配列およびＶ_Ｌをコードする配列を含む核酸から発現され得る。米国特許第５，０９１，５１３号、同５，１３２，４０５号および同４，９５６，７７８号ならびに米国特許出願公開第２００５０１９６７５４号および同２００５０１９６７５４号も参照されたい。阻害活性を有するアンタゴニストｓｃＦｖも記載されている（例えば、Zhao et al., Hyrbidoma (Larchmt) 2008 27(6):455-51、Peter et al., J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 August 12、Shieh et al., J Imunol2009 183(4):2277-85、Giomarelli et al., Thromb Haemost 2007 97(6):955-63、Fife eta., J Clin Invst 2006 116(8):2252-61、Brocks et al., Immunotechnology 1997 3(3):173-84、Moosmayer et al., Ther Immunol 1995 2(10:31-40も参照されたい）。刺激活性を有するアゴニストｓｃＦｖが記載されている（例えば、Peter et al., J Bioi Chern 2003 25278(38):36740-7、Xie et al., Nat Biotech 1997 15(8):768-71、Ledbetter et al., Crit Rev Immunol1997 17(5-6):427-55、Ho et al., BioChim Biophys Acta 2003 1638(3):257-66を参照されたい）。

本明細書で使用される場合、「Ｆ（ａｂ）」とは、抗原に結合するが、一価であり、Ｆｃ部分を有さない抗体構造の断片を指し、例えば、酵素パパインによって消化された抗体は、２つのＦ（ａｂ）断片およびＦｃ断片（例えば、重（Ｈ）鎖定常領域；抗原に結合しないＦｃ領域）をもたらす。

本明細書で使用される場合、「Ｆ（ａｂ’）_２」とは、全ＩｇＧ抗体のペプシン消化によって生成した抗体断片を指し、この断片は、２つの抗原結合性（ａｂ’）（二価）領域を有し、各（ａｂ’）領域は、２つの別個のアミノ酸鎖、抗原に結合するためのＳ－Ｓ結合によって連結されたＨ鎖および軽（Ｌ）鎖の一部を含み、残りのＨ鎖部分は一緒に連結される。「Ｆ（ａｂ’）_２」断片は、２つの個々のＦａｂ’断片に分けることができる。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、任意の遺伝エレメント、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどを指し、適切な制御エレメントと関連付けられると複製可能であり、遺伝子配列を細胞中に移入することができる。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクルならびにウイルスベクターおよびプラスミドベクターを含む。

本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列および特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適当な核酸配列を含有する組換え核酸配列、例えば、組換えＤＮＡ分子を指す。原核生物における発現に必要な核酸配列は、普通、プロモーター、オペレーター（必要に応じた）およびリボソーム結合部位を、多くは、他の配列とともに含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサーおよび終結およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。

本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域アミノ酸配列と定義される。例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照されたい。一般に、抗体は、可変領域中に３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲまたはＣＤＲ領域を含む。ＣＤＲは、抗体の、抗原またはエピトープへの結合のための接触残基の大部分を提供する。ある特定の実施形態では、ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステムを使用して描写される（Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。

本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、結合力の尺度を意味する。理論に捉われようとは思わないが、親和性は、抗体結合部位と抗原決定基の間の立体化学的適合の近さに、それらの間の接触の区域の大きさに、および荷電基および疎水基の分布に依存する。親和性はまた、「アビディティー」という用語を含み、これは、可逆的複合体の形成後の抗原抗体結合の力を指す。抗体の抗原に対する親和性を算出する方法は、当技術分野で公知であり、親和性を算出する結合実験の使用を含む。機能アッセイ（例えば、フローサイトメトリーアッセイ）における抗体活性もまた、抗体親和性を反映する。抗体および親和性は、表現型で特徴付けられる場合があり、機能アッセイ（例えば、フローサイトメトリーアッセイ）を使用して比較される。

本開示の主題において有用な核酸分子として、ポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子が挙げられる。ある特定の実施形態では、本開示の主題において有用な核酸分子として、抗体またはその抗原結合性部分をコードする核酸分子が挙げられる。このような核酸分子は、内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、通常、実質的同一性を示す。内因性配列に対する「実質的相同性」または「実質的同一性」を有するポリヌクレオチドは、通常、二本鎖核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズ可能である。「ハイブリダイズする」とは、ストリンジェンシーの種々の条件下で相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書において記載される遺伝子）またはその部分の間の二本鎖分子を形成する対を意味する（例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399、Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照されたい）。

「実質的に相同の」または「実質的に同一の」という用語は、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書において記載されるアミノ酸配列のいずれか１つ）または核酸配列（例えば、本明細書において記載される核酸配列のいずれか１つ）と少なくとも５０％の相同性または同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。例えば、このような配列は、比較のために使用される配列に対して、アミノ酸レベルまたは核酸で少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはさらに約９９％相同（例えば、同一）である。

配列相同性または配列同一性は、通常、配列分析ソフトウェア（例えば、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ、１７１０ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＡｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ. ５３７０５の配列分析ソフトウェアパッケージ、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰまたはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。このようなソフトウェアは、種々の置換、欠失および／または他の改変の程度を割り当てることによって同一または同様の配列に一致させる。同一性の程度を決定する例示的アプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムが使用されてもよく、ｅ^－３から^{ｅ－１００}の間の確率スコアは密接に関連する配列を示す。

ある特定の実施形態では、「交差競合する」または「競合する」という用語は、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインの、所与の抗原への結合が、例えば、本開示のｓｃＦｖのいずれか１つのＶ_ＨおよびＶ_ＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列またはＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を含む参照抗体またはその抗原結合性部分の、同一抗原への結合を減少させるか、または低減する状況を指す。「交差競合する」または「競合する」という用語はまた、参照抗体またはその抗原結合性部分の、所与の抗原への結合が、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインの同一抗原への結合を減少させるか、または低減する状況を指す。ある特定の実施形態では、「交差競合性」または「競合性」細胞外抗原結合性ドメインは、参照抗体またはその抗原結合性部分と同一または実質的に同一のエピトープ、重複エピトープまたは隣接エピトープに結合する。

本明細書で使用される場合、「アナログ」という用語は、参照ポリペプチドまたは核酸分子の機能を有する構造的に関連するポリペプチドまたは核酸分子を指す。

本明細書で使用される場合、「リガンド」という用語は、受容体に結合する分子を指す。特に、リガンドは、別の細胞上の受容体に結合し、細胞対細胞の認識および／または相互作用を可能にする。

本明細書で使用される場合、「疾患」という用語は、細胞、組織または臓器の正常機能に損傷を与えるか、またはそれに干渉する任意の状態または障害を指す。疾患の例として、新生物または細胞の病原体感染が挙げられる。

「有効量」（または「治療有効量」）とは、処置の際に有益な、または所望の臨床結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、対象に１回または複数回用量で投与され得る。処置の観点から、有効量は、疾患（例えば、新生物）の進行を緩和する、改善する、安定化する、逆転させる、または減速させる、そうでなければ、疾患（例えば、新生物）の病理学的帰結を低減するのに十分な量である。有効量は、一般に、ケースバイケースで医師によって決定され、当技術分野のスキルの範囲内である。有効量を達成する適当な投与量を決定する場合には、いくつかの因子が、通常、考慮される。これらの因子として、対象の年齢、性別および体重、処置されている状態、状態の重症度ならびに投与される免疫応答性細胞の形態および有効濃度が挙げられる。

本明細書において、「新生物」という用語は、細胞または組織の病的増殖および他の組織または臓器へのそれのその後の遊走またはその浸潤で特徴付けられる疾患を指す。新生物成長は、通常、制御されず、進行性であり、正常細胞の増殖を誘発しないか、またはその停止を引き起こす条件下で生じる。新生物は、それだけには限らないが、膀胱、結腸、骨、脳、乳房、軟骨、神経膠、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、胸膜、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮および膣からなる群から選択される臓器またはその組織もしくは細胞型を含む様々な細胞型、組織または臓器に影響を及ぼし得る。新生物は、がん、例えば、肉腫、癌または形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）を含む。

本明細書で使用される場合、「異種核酸分子またはポリペプチド」という用語は、細胞または細胞から得られた試料中に普通は存在しない核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）またはポリペプチドを指す。この核酸は、別の生物から得たものである場合もあり、例えば、細胞もしくは試料において普通は発現されないｍＲＮＡ分子である場合もある。

本明細書で使用される場合、「免疫応答性細胞」という用語は、免疫応答おいて機能する細胞またはその前駆体もしくは後代を指す。

本明細書で使用される場合「モジュレートする」という用語は、正にまたは負に変更することを指す。例示的モジュレーションは、約１％、約２％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％または約１００％の変化を含む。

本明細書で使用される場合、「増加する」という用語は、少なくとも約５％正に変更することを指し、それだけには限らないが、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％または約１００％正に変更することを含む。

本明細書で使用される場合、「低減する」という用語は、少なくとも約５％負に変更することを指し、それだけには限らないが、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％または約１００％負に変更することを含む。

本明細書で使用される場合、「単離された細胞」という用語は、細胞に天然に付随する分子構成成分および／または細胞構成成分から分離されている細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態で見出されるようなそれに普通付随する構成成分を程度の差こそあれ含まない材料を指す。「単離する」は、元の供給源または周囲のものからの分離の程度を示す。「精製する」は、単離よりも高い分離の程度を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、どのような不純物もタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を及ぼさないし、他の悪影響も引き起こさないように、他の材料を十分に含まない。すなわち、本開示の主題の核酸またはポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって生成された場合に細胞性材料、ウイルス性材料もしくは培養培地を、または化学合成された場合に化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない場合に精製されている。純度および均一性は、通常、分析的化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じさせることを示し得る。改変、例えば、リン酸化またはグリコシル化に付され得るタンパク質については、異なる改変によって、異なる単離タンパク質を生じさせてもよく、それを別個に精製できる。

本明細書で使用される場合、「分泌された」という用語は、小胞体、ゴルジ装置を通り、細胞原形質膜で一過性に融合し、細胞の外側にタンパク質を放出する小胞として分泌経路によって細胞から放出されるポリペプチドを意味する。

本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」または「に特異的に結合する」または「特異的に標的とする」という用語は、試料中の、例えば、ヒトシアリルルイスＡを含むか、または発現する生物学的試料中の、目的の生体分子（例えば、ポリペプチド）を認識し、結合するが、他の分子を実質的に認識せず、結合しないポリペプチドまたはその断片を意味する。例えば、一部の実施形態では、他の潜在的標的が存在する場合にある特定の標的（例えば、シアリルルイスＡ）と相互作用する本明細書において記載されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインが、相互作用する標的（例えば、シアリルルイスＡ）に「特異的に結合する」といわれる。一部の実施形態では、特異的結合は、標的結合性部分とそのパートナーの間の会合の程度を検出または決定することによって評価され、一部の実施形態では、特異的結合は、標的結合性部分－パートナー複合体の解離の程度を検出または決定することによって評価され、一部の実施形態では、特異的結合は、標的結合性部分の、そのパートナーと別の実体の間の代替相互作用と競合する能力を検出または決定することによって評価される。一部の実施形態では、特異的結合は、このような検出または決定を、濃度の範囲にわたって実施することによって評価される。

本明細書で使用される場合、「処置すること」または「処置」という用語は、処置されている個体または細胞の疾患の過程を変更しようとする臨床的介入を指し、防止のため、または臨床病理の過程の間のいずれかで実施され得る。処置の治療効果として、限定するものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の直接的または間接的病理学的帰結の減少、転移の防止、疾患進行速度の低下、疾患状態の寛解または緩和および予後の緩解または改善が挙げられる。疾患または障害の進行を防ぐことによって、処置は、罹患した対象もしくは診断された対象または障害を有すると疑われる対象における障害による悪化を防ぐことができるだけでなく、処置は、障害のリスクにある対象または障害を有すると疑われる対象において障害または障害の症状の開始を防ぐ場合もある。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、それだけには限らないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含む（例えば、特定の処置のレシピエントである、または細胞が収集された）任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。

ＩＩ．シアリルルイスＡ
シアリルルイスＡ（Ｌｅ^Ａ、シアリルＬｅ^ＡおよびＳＬｅ^Ａ、ＣＡＳ番号９２４４８－２２－１としても知られる）とは、ＮｅｕＡｃ（ａ２－３）Ｇａｌ（ｂ１－３）［Ｆｕｃ（ａ１－４）］ＧｌｃＮＡｃの糖配列を含む四糖である。ある特定の実施形態では、Ｌｅ^Ａは、次式を含む。

Ｌｅ^Ａは、ある特定の細胞の表面に存在し、細胞対細胞認識プロセスに関与する。Ｌｅ^Ａは、腫瘍、例えば、膵腫瘍の７５～９０％で発現されるが、正常ヒト組織でのその発現は相対的に低い表面抗原である。

ＩＩＩ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本開示は、がん抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。多数の実施形態では、本開示は、膵臓がん抗原、例えば、シアリルルイスＡを標的とするＣＡＲを提供する。

ＣＡＲは、目的の特異性を免疫エフェクター細胞に移植または付与する操作された受容体である。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植するために使用でき、レトロウイルスベクターによって促進されるそのコード配列の移入を伴う。

３世代のＣＡＲがある。「第１世代」のＣＡＲは、通常、Ｔ細胞受容体鎖の細胞質／細胞内ドメインに融合された、膜貫通ドメインに融合された細胞外抗原結合性ドメイン（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））から構成される。「第１世代」のＣＡＲは、通常、内因性ＴＣＲからのシグナルの主伝達物質であるＣＤ３ξ鎖に由来する細胞内ドメインを有する。「第１世代」のＣＡＲは、ｄｅｎｏｖｏ抗原認識を提供し、ＨＬＡ媒介性抗原提示とは独立に、単一融合分子中のそのＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメインを介してＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞両方の活性化を引き起こすことができる。「第２世代」のＣＡＲは、種々の共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０）に由来する細胞内ドメインを、ＣＡＲの細胞質尾部に付加して、Ｔ細胞にさらなるシグナルを提供する。「第２世代」のＣＡＲは、共刺激（例えば、ＣＤ２８または４－１ＢＢ）および活性化（ＣＤ３ζ）の両方を提供するものを含む。前臨床研究によって、「第２世代」のＣＡＲはＴ細胞の抗腫瘍活性を改善できることが示された。例えば、「第２世代」のＣＡＲによって改変されたＴ細胞の頑強な有効性が、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する患者におけるＣＤ１９分子を標的とする臨床試験において実証された。「第３世代」のＣＡＲは、複数の共刺激（例えば、ＣＤ２８および４－１ＢＢ）および活性化（ＣＤ３ζ）を提供するものを含む。本開示を読む当業者であれば、本明細書において提供されるＣＡＲ構築物は、第１世代、第２世代または第３世代の構築物（複数可）であり得るということは認識する。

ある特定の限定されない実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトシアリルルイスＡに対して高い結合特異性ならびに高い結合親和性を有する。例えば、このような実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメイン（例えば、ヒトｓｃＦｖまたはそのアナログにおいて具体化される）は、ヒトシアリルルイスＡに約２×１０^－７Ｍまたはそれ未満の解離定数（Ｋ_ｄ）で結合する。ある特定の実施形態では、Ｋ_ｄは、約２×１０^－７Ｍもしくはそれ未満、約１×１０^－７Ｍもしくはそれ未満、約５×１０^－８Ｍもしくはそれ未満、約２×１０^－８Ｍもしくはそれ未満、約１×１０^－８Ｍもしくはそれ未満、約９×１０^－９もしくはそれ未満、約８×１０^－９もしくはそれ未満、約７×１０^－９もしくはそれ未満、約６×１０^－９もしくはそれ未満、約５×１０^－９もしくはそれ未満、約４×１０^－９もしくはそれ未満、約３×１０^－９もしくはそれ未満、約２×１０^－９もしくはそれ未満または約１×１０^－９Ｍもしくはそれ未満である。ある特定の限定されない実施形態では、Ｋ_ｄは、約２×１０^－８Ｍまたはそれ未満である。ある特定の限定されない実施形態では、Ｋ_ｄは、約１×１０^－８Ｍ～約２×１０^－８Ｍである。ある特定の限定されない実施形態では、Ｋ_ｄは、約１．３×１０^－８Ｍまたはそれ未満である。ある特定の限定されない実施形態では、Ｋ_ｄは、約１．８×１０^－８Ｍまたはそれ未満である。ある特定の限定されない実施形態では、Ｋ_ｄは、約１×１０^－９Ｍ～約１×１０^－８Ｍである。

本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメイン（例えば、ヒトｓｃＦｖまたはそのアナログにおける実施形態）の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害）またはウエスタンブロットアッセイによって確認できる。これらのアッセイの各々は、一般に、目的の複合体に対して特異的な標識された試薬（例えば、抗体またはｓｃＦｖ）を使用することによって特に目的のタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。例えば、ｓｃＦｖを放射性標識し、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において使用できる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照されたい）。放射性同位元素は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用のような手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出され得る。ある特定の実施形態では、シアリルルイスＡ標的化ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、蛍光マーカーで標識される。蛍光マーカーの限定されない例として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、ＡｚｕｒｉｔｅおよびｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、ＣｅｒｕｌｅａｎおよびＣｙＰｅｔ）および黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＶｅｎｕｓおよびＹＰｅｔ）が挙げられる。ある特定の実施形態では、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲのヒトｓｃＦｖは、ＧＦＰで標識される。

本開示の主題によれば、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、必要に応じて架橋されるＦａｂである。ある特定の実施形態では、細胞外結合ドメインは、Ｆ（ａｂ）_２である。ある特定の実施形態では、前記の分子のいずれも、異種配列との融合タンパク質中に含まれて、細胞外抗原結合性ドメインを形成してもよい。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトシアリルルイスＡに特異的に結合するヒトｓｃＦｖを含む。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖファージライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。

ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメイン
ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、その内容が本明細書において記載される目的のためにその全体が参照により組み込まれる米国特許第９，４７５，８７４号（「’８７４特許」）に開示されるような、抗シアリルルイスＡ抗体またはその抗体結合性断片の１、２または３つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３）を含む重可変領域を含む。さらに、またはあるいは、ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、その内容が本明細書において記載される目的のためにその全体が参照により組み込まれる’８７４特許に開示されるような、抗シアリルルイスＡ抗体またはその抗体結合性断片の１、２または３つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３）を含む軽可変領域を含む。例えば、’８７４特許の表２は、このような抗シアリルルイスＡ抗体またはその抗体結合性断片の重鎖および軽鎖中のＣＤＲのアミノ酸および核酸配列を示す。本開示を読む当業者ならば、このような配列のいずれも、本開示に従って使用され得るということは理解する。

ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、（ｉ）その内容が本明細書において記載される目的のためにその全体が参照により組み込まれる’８７４特許に開示されるような抗シアリルルイスＡ抗体もしくはその抗体結合性断片の重鎖可変領域および／または（ｉｉ）’８７４特許に開示されるような抗シアリルルイスＡ抗体もしくはその抗体結合性断片の軽鎖可変領域を含む。例えば、’８７４特許の図１～１０は、このような抗シアリルルイスＡ抗体またはその抗体結合性断片のＶ_ＨおよびＶ_Ｌのアミノ酸配列を示す。本開示を読む当業者ならば、このような配列のいずれも、本開示に従って使用され得るということは理解する。当業者ならば、得られた配列が、対応する親配列と少なくとも７０％またはそれよりも多く（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも多く）同一であり、シアリルルイスＡに特異的に結合する能力を保持する限り、適当な置換（例えば、保存的置換）、欠失、挿入および／または改変もこのような配列に行われてもよいということも理解する。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメイン（例えば、ヒトｓｃＦｖ）は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。配列番号７のアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列は、配列番号９に示されている。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメイン（例えば、ヒトｓｃＦｖ）は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。配列番号８のアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列は、配列番号１０に示されている。配列番号１～１０の配列は、以下の表１に記載されている。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトｓｃＦｖであり、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）に特異的に結合し、ｓｃＦｖ５Ｂ１と名付けられる。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、必要に応じて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の間に（ｉｉｉ）リンカー配列、例えば、リンカーペプチドを有する。ある特定の実施形態では、リンカーは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域もしくは表１から選択されるＣＤＲを有する、ヒトｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質または全長ヒトＩｇＧである。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、表１に示されるような、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％）相同である（例えば、同一である）アミノ酸配列を含むＶ_Ｈを含む。例えば、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号７に示されるアミノ酸配列に約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同である（例えば、同一である）アミノ酸配列を含むＶ_Ｈを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、表１に示されるような、配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％）相同である（例えば、同一である）アミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。例えば、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号８に示されるアミノ酸配列に約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相同である（例えば、同一である）アミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％）相同である（例えば、同一である）アミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％）相同である（例えば、同一である）アミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。

ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡを特異的に標的とする少なくとも１つまたは複数（例えば、１、２または３つ）の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）ＣＤＲを含む。例えば、一部の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、以下のうち少なくとも１つまたは複数（例えば、１、２または３つ）を含む：表１に示されるような、（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ１またはその保存的改変、（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ２またはその保存的改変および（ｉｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ３またはその保存的改変。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、表１に示されるような、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ１またはその保存的改変、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ２またはその保存的改変および配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ３またはその保存的改変を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ３を含む。

ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡを特異的に標的とする少なくとも１つまたは複数（例えば、１、２または３つ）の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）ＣＤＲを含む。例えば、一部の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、以下のうち少なくとも１つまたは複数（例えば、１、２または３つ）を含む：表１に示されるような、（ｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ１またはその保存的改変、（ｉｉ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ２またはその保存的改変および（ｉｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ３またはその保存的改変。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、表１に示されるような、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ１またはその保存的改変、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ２またはその保存的改変および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ３またはその保存的改変を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ２および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ３を含む。

ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ１またはその保存的改変および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ１またはその保存的改変を含む。ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ２またはその保存的改変および配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ２またはその保存的改変を含む。ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ３またはその保存的改変および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ３またはその保存的改変を含む。

ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ１またはその保存的改変、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ２またはその保存的改変、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ３またはその保存的改変、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ１またはその保存的改変、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ２またはその保存的改変および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ３またはその保存的改変を含む。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ２および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ３を含む。

ある特定の実施形態では、ＣＤＲは、以下に提示される（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けに従って）。

本明細書で使用される場合、「保存的改変」または「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含む本開示のＣＡＲ（例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメイン）の結合特徴（例えば、特異性および／または親和性）に有意に影響を及ぼさす、変更もしないアミノ酸改変を指す。保存的改変は、アミノ酸置換、付加および欠失を含み得る。改変は、当技術分野で公知の標準技術、例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発によって本開示のＣＡＲのヒトｓｃＦｖ中に導入され得る。アミノ酸は、その物理化学的特性、例えば、電荷および極性に従って群に分類できる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同一群内のアミノ酸で置き換えられるものである。例えば、アミノ酸は、電荷によって分類できる：正電荷を有するアミノ酸として、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられ、負電荷を有するアミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられ、中性電荷アミノ酸として、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが挙げられる。さらに、アミノ酸は、極性によって分類できる：極性アミノ酸として、アルギニン（塩基性極性）、アスパラギン、アスパラギン酸（酸性極性）、グルタミン酸（酸性極性）、グルタミン、ヒスチジン（塩基性極性）、リシン（塩基性極性）、セリン、トレオニンおよびチロシンが挙げられ、非極性アミノ酸として、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンが挙げられる。したがって、ＣＤＲ領域内の１個または複数のアミノ酸残基を、同一群からの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、変更された抗体を、本明細書において記載される機能アッセイを使用して保持された機能（すなわち、上記の（ｃ）から（ｌ）に示された機能）について試験できる。ある特定の実施形態では、指定の配列またはＣＤＲ領域内の１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下の残基が変更される。

例えば、一部の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲ中に含まれるＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌアミノ酸配列（例えば、表１に示されるような配列番号１～１０）の保存的改変は、指定の配列（複数可）に対して少なくとも１つまたは複数の（例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０またはそれよりも多い）置換（例えば、保存的置換）、挿入および／または欠失を含有するが、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）に結合する能力を保持する、指定の配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％（例えば、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％）の相同性または同一性を有するアミノ酸配列である。一部の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲ中に含まれるＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌアミノ酸配列（例えば、表１に示されるような配列番号１～１０）のこのような保存的改変は、対応する改変されていないＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌアミノ酸配列のシアリルルイスＡに対する結合親和性の、例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれよりも多く、最大１００％を含む、少なくとも７０％またはそれよりも多くを保持する。例えば、ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）に、約３×１０^－８またはそれ未満の結合親和性（Ｋ_ｄ）で特異的に結合する。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）に、約２×１０^－８またはそれ未満の結合親和性（Ｋ_ｄ）で特異的に結合する。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）に、約１．３×１０^－８またはそれ未満の結合親和性（Ｋ_ｄ）で特異的に結合する。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）に、約１．８×１０^－８またはそれ未満の結合親和性（Ｋ_ｄ）で特異的に結合する。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）に約１×１０^－９～約１×１０^－７の結合親和性（Ｋ_ｄ）で結合する。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）に、約１×１０^－８～約２×１０^－８の結合親和性（Ｋ_ｄ）で結合する。ある特定の実施形態では、配列番号７または８において合計１～１０個のアミノ酸が、置換、挿入および／または欠失される。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、細胞外抗原結合性ドメインのＣＤＲの外側の領域中（例えば、ＦＲ中）に生じる。本明細書において提示される表１を読む当業者ならば、提供された配列情報に基づいてフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸および／または核酸配列を同定および決定できる。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、その配列（配列番号７または８）の翻訳後改変を含む、配列番号７および８からなる群から選択されるＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む。

本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、２つの配列間の同一性パーセントと同等である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一である位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝同一である位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。

２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)）を使用して、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用して決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム中に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）アルゴリズム（www.gcg.comで入手可能）を使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかおよび１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用して決定され得る。

さらに、またはあるいは、本開示の主題のアミノ酸配列は、例えば、関連配列を同定するために公開データベースに対して検索を実施するための「クエリー配列」としてさらに使用され得る。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。本明細書において開示される指定の配列（例えば、ｓｃＦｖｍ９０３、ｍ９０４、ｍ９０５、ｍ９０６およびｍ９００の重鎖および軽鎖可変領域配列）と相同であるアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索が、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施され得る。比較目的のためにギャップ付きアラインメントを得るために、Altschul et al.,(1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されるようにギャップ付きＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。

ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）への結合について、例えば、本開示のｓｃＦｖのいずれか１つのＶ_ＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにＶ_ＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む参照抗体またはその抗原結合性部分と交差競合する。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）への結合について、例えば、本開示のｓｃＦｖのいずれか１つのＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を含む参照抗体またはその抗原結合性部分と交差競合する。

ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）への結合について、ｓｃＦｖ５Ｂ１のＶ_ＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにＶ_ＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む参照抗体またはその抗原結合性部分と交差競合する。例えば、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）への結合について、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ２および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ３を含む参照抗体またはその抗原結合性部分と交差競合する。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡへの結合について、ｓｃＦｖ５Ｂ１のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を含む参照抗体またはその抗原結合性部分と交差競合する。例えば、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡへの結合について、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む参照抗体またはその抗原結合性部分と交差競合する。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、参照抗体またはその抗原結合性部分と同一または重複する、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）上のエピトープに結合する。例えば、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、例えば、本開示のｓｃＦｖのいずれか１つのＶ_ＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにＶ_ＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む参照抗体またはその抗原結合性部分と同一または重複する、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）上のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、例えば、本開示のｓｃＦｖのいずれか１つのＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を含む参照抗体またはその抗原結合性部分と同一または重複する、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）上のエピトープに結合する。

ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖ５Ｂ１のＶ_ＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにＶ_ＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む参照抗体またはその抗原結合性部分と同一または重複する、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）上のエピトープに結合する。例えば、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ２および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ３を含む参照抗体またはその抗原結合性部分と同一または重複する、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）上のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖ５Ｂ１のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を含む参照抗体またはその抗原結合性部分と同一または実質的に同一の、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）上のエピトープに結合する。例えば、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む参照抗体またはその抗原結合性部分と同一または重複する、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）上のエピトープに結合する。

シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）への結合について参照抗体またはその抗原結合性部分と交差競合または競合する細胞外抗原結合性ドメインは、それだけには限らないが、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティングおよび任意の他の適した定量的または定性的抗体－結合アッセイを含む当技術分野で公知の日常的な方法を使用することによって同定され得る。競合ＥＬＩＳＡは、その全体が参照により組み込まれる、J. Walkerによって編集されたMorris, "Epitope Mapping of Protein Antigens by Competition ELISA", The Protein Protocols Handbook (1996), pp 595-600に記載されている。ある特定の実施形態では、抗体結合アッセイは、参照抗体のシアリルルイスＡへの最初の結合を測定すること、参照抗体を試験細胞外抗原結合性ドメインと混合すること、試験細胞外抗原結合性ドメインの存在下で参照抗体のシアリルルイスＡへの第２の結合を測定することおよび参照抗体の最初の結合を第２の結合と比較することを含み、最初の結合と比較して減少した、参照抗体のシアリルルイスＡへの第２の結合が、試験細胞外抗原結合性ドメインが、シアリルルイスＡへの結合について参照抗体と交差競合すること、例えば、同一または実質的に同一のエピトープ、重複エピトープまたは隣接エピトープを認識するものを示す。ある特定の実施形態では、参照抗体は例えば、蛍光色素、ビオチンまたはペルオキシダーゼで標識される。ある特定の実施形態では、シアリルルイスＡは、例えば、フローサイトメトリー試験において細胞において発現される。ある特定の実施形態では、シアリルルイスＡは、Ｂｉａｃｏｒｅシップ（ship）（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ試験において）または表面プラズモン共鳴分析に適した他の媒体を含む表面上に固定化される。完全に無関係の抗体（シアリルルイスＡに結合しない）の存在下での参照抗体の結合は、対照高値として役立ち得る。対照低値は、標識された参照抗体を未標識参照抗体とともにインキュベートすることによって得ることができ、標識された参照抗体の競合および結合の低減が生じる。ある特定の実施形態では、参照抗体のシアリルルイスＡへの結合を少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％低減する試験細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡへの結合について参照抗体と交差競合する細胞外抗原結合性ドメインであると考えられる。ある特定の実施形態では、アッセイは室温で実施される。

ある特定の実施形態では、抗体－結合アッセイは、試験細胞外抗原結合性ドメインのシアリルルイスＡへの最初の結合を測定すること、試験細胞外抗原結合性ドメインを参照抗体と混合すること、参照抗体の存在下で試験細胞外抗原結合性ドメインのシアリルルイスＡポリペプチドへの第２の結合を測定することおよび試験細胞外抗原結合性ドメインの最初の結合を第２の結合と比較することを含み、最初の結合と比較して減少した、試験細胞外抗原結合性ドメインのシアリルルイスＡへの第２の結合が、試験細胞外抗原結合性ドメインがシアリルルイスＡへの結合について参照抗体と交差競合すること、例えば、同一または実質的に同一のエピトープ、重複エピトープまたは隣接エピトープを認識するものを示す。ある特定の実施形態では、試験細胞外抗原結合性ドメインは、例えば、蛍光色素、ビオチンまたはペルオキシダーゼで標識される。ある特定の実施形態では、シアリルルイスＡは、例えば、フローサイトメトリー試験において細胞において発現される。ある特定の実施形態では、シアリルルイスＡは、Ｂｉａｃｏｒｅシップ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ試験において）または表面プラズモン共鳴分析に適した他の媒体を含む表面上に固定化される。完全に無関係の抗体（シアリルルイスＡに結合しない）の存在下での試験細胞外抗原結合性ドメインの結合は、対照高値として役立ち得る。対照低値は、標識された試験細胞外抗原結合性ドメインを未標識試験細胞外抗原結合性ドメインとともにインキュベートすることによって得ることができ、標識試験細胞外抗原結合性ドメインの競合および結合の低減が生じる。ある特定の実施形態では、参照抗体の存在下で、シアリルルイスＡへの結合が少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％減少される試験細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡへの結合について参照抗体と交差競合する細胞外抗原結合性ドメインであると考えられる。ある特定の実施形態では、アッセイは室温で実施される。

ＣＤＲ３ドメインが、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメイン（複数可）とは独立して、単独で、コグネイト抗原に対する抗体またはその抗原結合性部分の結合特異性を決定できることおよび共通のＣＤＲ３配列に基づいて同一の結合特異性を有する複数の抗体を予想通りに作製できることは当技術分野で周知である。例えば、Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000)（マウス抗ＣＤ３０抗体Ｋｉ－４の重鎖可変ドメインＣＤＲ３のみを使用する、ヒト化抗ＣＤ３０抗体の生成を記載する）、Beiboer et al., J. Mol. Bioi. 296:833-849 (2000)（親マウスＭＯＣ－３１抗－ＥＧＰ－２抗体の重鎖ＣＤＲ３配列のみを使用する組換え上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）抗体を記載する）、Rader et al., Proc. Natl. Acad Sci. US.A. 95:8910-8915 (1998)（マウス抗インテグリンα_ｖβ_３抗体ＬＭ６０９の重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ３ドメインを使用するヒト化抗インテグリンα_ｖβ_３抗体のパネルを記載し、各メンバー抗体は、ＣＤＲ３ドメインの外側の別個の配列を含み、親マウス（muring）抗体と同一のエピトープと結合可能であり、親マウス抗体と同程度に高いか、またはそれより高い親和性を有する）、Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994)（ＣＤＲ３ドメインが、抗原結合への最も顕著な寄与を提供することを開示する）、Barbas et al., Proc. Natl. Acad Sci. US.A. 92:2529-2533 (1995)（抗テタヌストキソイドＦａｂの重鎖への、ヒト胚盤ＤＮＡに対する３つのＦａｂ（ＳＩ－ｌ、ＳＩ－４０およびＳＩ－３２）の重鎖ＣＤＲ３配列のグラフティング、それによって、既存の重鎖ＣＤＲ３を置き換えることを記載し、ＣＤＲ３ドメインが単独で結合特異性を付与したことを実証する）、およびDitzel et ai., J. Immunol. 157:739-749 (1996)（単一特異性ＩｇＧテタヌストキソイド結合性Ｆａｂｐ３１３抗体の重鎖への親の多特異性ＦａｂＬＮＡ３の重鎖ＣＤＲ３のみの移入が、親Ｆａｂの結合特異性を保持するのに十分であったグラフティング研究を記載する）を参照されたい。これらの参考文献の各々は、その全体がこれにより参照により組み込まれる。

ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号３の保存的改変および／または配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３またはその保存的改変を含む。一部のこのような実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインはまた、（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２もしくはその保存的改変および配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２もしくはその保存的改変を含み、ならびに／または（ｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１もしくはその保存的改変および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１もしくはその保存的改変も含み得る。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ２、および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ３を含む。

さらに、ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３またはその保存的改変および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３またはその保存的改変を含む。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３またはその保存的改変および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３またはその保存的改変を含む。

細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２またはその保存的改変および配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２またはその保存的改変をさらに含み得る。

細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１またはその保存的改変および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１またはその保存的改変をさらに含み得る。

ある特定の限定されない実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合性ドメインは、細胞外抗原結合性ドメインの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を接続するリンカーを含み得る。本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、互いに接続されるように２つのまたはそれよりも多くのポリペプチドまたは核酸を共有結合によって付着させる官能基（例えば、化学物質またはポリペプチド）を指す。本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」とは、２つのタンパク質を一緒に結合するために（例えば、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを結合するために）使用される１個またはそれよりも多いアミノ酸を指す。ある特定の実施形態では、リンカーは、配列番号１１に示される配列を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、配列番号１１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１２に示されている。

さらに、細胞外抗原結合性ドメインは、新生タンパク質を小胞体に向けるリーダーまたはシグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドまたはリーダーは、ＣＡＲがグリコシル化され、細胞膜に固定される場合には必須であり得る。シグナル配列またはリーダーは、その侵入を分泌経路へ向ける、新しく合成されたタンパク質のＮ末端に存在するペプチド配列（約５、約１０、約１５、約２０、約２５または約３０個のアミノ酸長）であり得る。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、細胞外抗原結合性ドメインの５’末端に共有結合によって繋がれる。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、以下に提供されるような配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤ８ポリペプチドを含む。
TAMALPVTALLLPLALLLHAARP［配列番号１３］

配列番号１３のアミノ酸配列をコードする例示的ヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号１４に示される：
ACTGCCATGGCCCTGCCAGTAACGGCTCTGCTGCTGCCACTTGCTCTGCTCCTCCATGCAGCCAGGCCT［配列番号７４］

ＣＡＲの膜貫通ドメイン
ある特定の限定されない実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、少なくとも膜の部分に広がる疎水性アルファヘリックスを含む。異なる膜貫通ドメインは、異なる受容体安定性をもたらす。抗原認識後、受容体は密集しシグナルは、細胞に伝達される。本開示の主題に従って、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、ＣＤ４０ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＣＤ８４ポリペプチド、ＣＤ１６６ポリペプチド、ＣＤ８ａポリペプチド、ＣＤ８ｂポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＩＣＡＭ－１ポリペプチド、ＣＴＬＡ－４ポリペプチド、ＣＤ２７ポリペプチド、ＣＤ４０／Ｍｙ８８ポリペプチド、ＮＫＧＤ２ポリペプチド、合成ポリペプチド（免疫応答と関連するタンパク質をベースとしない）の天然または改変された膜貫通ドメインまたはそれらの組合せを含み得る。

ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２８ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメインまたはその部分）を含む。ＣＤ２８ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号Ｐ１０７４７またはＮＰ＿００６１３０を有する配列（配列番号１５）またはその断片と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは１００％相同である（例えば、同一である）、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つのもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得るアミノ酸配列を有し得る。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、少なくとも２０または少なくとも３０または少なくとも４０または少なくとも５０および最大２２０個のアミノ酸長である配列番号１５の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいはまたはさらに、限定されない種々の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸１～２２０、１～５０、５０～１００、１００～１５０、１１４～２２０、１５０～２００または２００～２２０のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＣＤ２８ポリペプチドを含む膜貫通ドメイン、ＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内ドメインを含む。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン中に含まれるＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸１１４～２２０を含むか、または有する。

配列番号１５は、以下に提供される：

本開示の主題に従って、「ＣＤ２８核酸分子」とは、ＣＤ２８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。配列番号１５のアミノ酸１１４～２２０をコードする例示的ヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号１６に示される。

ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチド（例えば、ＣＤ２８の膜貫通ドメインまたはその部分）を含む。ＣＤ８ポリペプチドは、配列番号１７またはその断片と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同である、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得るアミノ酸配列を有し得る。ある特定の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、少なくとも２０または少なくとも３０または少なくとも４０または少なくとも５０および最大２３５個のアミノ酸長である、配列番号１７の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいはまたはさらに、限定されない種々の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸１～２３５、１～５０、５０～１００、１００～１５０、１５０～２００または２００～２３５を含むか、または有する。

本開示の主題に従って、「ＣＤ８核酸分子」とは、ＣＤ８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ１６６ポリペプチドの天然または改変された膜貫通ドメインを含む。ＣＤ１６６ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１６１８．２を有する配列（配列番号１８）またはその断片と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは１００％相同である、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得るアミノ酸配列を有し得る。限定されないある特定の実施形態では、ＣＤ１６６ポリペプチドは、少なくとも２０または少なくとも３０または少なくとも４０または少なくとも５０および最大５８３個のアミノ酸長である、配列番号１８の連続部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいはまたはさらに、限定されない種々の実施形態では、ＣＤ１６６ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸１～５８３、１～５０、５０～１００、１００～１５０、１５０～２００、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、３５０～４００、４００～４５０、４５０～５００、５２８～５５３、５００～５５０または５５０～５８３のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの膜貫通ドメイン中に含まれるＣＤ１６６ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸５２８～５５３を含むか、または有する。

配列番号１８は、以下に提供される：

本開示の主題に従って、「ＣＤ１６６核酸分子」とは、ＣＤ１６６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。配列番号１８のアミノ酸５２８～５５３をコードする例示的ヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号１９に示される。
CTAATTGTGGGAATCGTTGTTGGTCTCCTCCTTGCTGCCCTTGTTGCTGGTGTCGTCTACTGGCTGTACATGAAGAAG［配列番号１９］

ヒンジ／スペーサー領域
ある特定の限定されない実施形態では、ＣＡＲはまた、細胞外抗原結合性ドメインを膜貫通ドメインに連結するヒンジ／スペーサー領域を含み得る。ヒンジ／スペーサー領域は、ＣＡＲの活性化活性を保ちながら抗原認識を容易にするために、抗原結合性ドメインを種々の方向に方向付けることを可能にするほど十分に可動性であり得る。ある特定の限定されない実施形態では、ヒンジ／スペーサー領域は、ＩｇＧ１由来のヒンジ領域、免疫グロブリンのＣＨ_２ＣＨ_３領域およびＣＤ３の部分、ＣＤ２８ポリペプチド（例えば、配列番号１５）の部分、ＣＤ８ポリペプチド（例えば、配列番号１７）の部分、ＣＤ１６６ポリペプチド（例えば、配列番号１８）の部分、それと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％相同である前記のもののいずれかの変形形態または合成スペーサー配列であり得る。ある特定の限定されない実施形態では、ヒンジ／スペーサー領域は、約１～５０（例えば、５～２５、１０～３０または３０～５０）個のアミノ酸の間の長さを有し得る。

ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲのヒンジ／スペーサー領域は、本明細書において記載されるようなＣＤ１６６ポリペプチドの天然または改変された（例えば、保存的改変を有する）ヒンジ領域を含む。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲのヒンジ／スペーサー領域中に含まれるＣＤ１６６ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸４８９～５２７のアミノ酸配列を含むか、または有する。配列番号１８のアミノ酸４８９～５２７をコードする例示的ヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号２０に示される。
ACCAACTGGAGAGAACAGTAAACTCCTTGAATGTCTCTGCTATAAGTATTCCAGAACACGATGAGGCAGACGAGATAAGTGATGAAAACAGAGAAAAGGTGAATGACCAGGCAAAA［配列番号２０］

ＣＡＲの細胞内ドメイン
ある特定の限定されない実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞（例えば、リンパ系列の細胞、例えば、Ｔ細胞）を活性化または刺激できるＣＤ３ζポリペプチドを含む。野生型（「天然」）ＣＤ３ζは、３つの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（「ＩＴＡＭ」）（例えば、ＩＴＡＭ１、ＩＴＡＭ２およびＩＴＡＭ３）、３つの塩基性豊富ストレッチ（ＢＲＳ）領域（ＢＲＳ１、ＢＲＳ２およびＢＲＳ３）を含み、抗原が結合された後に活性化シグナルを細胞（例えば、リンパ系列の細胞、例えば、Ｔ細胞）に伝達する。天然ＣＤ３ζ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインは、内因性ＴＣＲからのシグナルの主伝達物質である。本明細書における実施形態において使用される場合ＣＤ３ζは、天然ＣＤ３ζではなく、改変されたＣＤ３ζである。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、その内容が本明細書において記載される目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１８年１２月３１日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６８１３４（国際公開番号ＷＯ２０１９／１３３９６９に対応する）において開示されるＣＤ３ζポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿９３２１７０を有する配列（配列番号２１）またはその断片と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相同であるアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の限定されない実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、少なくとも２０または少なくとも３０または少なくとも４０または少なくとも５０または少なくとも１００または少なくとも１１０または少なくとも１１３および最大１６３個のアミノ酸長である配列番号２１の連続部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいはまたはさらに、限定されない種々の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸１～５０、５０～１００、１００～１５０、５０～１６４、５５～１６４または１５０～１６４のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸５２～１６４のアミノ酸配列を含むか、または有する。

配列番号２１は、以下に提供される：

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、改変されたヒトＣＤ３ζポリペプチドを含む。改変されたヒトＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号２２またはその断片と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％もしくは約１００％相同である（例えば、同一である）、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得るアミノ酸配列を含み得るか、または有し得る。配列番号２２は、以下に提供される：
RVKFSRSADA PAYQQGQNQL YNELNLGRRE EYDVLDKRRG RDPEMGGKPR RKNPQEGLYN
ELQKDKMAEA YSEIGMKGER RRGKGHDGLY QGLSTATKDT YDALHMQALP PR［配列番号２２］

配列番号２２のアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列は、以下に提供される配列番号２３に示される。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、改変されたヒトＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号２４またはその断片と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％もしくは少なくとも約９９％、少なくとも約１００％相同である（例えば、同一である）、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得るアミノ酸配列を含むか、または有する。配列番号２４は以下に提供される：
RVKFSRSADA PAYQQGQNQL YNELNLGRRE EYDVLDKRRG RDPEMGGKPR RKNPQEGLFN
ELQKDKMAEA FSEIGMKGER RRGKGHDGLF QGLSTATKDT FDALHMQALP PR［配列番号２４］

配列番号２４のアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列は、以下に提供される配列番号２５に示される。

免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）
ある特定の限定されない実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１、２または３つのＩＴＡＭを含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む天然ＩＴＡＭ１を含む。
QNQLYNELNLGRREEYDVLDKR［配列番号２６］

配列番号２６のアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列は、以下に提供される配列番号２７に示される。
cagaaccagctctataacgagctcaatctagga cgaagagaggagtacgatgttttggacaagaga［配列番号２７］

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、１つまたは複数の機能欠失変異を含むＩＴＡＭ１バリアントを含む。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、２つの機能欠失変異を含むＩＴＡＭ１バリアントを有する。ある特定の実施形態では、機能欠失変異は、ＩＴＡＭ１中のチロシン残基の変異を含む。ある特定の実施形態では、２つの機能欠失変異からなるＩＴＡＭ１バリアントは、以下に提供される配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。
QNQLFNELNLGRREEFDVLDKR［配列番号２８］

配列番号２８のアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列は、以下に提供される配列番号２９に示される。
cagaaccagctctTtaacgagctcaatctagga cgaagagaggagtTcgatgttttggacaagaga［配列番号２９］

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、以下に提供される配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む天然ＩＴＡＭ２を含む。
QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK［配列番号３０］

配列番号３０のアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列は、以下に提供される配列番号３１に示される。
caggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaa［配列番号３１］

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、１つまたは複数の機能欠失変異を含むＩＴＡＭ２バリアントを含む。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、２つの機能欠失変異を含むＩＴＡＭ２バリアントを有する。ある特定の実施形態では、機能欠失変異は、ＩＴＡＭ２中のチロシン残基の変異を含む。ある特定の実施形態では、２つの機能欠失変異からなるＩＴＡＭ２バリアントは、以下に提供される配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む。
QEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMK［配列番号３２］

配列番号３２のアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列は、以下に提供される配列番号３３に示される。
caggaaggcctgtTcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctTcagtgagattgggatgaaa［配列番号３３］

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、以下に提供される配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含む天然ＩＴＡＭ３を含む。
HDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ［配列番号３４］

配列番号３４のアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列は、以下に提供される配列番号３５に示される。
cacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcag［配列番号３５］

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、１つまたは複数の機能欠失変異を含むＩＴＡＭ３バリアントを含む。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、２つの機能欠失変異を含むＩＴＡＭ３バリアントを有する。ある特定の実施形態では、機能欠失変異は、ＩＴＡＭ３中のチロシン残基の変異を含む。ある特定の実施形態では、２つの機能欠失変異からなるＩＴＡＭ３バリアントは、以下に提供される配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む。
HDGLFQGLSTATKDTFDALHMQ［配列番号３６］

配列番号３６のアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列は、以下に提供される配列番号３７に示される。
cacgatggcctttTccaggggctcagtacagccaccaaggacacctTcgacgcccttcacatgcag［配列番号３７］

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つもしくは複数の機能欠失変異を含むＩＴＡＭ１バリアント、１つもしくは複数の機能欠失変異を含むＩＴＡＭ２バリアント、１つもしくは複数の機能欠失変異を含むＩＴＡＭ３バリアントまたはそれらの組合せを含む、または本質的にそれからなる、またはそれからなる改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つまたは複数の（例えば、２つの）機能欠失変異を含むＩＴＡＭ２バリアントおよび１つまたは複数の（例えば、２つの）機能欠失変異を含むＩＴＡＭ３バリアントを含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭ１、２つの機能欠失変異を含むか、または有するＩＴＡＭ２バリアントおよび２つの機能欠失変異を含むか、または有するＩＴＡＭ３バリアントを含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する天然ＩＴＡＭ１、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有するＩＴＡＭ２バリアントおよび配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するＩＴＡＭ３バリアントを含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むか、または有する。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つまたは複数の（例えば、２つの）機能欠失変異を含むＩＴＡＭ１バリアントおよび１つまたは複数の（例えば、２つの）機能欠失変異を含むＩＴＡＭ３バリアントを含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの機能欠失変異を含むＩＴＡＭ１バリアント、天然ＩＴＡＭ２および２つの機能欠失変異を含むＩＴＡＭ３バリアントを含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するＩＴＡＭ１バリアント、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する天然ＩＴＡＭ２および配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するＩＴＡＭ３バリアントを含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つまたは複数の（例えば、２つの）機能欠失変異を含むＩＴＡＭ１バリアントおよび１つまたは複数の（例えば、２つの）機能欠失変異を含むＩＴＡＭ２バリアントを含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの機能欠失変異を含むＩＴＡＭ１バリアント、２つの機能欠失変異を含むＩＴＡＭ２バリアントおよび天然ＩＴＡＭ３を含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するＩＴＡＭ１バリアント、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有するＩＴＡＭ２バリアントおよび配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する天然ＩＴＡＭ３を含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つまたは複数の（例えば、２つの）機能欠失変異を含むＩＴＡＭ１バリアントを含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの機能欠失変異を含むＩＴＡＭ１バリアント、天然ＩＴＡＭ２および天然ＩＴＡＭ３を含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するＩＴＡＭ１バリアント、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する天然ＩＴＡＭ２および配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する天然ＩＴＡＭ３を含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭ１、天然ＩＴＡＭ２および１つまたは複数の（例えば、２つの）機能欠失変異を含むＩＴＡＭ３バリアントを含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭ１、天然ＩＴＡＭ２および２つの機能欠失変異を含むＩＴＡＭ１バリアントを含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する天然ＩＴＡＭ１、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する天然ＩＴＡＭ２および配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するＩＴＡＭ３バリアントを含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭ１、１つまたは複数の（例えば、２つの）機能欠失変異を含むＩＴＡＭ２バリアントおよび天然ＩＴＡＭ３を含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、天然ＩＴＡＭ１、２つの機能欠失変異を含むＩＴＡＭ２バリアントおよび天然ＩＴＡＭ３を含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する天然ＩＴＡＭ１、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有するＩＴＡＭ２バリアントおよび配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する天然ＩＴＡＭ３を含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つまたは２つのＩＴＡＭの欠失を含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＩＴＡＭ１およびＩＴＡＭ２の欠失を含む、例えば、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、天然ＩＴＡＭ３またはＩＴＡＭ３バリアントを含み、ＩＴＡＭ１およびＩＴＡＭ２を含まない。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する天然ＩＴＡＭ３を含み、ＩＴＡＭ１（天然もしくは改変された）およびＩＴＡＭ２（天然もしくは改変された）を含まない。

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＩＴＡＭ２およびＩＴＡＭ３の欠失を含み、例えば、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、天然ＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ１バリアントを含み、ＩＴＡＭ２およびＩＴＡＭ３を含まない。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有する天然ＩＴＡＭ１を含み、ＩＴＡＭ２（天然もしくは改変された）およびＩＴＡＭ３（天然もしくは改変された）を含まない。

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＩＴＡＭ１およびＩＴＡＭ３の欠失を含み、例えば、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、天然ＩＴＡＭ２またはＩＴＡＭ２バリアントを含み、ＩＴＡＭ１およびＩＴＡＭ３を含まない。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有する天然ＩＴＡＭ２を含み、ＩＴＡＭ１（天然もしくは改変された）およびＩＴＡＭ３（天然もしくは改変された）を含まない。

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＩＴＡＭ１の欠失を含み、例えば、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、天然ＩＴＡＭ２またはＩＴＡＭ２バリアントおよび天然ＩＴＡＭ３またはＩＴＡＭ３バリアントを含み、ＩＴＡＭ１（天然もしくは改変された）を含まない。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＩＴＡＭ２の欠失を含み、例えば、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、天然ＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ１バリアントおよび天然ＩＴＡＭ３またはＩＴＡＭ３バリアントを含み、ＩＴＡＭ２（天然もしくは改変された）を含まない。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＩＴＡＭ３の欠失を含み、例えば、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、天然ＩＴＡＭ１またはＩＴＡＭ１バリアントおよび天然ＩＴＡＭ２またはＩＴＡＭ２バリアントを含み、ＩＴＡＭ３（天然もしくは改変された）を含まない。

塩基性豊富ストレッチ（ＢＲＳ）領域
ある特定の限定されない実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１、２または３つのＢＲＳ領域（すなわち、ＢＲＳ１、ＢＲＳ２およびＢＲＳ３）を含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ＢＲＳ領域は、天然ＢＲＳまたは改変されたＢＲＳ（例えば、ＢＲＳバリアント）であり得る。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、以下に提供される配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含む天然ＢＲＳ１領域を含む。
ＫＲＲＧＲ［配列番号３８］

配列番号３８のアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列は、以下に提供される配列番号３９に示されている。
ａａｇａｇａｃｇｔｇｇｃｃｇｇ［配列番号３９］

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、１つまたは複数の機能欠失変異を含むＢＲＳ１バリアントを含む。

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含む天然ＢＲＳ２を含む。
ＫＰＲＲＫ［配列番号４０］

配列番号４０のアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列は、以下に提供される配列番号４１に示されている。
ａａｇｃｃｇａｇａａｇｇａａｇ［配列番号４１］

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、１つまたは複数の機能欠失変異を含むＢＲＳ２バリアントを含む。

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む天然ＢＲＳ３を含む。
ＫＧＥＲＲＲＧＫ［配列番号４２］

配列番号４２のアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列は、以下に提供される配列番号４３に示されている。
ａａａｇｇｃｇａｇｃｇｃｃｇｇａｇｇｇｇｃａａｇ［配列番号４３］

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、１つまたは複数の機能欠失変異を含むＢＲＳ３バリアントを含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、３つのＢＲＳ領域すべて、すなわちＢＲＳ１領域、ＢＲＳ２領域およびＢＲＳ３領域を含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、天然ＢＲＳ１、天然ＢＲＳ２および天然ＢＲＳ３を含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つまたは２つであるが３つすべてではないＢＲＳ領域を含む改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＢＲＳ１領域およびＢＲＳ２領域を含み、ＢＲＳ３領域を含まない。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＢＲＳ１領域およびＢＲＳ３領域を含み、ＢＲＳ２領域を含まない。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＢＲＳ２領域およびＢＲＳ３領域を含み、ＢＲＳ１領域を含まない。

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＢＲＳ１領域を含み、ＢＲＳ２領域およびＢＲＳ３領域を含まない。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＢＲＳ２領域を含み、ＢＲＳ１領域およびＢＲＳ３領域を含まない。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＢＲＳ３領域を含み、ＢＲＳ１領域およびＢＲＳ２領域を含まない。

ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチド、例えば、構築物Ｄ１２中に含まれる改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＢＲＳ領域（天然または改変されたＢＲＳ１、ＢＲＳ２およびＢＲＳ３）を含まない、例えば、３つのＢＲＳすべてが欠失されている。

ある特定の限定されない実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含み、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のすべてまたは一部を欠き、ＩＴＡＭは、ＩＴＡＭ１、ＩＴＡＭ２およびＩＴＡＭ３である。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＩＴＡＭ２またはその部分を欠く。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＩＴＡＭ３またはその部分をさらに欠く。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＩＴＡＭ１またはその部分をさらに欠く。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＩＴＡＭ１またはその部分を欠く。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＩＴＡＭ３またはその部分をさらに欠く。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＩＴＡＭ３またはその部分を欠く。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、塩基性豊富ストレッチ（ＢＲＳ）領域のすべてまたは一部を欠き、ＢＲＳ領域は、ＢＲＳ１、ＢＲＳ２およびＢＲＳ３である。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＢＲＳ２またはその部分を欠く。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＢＲＳ３またはその部分をさらに欠く。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＢＲＳ１またはその部分をさらに欠く。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＢＲＳ１またはその部分を欠く。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＢＲＳ３またはその部分をさらに欠く。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＢＲＳ３またはその部分を欠く。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＢＲＳ１またはその部分、ＢＲＳ２またはその部分およびＢＲＳ３またはその部分を欠く。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＩＴＡＭ２、ＩＴＡＭ３、ＢＲＳ２およびＢＲＳ３を欠く。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含み、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、塩基性豊富ストレッチ（ＢＲＳ）領域のすべてまたは一部を欠き、ＢＲＳ領域は、ＢＲＳ１、ＢＲＳ２およびＢＲＳ３である。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含み、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、ＢＲＳ１バリアント、ＢＲＳ２バリアントおよびＢＲＳ３バリアントから選択されるＢＲＳバリアントを含み、ＢＲＳバリアントは、１つまたは複数の機能欠失変異を含む。

共刺激ドメイン
ある特定の限定されない実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、共刺激シグナル伝達領域は、最適リンパ球活性化を提供し得る、少なくとも１つの共刺激分子またはその部分を含む。本明細書で使用される場合、「共刺激分子」とは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答にとって必要である、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子を指す。少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８ポリペプチド（例えば、ＣＤ２８の細胞内ドメインまたはその部分）、４－１ＢＢポリペプチド（例えば、４－１ＢＢの細胞内ドメインまたはその部分）、ＯＸ４０ポリペプチド（例えば、ＯＸ４０の細胞内ドメインまたはその部分）、ＩＣＯＳポリペプチド（例えば、ＩＣＯＳの細胞内ドメインまたはその部分）、ＤＡＰ－１０ポリペプチド（例えば、ＤＡＰ－１０の細胞内ドメインまたはその部分）またはそれらの組合せを挙げることができる。共刺激分子は、細胞表面に発現されるタンパク質である共刺激リガンドに結合でき、これは、その受容体への結合の際に、共刺激応答、すなわち、抗原がそのＣＡＲ分子に結合する場合に提供される刺激を引き起こす細胞内応答をもたらす。共刺激リガンドとして、それだけには限らないが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４８、ＴＮＦＲＳＦ１４およびＰＤ－Ｌ１が挙げられる。一例として、４－１ＢＢリガンド（すなわち、４－１ＢＢＬ）は、ＣＡＲシグナルと組み合わせて、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のエフェクター細胞機能を誘導する細胞内シグナルを提供するために４－１ＢＢ（「ＣＤ１３７」としても知られる）に結合し得る。４－１ＢＢ、ＩＣＯＳまたはＤＡＰ－１０を含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内ドメインを含むＣＡＲが、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．７，４４６，１９０に開示されている（例えば、Ｕ．Ｓ．７，４４６，１９０では、４－１ＢＢをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に示され、ＩＣＯＳをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６に示され、ＤＡＰ－１０をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７に示されている）。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、２つの共刺激分子：ＣＤ２８および４－１ＢＢまたはＣＤ２８およびＯＸ４０を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。

４－１ＢＢは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドとして作用し、刺激活性を有し得る。４－１ＢＢポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号Ｐ４１２７３またはＮＰ＿００１５５２を有する配列（配列番号４４）またはその断片と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％相同である（例えば、同一である）、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得るアミノ酸配列を有し得る。

配列番号４４は、以下に提供される：

本開示の主題に従って、「４－１ＢＢ核酸分子」とは、４－１ＢＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

ＯＸ４０ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号Ｐ４３４８９またはＮＰ＿００３３１８を有する配列（配列番号４５）またはその断片と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％相同である（例えば、同一である）、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得るアミノ酸配列を有し得る。

配列番号４５は、以下に提供される：

本開示の主題に従って、「ＯＸ４０核酸分子」とは、ＯＸ４０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

ＩＣＯＳポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿０３６２２４を有する配列（配列番号４６）またはその断片と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％相同である（例えば、同一である）、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得るアミノ酸配列を有し得る。

配列番号４６は、以下に提供される：

本開示の主題に従って、「ＩＣＯＳ核酸分子」とは、ＩＣＯＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２８の細胞内ドメインまたはその部分を含む。ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列もしくはその断片と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは１００％相同である（例えば、同一である）、および／または、必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得るアミノ酸配列を含み得る、または有し得る。限定されないある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、少なくとも２０または少なくとも３０または少なくとも４０または少なくとも５０および最大２２０個のアミノ酸長である配列番号１５の連続部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいはまたはさらには、限定されない種々の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸１～２２０、１～５０、５０～１００、１００～１５０、１１４～２２０、１５０～２００または２００～２２０のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１５のアミノ酸１８０～２２０のアミノ酸配列を含むか、または有するＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、マウスＣＤ２８またはその部分の細胞内ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿０３１６６８．３を有する配列（配列番号４７）またはその断片と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同である、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得るアミノ酸配列を含むか、または有する。限定されないある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、少なくとも約２０または少なくとも約３０または少なくとも約４０または少なくとも約５０および最大２１８個のアミノ酸長である配列番号４７の連続部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいはまたはさらには、限定されない種々の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号４７のアミノ酸１～２１８、１～５０、５０～１００、１００～１５０、１１４～２２０、１５０～２００、１７８～２１８または２００～２２０のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの共刺激シグナル伝達領域は、配列番号４７のアミノ酸１７８～２１８を含むか、または有するＣＤ２８ポリペプチドを含む。

配列番号４７、以下に提供される：

本開示の主題に従って、「ＣＤ２８核酸分子」とは、ＣＤ２８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。配列番号４７）のアミノ酸１７８～２１８をコードする例示的ヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号４８に示される。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、マウスＣＤ２８の細胞内ドメインまたはその部分を含む。マウスＣＤ２８の細胞内ドメインは、配列番号４９またはその断片と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同である（例えば、同一である）、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得るアミノ酸配列を含み得るか、または有し得る。配列番号４９は、以下に提供される：
NSRRNRLLQS DYMNMTPRRP GLTRKPYQPY APARDFAAYR P［配列番号４９］

配列番号４９のアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列は、以下に提供される配列番号５０に示される。
AATAGTAGAAGGAACAGACTCCTTCAAAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGGAGGCCTGGGCTCACTCGAAAGCCTTACCAGCCCTACGCCCCTGCCAGAGACTTTGCAGCGTACCGCCCC［配列番号５０］

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２８の細胞内ドメインまたはその部分を含む。ヒトＣＤ２８の細胞内ドメインは、配列番号５１またはその断片と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同である（例えば、同一である）、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得るアミノ酸配列を含み得るか、または有し得る。配列番号５１は、以下に提供される；
RSKRSRLLHS DYMNMTPRRP GPTRKHYQPY APPRDFAAYR S［配列番号５１］

配列番号５１のアミノ酸配列をコードする例示的核酸配列は、以下に提供される配列番号５２に示される。
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC［配列番号５２］

ある特定の実施形態では、異なるタンパク質に由来するＣＡＲのドメイン／モチーフ／領域間の変異部位および／または接合部が、脱免疫化される。異なるＣＡＲ部分の間の接合部の免疫原性は、ＮｅｔＭＨＣ４．０サーバーを使用して予測され得る。次の部分からの少なくとも１つのアミノ酸を含有する各ペプチドについて、ＨＬＡＡ、ＢおよびＣに対する結合親和性をすべての対立遺伝子について予測できる。各ペプチドについて各ペプチドの免疫原性のスコアを割り当てることができる。免疫原性スコアは、式免疫原性スコア＝［（５０－結合親和性）＊ＨＬＡ頻度］_ｎを使用して算出できる。ｎは、各ペプチドの予測数である。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ヒトシアリルルイスＡに特異的に結合するヒトｓｃＦｖを含む細胞外抗原結合性領域、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ８ポリペプチドまたはＣＤ１６６ポリペプチドを含む膜貫通ドメインならびに野生型または改変されたＣＤ３ζポリペプチドおよびＣＤ２８ポリペプチドまたは４－１ＢＢポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内ドメインを含む。ＣＡＲはまた、細胞外抗原結合性ドメインの５’末端に共有結合によって繋がれたシグナルペプチドまたはリーダーも含む。シグナルペプチドは、配列番号１３に示される配列を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、ヒトｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ５Ｂ１であり、その可変領域配列は、表１に提供される。

一部の実施形態では、本開示の主題のＣＡＲは、ヒト細胞において核酸配列を発現するための誘導性プロモーターをさらに含む。ＣＡＲ遺伝子の発現において使用するためのプロモーターは、構成的プロモーター、例えば、ユビキチンＣ（ＵｂｉＣ）プロモーターであり得る。

本開示の主題はまた、本明細書において記載されるシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲまたはその機能的部分をコードする核酸分子を提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、ヒトシアリルルイスＡに特異的に結合するヒトｓｃＦｖを含む本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲ、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ８ポリペプチドまたはＣＤ１６６ポリペプチドを含む膜貫通ドメインならびに野生型または改変されたＣＤ３ζポリペプチドおよびＣＤ２８ポリペプチドまたは４－１ＢＢポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内ドメインをコードする。

ある特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間に位置する配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するリンカーを含むヒトｓｃＦｖを含むシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲ、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ８ポリペプチドまたはＣＤ１６６ポリペプチドを含む膜貫通ドメインならびに野生型または改変されたＣＤ３ζポリペプチドおよびＣＤ２８ポリペプチドまたは４－１ＢＢポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内ドメインをコードする。

ある特定の実施形態では、核酸分子は、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲの機能的部分をコードする。本明細書で使用される場合、「機能的部分」という用語は、シアリルルイスＡ標的化ＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物活性を保持する、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲの任意の部分、一部または断片を指す。例えば、機能的部分は、親ＣＡＲと同様、同一またはさらにはそれよりも高い程度に、標的細胞を認識する、疾患を処置する能力を保持する、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲの部分、一部または断片を包含する。ある特定の実施形態では、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲの機能的部分をコードする単離核酸分子は、親ＣＡＲの例えば、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％および約９５％またはそれより多くを含むタンパク質をコードし得る。

Ｖ．免疫応答性細胞
本開示の主題は、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを含む細胞および悪性成長を処置するために、例えば、がん、例えば膵臓がんを処置するためにこのような細胞を使用する方法を提供する。例えば、一部の実施形態では、本明細書において開示されるシアリルルイスＡを認識するキメラ抗原受容体を含むＴ細胞が、本明細書において提供される。このような細胞は、腫瘍、例えば、固形腫瘍、例えば、膵臓がんの悪性成長を処置および／または防止するためにそれを必要とするヒト対象に投与される。

一部の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲは、当業者に公知の適当な手段によって免疫応答性細胞に送達され得る。例えば、一部の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲは、ベクターまたは他の送達ビヒクルによって免疫応答性細胞に送達され得る。一部の実施形態では、本明細書において記載されるＣＡＲは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）構築物の形態で免疫応答性細胞に送達され得る。一部の実施形態では、免疫応答性細胞は、細胞がＣＡＲを発現するように、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター）によって本開示のＣＡＲを用いて形質導入され得る。本開示の主題はまた、腫瘍または固形腫瘍、例えば、膵臓がんの処置のためにこのような細胞を使用する方法も提供する。

本開示の主題の免疫応答性細胞は、リンパ系列の細胞であり得る。Ｂ、Ｔおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含むリンパ系列は、抗体の生成、細胞性免疫系の調節、血液中の外来物質の検出、宿主に対して外来である細胞の検出などを提供する。リンパ系列の免疫応答性細胞の限定されない例として、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、胚性幹細胞および多能性幹細胞（例えば、リンパ球様細胞がそれから分化し得るもの）が挙げられる。Ｔ細胞は、胸腺において成熟し、細胞媒介性免疫に主に関与するリンパ球であり得る。Ｔ細胞は、適応免疫系に関与している。本開示の主題のＴ細胞は、それだけには限らないが、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞（セントラルメモリーT細胞、幹細胞様記憶Ｔ細胞（または幹様記憶Ｔ細胞）および２種類のエフェクター記憶Ｔ細胞：例えば、Ｔ_ＥＭ細胞およびＴ_ＥＭＲＡ細胞、制御性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞としても知られる）、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞およびγδＴ細胞を含むＴ細胞の任意の種類であり得る。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬまたはキラーＴ細胞）は、感染体細胞または腫瘍細胞の死を誘導可能なＴリンパ球のサブセットである。患者自身のＴ細胞が、本明細書において開示される任意のポリペプチドまたはシステムの導入によって特定の抗原を標的とするように遺伝子改変され得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞であり得る。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。

ある特定の実施形態では、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、Ｆｏｘｐ３を発現して、Ｔ制御性表現型を達成および維持する。

ある特定の実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー細胞である。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞媒介性免疫の一部であり、自然免疫応答の際に作用するリンパ球であり得る。ＮＫ細胞は、標的細胞に対するその細胞傷害性効果を発揮するために事前の活性化を必要としない。

本開示の主題の免疫応答性細胞は、がん、例えば、膵臓がんの処置のための、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）に特異的に結合する細胞外抗原結合性ドメイン（例えば、ヒトｓｃＦＶ、必要に応じて架橋されるＦａｂまたはＦ（ａｂ）_２）を発現し得る。このような免疫応答性細胞は、がんの処置のためにそれを必要とする対象（例えば、ヒト対象）に投与され得る。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞であり得る。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。

本開示の免疫応答性細胞は、少なくとも１つの組換えまたは外因性共刺激リガンドをさらに含み得る。例えば、本開示の免疫応答性細胞は、免疫応答性細胞が、シアリルルイスＡ標的化ＣＡＲおよび少なくとも１つの共刺激リガンドを共発現するように、または共発現するように誘導されるように、少なくとも１つの共刺激リガンドを用いてさらに形質導入され得る。シアリルルイスＡ標的化ＣＡＲと少なくとも１つの共刺激リガンドとの間の相互作用は、免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）の完全活性化にとって重要な非抗原特異的シグナルを提供する。共刺激リガンドとして、それだけには限らないが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンドのメンバーが挙げられる。ＴＮＦは、全身炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を刺激する。その主な役割は、免疫細胞の調節にある。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、いくつかの共通の特徴を共有する。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの大部分は、短い細胞質セグメントおよび比較的長い細胞外領域を含有するＩＩ型膜貫通タンパク質（細胞外Ｃ末端）として合成される。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーとして、限定するものではないが、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０Ｌ）／ＣＤ１５４、ＣＤ１３７Ｌ／４－１ＢＢＬ、ＴＮＦ－α、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ２５２、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ３０Ｌ／ＣＤ１５３、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）／リンホトキシン－アルファ（ＬＴα）、リンホトキシン－ベータ（ＬＴβ）、ＣＤ２５７／Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）／Ｂｌｙｓ／ＴＨＡＮＫ／Ｔａｌｌ－１、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）が挙げられる。免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーは、細胞の認識、結合または接着プロセスに関与する細胞表面および可溶性タンパク質の大きな群である。これらのタンパク質は、免疫グロブリンと構造的特徴を共有する－－それらは免疫グロブリンドメイン（フォールド）を有する。免疫グロブリンスーパーファミリーリガンドとして、それだけには限らないが、両方ともＣＤ２８のリガンドであるＣＤ８０およびＣＤ８６、ＰＤ－１のリガンドであるＰＤ－Ｌ１／（Ｂ７－Ｈ１）が挙げられる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＰＤ－Ｌ１およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、４－１ＢＢＬである１つの組換え共刺激リガンドを含む。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、４－１ＢＢＬおよびＣＤ８０である２つの組換え共刺激リガンドを含む。ＣＡＲおよび少なくとも１つの組換え共刺激リガンドを含む免疫応答性細胞は、米国特許第８，３８９，２８２号および米国特許公開番号第２０１６／００４５５５１号に記載されており、その両方ともその全体が参照により組み込まれる。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲおよび組換えサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２）を含む。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲおよび組換えＣＤ４０Ｌポリペプチドを含む。

さらに、本開示の免疫応答性細胞は、少なくとも１つの外因性サイトカインをさらに含み得る。例えば、本開示の免疫応答性細胞は、免疫応答性細胞が、少なくとも１つのサイトカインを分泌し、ならびにシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを発現するように、少なくとも１つのサイトカインでさらに形質導入され得る。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７およびＩＬ－２１からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１２である。

末梢ドナーリンパ球において使用され得るシアリルルイスＡ特異的またはシアリルルイスＡ標的化ヒトリンパ球、例えば、Sadelain, M., et al. 2003 Nat Rev Cancer 3:35-45に開示されるもの（ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球を開示する）、Morgan, R.A., et al. 2006 Science 314:126-129に開示されるもの（αおよびβヘテロ二量体を含む全長腫瘍抗原認識性Ｔ細胞受容体複合体を発現するように遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球を開示する）、Panelli, M.C., et al. 2000 J Immunol 164:495-504、Panelli, M.C., et al. 2000 J Immunol 164:4382-4392に開示されるもの（腫瘍生検における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来するリンパ球培養物を開示する）およびDupont, J., et al. 2005 Cancer Res 65:5417-5427、Papanicolaou, G.A., et al. 2003 Blood 102:2498-2505に開示されるもの（人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）またはパルス樹状細胞を使用する選択的にｉｎｖｉｔｒｏ増大した（expanded）抗原特異的末梢血白血球を開示する）。免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、自己、非自己（例えば、同種異系の）である場合も、操作された前駆体もしくは幹細胞からｉｎｖｉｔｒｏで誘導される場合もある。

ある特定の実施形態では、本開示の免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、約１～約５、約１～約４、約２～約５、約２～約４、約３～約５、約３～約４、約４～約５、約１～約２、約２～約３、約３～約４または約４～約５のベクターコピー数／本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲの細胞を発現する。

さらに、免疫応答性細胞は、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）とは異なる第２の抗原に結合する抗原認識性受容体を含み、発現し得る（例えば、天然に発現する、または発現するように改変される）。免疫応答性細胞上に本開示のＣＡＲに加えて抗原認識性受容体を含むことによって、ＣＡＲまたは標的とした細胞上にそれを含む免疫応答性細胞のアビディティーが増加し得る、特に、ＣＡＲは、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）に対して低い結合親和性、例えば、約２×１０^－８Ｍもしくはそれより大きい、約５×１０^－８Ｍもしくはそれより大きい、約８×１０^－８Ｍもしくはそれより大きい、約９×１０^－８Ｍもしくはそれより大きい、約１×１０^－７Ｍもしくはそれより大きい、約２×１０^－７Ｍもしくはそれより大きい、または約５×１０^－７Ｍもしくはそれより大きいＫ_ｄを有するものである。

ある特定の実施形態では、抗原認識性受容体は、キメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）である。本明細書で使用される場合、「キメラ共刺激受容体」または「ＣＣＲ」という用語は、抗原と結合し、共刺激シグナルを提供するが、Ｔ細胞活性化シグナルを提供しないキメラ受容体を指す。ＣＣＲは、Krause, et al., J. Exp. Med. (1998);188(4):619-626およびＵＳ２００２００１８７８３に記載されており、それらの内容は、その全体が参照により組み込まれる。ＣＣＲは、共刺激シグナルを模倣するが、ＣＡＲとは異なり、Ｔ細胞活性化シグナルを提供しない、例えば、ＣＣＲは、ＣＤ３ζポリペプチドを欠く。ＣＣＲは、抗原提示細胞上の天然共刺激リガンドの不在下で、共刺激、例えば、ＣＤ２８様シグナルを提供する。コンビナトリアル抗原認識、すなわち、ＣＡＲと組み合わせたＣＣＲの使用は、二重抗原発現Ｔ細胞に対するＴ細胞反応性を増強し、それによって、選択的腫瘍標的化を改善できる。Kloss et al.は、コンビナトリアル抗原認識、分割シグナル伝達および重要なことに、Ｔ細胞活性化と共刺激のバランスのとれた力を統合して、各抗原を個々に発現する細胞を温存しながら、抗原の組合せを発現する標的細胞を排除するＴ細胞を生成する戦略を記載している（Kloss et al., Nature Biotechnololgy (2013);31(1):71-75、その内容はその全体が参照により組み込まれる）。このアプローチを用いる場合、Ｔ細胞活性化は、ある抗原（例えば、シアリルルイスＡ）のＣＡＲによって媒介される認識を必要とするが、共刺激は、第２の抗原に特異的なＣＣＲによって独立に媒介される。腫瘍選択性を達成するために、コンビナトリアル抗原認識アプローチは、Ｔ細胞活性化の効率を、第２の抗原の同時ＣＣＲ認識によって提供されるレスキューなしには無効であるレベルに減少させる。ある特定の実施形態では、ＣＣＲは、シアリルルイスＡとは異なる抗原に結合する細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインならびにそれだけには限らないが、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、２Ｂ４およびＢＴＬＡを含む少なくとも１つの共刺激分子を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＣＲの共刺激シグナル伝達領域は、１つの共刺激シグナル伝達分子を含む。ある特定の実施形態では、１つの共刺激シグナル伝達分子は、ＣＤ２８である。ある特定の実施形態では、１つの共刺激シグナル伝達分子は、４－１ＢＢである。ある特定の実施形態では、ＣＣＲの共刺激シグナル伝達領域は、２つの共刺激シグナル伝達分子を含む。ある特定の実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達分子は、ＣＤ２８および４－１ＢＢである。第２の抗原は、シアリルルイスＡおよび第２の抗原両方の発現が標的とした細胞（例えば、がん性組織またはがん性細胞）に制限されるように選択される。ＣＡＲと同様に、細胞外抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２または細胞外抗原結合性ドメインを形成する異種配列との融合タンパク質であり得る。ある特定の実施形態では、ＣＣＲは、膵臓がん特異的抗原に結合する。

ある特定の実施形態では、抗原認識性受容体は、切断型ＣＡＲである。「切断型ＣＡＲ」は、細胞内シグナル伝達ドメインを欠くことでＣＡＲとは異なる。例えば、切断型ＣＡＲは、細胞外抗原結合性ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインを欠く。本開示の主題に従って、切断型ＣＡＲは、標的とした細胞（例えば、膵臓がん細胞）で発現される第２の抗原、例えば、膵臓がん特異的抗原に対して高い結合親和性を有する。切断型ＣＡＲは、本開示のＣＡＲ、特に、シアリルルイスＡに対して低い結合親和性を有するＣＡＲのアビディティーを増強し、それによって本開示のＣＡＲまたはそれを含む免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）の有効性を改善する接着分子として機能する。ある特定の実施形態では、本開示のＴ細胞は、シアリルルイスＡを標的とする本開示のＣＡＲおよび膵臓がん特異的抗原を標的とする切断型ＣＡＲを含むか、またはそれを発現するように形質導入される。

ＶＩ．核酸組成物およびベクター
本開示の主題は、本明細書において開示されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む核酸組成物を提供する。またこのような核酸組成物を含む細胞も提供される。

免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の遺伝子改変は、ＣＡＲをコードする組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を実質的に均一な細胞組成の標的細胞へと送達することによって達成され得る。一部の実施形態では、このような組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物は、ベクターを使用して免疫応答性細胞中に送達され得る。一部の実施形態では、このようなベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物の宿主細胞ゲノムへの導入のために使用されるレトロウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルスの）であり得る。例えば、シアリルルイスＡ標的化ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを、レトロウイルスベクター中にクローニングでき、発現を、その内因性プロモーターから、レトロウイルスの長鎖末端反復配列から、または代替内部プロモーターから駆動できる。

非ウイルスベクターまたはＲＮＡも同様に使用され得る。ランダムな染色体の組込みまたは標的化された組込み（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用する、および／またはクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）または導入遺伝子発現（例えば、天然または化学的に改変されたＲＮＡを使用する）が使用され得る。

シアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを発現する細胞を提供するための細胞の最初の遺伝子改変のためには、一般に、レトロウイルスベクターが、形質導入のために使用されるが、任意の他の適したウイルスベクターまたは非ウイルス送達系も使用され得る。少なくとも２つの共刺激リガンドを含む複合体を提示する抗原を含む細胞を提供するための細胞のその後の遺伝子改変のためには、レトロウイルス遺伝子導入（形質導入）が同様に有効であることが判明する。カプシドタンパク質がヒト細胞に感染するために機能的である場合には、レトロウイルスベクターと適当なパッケージングラインの組合せも適している。それだけには限らないが、ＰＡ１２（Miller, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437）、ＰＡ３１７（Miller, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902）、およびＣＲＩＰ（Danos, et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464）を含む種々の両種指向性ウイルス生成細胞系が公知である。非両種指向性粒子、例えば、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４またはＧＡＬＶエンベロープでシュードタイプ化された粒子および当技術分野で公知の任意の他のものも適している。

可能性ある形質導入の方法にはまた、例えば、Bregni, et al. (1992) Blood 80:1418-1422の方法による細胞とプロデューサー細胞の直接共培養、または例えば、Xu, et al. (1994) Exp. Hemat. 22:223-230、およびHughes, et al. (1992) J. Clin. Invest. 89:1817の方法によるウイルス上清単独もしくは適当な成長因子およびポリカチオンを伴う、もしくは伴わない濃縮ベクターストックとともに培養することも含まれる。

免疫応答性細胞において共刺激リガンドを発現および／またはサイトカイン（例えば、４－１ＢＢＬおよび／またはＩＬ－１２）を分泌するために、形質導入ウイルスベクターが使用され得る。好ましくは、選択されたベクターは、高い感染効率および安定な組込みおよび発現を示す（例えば、Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997、Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996、Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649, 1997、Naldini et al., Science 272:263 267, 1996、およびMiyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997を参照されたい）。使用できる他のウイルスベクターとして、例えば、アデノウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスまたはヘルペスウイルス、例えば、エプスタイン－バーウイルス（例えば、Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990、Friedman, Science 244:1275-1281, 1989、Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988、Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990、Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991、Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987、Anderson, Science 226:401-409, 1984、Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991、Miller et al., Biotechnology 7:980-990, 1989、Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993、およびJohnson, Chest 107:77S- 83S, 1995のベクターも参照されたい）が挙げられる。レトロウイルスベクターは、特に十分に開発されており、臨床実践場面において使用されてきた（Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323:370, 1990、Anderson et al.,米国特許第５，３９９，３４６号）。

ある特定の限定されない実施形態では、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを発現するベクターは、レトロウイルスベクター、例えば、オンコレトロウイルスベクターである。

細胞におけるタンパク質の発現のために非ウイルスアプローチも使用され得る。例えば、核酸分子は、リポフェクション（Feigner et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413、1987、Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990、Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989、Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983)、アシアロオロソムコイド－ポリリシンコンジュゲーション（Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988、Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989)の存在下で核酸を投与することによって、または外科的条件下でのマイクロインジェクションによって（Wolff et al., Science 247:1465, 1990）細胞中に導入され得る。遺伝子導入のための他の非ウイルス手段として、リン酸カルシウムを使用するｉｎｖｉｔｒｏでのトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔およびプロトプラスト融合が挙げられる。リポソームも、細胞へのＤＮＡの送達にとって潜在的に有益であり得る。正常遺伝子の対象の罹患組織への移植はまた、正常核酸をｅｘｖｉｖｏの培養可能な細胞型（例えば、自己または異種一次細胞またはその後代）へ移入し、その後、細胞（またはその子孫）を標的とした組織へと注射するか、または全身に注射することによって達成され得る。組換え受容体はまた、トランスポサーゼまたは標的化ヌクレアーゼ（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼ）を使用して誘導するか、または得ることができる。一過性の発現は、ＲＮＡ電気穿孔によって得ることができる。

ポリヌクレオチド療法の方法において使用するためのｃＤＮＡ発現は、任意の適したプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）またはメタロチオネインプロモーター）から指示され、任意の適当な哺乳動物調節エレメントまたはイントロン（例えば、伸長因子１αエンハンサー／プロモーター／イントロン構造）によって調節され得る。例えば、必要に応じて、核酸の発現を指示するために、特定の細胞型における遺伝子発現を選択的に指示することが知られているエンハンサーが使用され得る。使用されるエンハンサーとして、限定するものではないが、組織－または細胞－特異的エンハンサーとして特徴付けられるものを挙げることができる。あるいは、治療用構築物としてゲノムクローンが使用される場合には、調節は、同族調節配列によって、必要に応じて、上記のプロモーターまたは調節エレメントのいずれかを含む異種供給源に由来する調節配列によって媒介され得る。得られた細胞は、未改変細胞のものと同様の条件下で成長させることができ、それによって改変された細胞を増大させ、様々な目的のために使用できる。

ＶＩＩ．免疫応答性細胞へのゲノム組込み
ある特定の実施形態では、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲは、免疫応答性細胞のゲノムの選択された遺伝子座へと組み込まれ得る。免疫応答性細胞のゲノムの選択された遺伝子座中にＣＡＲを組み込むために、任意の標的化ゲノム編集法が使用され得る。ある特定の実施形態では、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲの発現は、遺伝子座内またはその付近の内因性プロモーター／エンハンサーによって駆動される。ある特定の実施形態では、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲの発現は、遺伝子座へと組み込まれた外因性プロモーターによって駆動される。本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲが組み込まれる遺伝子座は、遺伝子座内の遺伝子の発現レベルおよび遺伝子座内の遺伝子の遺伝子発現のタイミングに基づいて選択される。発現レベルおよびタイミングは、細胞分化の異なる段階およびマイトジェン／サイトカイン微小環境下で変わる場合があり、これらは、選択を行う場合に考慮されるべき要因の一つである。

ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞のゲノムの選択された遺伝子座中に本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを組み込むために、ＣＲＩＳＰＲシステムが使用される。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、原核細胞において発見されたゲノム編集ツールである。ゲノム編集のために使用される場合には、このシステムは、Ｃａｓ９（ｃｒＲＮＡをそのガイドとして利用してＤＮＡを改変可能なタンパク質）、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡは、宿主ＤＮＡの修正セクションへそれをガイドするＣａｓ９によって使用されるＲＮＡを、Ｃａｓ９と活性複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡに結合する領域（一般に、ヘアピンループ形態で）とともに含有する）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡに結合し、Ｃａｓ９と活性複合体を形成する）およびＤＮＡ修復鋳型の最適セクション（特定のＤＮＡ配列の挿入を可能にする細胞性修復プロセスをガイドするＤＮＡ）を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、プラスミドを標的細胞にトランスフェクトするために使用することが多い。ｃｒＲＮＡは、細胞において標的ＤＮＡを同定し、直接結合するためにＣａｓ９が使用する配列であるので、各適用のために設計される必要がある。ＣＡＲ発現カセットを保持する修復鋳型も、切断のいずれかの側の配列と重複しなくてはならず、挿入配列をコードするので、各適用のために設計される必要がある。複数のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、一緒にパッケージングされて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成し得る。このｓｇＲＮＡを、Ｃａｓ９遺伝子と一緒に結合させ、プラスミドへと作製して、細胞にトランスフェクトすることができる。ＣＲＩＳＰＲシステムを使用する方法は、例えば、ＷＯ２０１４０９３６６１Ａ２、ＷＯ２０１５１２３３３９Ａ１およびＷＯ２０１５０８９３５４Ａ１に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ある特定の実施形態では、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用して、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを免疫応答性細胞のゲノムの選択された遺伝子座中に組み込む。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、人工制限酵素であり、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを、ＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることによって生成される。亜鉛フィンガードメインを、特異的ＤＮＡ配列を標的とするように操作することができ、これによって、亜鉛フィンガーヌクレアーゼがゲノム内の所望の配列を標的とすることが可能になる。個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、通常、複数の個々の亜鉛フィンガーリピートを含有し、複数の塩基対を各々認識できる。新規亜鉛フィンガードメインを生成する最も一般的な方法は、公知の特異性のより小さい亜鉛フィンガー「モジュール」を組み合わせることである。ＺＦＮ中の最も一般的な切断ドメインは、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩ由来の非特異的切断ドメインである。内因性相同組換え（ＨＲ）機構およびＣＡＲ発現カセットを保持する相同ＤＮＡ鋳型を使用し、ＺＦＮを使用してＣＡＲ発現カセットをゲノム中に挿入することができる。標的とした配列が、ＺＦＮによって切断された場合に、ＨＲ機構が、損傷を受けた染色体と相同ＤＮＡ鋳型の間の相同性について探索し、次いで、染色体の２つの破壊された末端の間の鋳型の配列をコピーし、それによって相同ＤＮＡ鋳型がゲノム中に組み込まれる。ＺＦＮシステムを使用する方法は、例えば、ＷＯ２００９１４６１７９Ａ１、ＷＯ２００８０６０５１０Ａ２およびＣＮ１０２１７４５７６Ａに記載されており、それらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥＮシステムを使用して、免疫応答性細胞のゲノムの選択された遺伝子座中に本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを組み込む。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＮＡの特定の配列を切断するように操作され得る制限酵素である。ＴＡＬＥＮシステムは、ＺＦＮとほとんど同一の原理で作動する。それらは、転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメインを、ＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることによって生成する。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、特定のヌクレオチドに対する強力な認識を有する２つの可変位置を有する３３～３４個のアミノ酸反復モチーフから構成される。これらのＴＡＬＥのアレイをアセンブルすることによって、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインは、所望のＤＮＡ配列に結合し、それによって、ヌクレアーゼをガイドして、ゲノム中の特定の位置で切断するように操作され得る。ＴＡＬＥＮシステムを使用する方法は、例えば、ＷＯ２０１４１３４４１２Ａ１、ＷＯ２０１３１６３６２８Ａ２およびＷＯ２０１４０４０３７０Ａ１に記載されており、それらは、その全体が参照により組み込まれる。ゲノム編集物質を送達する方法は、必要に応じて変わり得る。ある特定の実施形態では、選択されたゲノム編集方法の構成成分は、１つまたは複数のプラスミド中のＤＮＡ構築物として送達される。ある特定の実施形態では、構成成分はウイルスベクターを介して送達される。一般的な送達方法として、それだけには限らないが、電気穿孔、マイクロインジェクション、遺伝子銃、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、静水圧、連続注入、超音波処理、マグネトフェクション、アデノ随伴ウイルス、ウイルスベクターのエンベロープタンパク質シュードタイピング、複製コンピテントベクターシスおよびトランス作用性エレメント、単純ヘルペスウイルスおよび化学的ビヒクル（例えば、オリゴヌクレオチド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、無機ナノ粒子および細胞透過性ペプチド）が挙げられる。

改変は、選択された遺伝子座内のどの場所でも、または組み込まれたシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲの遺伝子発現に影響を及ぼし得るどの場所でも行われ得る。ある特定の実施形態では、改変は、組み込まれたシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲの転写開始部位の上流に導入される。ある特定の実施形態では、改変は、組み込まれたシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲの転写開始部位とタンパク質コーディング領域の間に導入される。ある特定の実施形態では、改変は、組み込まれた本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲのタンパク質コーディング領域の下流に導入される。

ＶＩＩＩ．ポリペプチドおよびアナログおよびポリヌクレオチド
シアリルルイスＡ（例えば、ｓｃＦｖ（例えば、ヒトｓｃＦｖ）、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）_２）、ＣＤ３ζ、ＣＤ８、ＣＤ２８などに特異的に結合する細胞外抗原結合性ドメインも、本開示の主題に含まれる。ポリペプチドまたはその断片およびそれをコードするポリヌクレオチドは、免疫応答性細胞において発現された場合にその抗腫瘍活性を増強する方法で改変される。本開示の主題は、配列中に変更をもたらすことによってアミノ酸配列または核酸配列を最適化する方法を提供する。このような変更は、ある特定の変異、欠失、挿入または翻訳後改変を含み得る。本開示の主題は、本開示の主題の任意の天然に存在するポリペプチドのアナログをさらに含む。アナログは、アミノ酸配列相違によって、翻訳後改変によって、または両方によって本開示の主題の天然に存在するポリペプチドから異なり得る。本開示の主題のアナログは、一般に、本開示の主題の天然に存在するアミノ酸配列のすべてまたは一部と少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれよりも多い同一性または相同性を示し得る。配列比較の長さは、少なくとも約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約７５、約１００またはそれよりも多いアミノ酸残基である。再度、同一性の程度を決定する例示的アプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムが使用されてもよく、ｅ^－３からｅ^－１００の間の確率スコアは密接に関連する配列を示す。改変は、ポリペプチドのｉｎｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏ化学的誘導体化、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化またはグリコシル化を含み、このような改変は、単離された改変酵素を用いてポリペプチド合成またはプロセシングまたは以下の処置の間に生じ得る。アナログはまた、一次配列の変更によって本開示の主題の天然に存在するポリペプチドから異なり得る。これらとして、天然および誘導された両方の遺伝的バリアント（例えば、Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), CSH Press, 1989またはAusubel et al、上記に記載されるような、照射またはエタンメチルスルフェートに対する曝露によるランダム変異誘発に起因する、または部位特異的変異誘発による）。また、Ｌ－アミノ酸（L-amina acid）以外の残基、例えば、Ｄ－アミノ酸または天然に存在しないまたは合成アミノ酸、例えば、ベータ（β）またはガンマ（γ）アミノ酸を含有する環化ペプチド、分子およびアナログも含まれる。

全長ポリペプチドに加えて、本開示の主題はまた、本開示の主題のポリペプチドまたはペプチドドメインのいずれか１つの断片を提供する。断片は、少なくとも約５、約１０、約１３または約１５個のアミノ酸であり得る。一部の実施形態では、断片は、少なくとも約２０個の連続アミノ酸、少なくとも約３０個の連続アミノ酸または少なくとも約５０個の連続アミノ酸である。一部の実施形態では、断片は、少なくとも約６０～約８０、約１００、約２００、約３００またはそれより多い連続アミノ酸である。本開示の主題の断片は、当業者に公知の方法によって生成できる、または正常タンパク質プロセシング（例えば、生物活性にとって必要ではない新生ポリペプチドからのアミノ酸の除去または選択的ｍＲＮＡスプライシングもしくは選択的タンパク質プロセシング事象によるアミノ酸の除去）に起因し得る。

非タンパク質アナログは、本発明のタンパク質の機能活性を模倣するように設計された化学構造を有する。このようなアナログは、本開示の主題の方法に従って投与される。このようなアナログは、元のポリペプチドの生理学的活性を超える場合がある。アナログ設計の方法は、当技術分野で周知であり、アナログの合成は、化学構造を改変することによってこのような方法に従って実施でき、その結果、得られたアナログは、免疫応答性細胞において発現されると元のポリペプチドの抗新生物活性を増加させる。これらの化学的改変として、それだけには限らないが、代替Ｒ基を置換することおよび参照ポリペプチドの特定の炭素原子で飽和度を変えることが挙げられる。タンパク質アナログは、ｉｎｖｉｖｏ分解に対して比較的耐性であり得、投与の際により長期の治療効果をもたらす。機能活性を測定するアッセイとして、それだけには限らないが、以下の実施例において記載されるものが挙げられる。

本開示の主題に従って、シアリルルイスＡ（例えば、ヒトシアリルルイスＡ）（例えば、ｓｃＦｖ（例えば、ヒトｓｃＦｖ）、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）_２）、ＣＤ３ζ、ＣＤ８、ＣＤ２８）に特異的に結合する細胞外抗原結合性ドメインをコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化によって改変され得る。コドン最適化により天然に存在するおよび組換え遺伝子配列の両方を変更して、任意の所与の発現系において考えられる最高レベルの生産性を達成することができる。タンパク質発現の異なる段階に関与する因子として、転写および翻訳におけるコドン適応性、ｍＲＮＡ構造ならびに種々のシスエレメントが挙げられる。本開示の主題のポリヌクレオチドを改変するために、それだけには限らないが、ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）、Ｅｎｃｏｒ最適化およびＢｌｕｅＨｅｒｏｎを含む当業者に公知である任意の適したコドン最適化法または技術が使用され得る。

ＩＸ．投与
本開示の主題のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲおよびそれを含む免疫応答性細胞は、新生物の処置または防止のために全身的に、または直接的に対象に提供されてもよい。ある特定の実施形態では、シアリルルイスＡ標的化ＣＡＲおよびそれを含む免疫応答性細胞は、目的の臓器（例えば、新生物に冒された臓器）中に直接的に注射される。あるいはまたはさらに、シアリルルイスＡ標的化ＣＡＲおよびそれを含む免疫応答性細胞は、例えば、循環系（例えば、腫瘍脈管構造）への投与によって目的の臓器に間接的に提供される。ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏでのＴ細胞の生成を増加させるために、細胞および組成物の投与の前、その間またはその後に、増大および分化剤（expansion and differentiation agent）が提供され得る。

本開示の主題のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲおよびそれを含む免疫応答性細胞は、任意の生理学的に許容されるビヒクル中で、普通、血管内に投与され得るが、それらはまた、骨または細胞が再生および分化に適当な部位を見出し得る他の好都合な部位（例えば、胸腺）に導入されてもよい。ある特定の実施形態では、少なくとも１×１０^５個の細胞が投与されてもよく、最終的に１×ｌ０^１０個またはそれより多くの細胞に達する。ある特定の実施形態では、少なくとも１×１０^６個の細胞が投与され得る。本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを含む免疫応答性細胞を含む細胞集団は、細胞の精製された集団を含み得る。当業者ならば、種々の周知の方法、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して細胞集団中の免疫応答性細胞のパーセンテージを容易に決定できる。本開示の抗シアリルルイスＡ特異的ＣＡＲを含む免疫応答性細胞を含む細胞集団における純度の範囲は、約５０％～約５５％、約５５％～約６０％、約６５％～約７０％、約７０％～約７５％、約７５％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％または約９５～約１００％であり得る。投与量は、当業者によって容易に調整され得る（例えば、純度の低下は、投与量の増加を必要とし得る）。免疫応答性細胞は、注射、カテーテルなどによって導入され得る。必要な場合には、それだけには限らないが、インターロイキン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ６、ＩＬ－１１、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１ならびに他のインターロイキン、コロニー刺激因子、例えば、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦおよびＧＭ－ＣＳＦ、インターフェロン、例えばγ－インターフェロンを含む因子もまた含まれ得る。

ある特定の実施形態では、本開示の主題の組成物は、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを含む免疫応答性細胞を含む医薬組成物および薬学的に許容される担体を含む。投与は、自己または非自己であり得る。例えば、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを含む免疫応答性細胞およびそれを含む組成物を、ある対象から得、同一対象または異なる、適合する対象に投与することができる。本開示の主題の末梢血由来Ｔ細胞またはその後代（例えば、ｉｎｖｉｖｏ、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏ由来）は、カテーテル投与を含む局所注射、全身注射、局所注射、静脈内注射または非経口投与によって投与され得る。本開示の主題の医薬組成物（例えば、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを含む免疫応答性細胞を含む医薬組成物）を投与する場合、注射用単位剤形（液剤、懸濁剤、乳剤）に製剤化されてもよい。

ある特定の実施形態では、本開示の主題の組成物は、１種または複数種の抗原結合性タンパク質、例えば、本明細書において開示される抗シアリルルイスＡ抗体またはその抗原結合性断片および薬学的に許容される担体を含み得る。

ＸＩ．製剤
本開示の主題の本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを含む免疫応答性細胞およびそれを含む組成物は、選択されたｐＨに緩衝され得る、滅菌液体調製物、例えば、等張性水性液剤、懸濁剤、乳剤、分散液剤または粘稠性組成物として好都合に提供され得る。液体調製物は、普通、ゲル剤、他の粘稠性組成物および固体組成物よりも調製するのが容易である。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するのに幾分かより好都合である。他方、粘稠性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために適当な粘度範囲内で製剤化され得る。液体または粘稠性組成物は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）および適したそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る担体を含み得る。

滅菌注射用液剤は、本開示の主題の組成物、例えば、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞を含む組成物を、必要な量の適当な溶媒に要求のとおりに種々の量の他の成分とともに組み込むことによって調製され得る。このような組成物は、適した担体、希釈剤または賦形剤、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどとの混合物であり得る。組成物はまた、凍結乾燥されてもよい。組成物は、投与経路および所望の調製物に応じて、補助物質、例えば、湿潤剤、分散剤または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化もしくは粘稠性増強添加物、保存料、香味剤、着色剤などを含有し得る。過度の実験を行うことなく適した調製物を調製するために、標準教本、例えば、参照により本明細書に組み込まれる"REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985が参考にされ得る。

抗菌保存料、抗酸化物質、キレート化剤およびバッファーを含む、組成物の安定性および無菌性を増強する種々の添加物が添加されてもよい。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって保証され得る。注射用医薬品形態の長期吸収が、吸収を遅延する剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム（alum inurn monostearate）およびゼラチンの使用によってもたらされ得る。しかし、本開示の主題に従って、使用される任意のビヒクル、希釈剤または添加物は、一般に本開示の主題のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞と適合性でなくてはならない。

組成物は、等張性であり得る、すなわち、血液および涙液と同じ浸透圧を有し得る。本開示の主題の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウムまたは他の薬学的に許容される剤、例えば、デキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機もしくは有機溶質を使用して達成され得る。ナトリウムイオンを含有するバッファーについては塩化ナトリウムが特に好ましい。

組成物の粘稠性は、必要な場合には、薬学的に許容される増粘剤を使用して選択されたレベルで維持され得る。メチルセルロースは、容易でかつ経済的に利用可能であり、それを使って作業するのが容易であるので、それを使用することができる。他の適した増粘剤として、例えば、キサンタンゴム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の濃度は、選択された剤に応じて変わり得る。重要な点は、選択された粘稠性を達成する量を使用することである。適した担体および他の添加物の選択は正確な投与経路および特定の剤形、例えば、液体剤形の性質（例えば、組成物が液剤、懸濁剤、ゲル剤または別の液体形態、例えば、持続放出形態または液体充填形態に製剤化されるかどうか）に応じて変わるということは明らかである。

本開示の主題において記載されるように、組成物の構成成分は、化学的に不活性であって、免疫応答性細胞の生存力または有効性に影響を及ぼさないように選択されるべきであることは当業者ならば認識する。化学および薬学の原理に精通したものにとってこれは問題ではなく、または問題は、本開示および本明細書に引用される文書から、標準教本を参照することによって、もしくは簡単な実験によって（過度の実験を含まない）容易に避けることができる。

本開示の主題の免疫応答性細胞の治療的使用に関する１つの考慮事項は、最適効果を達成するために必要な細胞の量である。投与されるべき細胞の量は、処置されている対象によって変わる。ある特定の実施形態では、本開示の主題の約１０^４～約１０^１０、約１０^５～約１０^９または約１０^６～約１０^８個の免疫応答性細胞が、対象に投与される。より有効な細胞は、さらに少ない数で投与されてもよい。一部の実施形態では、少なくとも約１×１０^８、約２×１０^８、約３×１０^８、約４×１０^８および約５×１０^８個の本開示の主題の免疫応答性細胞が、ヒト対象に投与される。有効用量と考えられるものの正確な決定は、特定の対象のサイズ、年齢、性別、体重および状態を含む各対象に個別の因子に基づいたものであり得る。投与量は、本開示および当技術分野における知識から当業者によって容易に確認され得る。

当業者ならば、組成物中の、本開示の主題の方法において投与されるべき細胞の量および最適添加物、ビヒクルおよび／または担体を容易に決定できる。通常、任意の添加物（活性細胞（複数可）および／または剤（複数可）に加えて）が、リン酸緩衝食塩水中の液剤に約０．００１重量％～約５０重量％）の量で存在し、有効成分は、マイクログラム～ミリグラムのオーダー、例えば、約０．０００１重量％～約５重量％、約０．０００１重量％～約１重量％、約０．０００１重量％～約０．０５重量％、約０．００１重量％～約２０重量％、約０．０１重量％～約１０重量％または約０．０５重量％～約５重量％で存在する。動物またはヒトに投与されるべき任意の組成物について、投与の任意の特定の方法について、毒性は、適した動物モデル、例えば、げっ歯類、例えば、マウスにおける致死用量（ＬＤ）およびＬＤ５０、適した応答を誘発する、組成物（複数可）の投与量、その中の構成成分の濃度および組成物（複数可）を投与するタイミングを決定することなどによって決定されるべきである。このような決定は、当業者の知識、本開示および本明細書において引用される文書から過度の実験を必要としない。また、逐次投与の時間は過度の実験を行わずに確認できる。

ＸＩＩ．処置の方法
対象において悪性成長を処置する方法が本明細書において提供される。方法は、本明細書において記載される１つまたは複数のＣＡＲを含む本開示の細胞を、既存の状態の緩和または再発の防止である所望の効果を達成するのに有効な量で投与することを含む。処置のために、投与される量は、所望の効果をもたらすのに有効な量である。有効量は、１回または一連の投与で提供されてもよい。有効量は、ボーラスで、または連続灌流によって提供されてもよい。

抗原特異的Ｔ細胞を使用する養子免疫療法については、約１０^６～約１０^１０個（例えば、約１０^９または約１０^６個）の範囲の細胞用量が、通常注入される。対象への免疫応答性細胞の投与およびその後の分化の際に、１つの特異的抗原（例えば、シアリルルイスＡ）に対して特異的に向けられた免疫応答性細胞が誘導される。Ｔ細胞の「誘導」は、欠失またはアネルギーなどによる抗原特異的Ｔ細胞の不活性化を含み得る。不活性化は、自己免疫障害などにおいて耐容性（tolerance）を確立または再確立するために特に有用である。本開示の主題の免疫応答性細胞は、それだけには限らないが、胸膜投与、静脈内投与、皮下投与、結節内投与、腫瘍内投与、髄腔内投与、胸膜内投与、腹腔内投与および胸腺への直接投与を含む当技術分野で公知の任意の方法によって投与され得る。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞およびそれを含む組成物は、必要とする対象に静脈内に投与される。

本開示の主題は、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを含む免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）を使用する種々の方法を提供する。例えば、本開示の主題は、対象において腫瘍負荷を低減する方法を提供する。ある特定の限定されない例では、腫瘍負荷を低減する方法は、有効量の本開示の免疫応答性細胞を対象に投与することを含む。本開示の免疫応答性細胞は、腫瘍細胞の数を低減、腫瘍サイズを低減および／または対象において腫瘍を根絶できる。

本開示の主題はまた、新生物を有する対象の生存を増加させるまたは延長する方法も提供する。ある特定の限定されない例では、新生物を有する対象の生存を増加させるまたは延長する方法は、有効量の本開示の免疫応答性細胞を対象に投与することを含む。方法は、対象において腫瘍負荷を低減または根絶できる。

本開示の主題は、対象において新生物を処置および／または防止する方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、方法は、有効量の本開示の免疫応答性細胞を対象に投与することを含む。

本開示の主題の免疫応答性細胞を使用して成長が阻害され得るがんは、免疫療法に対して通常応答性であるがんを含む。処置のための新生物、がんおよび／または腫瘍の限定されない例として膵臓がんが挙げられる。

さらに、本開示の主題は、対象におけるがん細胞に応じて免疫活性化サイトカイン生成を増加させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、本開示の免疫応答性細胞を対象に投与することを含む。免疫活性化サイトカインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、インターフェロン調節因子７（ＩＲＦ７）およびそれらの組合せであり得る。ある特定の実施形態では、本開示の主題のシアリルルイスＡ特異的ＣＡＲを含む免疫応答性細胞は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γおよび／またはＴＮＦ－αの生成を増加させる。

療法のための適したヒト対象は、通常、臨床基準によって区別され得る２つの処置群を含む。「進行した疾患」または「高い腫瘍負荷」を有する対象は、臨床的に測定可能な腫瘍を有するものである。臨床的に測定可能な腫瘍は、腫瘍量に基づいて検出され得るものである（例えば、触診、ＣＡＴスキャン、超音波画像、マンモグラムまたはＸ線によって；陽性の生化学的または病理組織学的マーカーはそれ自体では、この集団を同定するには不十分である）。本開示の主題において具体化される医薬組成物は、その状態を緩和する目的で抗腫瘍応答を誘発するためにこれらの対象に投与される。理想的には、腫瘍量の低減が結果として生じるが、任意の臨床的改善は利益を構成する。臨床的改善は、リスクもしくは進行速度の減少または腫瘍の病理学的帰結の低減を含む。

適した対象の第２の群は、「アジュバント群」として当技術分野で公知である。これらは、新生物の病歴を有していたが、別の治療様式に対して応答性であった個体である。前の療法は、外科的切除、放射線療法および従来の化学療法を含み得るが、それに制限されていない。結果として、これらの個体は、臨床的に測定可能ではない腫瘍を有する。しかし、それらは、元の腫瘍部位付近のまたは転移による疾患の進行のリスクにあると疑われる。この群は、ハイリスクおよびローリスク個体にさらに細分され得る。細分は、最初の処置の前または後に観察される特徴に基づいて行われる。これらの特徴は、臨床の技術分野では公知であり、異なる新生物各々について適宜定義されている。ハイリスクサブグループに特有の特徴として、腫瘍が隣接組織に浸潤したものまたはリンパ節の関与を示すものがある。別の群は、新生物に対する遺伝的素因を有するが、新生物の臨床的徴候をまだ証明していない。例えば、乳がんと関連する遺伝子変異について検査で陽性であるが、まだ妊娠可能年齢の女性は、予防的手術を実施するのに適するまで、新生物の出現を予防的に防ぐ処置において本明細書において記載される抗原結合性断片のうち１つまたは複数の投与を希望できる。

対象は、進行形態の疾患を有する場合があり、この場合には、処置目的は、疾患進行の軽減または逆転および／または副作用の寛解を含み得る。対象は、すでに処置されている状態の病歴を有する場合があり、この場合には、治療目的は、通常、再発のリスクの減少または遅延を含むこととなる。

免疫学的合併症（「悪性Ｔ細胞形質転換」として知られる）、例えば、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを防ぐか、もしくは最小化するために、または健常組織が、腫瘍細胞と同一の標的抗原を発現し、ＧｖＨＤと同様のアウトカムにつながる場合には、シアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを発現する免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）にさらなる改変が導入されてもよい。この問題に対する潜在的な解決策は、シアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを発現するＴ細胞に自殺遺伝子を操作して入れることである。適した自殺遺伝子として、それだけには限らないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｓｖ－ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９自殺遺伝子（ｉＣａｓｐ－９）および切断型ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）ポリペプチドが挙げられる。ある特定の実施形態では、自殺遺伝子は、ＥＧＦＲｔポリペプチドである。ＥＧＦＲｔポリペプチドは、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（例えば、セツキシマブ）を投与することによってＴ細胞排除を可能にできる。ＥＧＦＲｔは、シアリルルイスＡ標的化ＣＡＲの細胞内ドメインの３’末端に共有結合によって繋がれ得る。自殺遺伝子は、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲをコードする核酸を含むベクター内に含まれ得る。このようにして、悪性Ｔ細胞形質転換（例えば、ＧＶＨＤ）の際の自殺遺伝子を活性化するように設計されたプロドラッグ（例えば、プロドラッグ（例えば、ｉＣａｓｐ－９を活性化できるＡＰ１９０３）の投与は、自殺遺伝子によって活性化されるＣＡＲを発現するＴ細胞においてアポトーシスを引き起こす。本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲ中に自殺遺伝子を組み込むことは、極めて短い期間内にＣＡＲＴ細胞の大部分を排除する能力を備えた付加されたレベルの安全性を与える。自殺遺伝子を組み込まれた本開示の免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＡＲＴ細胞注入後の所与の時点で先制して排除され得るか、または毒性の最も早い徴候で根絶され得る。

ＸＩＩＩ．キット
本開示の主題は、新生物の処置または防止のためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、単位剤形中に、本開示のシアリルルイスＡ標的化ＣＡＲを含む免疫応答性細胞の有効量を含む治療用または予防用組成物を含む。特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの共刺激リガンドをさらに発現する。一部の実施形態では、キットは、治療用または予防用ワクチンを含有する滅菌容器を含み、このような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパックまたは当技術分野で公知の他の適した容器形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔または医薬を保持するのに適した他の材料で作製され得る。

必要な場合には、免疫応答性細胞は、新生物の発生を有するか、またはそのリスクにある対象に細胞を投与するための指示と一緒に提供され得る。指示は、一般に、新生物の処置および／または防止のための組成物の使用に関する情報を含む。他の実施形態では、指示は、以下のうち少なくとも１つを含む：治療剤の説明、新生物またはその症状の処置または防止のための投与量スケジュールおよび投与、警告、適応症、禁忌、過量投与情報、有害反応、動物薬理学、臨床研究および／または参考文献。指示は、容器に直接印刷されている場合もあり（存在する場合には）、容器につけられたラベルとして、または容器中にもしくは容器とともに供給された別個のシート、パンフレット、カードもしくはホルダーとして印刷される場合もある。

本発明の実践は、別段の指示がない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を用い、これらは十分に当業者の範囲内である。そのような技法は、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989)、"Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984)、"Animal Cell Culture" (Freshney, 1987)、"Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996)、"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)、"Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987)、"PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994)、"Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)等の文献において完全に説明されている。これらの技法は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に適用可能であり、したがって、本発明を実施および実践する際に考慮されてもよい。特定の実施形態に特に有用な技法は続く節において考察される。

以下の実施例は、当業者に本発明の組成物、ならびにアッセイ、スクリーニングおよび治療方法を作製および使用する方法に関する完全な開示および説明を提供するために記載され、本発明者らが本発明と考えるものの範囲を限定することを意図するものではない。

（実施例１）
序論
抗原提示を改善する戦略は、エピトープ拡大を誘導するか、または現存の抗腫瘍Ｔ細胞応答が腫瘍抗原逃避と戦う見込みを保持することを永続させる。例えば、がんワクチンおよび「免疫原性」放射線（ＲＴ）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化させて、内因性Ｔ細胞への腫瘍新抗原表示を改善する（Spiotto et al., Sci Immunol (2016); 1）。しかしながら、それでもなお、完全奏効を得るためには、同じ新抗原がすべてではないにせよ大半の腫瘍細胞において発現し、提示されなければならない。遺伝子変異量と相関する既存の腫瘍反応性Ｔ細胞を有する患者では、免疫チェックポイント阻害剤はＴ細胞疲弊を軽減し、持続した応答を実現することができる。しかしながら、チェックポイント阻害は、ＣＡＲがＣＡＲ標的を欠いている腫瘍細胞に対する応答を導くことができないのと同様に、認識された抗原を提示しない腫瘍細胞に対するＴ細胞応答を回復することができない。

増加したＡＰＣ活性化、改善したＴ細胞浸潤、および腫瘍における増強したＨＬＡまたはＣＡＲ標的発現によって媒介される、電離放射線への曝露後に生じ得る改善した腫瘍認識（Spiotto et al., Sci Immunol (2016); 1、Weiss et al., Cancer Res (2018); 78:1031-1043）は、抗原消失に起因する抗原逃避という同じ課題に直面している。しかしながら、低線量照射に曝露された腫瘍は、ＣＡＲ標的を欠く腫瘍細胞を含め、ＣＡＲＴ細胞活性に対してより感受性が鋭くなることが見出された。この機構を理解することは固形腫瘍抗原逃避を克服することにおいて特に価値がある。

ＣＡＲＴ細胞媒介排除に対する腫瘍感受性が放射線前処置によって増強し、これを活用してＣＡＲＴ細胞の適用範囲を標的とした抗原以外にも拡大するこの代替機序を特徴付けた。膵臓がんは、改善がほとんどない予後不良を過去数十年にわたって伴い続け、一様に発現する治療標的抗原を確立しておらず、罹患率が増加している。部分的に抗原陰性である同所膵臓がんモデルにおいて、低線量放射線とＣＡＲ療法とを組み合わせることによってクローン抗原不均一性の課題に取り組む新規手段を実現した。

結果
シアリルルイスＡ（Ｌｅ^Ａ）特異的ＣＡＲＴ細胞はｉｎｖｉｔｒｏにおいて膵臓腫瘍細胞に対して活性である
１００％の腫瘍細胞に発現し、重要な正常組織には発現しない固形腫瘍標的を同定することは困難である。膵臓がんはこの問題の好例であり、いくつかの魅力的な標的を有するが、そのうちすべての腫瘍細胞に明確に発現するものは１つもない（Zhao et al., Cancer Cell (2015); 28:415-428）。７５～９０％の膵臓腫瘍に発現し（Viola-Villegas et al., J Nucl Med (2013); 54:1876-1882）、正常ヒト組織では低発現（Viola-Villegas et al., J Nucl Med (2013); 54:1876-1882）の表面抗原であるシアリルルイスＡ（Ｌｅ^Ａ）は、臨床試験における有効な抗体標的である（ＮＣＴ０３１１８３４９、ＮＣＴ０２６７２９１７、ＮＣＴ０２６８７２３０）。Ｌｅ^Ａを標的とするヒトモノクローナル５Ｂ１抗体は、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおける膵臓がんに対する特異性（Viola-Villegas et al., J Nucl Med (2013); 54:1876-1882）、ならびに生物学的活性用量での膵臓がん患者における安全性および忍容性（O'Reilly et al., Journal of Clinical Oncology (2017); 35:4110-4110）を実証している。したがって、このＬｅ^Ａ特異的ｓｃＦｖを使用して進行膵管腺癌（ＡＰＤＡＣ）標的ＣＡＲを構築した。Ｌｅ^Ａ特異的ＬＢＢｚＣＡＲは、Ｌｅ^Ａを発現する複数の膵臓がん腫瘍系に対する効果的な細胞傷害性を示したが、Ｌｅ^Ａ陰性ＰＣ３前立腺がん細胞に対しては示さなかった（図６Ａ～６Ｃ）。Ｃａｐａｎ２ＰＤＡＣは中間レベルのＬｅ^Ａを発現し（図６Ａ～６Ｃ）、さらなる実験のために選択された。

低線量放射線は標的抗原発現を誘導することなく腫瘍細胞をＣＡＲＴ細胞による殺滅に対して感受性にする
放射線療法（ＲＴ）はＬｅＡ発現を誘導し、異種標的抗原発現を有する腫瘍を排除するＣＡＲＴ細胞の能力を改善し得るという最初の仮説を試験するために、腫瘍細胞に２ＧｙＲＴを照射し、２日後、残っている生存細胞に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイおよび表面標的抗原発現のＦＡＣＳ解析を実施した。より高いＲＴ線量は、少ないが有意な腫瘍細胞死を誘導したが、２Ｇｙは腫瘍生存率において検出可能な差を生じなかったために、２Ｇｙを選択した（図１Ａ）。２Ｇｙ（以降「低線量ＲＴ」と称す）は、あらゆるエフェクター：標的比においてＣＡＲＴ細胞殺滅に対する腫瘍細胞の感受性を増加させるが（図１Ｂ）、驚くべきことに標的抗原発現を増加させない（図１Ｃ）ことが見出された。

低線量放射線はＴＲＡＩＬ媒介死に対する感受性と関連する遺伝子セットに影響を及ぼす
低線量ＲＴが腫瘍細胞をＣＡＲＴ細胞による殺滅に対して感受性にする潜在的な機構に対する洞察を得るために、ＲＮＡｓｅｑ解析を低線量ＲＴの前後に腫瘍細胞に対して実施した。ＲＴ自体は致死量以下であったが、遺伝子セット解析は多くのアポトーシス経路が低線量ＲＴによって有意に影響を受けることを明らかにした（図１Ｄ）。特に、ＴＲＡＩＬ媒介死に対して感受性である腫瘍細胞とそうでない腫瘍細胞とを識別する遺伝子セット（Hamai et al., Oncogene (2006); 25:7618-7634）^１は最も低い偽発見率を有することが明らかとなった（それぞれに関してＦＤＲ＜０．００００００１；４９２の陽性経路メンバーのうち４２９が誘導され、１２８の陰性経路メンバーのうち１１４が下方調節された）（図１Ｄ）。

ＣＡＲＴ細胞は標的抗原遭遇の際にＴＲＡＩＬを産生する
ＴＲＡＩＬとは、２つの異なる受容体、および感受性に影響を与えるいくつかの下流シグナル伝達分子を介して死を誘導する三量体タンパク質であり、腫瘍細胞は一般に正常細胞よりもＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して感受性であるが、様々な程度がある（Walczak et al., Nat Med (1999); 5:157-163）。遺伝子セット解析は低線量ＲＴが腫瘍細胞をＴＲＡＩＬ媒介死に対して転写プライミングし得ることを示唆したが、これは死リガンドが局所的に十分なレベルで存在した場合にのみ関連するものであった。ＬｅＡ特異的ＣＡＲＴ細胞からのＴＲＡＩＬ産生を解析し、ＣＡＲＴ細胞はベースラインでは低レベルのＴＲＡＩＬを産生するが、標的抗原遭遇の際ではＴＲＡＩＬｍＲＮＡおよびタンパク質を有意に誘導することが見出された（図１Ｅ）。対照的に、シグナル伝達ドメインを欠く切断型ＣＡＲ（Ｌｄｅｌ）を発現するＴ細胞による腫瘍認識後にＴＲＡＩＬは誘導されず、ＣＡＲシグナル伝達へのＴＲＡＩＬ誘導の依存性が確立された（図１Ｆ）。

低線量ＲＴに曝露された抗原陰性腫瘍細胞はＣＡＲＴ細胞ＴＲＡＩＬ媒介死を受け易い
低線量ＲＴに曝露された抗原陰性腫瘍に関する、活性化ＣＡＲＴ細胞によって産生されたＴＲＡＩＬの機能的有意性を試験するために、腫瘍細胞を抗原陽性（Ａｇ^＋）および抗原陰性（Ａｇ^－）集団にＦＡＣＳ選別した。Ａｇ^－細胞にホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を形質導入し、Ａｇ^－細胞は経時的に安定に抗原陰性のままであった（図７）。７５％のＡｇ^＋腫瘍細胞と２５％のＡｇ^－Ｌｕｃ^＋腫瘍細胞とを混合し、低線量ＲＴに曝露させるかまたはＲＴに曝露させず、ＴＲＡＩＬをＣＲＩＳＰＲによって破壊したＣＡＲＴ細胞とともにインキュベートした（図２Ａ～２Ｂおよび図７）。ＴＲＡＩＬ^ｗｔまたはノックアウトＣＡＲＴ細胞を、ＴＲＡＩＬ産生を誘導する３日前に静止するかまたは標的抗原によって刺激した。Ｌｕｃ活性を使用してＡｇ^－細胞殺滅をモニタリングし、ＲＴ曝露腫瘍細胞に関して予備刺激したｗｔＣＡＲＴ細胞が最大規模のＡｇ^－腫瘍細胞死を生じ、このＡｇ^－腫瘍細胞死がＣＡＲＴ細胞におけるＴＲＡＩＬの非存在または腫瘍に対する増感ＲＴの非存在によって有意に減少することが見出された（図２Ｂ）。標的細胞を認識するがＴＲＡＩＬを誘導しないＬ（ｄｅｌ）ＣＡＲＴ細胞は、ＴＲＡＩＬを構成的に発現させた場合、有意により多くのＲＴ増感Ａｇ^－腫瘍細胞を死滅させた（図２Ｃ）。

ＴＲＡＩＬは、腫瘍細胞とＴ細胞の両方のアポトーシスおよびネクロプトーシスを含むいくつかの文脈依存効果、または腫瘍細胞ＮＦｋＢ活性化を介した骨髄由来抑制細胞動員（Hartwig et al., Mol Cell (2017); 65:730-742 e735）もしくは腫瘍内のＲａｃ１およびＡｋｔ活性化を介した生存、侵襲および転移（von Karstedt et al., Cancer Cell (2015); 27:561-573）を含む腫瘍促進効果を発揮する。ＲＴ増感腫瘍がＣＡＲＴ細胞によって提供される増加したＴＲＡＩＬ刺激にどのように応答し得るかをより良好に理解するために、様々な下流ＴＲＡＩＬシグナル伝達経路の公知のメディエーターを調査した。多くの経路メディエーターは、転写、切断、リン酸化、ユビキチン化または他の事象を介して調節されるが、遺伝子発現解析は全体的な経路活性化状態に関する全般的な情報を提供することができる。とりわけ、増感ＲＴの前後のＲＮＡｓｅｑデータからの遺伝子発現変化は、ＴＲＡＩＬの下流の腫瘍促進メディエーターと抗腫瘍メディエーターの両方の大多数の個々のメンバーが増感ＲＴによって有意に変更されることを明らかにした（図３Ａ；赤色または緑色は有意な変化を表し、灰色は有意ではない変化を表す）。生存促進、遊走、転移および腫瘍支持炎症ＴＲＡＩＬ経路メンバーはほとんど一様に下方調節されたが、アポトーシス促進分子は圧倒的に誘導され、増感ＲＴにより腫瘍細胞がＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスを引き起こしやすくなり得ることを示唆した（図３Ａおよび図９）。アポトーシスおよびネクロプトーシスレベルは細胞膜におけるホスファチジルセリン（ＰＳ）発現によってモニタリングすることができるため、蛍光アネキシンＶ抗体を含有する培養物の生ビデオ顕微鏡検査を使用して、ＣＡＲＴ細胞によって産生されたＴＲＡＩＬがＡｇ^－細胞において検出可能な膜ＰＳ変化を経時的に誘導するかどうかを試験した。ＲＴ増感Ａｇ^－腫瘍細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識した後に非標識Ａｇ^＋腫瘍細胞、およびＴＲＡＩＬ^ｗｔまたはＴＲＡＩＬ^－／－ＣＡＲＴ細胞と混合した。アポトーシスを受けるＡｇ^－腫瘍細胞の自動定量は、ＴＲＡＩＬ^－／－ＣＡＲＴ細胞はＡｇ^－腫瘍アポトーシスを経時的に誘導することができないが、ＴＲＡＩＬ^ｗｔＣＡＲＴ細胞は一定かつ有意なＡｇ^－腫瘍細胞アポトーシスをもたらすことを実証した（ｐ＜０．０００１、図３Ｂ）。

耐性Ａｇ^－集団を含有する膵臓腫瘍はｉｎｖｉｖｏにおいて、増感ＲＴ後、ＣＡＲＴ細胞によって排除することができる
次に、標的抗原を部分的に欠いている異種固形腫瘍の困難だが一般的な臨床シナリオのためにマウスモデルを確立した。２５％Ａｇ^－細胞からなるＰＤＡＣをマウス膵臓において定着させ、９日後にＣＡＲＴ細胞を用いて処置した（図４Ａ）。Ａｇ^＋同所ＰＤＡＣを一貫して排除したＣＡＲＴ細胞はいかなる異種腫瘍も完全には排除することができなかった（図４Ｂ～４Ｅ）。次に、増感ＲＴがｉｎｖｉｖｏにおいてＣＡＲＴ細胞を用いて処置した異種腫瘍に対する何らかの有意義な利益をもたらしたかどうかを試験した。増感ＲＴとその後のＣＡＲＴ細胞とを用いて処置した、定着した異種ＰＤＡＣを有するマウスは、イメージング、剖検検査および病理学によってより多くのＣＲおよびＰＲを達成した（図４Ｂおよび４Ｆ）。ＣＡＲ非依存性Ｔ細胞殺滅の主要な公知の機構はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介し、ＲＴは標的細胞にＨＬＡ発現を誘導することができるため、ＴＣＲ依存性腫瘍殺滅が増感ＲＴ後に有意な役割を果たすかどうかを試験した。ＴＣＲを欠く（ＴＣＲ^－／－）ＣＡＲＴ細胞（図１０）は、ＲＴ増感異種腫瘍を排除する能力を維持した（図４Ｇ）。ＲＴは最初に、初めの２週間にわたって腫瘍内に中程度に増加したＴ細胞蓄積をもたらした（図４Ｉ～４Ｋ）。有意な腫瘍流入（図１１）にもかかわらず、ＴＲＡＩＬ^－／－ＣＡＲＴ細胞はＲＴ増感腫瘍保有マウスにおいて完全奏効を一貫して達成することができず、これは死亡（ＧＶＨＤまたは腫瘍進行のいずれかから生じた）時の応答のウォーターフォールプロット（図４Ｂ）と毎週の生物発光イメージング（図４Ｈ）の両方によって実証された。再発／進行した腫瘍を有するマウスは、ＦＡＣＳによって評価されるように血液、脾臓および腫瘍にＣＡＲＴ細胞を依然として所有し、ＩＨＣによって腫瘍に侵入する有意なＴ細胞を呈したが、Ａｇ^－腫瘍細胞という副産物を実証した（図４Ｌおよび図１２Ａ～１２Ｂ）。

ＴＲＡＩＬの効果とＣＡＲの効果とを切り離すために、ＲＴ増感マウスを、腫瘍と結合するが認識の際にＣＡＲ細胞傷害性もＴＲＡＩＬも誘導しないＬ（ｄｅｌ）ＣＡＲＴ細胞、および腫瘍と結合しＴＲＡＩＬを構成的に発現するがＣＡＲ媒介細胞傷害性を発揮しないＬ（ｄｅｌ）－ＴＲＡＩＬＣＡＲＴ細胞を用いて処置した。第１の戦略は局所的なＴ細胞蓄積にもかかわらず応答を生じなかったが（図４Ｍ）、外部ＣＡＲドメインを使用して構成的ＴＲＡＩＬ発現Ｔ細胞を腫瘍にターゲティングすることは奏効率を適度に増加させた（図４Ｍ）。

局所的ＲＴはその後のＣＡＲＴ細胞投与のために腫瘍を効果的に前処置する
全身ＲＴがＣＡＲＴ細胞による増感に必要とされるかどうか、または腫瘍に対する局所ＲＴが十分であるかどうかを決定するために、同所ＰＤＡＣを所有するマウスを、全身または膵臓腫瘍のみに対するＲＴと、それに続くＣＡＲＴ細胞投与とを用いて処置した（図５Ａ）。総身ＲＴ処置マウスは早期時点においてより多いＴ細胞腫瘍浸潤を有する傾向があったが（図１３）、両方の戦略は類似した腫瘍応答をもたらした（図５Ｂ～５Ｄ）。したがって、全身低線量ＲＴと局所低線量ＲＴの間の潜在的に異なる宿主効果にもかかわらず、いずれのアプローチも異種腫瘍をＣＡＲＴ細胞による殺滅に対して効果的に感受性にする。

異種腫瘍を有する患者におけるＲＴおよびＣＡＲＴ細胞処置：症例報告
ＲＴをＣＡＲＴ細胞と組み合わせる経験は限定されている。ＴＲＡＩＬ媒介殺滅のためにＲＴによって転写プライミングした腫瘍細胞が細胞培養およびマウス研究においてＣＡＲＴ細胞に応答した有意により多くの死を呈したのと同様に、類似した増感がＲＴ後の近傍の抗原陰性正常組織細胞において生じ得ることが考えられる。サンプリングした腫瘍塊において大きな割合のＣＤ１９^－腫瘍細胞を保有する難治性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を有する患者（図５Ｅ～５Ｆ）はＣＤ１９ＣＡＲ療法のために来院した（ＮＣＴ０２６３１０４４）。この患者は下腿、特に右側の下腿の皮膚に浸透する痛みを伴う疾患を有していた。緩和的ＲＴを患者の右下肢に与え（４Ｇｙ×５回）、次いで患者は計画通りにＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞を受けた。ＣＡＲＴ細胞療法の数日および数週間後、患者は照射範囲内に傷害性の徴候も症状も呈しなかった。患者は神経学的症状を伴わずにグレード２のＣＲＳを呈した。ＣＡＲＴ細胞の１か月後、患者はＰＥＴ－ＣＴイメージングに基づいて優れた応答を有した（図５Ｇ）。ＣＡＲＴ細胞注入の２か月後、腫瘍は、緩和的ＲＴとその後のＣＡＲＴ細胞とを受けた患部を除いて、以前の場所および新たな場所においてＣＤ１９低／陰性発現を伴ってリバウンドした。処置の１年後の現在、緩和的ＲＴとそれに続くＣＡＲＴ細胞とに供した抗原異種腫瘍の領域はＣＲのままである（図５Ｇ）。

考察
Ｂ細胞悪性腫瘍においてＣＤ１９を標的とする最初の選択は主として、白血病およびリンパ腫におけるＣＤ１９の上昇した比較的同種の発現、ならびに正常組織におけるその発現のＢ細胞系列への制限によって推進された（Brentjens et al., Nat Med (2003); 9:279-286、Maher et al., Nat Biotechnol (2002); 20:70-75）。第Ｉ相ＡＬＬ試験患者中７０～９０％という注目すべき完全寛解率に基づいて（Sadelain, J Clin Invest (2015); 125:3392-3400）、ＣＡＲ療法を幅広い範囲のがんに拡大する見通しが立ちつつある。ＣＡＲ療法は近年やっと固形腫瘍に取り組み始めたが（Zhao et al., Cancer Cell (2015); 28:415-428、Morello et al., Cancer Discov (2016); 6:133-146、Jindal et al., Med Oncol (2018); 35:87）、結果はこれまでのところ控えめであり、大奏効の発生はほとんどない（Louis et al., Blood (2011); 118:6050-6056、Brown et al., N Engl J Med (2016); 375:2561-2569）。抗原陰性腫瘍細胞の逃避および再成長は今では十分に立証されたＣＡＲ療法に耐性の機構であるため（Brown et al., N Engl J Med (2016); 375:2561-2569、Gardner et al., Blood (2016); 127:2406-2410、Jackson and Brentjiens, Cancer Discov (2015); 5:1238-1240）、ＣＡＲＴ細胞が抗原逃避を効果的に防止することを可能にする新規なアプローチが必要である。

ＣＡＲＴ細胞からの抗原逃避を克服する初期のアプローチは、２つの異なる抗原を標的とすることである（Hegde et al., J Clin Invest (2016); 126:3036-3052）。別のアプローチは、ＩＬ－１８等の活性化サイトカインの分泌（Avanzi et al., Cell Rep (2018); 23: 2130-2141）または共刺激リガンドの発現（Zhao et al., Cancer Cell (2015); 28:415-428）を介して内因性Ｔ細胞を動員する「武装化ＣＡＲ」を使用する。その後、ＣＡＲＴ細胞と内因性腫瘍反応性Ｔ細胞の両方を再活性化することを目的として、チェックポイント阻害剤療法がＣＡＲＴ細胞に加えられた（Suarez et al., Oncotarget (2016); 7:34341-34355、Cherkassky et al., J Clin Invest (2016); 126:3130-3144）。しかしながら、これらのアプローチのすべては、ＣＡＲまたはＴＣＲのいずれかによって認識される腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞に依存する。これらのアプローチのいずれも、ＣＡＲ標的と免疫原性ＴＣＲエピトープの両方を欠く腫瘍細胞がＴ細胞によって排除され得る機構を提供しない。

ここで報告されるアプローチは、腫瘍細胞が免疫原性と無関係に従前通りＣＡＲＴ細胞によってトランスに排除される機構を描写する。したがって、このアプローチは、抗原逃避を獲得することと関連し、新抗原提示および認識の確率が低い低変異量（low mutational burden）の腫瘍において特に有益であり得る。

ここで達成される空間的および時間的特異性は、ＣＡＲＴ細胞の生理応答および標的発現と無関係な腫瘍細胞の放射線増感に依拠する。ＴＲＡＩＬが腫瘍遭遇後のＣＡＲＴ細胞において誘導されるという観察は、腫瘍微小環境内における活発かつ最大の産生を確実にする。標的化ＲＴを介してＡｇ^＋およびＡｇ^－腫瘍細胞にＴＲＡＩＬ受容体を誘導できることは、異種腫瘍に対する部位特異的ＣＡＲＴ細胞有効性を増強する絶好の機会を提供する。この相互作用の効果は多数の意義を有する。全身ＲＴと局所的ＲＴの両方が腫瘍をＣＡＲＴ細胞による殺滅に対して感受性にすることが見出された。最も重要なことに、抗原異種膵臓がん（antigen-heterogeneous pancreatic cancer）において、他の場合であればＣＡＲ認識から逃避するＡｇ^－腫瘍細胞がｉｎｖｉｖｏにおいて、低線量ＲＴ後、ＣＡＲＴ細胞によって排除することができることが示された。全身疾患の場合、低線量総身照射は腫瘍細胞を効果的に感受性にする場合があり、より低いＣＡＲＴ細胞用量で排除をもたらし、有効性を高めると同時にサイトカイン放出症候群のリスクを潜在的に低減する。

腫瘍細胞が正常細胞と比較してＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して高度に感受性であるという初期の観察（Walczak et al., Nat Med (1999); 5:157-163）は、組換えＴＲＡＩＬまたはアゴニストＴＲＡＩＬ受容体に基づく療法に対する強い関心を生み出した。残念なことに、この療法は、ＴＲＡＩＬタンパク質の短い半減期（Ichikawa et al., Nat Med (2001); 7: 954-960）、二価抗体の低下したアポトーシス能（Wajant, Cell Death Differ (2015); 22:1727-1741）、全身投与した場合の限定的な局所腫瘍浸透、および腫瘍遺伝子発現変化による下流のアポトーシスに対する耐性（Ichikawa et al., Nat Med (2001); 7: 954-960）を含む複数の制限に直面している。ＴＲＡＩＬの起源としてのＣＡＲＴ細胞は、いくつかの潜在的な利点、例えば腫瘍内での濃縮ＴＲＡＩＬ合成、腫瘍およびＴ細胞が存在する限りでの継続的な産生、ならびに潜在的により低いアポトーシス性の二価抗体ではなく天然の三量体タンパク質の供給（Wajant, Cell Death Differ (2015); 22:1727-1741）を提供する。ＴＲＡＩＬはデスレセプター５を介してＣＡＲＴ細胞に対するアポトーシス促進効果を発揮し得るが（Tschumi et al., J Immunother Cancer (2018); 6:71）、この活性はＣＡＲＴ細胞注入前の放射線前処置によって増加しない。

免疫療法のいくつかの他の形態は、一般的にある特定の状況下でＲＴと組み合わされる。「免疫原性」切除的高線量の放射線は、腫瘍死を誘導し、一部の文脈では、増加した抗原提示、その後のＴ細胞活性化、および潜在的に、非照射腫瘍に対する「アブスコパル」または二次的免疫応答を生じる（Spiotto et al., Sci Immunol (2016); 1）。臨床診療におけるアブスコパル効果の低頻度のために、この現象を予測可能に利用することは依然として調査の活発な領域である。内因性Ｔ細胞と異なり、ＣＡＲＴ細胞は抗原提示に依存せず、放射線が特定のＣＡＲ標的分子の発現を誘導しない限り（Weiss et al., Cancer Res (2018); 78:1031-1043）、放射線がＣＡＲＴ細胞療法に対して免疫原性効果を有するか、免疫抑制効果を有するか、または無関係な効果を有するかは直観的ではない。ＣＡＲＴ細胞療法の文脈において根本的に異なる種類の「免疫原性放射線」を、すなわち、致死量以下の、低線量の放射線が腫瘍をＣＡＲＴ細胞による殺滅に対して局所的にトランスに感受性にする免疫原性放射線を記載した。切除対応物（ablative counterpart）と異なり、増感放射線は、疾患の場所によってもサイズによっても限定されず、またはるかに低い線量を考慮すると、ＲＴ関連副作用に関するより小さい懸念のため、びまん性転移を有する患者のためにより広域に適用され得る。

ＣＡＲＴ細胞療法の前に緩和的（非治癒的）ＲＴを用いて処置した異種腫瘍を有する患者は、過剰な傷害性の徴候を伴わず、マウスデータと一致した結果を呈した。この臨床的相関は動物所見と合致するが、仮説を試験するものではない。特に、患者の異種腫瘍の持続的な完全奏効に対するＲＴ単独の効果は無視することができない。しかしながら、投与した放射線量は、患者の腫瘍をｅｘｖｉｖｏにおいて排除することができず、この種のアグレッシブリンパ腫における肉眼的疾患のための４５Ｇｙ超という標準的な局所治癒的線量の概ね半分と一致した（Ng et al., International journal of radiation oncology, biology, physics (2018); 100:652-669）。さらに、傷害性は下肢のＲＴ範囲に観察されなかったが、ＧＩ系等の他の正常組織が活性化ＣＡＲＴ細胞産生ＴＲＡＩＬに対する高められたＲＴ感受性を呈し得る可能性はある（Finnberg et al., Cancer Res (2016); 76:700-712）。ＲＴをＣＡＲＴ細胞とともに組み込む臨床試験を計画し、クローン抗原不均一性に対する効果、ＲＴ前処置の安全性、および局所ＲＴのＣＡＲＴ細胞媒介疾患応答に対する全身効果を評価する。

ＲＴは現在、約半分の転移性がん患者の処置において緩和のためにある時点で使用され、ほとんどすべての非転移性がんの種類においては局所制御を向上するために外科的処置の代替としてまたはそれに加えて一般的に利用されている（Miller et al., CA Cancer J Clin (2016); 66:271-289）。現在のＲＴレジメンにＣＡＲ療法を実装することは局所および全身腫瘍制御をさらに向上し得る。所見は、これらの２種類の療法の統合された送達が疾患管理チーム間の協調を保証することを示唆する。

所見は、ＲＴ前処置を伴うマルチモダリティＣＡＲ療法が固形腫瘍における応答を改善し得るという考えを支持する。最も重要なことに、操作されたＴ細胞を、クローン的に異種の固形腫瘍を排除するようにさらに増強することができる機構プラットフォームを実現した。

材料および方法
細胞培養
ホタルルシフェラーゼ－ＧＦＰを発現する腫瘍細胞は以前に記載された（Zhao et al., Cancer Cell (2015); 28:415-428）。２９３Ｔ細胞系、Ｈ２９およびレトロウイルスパッケージング細胞系を、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した（Zhao et al., Cancer Cell (2015); 28:415-428）。Ｃａｐａｎ－２細胞はＪａｓｏｎＳ．Ｌｅｗｉｓ（ＭＳＫＣＣ）によって厚意により提供され、これを、１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ中で成長させた。細胞を、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔマイコプラズマ検出キット（Ｌｏｎｚａ）を使用してマイコプラズマに関して試験した後に動物に注射した。

健常なボランティアドナーからのバフィーコートをニューヨーク血液センターから取得した。末梢血単核細胞を密度勾配遠心分離によって単離し、次いで細胞を、ＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いて刺激し、以前に記載されたように培養した（Zhao et al., Cancer Cell (2015); 28:415-428）。

放射線
放射線量：ＰＤＡＣを使用したすべての実験は、別段の指定がない限り２Ｇｙを使用した。ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＲＴ研究に関して、すべてのＲＴ増感実験は、別段の定めのない限り、ＲＴを腫瘍分析またはＴ細胞との共培養の２日前に腫瘍細胞に投与して実施した。

照射方法：膵臓に対する局所ＲＴは、高精度コーンビームＣＴイメージングを全身麻酔下での３Ｄ画像誘導放射線処置と組み合わせるＸ－Ｒａｄ２２５Ｃｘ装置において、腹腔内造影コーンビームＣＴイメージングを使用して膵臓腫瘍を同定することによって実施した。局所ＲＴは、前後ビームまたは前後および左右ビームのいずれかを使用して送達した。より低い標的精度（総身ＲＴ）を必要とする実験は、ＡＰ方向に開放した顎部（open jaw）を備える小動物照射装置を使用して実施した。

フローサイトメトリー
ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ４（Ｓ３．５）、ＣＤ８（３Ｂ５）、ＤＲ５（ＤＪＲ２－４、ＰＥコンジュゲート、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ９５（ＤＸ２、ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬｅＡ（７ＬＥ、ＡＦ４０５コンジュゲート（conjuugated）、Ｎｏｖｕｓ）、ＣＤ１９（ＳＪ２５Ｃ１）、４１ＢＢＬ（５Ｆ４）およびグランザイムＢ（ＦＧＢ１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対する蛍光色素コンジュゲート抗体を使用した。Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）_２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＣＡＲを検出した。フローサイトメトリーをＢＤＬＳＲＩＩにおいて実施し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン９．５．２（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて解析した。ヒトＦｃ受容体結合阻害剤抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＦｃ受容体を遮断した。場合によっては、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を試料に添加して細胞数を計数した。

ＴＲＡＩＬ測定
ＲＮＡおよびＥＬＩＳＡ実験のために、ＣＡＲＴ細胞を、標的抗原を発現するＣａｐａｎ２に４時間曝露させ、続いてＴ細胞の除去および単培養を行い、新しい培地に毎日再播種した。細胞を除去し、所与の時点でＴＲＡＩＬｍＲＮＡ発現に関して分析し、培地を毎日の終わりにＴＲＡＩＬＥＬＩＳＡ（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅＭＢＳ３３５４９１）のために収集した。ｑＰＣＲを、プライマーＨｓ００９２１９７４（ＴＲＡＩＬ）、Ｈｓ００３６６２７８（ＤＲ５）およびＨｓ０４１９４３６６（ＲＰＬ１３Ａハウスキーピング）を使用したＴａｑＭａｎシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して実施した。

ＲＮＡ抽出およびリアルタイム定量ＰＣＲ
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者の指示に従って使用することによって細胞から抽出した。ＲＮＡ濃度および品質を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＴｈｅｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したＵＶ分光法によって評価した。１００～２００ｎｇの総ＲＮＡを使用し、１：１の体積比のランダムヘキサマーとオリゴｄＴとを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔ－ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡを調製した。完了したｃＤＮＡ合成反応物を、２ＵのＲＮアーゼＨを用いて３７℃で２０分間処理した。定量ＰＣＲを、ＡＢｓｏｌｕｔｅＢｌｕｅｑＰＣＲＳＹＢＲＧｒｅｅｎＬｏｗＲＯＸＭｉｘを使用して実施した。ＰＣＲアッセイを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７Ｆｌｅｘシステムにおいて実行し、Ｃ_ｔ値を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏリアルタイムＰＣＲソフトウェアを用いて取得した。遺伝子発現の相対変化を、２^ΔΔＣｔ法を用いて解析した。

ベクター構築物
ＳＪ２５Ｃ１ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖを含む１９２８ζおよび１９ＢＢζ ＣＡＲは以前に記載されている（Maher et al., Nat Biotechnol (2002); 20:70-75）。ＬＢＢｚおよびＬ２８ｚは、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖを、Ｌｅ^Ａを標的とするヒト５Ｂ１ｓｃＦｖに置き換えることによって構築した。すべての構築物は、以前に記載されたように、Ｔ細胞イメージングのためにＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼを発現するように設計した（Santos et al., Nat Med (2009); 15:338-344）。Ｌ（ｄｅｌ）変異体は、指定した構築物から細胞内共刺激因子およびシグナル伝達ドメインを除去する一方で細胞外および膜貫通部分を保持することによって作出した。ＴＲＡＩＬを発現する構築物は、指定したＣＡＲおよびＰ２Ａ配列に続けてＴＲＡＩＬｃＤＮＡ配列を付加することによって作出した。

レトロウイルス産生および形質導入
ＳＦＧγ－レトロウイルス（ＲＶ）ベクターをコードするプラスミド（Riviere et al., Proc Natl Acad Sci USA (1995); 92:6733-6737）を、以前に記載されたように調製した（Maher et al., Nat Biotechnol (2002); 20:70-75）。形質導入されたｇｐｇ２９線維芽細胞（Ｈ２９）に由来するＶＳＶ－Ｇ偽型レトロウイルス上清を使用して、安定なレトロウイルス産生細胞系を以前に記載されたように構築した（Gallardo et al., Blood (1997); 90:952－957）。Ｔ細胞は、レトロネクチン（Ｔａｋａｒａ）コーティングプレートにおける遠心分離によって形質導入した。Ｔ細胞ノックアウト研究では、ＣＡＲ形質導入は、記載されたように、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ電気穿孔の直後に実施した（Eyquem et al., Nature (2017); 543, 113-117）。

細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ（ＣＴＬ）
１００％Ａｇ＋腫瘍細胞を使用したＣＴＬ：ＣＡＲを形質導入したＴ細胞の細胞傷害性を標準的なルシフェラーゼベースアッセイによって決定した。ルシフェラーゼベースアッセイに関して、ホタルルシフェラーゼ－ＧＦＰを発現する腫瘍細胞は標的細胞として役立った。エフェクター細胞および腫瘍細胞を、示されたＥ／Ｔ比（ration）で黒壁９６または３８４ウェルプレートにおいて３連で共培養した。標的細胞単独を同じ細胞密度で播種して、ベースラインルシフェラーゼ発現を決定した（Ｔ細胞無し対照）。１８時間後、ルシフェラーゼ基質（Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに直接添加した。放出された光を発光プレートリーダー、またはイメージングデータセットの獲得のためのＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を備えるＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）によって測定した。溶解を［１－（ＲＬＵｓａｍｐｌｅ）／（ＲＬＵｍａｘ）］×１００として決定した。アッセイを、前の週以内に形質導入されたＣＡＲＴ細胞を使用して実施した。

７５％Ａｇ＋、２５％Ａｇ－腫瘍細胞を使用したＣＴＬ：予備刺激したＣＡＲＴ細胞を伴う実験において、すべてのＣＡＲＴ細胞を２０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２の存在下１００万個細胞／ｍｌの一定濃度で１０～１２日間成長させ、１日おきに再構成した。細胞を、実験の１日前に標的抗原を含有する接着細胞（Ｌｅ^Ａ＋Ｃａｐａｎ２）にＣＡＲＴ細胞を添加することによってＣＴＬ前に刺激し、実験の当日、Ｔ細胞を吸引によって除去した。次いで、ＣＡＲＴ細胞を、ＲＴ増感７５％Ａｇ^＋Ｃａｐａｎ２ＰＤＡＣとともに１：３のＥ：Ｔ比で４８ウェルプレート中において共培養した。残っているＡｇ＋およびＡｇ－腫瘍細胞の相対数に加えて、無処置対照と比較した殺滅パーセントを、ＬＢＢｚＣＡＲＴ細胞培養に関しては４日間、Ｌ（ｄｅｌ）ＣＡＲＴ細胞培養に関しては５日間のうちの予め規定した時点において決定した。Ａｇ－細胞殺滅を特異的に定量した実験では、Ａｇ－細胞のみがルシフェラーゼを発現した。

ＲＴを使用したすべての細胞傷害性アッセイでは、腫瘍細胞（Ｃａｐａｎ２）にＲＴを与え、培養中で２日間成長させ、次いで生細胞をＣＡＲＴ細胞とともにインキュベートした。

ビデオ顕微鏡検査
ＣＴＶ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ、ＦｉｓｈｅｒＣ３４５７１）で標識したＡｇ^－細胞を、８ウェル顕微鏡検査スライドにおけるＣＡＲＴ細胞、およびアネキシンＶ５９５（ＦｉｓｈｅｒＡ１３２０３）に加えて、非標識Ａｇ^＋細胞と７５％ＬｅＡ^＋の比で混合した。共焦点画像を、ＬＳＭ８８０共焦点顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）を用いて最適なイメージングパラメーターにおいて培養中で１８時間にわたって７分ごとに獲得した。データを、Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を使用して３Ｄレンダリングし、可視化した。ＬｅＡ^－細胞の殺滅パーセントを、総Ａｇ^－細胞（青色細胞）ならびに死／瀕死Ａｇ^－細胞（赤色および青色二重陽性）を自動的に定量するＩｍａｇｅＪ／ＦＩＪＩ（ＮＩＨ）において作成したカスタムマクロを使用してすべての時点で決定した。

遺伝子破壊
Ｔ細胞活性化を開始した４８時間後、ＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅＭＡＸシステム（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ）を使用したＣａｓ９ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの電気泳動転写によって細胞にトランスフェクトした。３×１０^６個の細胞を５μｇのＣａｓ９および５μｇのｇＲＮＡと混合して０．２ｃｍキュベットに入れた。電気穿孔後、細胞を培養培地に希釈し、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。ＴＣＲ陰性Ｔ細胞を取得するために、ＴＣＲ陽性Ｔ細胞を、ｇＲＮＡトランスフェクションの３～５日後に磁気ビオチン抗ＴＣＲαβおよび抗ビオチンマイクロビーズならびにＬＳカラム（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して除去した。ＴＲＡＩＬ陰性細胞を取得するために、ＴＲＡＩＬ陽性Ｔ細胞を、磁気ＰＥ－抗ＴＲＡＩＬ（Ｒ＆Ｄ、ＦＡＢ６８７Ｐ）および抗ＰＥマイクロビーズをＬＳカラム（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）中で使用して除去した。ＤＲ５陰性細胞を取得するために、ＦＡＣＳ選別を、ＰＥ－抗ＤＲ５染色を使用して実施した。

ＴＣＲノックアウトに関して、ＴＣＲαおよびβをアセンブルし細胞表面に所在させるために必要とされるＴＣＲα遺伝子の定常鎖（ＴＲＡＣ）の第１のエクソンにおける配列を標的とするｇＲＮＡを、以前に記載されたように使用した^４２。ＴＲＡＩＬを、合成改変ｇＲＮＡキット（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）を使用して実施した。ガイドＲＮＡを、ｃｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎＴバッファー（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ）中１μｇμｌ^－１で再構成した。Ｃａｓ９ｍＲＮＡをＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成した。

膵臓がん腫瘍モデル
８～１２週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２Ｒγ－ヌル（ＮＳＧ）雄マウス（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、ＭＳＫＣＣ動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従って使用した。規定の比のＬｅＡ＋およびＬｅＡ－ＦＡＣＳ選別Ｃａｐａｎ２ＰＤＡＣ腫瘍細胞を、ＩＲＢ承認マウスプロトコールに従って、マウスを外科的に切開し膵臓を露出させた後、ＮＳＧマウスの膵臓に注射した。マウス１匹当たり５０％マトリゲル中７５，０００個の腫瘍細胞を注射した。マウスを処置に対して無作為化し、処置群を、処置および腫瘍評価を実施する人員に対して盲検化した。腫瘍を膵臓において９日間定着させ、次いでマウスを、ＲＴとそれに続くＴ細胞とを用いて処置した。腫瘍体積を、後眼窩Ｄ－ルシフェリン注射とそれに続くＩＶＩＳイメージングとを使用して、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって測定した。各マウスの腫瘍負荷を、処置の開始時のそのマウスのベースライン腫瘍ＢＬＩと比較して経時的に表した。

Ｔ細胞イメージング
Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを含有するＣＡＲＴ細胞を、後眼窩注射したセレンテラジン（３０３１－１０Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ－ＳＯＬｉｎｖｉｖｏ、Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ）を使用してイメージングした。

トランスクリプトーム解析
細胞をＴｒｉｚｏｌＬＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解し、次いでＲＮＡ抽出のためにＭＳＫＣＣのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＧｅｎｏｍｉｃｓＯｐｅｒａｔｉｏｎに提出した。バイオアナライザーにおけるｒｉｂｏｇｒｅｅｎ定量および品質管理後、５００ｎｇの総ＲＮＡは、ＴｒｕｓｅｑＳｔｒａｎｄｅｄＴｏｔａｌＲＮＡライブラリー調製化学（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して６サイクルのＰＣＲによりライブラリー調製を受けた。試料をバーコード化し、ＴｒｕＳｅｑＳＢＳキットｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して５０ｂｐ／５０ｂｐペアエンドランにおいてＨｉｓｅｑ２５００１Ｔにかけた。試料１つ当たり平均で５１００万のペアリードが生成され、ｍＲＮＡ塩基のパーセントは平均して５８％であった。

出力されたＦＡＳＴＱデータファイルを、リードをゲノムマッピングしてスプライスジャンクションにわたるリードを解明するｒｎａＳｔａｒアライナーを使用して、標的ゲノムにマッピングした。リードを２回マッピングする２パスマッピング法を使用した。１回目のマッピングパスは、Ｅｎｓｅｍｂｌｅからの公知のアノテートされたジャンクションの一覧表を使用する。次いで、１回目のパスにおいて見出された新規ジャンクションを公知のジャンクションに追加し、２回目のマッピングパスを行う（２回目のパスに関してはＲｅｍｏｖｅＮｏｎｃａｎｏｎｃｉａｌフラグを使用する）。マッピング後、出力されたＳＡＭファイルを、ＰＩＣＡＲＤツール、例えばリード群を追加するツール、すなわちファイルをさらに並べ替えて圧縮ＢＡＭフォーマットに変換するＡｄｄＯｒＲｅｐｌａｃｅＲｅａｄＧｒｏｕｐｓを使用して後処理した。マッピングされたリードからの発現カウントマトリックスを、ＨＴＳｅｑ（ｗｗｗ－ｈｕｂｅｒ．ｅｍｂｌ．ｄｅ）およびいくつかの使用され得る遺伝子モデルデータベースのうち１つを使用して計算した。次いで、ＨＴＳｅｑによって生成した生カウントマトリックスを、完全データセットを正規化することと試料群間の差次的発現を解析することの両方のために使用するＲ／ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＤＥＳｅｑ（ｗｗｗ－ｈｕｂｅｒ．ｅｍｂｌ．ｄｅ）を使用して処理する。

ＧＳＡに関してＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＰＩＡＮＯを使用した（ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）。正確なコールは、ｇｓａ．ｒｅｓ＜－ｒｕｎＧＳＡ（ｆｃ、ｇｅｎｅＳｅｔＳｔａｔ＝「ｍｅａｎ」、ｇｓｃ＝ｇｓｃ、ｇｓＳｉｚｅＬｉｍ＝ｃ（ｍｉｎ．ｇｎｓ、ｍａｘ．ｇｎｓ）、ｎＰｅｒｍ＝ｎＰｅｒｍ）であり、ここでｆｃ＝＝倍率変化、ｍｉｎ．ｇｎｓ＝＝５、ｍａｘ．ｇｎｓ＝＝１０００、ｎＰｅｒｍ＝＝１ｅ４である。遺伝子セットに関してはＢｒｏａｄからのＭＳｉｇＤｂを使用した（ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ）。以下のコレクションを使用した：「ｃ１．ａｌｌ．ｖ４．０．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ」、「ｃ２．ａｌｌ．ｖ４．０．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ」、「ｃ３．ａｌｌ．ｖ４．０．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ」、「ｃ５－１．ａｌｌ．ｖ４．０．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ」、「ｃ６－１．ａｌｌ．ｖ４．０．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ」、「ｃ７．ａｌｌ．ｖ４．０．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ」。

統計
すべての実験データは平均±ｓ．ｅ．ｍとして表される。統計的方法は、試料サイズを予め決定するためには使用しなかった。群は対応のない両側ｔ検定を使用して比較した。統計分析はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７ソフトウェアにおいて実施した。

本開示の主題の実施形態
前述の記載から、本開示の主題を様々な使用法および条件に採用するために、本開示の主題に対して変形および修正を行うことができることは明らかである。そのような実施形態もまた以下の特許請求の範囲の範囲内である。

本明細書中の変量の任意の定義における要素の列挙の記載は、その変量の定義を任意の単一の要素または列挙された要素の組合せ（もしくは部分的組合せ）として含む。本明細書中のある実施形態の記載は、その実施形態を任意の単一の実施形態または任意の他の実施形態もしくはその部分との組合せとして含む。

本明細書で言及したすべての特許および刊行物は、独立した各特許および刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別的に指示される場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims

細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡへの結合について、参照抗体またはその抗原結合性部分と交差競合し、前記参照抗体またはその抗原結合性部分は、
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合性ドメインは、参照抗体またはその抗原結合性部分と同一の、シアリルルイスＡ上のエピトープに結合し、前記参照抗体またはその抗原結合性部分は、
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡに特異的に結合し、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３またはその保存的改変および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３またはその保存的改変を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２またはその保存的改変および配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２またはその保存的改変を含む、請求項３に記載のＣＡＲ。
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１またはその保存的改変および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１またはその保存的改変を含む、請求項３または４に記載のＣＡＲ。
細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡに特異的に結合し、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡに特異的に結合し、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、請求項３から７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡに特異的に結合し、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同（例えば、少なくとも約８０％同一）であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項９に記載のＣＡＲ。
細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡに特異的に結合し、配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同（例えば、少なくとも約８０％同一）であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１３に記載のＣＡＲ。
細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外抗原結合性ドメインは、シアリルルイスＡに特異的に結合し、
ａ）配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同（例えば、少なくとも約８０％同一）であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
ｂ）配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同（例えば、少なくとも約８０％同一）であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１３に記載のＣＡＲ。
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同（例えば、少なくとも約８０％同一）であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％相同（例えば、少なくとも約８０％同一）であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１３または１４に記載のＣＡＲ。
前記細胞外抗原結合性ドメインが、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記細胞外抗原結合性ドメインが、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記細胞外抗原結合性ドメインが、ヒトｓｃＦｖを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記細胞外抗原結合性ドメインが、必要に応じて架橋されるＦａｂを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記細胞外抗原結合性ドメインが、Ｆ（ａｂ）_２を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記ｓｃＦＶ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）_２のうち１つまたは複数が、異種配列との融合タンパク質中に含まれて、前記細胞外抗原結合性ドメインを形成する、請求項１７から２０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記細胞外抗原結合性ドメインが、前記細胞外抗原結合性ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間にリンカーを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記細胞外抗原結合性ドメインが、前記細胞外抗原結合性ドメインの５’末端に共有結合によって繋がれるシグナルペプチドを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、ＣＤ４ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＣＴＬＡ－４ポリペプチド、ＰＤ－１ポリペプチド、ＬＡＧ－３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、ＢＴＬＡポリペプチド、合成ペプチド（免疫応答と関連するタンパク質をベースとしない）またはそれらの組合せを含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記細胞内ドメインが、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＤＡＰ－１０ポリペプチドまたはそれらの組合せを含む、請求項２５に記載のＣＡＲ。
前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８ポリペプチドを含む、請求項２６に記載のＣＡＲ。
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、野生型ＣＤ３ζポリペプチドまたは改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含み、前記改変されたＣＤ３ζポリペプチドが、ａ）免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のすべてもしくは一部を欠き、前記ＩＴＡＭが、ＩＴＡＭ１、ＩＴＡＭ２およびＩＴＡＭ３であり、ならびに／または塩基性豊富ストレッチ（ＢＲＳ）領域のすべてもしくは一部を欠き、前記ＢＲＳ領域が、ＢＲＳ１、ＢＲＳ２およびＢＲＳ３である、請求項１から２７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記改変されたＣＤ３ζポリペプチドが、
ａ）ＩＴＡＭ２もしくはその部分を欠き、必要に応じて、ｉ）ＩＴＡＭ３もしくはその部分および／またはｉｉ）ＩＴＡＭ１もしくはその部分をさらに欠き、
ｂ）ＩＴＡＭ１もしくはその部分を欠き、必要に応じて、ＩＴＡＭ３もしくはその部分をさらに欠き、
ｃ）ＩＴＡＭ３もしくはその部分を欠き、
ｄ）ＩＴＡＭ２もしくはその部分の欠失を含み、必要に応じて、ｉ）ＩＴＡＭ３もしくはその部分の欠失および／またはｉｉ）ＩＴＡＭ１もしくはその部分の欠失をさらに含み、
ｅ）ＩＴＡＭ１もしくはその部分の欠失を含み、必要に応じて、ＩＴＡＭ３もしくはその部分の欠失をさらに含み、ならびに／または
ｆ）ＩＴＡＭ３もしくはその部分の欠失を含む、請求項２８に記載のＣＡＲ。
前記改変されたＣＤ３ζポリペプチドが、
ａ）ＢＲＳ２もしくはその部分を欠き、必要に応じて、ｉ）ＢＲＳ３もしくはその部分および／またはｉｉ）ＢＲＳ１もしくはその部分をさらに欠き、
ｂ）ＢＲＳ１もしくはその部分を欠き、必要に応じて、ＢＲＳ３もしくはその部分をさらに欠き、
ｃ）ＢＲＳ３もしくはその部分を欠き、ならびに／または
ｄ）ＢＲＳ１もしくはその部分、ＢＲＳ２もしくはその部分およびＢＲＳ３もしくはその部分を欠き、
ｅ）ＢＲＳ２もしくはその部分の欠失を含み、必要に応じて、ｉ）ＢＲＳ３もしくはその部分の欠失および／またはｉｉ）ＢＲＳ１もしくはその部分の欠失をさらに含み、
ｆ）ＢＲＳ１もしくはその部分の欠失を含み、必要に応じて、ＢＲＳ３もしくはその部分の欠失をさらに含み、
ｇ）ＢＲＳ３もしくはその部分の欠失を含み、ならびに／または
ｈ）ＢＲＳ１もしくはその部分、ＢＲＳ２もしくはその部分およびＢＲＳ３もしくはその部分の欠失を含む、請求項２８または２９に記載のＣＡＲ。
前記改変されたＣＤ３ζポリペプチドが、ＩＴＡＭ２、ＩＴＡＭ３、ＢＲＳ２およびＢＲＳ３を欠くか、または、ＩＴＡＭ２、ＩＴＡＭ３、ＢＲＳ２およびＢＲＳ３の欠失を含む、請求項２８から３０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
ヒンジ／スペーサー領域をさらに含み、前記ヒンジ／スペーサー領域が、必要に応じて、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、ＣＤ４ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＣＤ１６６ポリペプチド、ＣＤ１６６ポリペプチド、ＣＤ８ａポリペプチド、ＣＤ８ｂポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＩＣＡＭ－１ポリペプチド、ＣＴＬＡ－４ポリペプチド、ＣＤ２７ポリペプチド、ＣＤ４０／Ｍｙ８８ペプチド、ＮＫＧＤ２ペプチドまたはそれらの組合せからなる群から選択される分子の天然または改変されたヒンジ／スペーサー領域であり、前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、ＣＤ４ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＣＤ１６６ポリペプチド、ＣＤ１６６ポリペプチド、ＣＤ８ａポリペプチド、ＣＤ８ｂポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＩＣＡＭ－１ポリペプチド、ＣＴＬＡ－４ポリペプチド、ＣＤ２７ポリペプチド、ＣＤ４０／Ｍｙ８８ペプチド、ＮＫＧＤ２ペプチドまたはそれらの組合せからなる群から選択される分子の天然または改変された膜貫通ドメインである、請求項１から３１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記ヒンジ／スペーサー領域が、前記膜貫通ドメインが由来するものと同一の分子に由来する、請求項３２に記載のＣＡＲ。
ａ）ＣＤ２８ポリペプチドのヒンジ／スペーサー領域およびＣＤ２８ポリペプチドの膜貫通ドメイン、
ｂ）ＣＤ８４ポリペプチドのヒンジ／スペーサー領域およびＣＤ８４ポリペプチドの膜貫通ドメイン、
ｃ）ＣＤ１６６ポリペプチドのヒンジ／スペーサー領域およびＣＤ１６６ポリペプチドの膜貫通ドメイン、
ｄ）ＣＤ８ａポリペプチドのヒンジ／スペーサー領域およびＣＤ８ａポリペプチドの膜貫通ドメイン、または
ｅ）ＣＤ８ｂポリペプチドのヒンジ／スペーサー領域およびＣＤ８ｂポリペプチドの膜貫通ドメイン
を含む、請求項３３に記載のＣＡＲ。
ＣＤ１６６ポリペプチドのヒンジ／スペーサー領域およびＣＤ１６６ポリペプチドの膜貫通ドメインを含む、請求項３４に記載のＣＡＲ。
前記膜貫通ドメインおよび前記ヒンジ／スペーサー領域が、異なる分子に由来する、請求項３５に記載のＣＡＲ。
ＣＤ２８ポリペプチドのヒンジ／スペーサー領域およびＩＣＯＳポリペプチドの膜貫通ドメインを含む、請求項３６に記載のＣＡＲ。
組換え発現されるか、またはベクターから発現される、請求項１から３７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
前記ベクターが、レトロウイルスベクター（例えば、γ－レトロウイルスベクター）である、請求項３８に記載のＣＡＲ。
前記請求項のいずれか一項に記載のＣＡＲを含む免疫応答性細胞。
前記ＣＡＲを含む組成物（例えば、ベクター）を使用して改変される、請求項４０に記載の免疫応答性細胞。
前記ＣＡＲが、前記免疫応答性細胞の表面で構成的に発現される、請求項４０または４１に記載の免疫応答性細胞。
Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ヒト胚性幹細胞、リンパ球様前駆細胞、Ｔ細胞前駆体細胞およびリンパ球様細胞が分化し得る多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
Ｔ細胞である、請求項４３に記載の免疫応答性細胞。
前記Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞およびセントラルメモリーT細胞からなる群から選択される、請求項４４に記載の免疫応答性細胞。
請求項１から３９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸（nucleic）配列を含む核酸分子。
請求項４６に記載の核酸分子を含むベクター。
レトロウイルスベクター（例えば、γ－レトロウイルスベクター）である、請求項４７に記載のベクター。
請求項４７もしくは４８に記載のベクターを含む、または請求項４６に記載の核酸分子を発現する、宿主細胞。
Ｔ細胞である、請求項４９に記載の宿主細胞。
シアリルルイスＡに結合する免疫応答性細胞を生成するための方法であって、前記免疫応答性細胞中に、請求項１から３９のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を含む核酸分子を導入することを含む、方法。
請求項４０から４５のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞を含む組成物。
医薬組成物であり、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項５２に記載の組成物。
対象において悪性成長を処置または防止する方法であって、前記対象に有効量の請求項４０から４５のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞または請求項５２もしくは５３に記載の組成物を投与することを含む、方法。
前記悪性成長が、膵臓がんである、請求項５４に記載の方法。
前記対象において腫瘍負荷を低減または根絶する、請求項５４または５５に記載の方法。
前記対象がヒトである、請求項５４から５６のいずれか一項に記載の方法。
前記対象を、前記投与の前に低線量の照射に曝露することをさらに含む、請求項５４から５７のいずれか一項に記載の方法。
悪性成長を処置または防止するためのキットであって、請求項４０から４５のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞を含み、必要に応じて、新生物を有する対象を処置するために前記免疫応答性細胞を使用するための指示書をさらに含む、キット。
前記悪性成長が、膵臓がんである、請求項５９に記載のキット。