JP2004051536A

JP2004051536A - 歯周病疾患マーカー蛋白質及びそれを利用した歯周病診断方法

Info

Publication number: JP2004051536A
Application number: JP2002210814A
Authority: JP
Inventors: Mitsuhiro Oshima; 大島　光宏; Kichibee Otsuka; 大塚　吉兵衛; Koichi Ito; 伊藤　公一
Original assignee: Nihon University
Current assignee: Nihon University
Priority date: 2002-07-19
Filing date: 2002-07-19
Publication date: 2004-02-19

Abstract

【課題】歯周病疾患のマーカー蛋白質及びそれを利用した歯周病の診断方法を提供することを課題とする。
【解決手段】歯周病疾患マーカー蛋白質として、健常人の歯肉溝滲出液中には見出されず歯周病患者の歯肉溝滲出液中に特異的に見出され、親水性で陰性荷電の強い酸性蛋白質であって等電点が２．５以下であり且つ分子量が約９，０７０〜９，１００の蛋白質が見出された。ヒトから採取された歯肉溝滲出液または唾液のサンプル中にこの蛋白質が存在するか否かを調べることにより歯周病を客観的に診断することが可能となる。
【選択図】　　　　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、歯周病疾患マーカー蛋白質およびそれを利用した歯周病診断方法に関する。更に詳細には、健常人の歯肉溝滲出液中には見出されず歯周病患者の歯肉溝滲出液中に特異的に見出され、親水性で陰性荷電の強い酸性蛋白質であって等電点が２．５以下であり且つ分子量が約９，０７０〜９，１００の歯周病疾患マーカー蛋白質及びヒトから採取された歯肉溝滲出液または唾液のサンプル中に該蛋白質が存在するか否かを調べて歯周病を診断する歯周病診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノムのドラフトシーケンスが解読され、分子生物学・生化学は今後ますますゲノムの機能解明に重心が移ると予想される。
既に、癌や糖尿病、高血圧、また生殖・発生現象の種々の局面で時空間的に発現する遺伝子群のプロファイル（トランスクリプトーム）が解析され始めている。しかし、生体内で実際的かつ最終的に機能する蛋白質の解析が、ポストゲノム時代のプロテオームあるいはメタボローム研究に必須であり、これこそが生命現象の鍵を解明すると認識され始めている。従来、蛋白質の抽出・精製・同定・発現解析には多大の労力・時間・費用を必要としたが、近年開発されたプロテインチップ（Ｄａｖｉｅｓ，Ｈ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　７８：Ｂ２９（２０００）；　Ｕ．Ｓ．　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ．６，２９４，７９０　Ｂ１；　特表２０００−５０７２８２号公報）により、これら一連の作業の迅速・正確な施行とハイスループットな網羅的解析が可能となってきた。実際にプロテインチップを利用した前立腺癌マーカー蛋白質の探索（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｇ．Ｌ．Ｊｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，　２，　２６４−２７６（２０００））、プロテインチップを利用した卵巣癌患者血清のプロテオミックパターンの解析（Ｅｍａｎｕｅｌ　Ｆ．　Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ　ＩＩＩ　ｅｔ　ａｌ．，　ＴＨＥ　ＬＡＮＣＥＴ，　Ｖｏｌ．３５９，　Ｆｅｂｒｕａｒｙ　１６，２００２，　５７２−５７７）などが既に報告されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
このような流れのなかで、口腔科学での歯周病という分野においてもその疾患現象を遺伝子・蛋白質といった分子レベルから解明していく研究が極めて重要と考えられる。しかしながら、歯科口腔科学分野において、ゲノムをベースにした研究はまだ日が浅く、特に歯周病においてはＤＮＡチップやマイクロアレーを用いた研究解析の例は殆ど無く最新の研究に立ち遅れているのが現状である。
このような現状において、現在歯周病の分野では科学的に信頼できる客観的な診断技術が殆ど存在せず、旧来の目視による判定に頼っていると言わざるを得ない。従って、歯周病疾患のマーカーとなるような蛋白質を解明して歯周病の客観的な診断法を確立することが現在強く望まれている。
従って、本発明の課題は、歯周病疾患マーカー蛋白質を解明すること及びそれを利用した歯周病診断方法を開発することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記した課題を解決すべくプロテインチップを利用して歯周病疾患のマーカー蛋白質となり得る物質を探索した結果、歯周病患者の歯肉溝滲出液中に歯周病に特異的な蛋白質が発現していることを明らかにし、この蛋白質が歯周病マーカーとなり得ること、そしてこの蛋白質を利用することによって歯周病の客観的な診断が可能になることを見出して本発明を完成した。
即ち、本発明は、以下の特性を有する歯周病疾患マーカー蛋白質に関する：
（ａ）健常人の歯肉溝滲出液中には見出されず、歯周病患者の歯肉溝滲出液中に特異的に見出される；
（ｂ）親水性蛋白質である；
（ｃ）陰性荷電の強い酸性蛋白質である；
（ｄ）等電点が２．５以下である；
及び
（ｅ）分子量が約９，０７０〜９，１００である。
更に本発明は、ヒトから採取された歯肉溝滲出液または唾液のサンプル中に上記の蛋白質が存在するか否かを調べて歯周病を診断する歯周病診断方法に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
上記した通り、本発明者は、歯周病患者の歯と歯肉の間のわずかな隙間に出ている血清成分を主とした液として知られる歯肉溝滲出液、特に歯周炎罹患部位の歯肉溝滲出液中に歯周病疾患に特異的な蛋白質が発現していると予測して、この歯肉滲出液中の蛋白質について、プロテインチップシステムにより探索した。このシステムは、意図する試料中の蛋白質をアフィニティーにより捕捉するプロテインチップと、捕捉された各種蛋白質のそれぞれの分子量を測定する質量分析計を組み合わせたシステムで蛋白質の機能解析、精製・同定などを効率的に行うことのできるシステムである（Ｄａｖｉｅｓ，Ｈ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　７８：Ｂ２９（２０００）；　Ｕ．Ｓ．　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ．６，２９４，７９０　Ｂ１；　特表２０００−５０７２８２号公報）。
【０００６】
本明細書の後の実施例において詳細に説明するように、歯周炎罹患部位の歯肉溝滲出液を、シリカゲル（ＳｉＯ_２）が固定化された順相プロテインチップに適用し、このプロテインチップに捕捉された歯肉溝滲出液中の蛋白質を、飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により解析した。この順相プロテインチップは、シリカゲルに吸着する蛋白質、即ち親水性の蛋白質を捕捉することができる。この飛行時間型質量分析計は、プロテインチップに捕捉された蛋白質にＵＶパルスレーザーを照射して蛋白質をイオン化し、イオン化した蛋白質は一定の電圧で加速されて真空管の対極にあるイオン検知器に向かって飛行し、この時に蛋白質の質量に応じて飛行時間が変動するのでこの飛行時間を計測することによって、各蛋白質の分子量を求めるものである。この飛行時間型質量分析計で、順相プロテインチップに捕捉された各種蛋白質を解析した結果、健常人の歯肉溝滲出液中には観察されず歯周病患者の特に歯周炎罹患部位の歯肉滲出液中に特異的に観察される、分子量約９，１００、より具体的には分子量９０９３．９の蛋白質が見出された。
従って、健常人の歯肉溝滲出液中には見出されず歯周病患者の歯肉溝滲出液中に特異的に見出され、親水性で且つ分子量が約９，１００の蛋白質が、歯周病疾患マーカー蛋白質となり得ることが明らかとなった。
【０００７】
更に、歯周炎罹患部位の歯肉溝滲出液を、第４級アミノ基などの陽イオン性官能基が固定化された陰イオン交換プロテインチップ、あるいはスルフォネート基などの陰イオン性官能基が固定化された陽イオン交換プロテインチップに適用し、これらのプロテインチップに捕捉された歯肉溝滲出液中の蛋白質を、飛行時間型質量分析計により解析した。その結果、歯周病患者の歯周炎罹患部位の歯肉滲出液中に、陰イオン交換プロテインチップによって捕捉されるが、陽イオン交換プロテインチップによっては捕捉されない、即ち、陰性荷電の強い酸性蛋白質である、分子量約９，０７０、より具体的には分子量約９，０７７の蛋白質が見出された。更に、歯肉滲出液中について、陰イオン交換プロテインチップに適用する際のｐＨ値を６〜２．５に変動させて、同様の蛋白質が観察されるか否かを調べた結果、ｐＨ値が６〜３の条件下では、分子量約９，０７７の蛋白質が観察されたが、ｐＨ値が２．５の条件下では、この蛋白質は殆ど観察されなかった。この結果から、この蛋白質は等電点が２．５以下であることが明らかとなった。
【０００８】
以上の結果から、健常人の歯肉溝滲出液中には見出されず歯周病患者の歯肉溝滲出液中に特異的に見出され、親水性で陰性荷電の強い酸性蛋白質であって等電点が２．５以下であり且つ分子量が約９，０７０〜９，１００の蛋白質が、歯周病疾患マーカー蛋白質となることが明らかとなった。
【０００９】
この歯周病疾患マーカー蛋白質を指標として歯周病の客観的な診断が可能である。即ち、ヒトから採取されたサンプル中に、この歯周病疾患マーカー蛋白質が存在するか否かを調べることにより歯周病を客観的に診断することが可能である。サンプルとしては、ヒトの歯肉溝滲出液、歯肉溝滲出液中の成分が含まれる唾液などが使用される。これらのサンプルをリン酸緩衝液などの適当な緩衝液に加え、上記したように、順相プロテインチップまたは陰イオン交換プロテインチップおよび飛行時間型質量分析計に付して、分子量約９，０７０〜９，１００の蛋白質が観察されるか否かにより、歯周病を診断することができる。分子量約９，０７０〜９，１００の蛋白質が観察されれば、歯周病と判定できる。また、歯周病患者の特に歯周炎罹患部位の歯肉溝滲出液中の分子量約９，０７０〜９，１００の蛋白質の観察される量によって、歯周病の進行度、重症度なども判定できる。
あるいは、本発明によって見出された歯周病疾患マーカー蛋白質に対する抗体を作成して、この抗体を用いた通常の検出法によって、歯周病の診断を行うこともできる。ここで用いられる抗体としては、本発明の歯周病疾患マーカー蛋白質に対する抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体などが挙げられる。このような抗体を用いた検出法としては、ＥＬＩＳＡなどの酵素標識を利用したエンザイムイムノアッセイ、放射性同位体標識を利用したラジオイムノアッセイなどが挙げらる。これらの検出法は、それ自体既に当業者に周知であり、これらの通常の方法により、歯肉溝滲出液あるいは唾液のサンプルについて本発明の歯周病マーカー蛋白質の存否を調べることができる。
【００１０】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１１】
実施例１
歯周病疾患マーカー蛋白質の検索
（１）方法
歯周病患者の歯周炎罹患部位の歯肉溝滲出液およびコントロールとして健常人の健常部位の歯肉溝滲出液を、ペーパーストリップを用いて歯肉溝から１μｌ程度採取した。同時に、ブロービング深さや歯肉炎指数などの臨床的パラメーターの記録を行った。
歯肉溝滲出液を含んだぺーパーストリップを５０μｌのリン酸緩衝液に浸漬し、滲出液中の成分を緩衝液に溶出させ、その蛋白質量を定量した。
次いで、プロテインチップシステム（サイファージェン・バイオシステムズ社製）を用いて蛋白質の検索を行った。即ち、シリカゲル（ＳｉＯ_２）を固定した順相プロテインチップ（ＮＰ１チップ）上に一定量の歯肉溝滲出液を含むリン酸緩衝液を載せ、インキュベートした。次いでプロテインチップを洗浄し、乾燥させた。プロテインチップ上に捕捉された蛋白質を、飛行時間型質量分析計で解析した。得られたマススペクトルパターンを歯周炎罹患部位と健常部位からの歯肉溝滲出液中の蛋白質とで比較して、歯周炎に特異的なマーカー候補蛋白質を検索した。
【００１２】
（２）結果
歯周炎罹患部位と健常部位からの歯肉溝滲出液中の蛋白質のマススペクトルパターンを図１に示した。図１のＥｘｐ．１およびＥｘｐ．２はそれぞれ異なる実験系を示し、Ｅｘｐ．１のＨ−１からＨ−３、Ｅｘｐ．２のＨ−１からＨ−４は、それぞれ異なる健常人からの歯肉溝滲出液のサンプルを示し、括弧内の数字はプロテインチップのウエルに載せた蛋白質量を示す。同様に、図１のＥｘｐ．１のＤ−１からＤ−３、Ｅｘｐ．２のＤ−１からＤ−３およびＤ−５は、それぞれ異なる歯周病患者からの歯肉溝滲出液のサンプルを示す。
図１から明らかなように、歯周炎罹患部位の歯肉溝滲出液中に、特に急性症状を呈する部位から、分子量約９，０００、より具体的には分子量９０９３．９のマーカー候補蛋白質が見出された。
【００１３】
実施例２
歯周病疾患マーカー蛋白質の特徴付け
（１）方法
実施例１の方法と同様にして、歯周病患者の歯周炎罹患部位の歯肉溝滲出液を採取した。歯肉溝滲出液を含んだぺーパーストリップを１００μｌのリン酸緩衝液（ｐＨ８又はｐＨ４）に浸漬し、滲出液中の成分を緩衝液に溶出させ、その蛋白質量を定量した。
次いで、陰イオン交換プロテインチップ（ＳＡＸ２）及び陽イオン交換プロテインチップ（ＷＣＸ２）（サイファージェン・バイオシステムズ社製）に一定量の歯肉溝滲出液（４０μｌ／ｓｐｏｔ）を含むリン酸緩衝液（ＳＡＸ２の場合にはｐＨ８、ＷＣＸ２の場合にはｐＨ４）を載せ、インキュベートした。次いで各プロテインチップを洗浄し、乾燥させた。各プロテインチップ上に捕捉された蛋白質を、飛行時間型質量分析計で解析した。
【００１４】
（２）結果
歯周病患者の歯周炎罹患部位の歯肉溝滲出液のサンプル（Ｄ−４）について、陰イオン交換プロテインチップ（ＳＡＸ２）で捕捉された蛋白質のマススペクトルを図２の上に、陽イオン交換プロテインチップ（ＷＣＸ２）のそれを図２の下に示した。図２のマススペクトルから判るように、陰イオン交換プロテインチップによって捕捉されるが、陽イオン交換プロテインチップによっては捕捉されない、陰性荷電の強い酸性蛋白質である分子量約９０７７の蛋白質が観察された。
【００１５】
実施例３
歯周病疾患マーカー蛋白質の等電点の測定
（１）方法
実施例２の結果に基いて、歯周病患者の歯周炎罹患部位から採取した歯肉溝滲出液を、リン酸緩衝液のｐＨ値を６〜２．５に変動させて、ｐＨ値６〜２．５の条件下で陰イオン交換プロテインチップ（ＳＡＸ２）に適用し、各ｐＨ値において陰イオン交換プロテインチップ上に捕捉された蛋白質を、飛行時間型質量分析計で解析した。
【００１６】
（２）結果
歯周病患者の歯周炎罹患部位の歯肉溝滲出液のサンプル（Ｄ−１、Ｄ−３及びＤ−５の混合物）について、各ｐＨ値において陰イオン交換プロテインチップ上に捕捉された蛋白質を、飛行時間型質量分析計で解析し得られた蛋白質のマススペクトルを図３に示した。図３のマススペクトルから判るように、ｐＨ６〜３においては陰イオン交換プロテインチップによって捕捉されるが、ｐＨ２．５では歯周病患者に特異的な分子量約９，０７０の蛋白質は殆ど観察されなかった。このことから、歯周病患者に特異的な分子量約９，０７０の蛋白質は等電点が２．５以下であることが明らかになった。
なお、歯肉溝滲出液のサンプル中のマーカー蛋白質は、４℃では安定に保存できず、−８０℃で安定に保存可能であった。
【００１７】
実施例１から３の結果から、健常人の歯肉溝滲出液中には見出されず歯周病患者の歯肉溝滲出液中に特異的に見出され、親水性で陰性荷電の強い酸性蛋白質であって等電点が２．５以下であり且つ分子量が約９，０７０〜９，１００の蛋白質が、歯周病疾患のマーカー蛋白質となることが明らかとなった。
【００１８】
【発明の効果】
以上に説明した通り、本発明により、歯周病疾患のマーカー蛋白質として、健常人の歯肉溝滲出液中には見出されず歯周病患者の歯肉溝滲出液中に特異的に見出され、親水性で陰性荷電の強い酸性蛋白質であって等電点が２．５以下であり且つ分子量が約９，０７０〜９，１００の蛋白質が見出された。ヒトから採取された歯肉溝滲出液または唾液のサンプル中にこの蛋白質が存在するか否かを調べることにより歯周病を客観的に診断することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、歯周炎罹患部位と健常部位からの歯肉溝滲出液中の順相プロテインチップに捕捉される蛋白質のマススペクトルパターンを示す。
【図２】図２は、歯周炎罹患部位からの歯肉溝滲出液中の、陰イオン交換プロテインチップ及び陽イオン交換プロテインチップによって捕捉される蛋白質のマススペクトルパターンを示す。
【図３】図３は、歯周炎罹患部位からの歯肉溝滲出液中の、各ｐＨ値において陰イオン交換プロテインチップによって捕捉される蛋白質のマススペクトルパターンを示す。

Claims

以下の特性を有する歯周病疾患マーカー蛋白質：
（ａ）健常人の歯肉溝滲出液中には見出されず、歯周病患者の歯肉溝滲出液中に特異的に見出される；
（ｂ）親水性蛋白質である；
（ｃ）陰性荷電の強い酸性蛋白質である；
（ｄ）等電点が２．５以下である；
及び
（ｅ）分子量が約９，０７０〜９，１００である。
シリカゲルに吸着される請求項１の蛋白質。
シリカゲルが固定化された順相プロテインチップによって捕捉される請求項１または２の蛋白質。
陰イオン交換プロテインチップによって捕捉されるが、陽イオン交換プロテインチップによっては捕捉されない請求項１から３のいずれかの蛋白質。
ヒトから採取された歯肉溝滲出液または唾液のサンプル中に請求項１から４のいずれかに記載の蛋白質が存在するか否かを調べて歯周病を診断する歯周病診断方法。
サンプルをシリカゲルが固定化された順相プロテインチップまたは陰イオン交換プロテインチップに適用し、次いで順相プロテインチップまたは陰イオン交換プロテインチップに捕捉された蛋白質を飛行時間型質量分析計で解析してサンプル中に分子量約９，０７０〜９，１００の蛋白質が存在するか否かを調べる請求項５の診断方法。