ES2344118T3 - Diagnostico de enfermedades neurodegenerativas. - Google Patents

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John Collinge
Graham Stuart Jackson
Emma Mcgregor
Nicola Louise Leeds
James Campbell
Jules Westbrook
Helen Byers
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University College London
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Abstract

Método de diagnóstico de vCJD en una muestra diagnóstica de un tejido o fluido corporal válido tomado de un sujeto humano, que comprende detectar una concentración aumentada de beta-actina en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra de un sujeto humano de control.

Description

Diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
Esta invención se refiere al diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas, concretamente la variante de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (vCJD).
Descripción de la técnica relacionada
La neuropatología de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob, como de otras enfermedades priónicas, se manifiesta por sí misma como un aspecto espongiforme característico del tejido cerebral, muerte de células neuronales en el sistema nervioso central, acompañado por proliferación de astrocitos y en algunos casos la deposición de placas amiloides. Característico de todas las enfermedades priónicas es la acumulación en el cerebro de una forma alterada, asociada a enfermedad, de la proteína priónica normal (PrP^{c}) representada como PrP^{Sc}. Cuatro tipos de PrP^{Sc} están asociados con enfermedad priónica humana. De éstas, el tipo 4 está asociado sólo con la variante de CJD (vCJD) que salió a la luz en el RU en 1996. Se cree que ha surgido del consumo por los seres humanos de carne de ternera infectada con BSE. Ninguna muestra de otras enfermedades priónicas ha mostrado un perfil de tipo 4.
Las dificultades del diagnóstico de la vCJD han conducido a la necesidad de que se desarrollen métodos adicionales.
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Sumario de la invención
La invención proporciona el uso de beta-actina y el precursor de apolipoproteína A-IV en o para el diagnóstico de la vCJD. Se ha encontrado que estas proteínas marcadoras se expresan de manera diferencial en electroforesis bidimensional y/o perfilado de plasma por espectrometría de masas en tiempo de vuelo mediante desorción-ionización por láser de superficie (SELDI).
La descripción identifica las proteínas marcadoras y sus características de expresión diferencial tal como sigue:
IA.
Proteínas presentes en una concentración aumentada en una muestra de vCJD en comparación con controles neurológicos y/o sin enfermedad: cadena beta de haptoglobina que consiste en los residuos 162-406 (n.º de registro de SwissProt P00738); cadena beta de hemoglobina (n.º de registro de SwissProt P02023), alfa-1-antitripsina (n.º de registro de SwissProt P0l009), beta-actina (n.º de registro de SwissProt P60709), cadena beta de hemoglobina (n.º de registro de SwissProt P02023) y precursor de apolipoproteína A-IV (n.º de registro de SwissProt P06727);
IB.
Proteína presente en una concentración disminuida en una muestra de vCJD, en comparación con un control: precursor de alfa-fibrinógeno (n.º de registro de SwissProt P02671); proteína IGHG4 (n.º de registro de SwissProt Q8TC63); cadena pesada lambda de inmunoglobulina; precursor del inhibidor de proteasa plasmática (C1) (n.º de registro de SwissProt P05155); componente 1 del complemento, subcomponente s (n.º de registro de SwissProt P09871), precursor de butirilcolinesterasa (n.º de registro de SwissProt P06276), componente C4B del complemento (n.º de registro de SwissProt P0l028) y lumicano (n.º de registro de SwissProt P51884).
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2. Proteínas presentes en una concentración aumentada o disminuida en una muestra de vCJD en comparación con un control:
1
La invención se define en las reivindicaciones.
La proteína marcadora puede está presente en el tejido corporal en cualquier forma biológicamente relevante, por ejemplo en una forma glicosilada, fosforilada, multimérica o precursora.
Aunque hay un alto grado de confianza en la identificación de las proteínas marcadoras especificadas anteriormente, las proteínas pueden definirse alternativamente en cuanto a ser manchas expresadas de manera diferencial en un gel electroforético bidimensional, concretamente los identificados en las figuras 2 a 5 en el presente documento, independientemente de los nombres y las identificaciones de bases de datos facilitados anteriormente.
Definiciones
La expresión "expresado de manera diferencial" en el contexto de electroforesis en gel bidimensional significa que las manchas que portan proteína teñida están presentes a una densidad óptica superior o inferior en el gel de la muestra tomada para el diagnóstico (la "muestra diagnóstica") que en el gel de una muestra control u otra muestra comparativa, y en el contexto de SELDI-TOF significa que el pico de proteína es a una intensidad superior o inferior en el espectrograma de masas de la muestra tomada para el diagnóstico (la "muestra diagnóstica") que el espectrograma de masas de una muestra control u otra muestra comparativa. Se deduce que las proteínas están presentes en el plasma de la muestra diagnóstica a una concentración superior o inferior que en la muestra control u otra muestra comparativa en la misma dirección de expresión diferencial observada en la electroforesis en gel S-dimensional y SELDI-TOF.
El término "control" se refiere a un sujeto humano que no padece vCJD.
La terminología "concentración aumentada/disminuida... en comparación con una muestra de un control" no implica que se acometa realmente una etapa de comparación, puesto que en muchos casos será obvio para el experto que la concentración es anómalamente alta. Además, cuando el estadio de la evolución de la vCJD está monitorizándose progresivamente, la comparación realizada puede ser con la concentración anteriormente observada en el mismo sujeto más temprano en la evolución de la enfermedad.
La expresión "pareja de unión" incluye una sustancia que reconoce o tiene afinidad por la proteína marcadora. Puede estar o no marcada por sí misma.
La expresión "proteína marcadora" incluye todas las formas biológicamente relevantes de la proteína identificada.
El término "diagnóstico", tal como se usa en el presente documento, incluye determinar si está presente o ausente la vCJD y también incluye determinar el estadio hasta el que ha evolucionado. El diagnóstico puede servir como base de un pronóstico en cuanto al desenlace futuro para el paciente.
La expresión "tejido corporal válido" significa cualquier tejido en el que puede esperarse razonablemente que se acumule una proteína marcadora en relación con la vCJD. Aunque será principalmente un fluido corporal, también incluye tejido del cerebro o de los nervios, la amígdala, el bazo u otro tejido linforreticular, se entiende que el diagnóstico puede realizarse o bien pre mortem o bien post mortem.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es una fotografía de un gel bidimensional típico realizado para fines analíticos, mediante el método descrito en el ejemplo 1 a continuación, en una muestra derivada de un paciente con vCJD. El peso molecular (masa molecular relativa) se muestra en la ordenada en kiloDaltons. Los marcadores de peso molecular se muestran en el lado izquierdo. El punto isoeléctrico (pI) se muestra en la ordenada, aumentando de izquierda a derecha.
La figura 2 es una fotografía de un gel similar, pero marcado con las manchas 1713, 1893, 1960, 2730 y 2732, explicados en detalle en el ejemplo 1. La mancha 1960, aunque es una proteína marcadora para HD (no para vCJD), se muestra aquí por conveniencia, puesto que aparece en pacientes con vCJD, a aproximadamente el mismo nivel que en un control.
La figura 3 es una fotografía ampliada para mostrar una parte del gel de la figura 1 y las manchas 846 y 1526.
La figura 4 es una fotografía ampliada para mostrar otra parte del gel de la figura 1 y la mancha 1488. Las manchas 1293 y 2885 se muestran también, pero no se continuó más con ellos, tal como se explica en el ejemplo 1.
La figura 5 es similar a la figura 2, pero mostrando las manchas 1713 y 1960 en una muestra derivada de un paciente con HD.
Las figuras 6 a 13 son rastros de SELDI, tal como se describe más completamente en el ejemplo 2.
La figura 14 es una imagen de un gel teñido con plata del material extraído de chips Q10 de plasma empobrecido, tal como se describe en el ejemplo 2.
La figura 15 es una imagen de un gel teñido con plata del material extraído de chips WCX CM10 de plasma empobrecido, tal como se describe en el ejemplo 2.
Descripción de realizaciones preferidas
Un método de diagnóstico preferido comprende realizar un ensayo de unión para la proteína marcadora. Puede usarse cualquier pareja de unión razonablemente específica. Preferiblemente, la pareja de unión está marcada. Preferiblemente, el ensayo es un inmunoensayo, especialmente entre el marcador y un anticuerpo que reconoce la proteína, especialmente un anticuerpo marcado. Puede ser un anticuerpo producido contra parte o la totalidad de la misma, lo más preferiblemente un anticuerpo monoclonal o un antisuero anti-ser humano policlonal de alta especificidad para la proteína marcadora.
Por tanto, las proteínas marcadoras descritas anteriormente son útiles para el fin de producir anticuerpos frente a las mismas que pueden usarse para detectar la concentración aumentada o disminuida de las proteínas marcadoras presentes en una muestra de diagnóstico. Tales anticuerpos pueden producirse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en el campo del inmunodiagnóstico.
Los anticuerpos pueden ser contra/frente a cualquier estado biológicamente relevante de la proteína. Por tanto, por ejemplo, podrían producirse contra la forma no glicosilada de una proteína que existe en el cuerpo en una forma glicosilada, contra una forma más madura de una proteína precursora, por ejemplo menos su secuencia señal, o contra un péptido que porta un epítopo relevante de la proteína marcadora.
La muestra puede tomarse de cualquier tejido corporal válido, especialmente fluido corporal, de un sujeto (humano), pero preferiblemente sangre, plasma o suero. Otros fluidos corporales que pueden usarse incluyen líquido cefalorraquídeo (LCR), orina y lágrimas.
Según otro ejemplo, el diagnóstico se lleva a cabo pre o post mortem en un tejido corporal de origen neurológico relevante para la vCJD tal como del cerebro o de los nervios, la amígdala, el bazo u otro tejido linforreticular. El tejido se trata previamente para extraer proteínas del mismo, incluyendo las que estarían presentes en la sangre del fallecido, de modo que se garantiza que las proteínas marcadoras relevantes especificadas anteriormente estarán presentes en una muestra positiva. Para los fines de esta memoria descriptiva de patente, un extracto de este tipo es equivalente a un fluido corporal.
A modo de ejemplo, se disecciona el tejido cerebral y se solubilizan subsecciones mediante métodos bien establecidos en la técnica tales como rotura mecánica en una solución salina tamponada con fosfato, en una razón de aproximadamente 100 mg de tejido con respecto a 1 ml de tampón. Cuando sea deseable pueden incluirse sales caotrópicas tales como clorhidrato de guanidinio o dodecilsulfato de sodio para inactivar el agente priónico infeccioso siempre que esto no interfiera con la posterior detección de los biomarcadores de la vCJD.
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El inmunoensayo preferido se lleva a cabo midiendo el grado de la interacción proteína/anticuerpo. Puede usarse cualquier método de inmunoensayo conocido. Se prefiere un ensayo tipo "sandwich". En este método, se une un primer anticuerpo frente a la proteína marcadora a la fase sólida tal como un pocillo de una placa de microtitulación de plástico, y se incuba con la muestra y con un segundo anticuerpo marcado específico frente a la proteína que va a someterse a ensayo. Alternativamente, podría usarse un ensayo de captura de anticuerpos. En este caso, la muestra de prueba se deja unir a una fase sólida, y entonces se añade el anticuerpo anti-proteína marcadora y se deja unir. Tras eliminar por lavado el material no unido, se determina la cantidad de anticuerpo unido a la fase sólida usando un segundo anticuerpo marcado, frente al primero.
En otro ejemplo, se realiza un ensayo de competición entre la muestra y una proteína marcadora marcada o un péptido derivado de la misma, estando estos dos antígenos en competición por una cantidad limitada de anticuerpo anti-proteína marcadora unido a un soporte sólido. La proteína marcadora marcada o péptido de la misma podría incubarse previamente con el anticuerpo en la fase sólida, mediante lo cual la proteína marcadora en la muestra desplaza parte de la proteína marcadora o péptido de la misma unido al anticuerpo.
Aún en otro ejemplo, se deja que los dos antígenos compitan en una única incubación conjunta con el anticuerpo. Tras la eliminación del antígeno no unido del soporte mediante lavado, se determina la cantidad de marcador unido al soporte y se mide la cantidad de proteína en la muestra en referencia a curvas de titulación patrón establecidas previamente.
El marcador es preferiblemente una enzima. El sustrato para la enzima puede ser, por ejemplo, formador de color, fluorescente o quimioluminiscente.
La pareja de unión en el ensayo de unión es preferiblemente una pareja de unión específica marcada, pero no necesariamente un anticuerpo. Por ejemplo, cuando la proteína marcadora es alfa-1-antitripsina, la pareja de unión específica puede ser tripsina. La pareja de unión habitualmente estará marcada por sí misma, pero alternativamente puede detectarse mediante una reacción secundaria en la que se genera una señal, por ejemplo a partir de otra sustancia marcada.
Es sumamente preferible usar una forma de ensayo amplificado, mediante la cual se produce una "señal" potenciada a partir de un nivel relativamente bajo de proteína que va a detectarse. Una forma particular de inmunoensayo amplificado es el ensayo de quimioluminiscencia potenciada. De manera conveniente, el anticuerpo se marca con peroxidasa del rábano, que participa en una reacción quimioluminiscente con luminol, un sustrato de peróxido y un compuesto que potencia la intensidad y duración de la luz emitida, normalmente 4-yodofenol o ácido 4-hidroxicinámico.
Otra forma preferida de inmunoensayo amplificado es la inmuno-PCR. En esta técnica, el anticuerpo se une covalentemente a una molécula de ADN arbitrario que comprende cebadores de PCR, mediante lo cual el ADN con el anticuerpo unido al mismo se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Véase E. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids Research 23: 522-529 (1995). La señal se lee como anteriormente.
Alternativamente, la muestra diagnóstica puede someterse a electroforesis en gel bidimensional para producir un gel teñido y detectarse la concentración aumentada o disminuida de la proteína mediante una intensidad aumentada o disminuida de una mancha que contiene proteína en el gel teñido, en comparación con un control correspondiente o gel comparativo. Las manchas relevantes, enfermedades identificadas y expresión diferencial son los enumerados en la tabla 1 a continuación. La invención incluye un método de este tipo, independientemente de la identificación de la proteína marcadora facilitada anteriormente y en la tabla 2.
El diagnóstico no requiere necesariamente una etapa de comparación de la concentración de la proteína con un control, pero puede llevarse a cabo con referencia o bien a una muestra control o bien una muestra comparativa. Por tanto, la invención puede usarse para determinar el estadio de la evolución de la vCJD si se desea mediante la comparación de los niveles de proteína con los resultados obtenidos anteriormente del mismo paciente o mediante referencia a valores patrón que se consideran típicos del estadio de la enfermedad. De este modo, la invención puede usarse para determinar si, por ejemplo tras el tratamiento del paciente con un fármaco o fármaco candidato, la enfermedad ha evolucionado o no. El resultado puede conducir a un pronóstico del desenlace de la enfermedad.
La descripción incluye además el uso para un fin terapéutico o de diagnóstico (y por tanto posiblemente de pronóstico) de un material de pareja que reconoce, se une a o tiene afinidad por una proteína marcadora especificada anteriormente y/o representada por una mancha electroforética de gel bidimensional expresado de manera diferencial mostrado en cualquiera de las figuras 2 a 5 en el presente documento, o los picos de SELDI expresados de manera diferencial a PM 3223 Da, PM 4132 Da, PM 4340 Da, PM 4490 Da, PM 6243 Da, PM 7533 Da, PM 8644 Da, PM 8856 Da, PM 8868 Da, PM 14257 Da, PM 27202 Da. Por tanto, por ejemplo, pueden usarse anticuerpos frente a las proteínas marcadoras, apropiadamente humanizados cuando sea necesario, para tratar la vCJD y HD. El material de pareja será habitualmente un anticuerpo y se usará en cualquier formato compatible con el ensayo, de manera conveniente un formato inmovilizado, por ejemplo, perlas de micro o nanopartículas o un chip de vidrio, silicona o nitrocelulosa. O bien el material de pareja estará marcado o bien podrá interaccionar con un marcador.
La descripción incluye además un kit para su uso en un método de diagnóstico, que comprende un material de pareja, tal como se describió anteriormente, en un formato compatible con el ensayo, tal como se describió anteriormente, para su interacción con una proteína presente en la muestra diagnóstica.
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El diagnóstico puede basarse en la expresión diferencial de una, dos, tres o más de las proteínas marcadoras. Además, puede ser parte de un diagnóstico más amplio en el que se diagnostican una o más enfermedades adicionales además de la vCJD. Por consiguiente, la vCJD puede diagnosticarse junto con al menos otra enfermedad, que puede ser o no neurológica, en la misma muestra de fluido corporal, mediante un método que incluye detectar una concentración aumentada de otra proteína en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra de un sujeto humano normal de control. Esta(s) otra(s) enfermedad(es) puede(n) ser cualquiera que pueda diagnosticarse en un fluido corporal. Pueden ser neurológicas, por ejemplo otra encefalopatía espongiforme transmisible, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, meningitis, pero no son necesariamente neurológicas, por ejemplo síndrome de choque tóxico, MRSA o enfermedad celíaca.
Por tanto, en particular, se contempla usar un chip de anticuerpos o serie de chips que pueden diagnosticar una o más proteínas que interaccionan con ese anticuerpo.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención.
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Ejemplo 1
Se tomaron diez muestras de plasma de pacientes (4 mujeres, 6 hombres) a los que se les había diagnosticado la variante de CJD (vCJD), diez de pacientes (7 mujeres, 3 hombres) a los que se les había diagnosticado mediante pruebas genéticas que tenían la enfermedad de Huntington ("Huntington's disease", HD) que servían como control de enfermedad neurológica y diez de controles sin enfermedad, es decir, pacientes normales (8 mujeres, 2 hombres) que no tenían ningún síntoma neuropatológico.
Se eliminaron la albúmina e IgG de las muestras usando un kit suministrado por Amersham Biosciences UK Ltd. Este kit contiene una resina de afinidad que contiene un anticuerpo que elimina específicamente albúmina e IgG directamente de muestras de plasma y suero humano completo. Se reivindica que puede lograrse una eliminación de más del 95% de la albúmina y más del 90% de la IgG a partir de 15 \mul de suero/plasma humano, aumentando de ese modo la resolución de las proteínas de abundancia inferior en la electroforesis posterior. Se usa una columna de microcentrifugación, a través de la cual se eluye la proteína no unida.
Se llevó a cabo el empobrecimiento según las instrucciones del fabricante usando un volumen de partida de 15 \mul de muestra de plasma bruta. Se añadió la resina al plasma, se incubó la mezcla con agitación, se transfirió a una columna de microcentrifugación, se centrifugó y se recogió el filtrado. Se concentró la muestra empobrecida resultante y se desaló mediante precipitación con acetona (tal como se recomienda en las instrucciones del kit). Se decantó la acetona y se resuspendieron los sedimentos en tampón de lisis de gel 2-D convencional (urea 9,5 M, CHAPS al 2%, DTT al 1%, Pharmalyte al 0,8%, pH 3-10, inhibidores de proteasas (1 comprimido/10 ml de tampón de lisis) (Roche). Se usó esta suspensión para la electroforesis en gel bidimensional
Se realizó la electroforesis en gel bidimensional según J. Weekes et al., Electrophoresis 20: 898-906 (1999) y M. Y. Heinke et al., Electrophoresis 20: 2086-2093 (1999), usando tiras de gradiente no lineal de pH 3-10 inmovilizado de 18 cm (IPG). Se realizó la segunda dimensión usando electroforesis en gel de T SDS-poliacrilamida al 12%. Para el análisis inicial, se cargaron los geles con 75 microgramos de proteína. Se tiñeron los geles con plata con la tinción de plata analítica OWL (Insight Biotechnologies, RU).
Ser realizó el análisis de imagen cuantitativo y cualitativo usando el software ProgenesisTM Workstation, versión 2003.02 (Nonlinear Dynamics Ltd.). Se procesaron las imágenes a través del asistente automático para la detección, alabeo y apareamiento de manchas. Después de eso, se sometieron todas las imágenes a una edición manual extensa y un apareamiento óptimo con el gel de referencia (>80% por gel). Tras la resta del fondo y la normalización respecto al volumen de mancha total, se exportaron los datos de manchas de proteína a Excel para realizar el análisis estadístico cuantitativo y las comparaciones de cambios cualitativos.
Se realizó la prueba de la t de Student, al intervalo de confianza del 95%, para cada mancha de proteína que pudiera compararse entre las muestras de los pacientes enfermos y los controles y que estuviese presente en al menos el 60% de los geles de cada grupo, es decir, al menos 6. Se realizó una transformación logarítmica, puesto que ésta dio una distribución más normal, que cumple así mejor las suposiciones de esta prueba tal como se aplica a muestras independientes.
Las manchas para las que se observó una disminución o un aumento significativo en comparaciones entre los tres grupos se muestran en las figuras 2 a 5 y se enumeran en la tabla 1.
TABLA 1
2 
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Se observaron cambios cuantitativos en otras dos manchas (1293 y 2885) en los geles analíticos, pero no en los geles preparativos (véase a continuación). Ambos estaban en la comparación de vCJD frente al control neurológico (HD). La mancha 1293 disminuyó y 2885 aumentó en vCJD frente al control neurológico (HD).
Se observará que la mancha 1713 es uno al que puede atribuirse una confianza particularmente alta en los resultados en relación con el aumento en su intensidad en las muestras control neurológico (HD) frente a los controles. Esta mancha mostró también un aumento en la comparación de vCJD frente al control.
Las manchas 1893, 2732, 1526 y 2730 mostraron aumentos en la comparación de vCJD frente a los controles. La mancha 2732 también mostró un aumento en las muestras de vCJD en comparación con el control neurológico (HD).
La mancha 846 disminuyó en las muestras de vCJD en comparación con el control neurológico (HD).
Para fines preparativos, se prepararon luego geles bidimensionales adicionales mediante el mismo método, agrupando todas las muestras dentro de cada grupo experimental y cargando los geles con 400 microgramos de proteína. Se prepararon por tanto tres geles, uno para cada grupo, que estaban teñidos con plata, usando la tinción de plata PlusOne (Amersham Pharmacia Biosciences UK Ltd.).
Normalmente, se cortaron las manchas de los geles preparativos en los que tenían una intensidad elevada, pero cuando esto no era posible, es decir, cuando las manchas disminuyeron en intensidad en la vCJD, se cortaron de otro gel. Tras la reducción, alquilación y digestión en el gel del material cortado con tripsina, se extrajeron los péptidos producidos y se analizaron posteriormente mediante CL/EM/EM. Este procedimiento implica la separación de los péptidos mediante HPLC de fase inversa, seguido por electropulverización para ionizar la muestra, a medida que entra en un espectrómetro de masas en tándem. El espectrómetro de masas registra la razón de masa con respecto a carga de los iones de precursores peptídicos, que entonces se seleccionan individualmente para su fragmentación mediante disociación inducida por colisión (CID). Esta denominada exploración de EM/EM permite que se determine la secuencia del péptido. Para cada muestra, por tanto, el conjunto de datos incluye pesos moleculares determinados con precisión para múltiples péptidos presentes, acompañados por la correspondiente información de secuencia. Se usa entonces ésta para identificar la proteína mediante bases de datos de búsqueda. En el presente caso, se usó el algoritmo de búsqueda Mascot en las bases de datos SWISS-PROT y de proteína no redundante (nr) del Centro Nacional de Información biotecnológica ("National Center for Biotechnology Information") (NCBI).
Los resultados de la identificación se muestran en la tabla 2. Todas las manchas de la tabla 1 que se expresaban de manera diferencial en el gel se identificaron como proteínas conocidas. La tabla muestra los números de geninfo (gi) de la base de datos del NCBI y los números de registro de SwissProt.
En algunos casos, se identificó más de una proteína, lo que significa que la mancha cortada contenía una mezcla de proteína, al menos una de las cuales se expresaba de manera diferencial en el gel. Las proteínas identificadas en la base de datos tenían pesos moleculares y puntos isoeléctricos diferentes, inferiores o superiores, a los aparentes en el gel. Esto es totalmente habitual y puede explicarse porque la proteína dentro de la mancha del gel ha experimentado escisión química o enzimática o se ha modificado postraduccionalmente tal como mediante glicosilación, fosforilación o la adición de lípidos.
Como entre las manchas 2730 y 2732, que se refieren a formas de la misma proteína, 2732 tiene un pI ligeramente superior y por consiguiente debe entenderse que se haga referencia a la misma.
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TABLA 2
4 
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Notas al pie de página para la tabla 2
* La cadena beta de haptoglobina que consiste en los residuos 162-406 de la secuencia de la base de datos, que se forma por escisión enzimática del precursor; esta proteína se glicosila en el plasma
** Incluyendo 2 péptidos únicos
Ejemplo de referencia 2
Descubrimiento de biomarcadores de vCJD mediante espectrometría de masas SELDI-TOF
Se reveló un segundo conjunto de biomarcadores de vCJD usando espectrometría de masas en tiempo de vuelo mediante desorción/ionización por láser de superficie (SELDI). Se describen también experimentos para establecer la identidad de estos nuevos candidatos.
1.1 Preparación de la muestra para el descubrimiento mediante SELDI
Se recogieron las muestras de plasma usadas en el ejemplo 1 de casos clínicamente confirmados de vCJD (n=10), controles neurológicos (HD) (n=10) y pacientes de control sin enfermedad (n=10) de la unidad de priones MRC. Se diluyeron dos microlitros de cada una de las muestras empobrecidas en 3 \mul de tampón de lisis que contenía urea 9,5 M, CHAPS al 2%, Pharmalyte al 0,8% pH 3-10, DTT al 1% e inhibidor de proteasas y se diluyeron las muestras no empobrecidas en la misma razón usando el tampón de lisis anterior sin Pharmalyte.
1.2 Empobrecimiento del plasma
De manera consecuente con el estudio 2DE anterior, se eliminaron albúmina e IgG del plasma usando una resina comercialmente disponible (GE Healthcare). Este kit está basado en anticuerpos y contiene una resina que elimina específicamente albúmina e IgG directamente de muestras de plasma y suero humano. Se reivindica que puede lograrse > 95% de la albúmina y > 90% de la IgG a partir de 15 \mul de suero/plasma humano, aumentando de ese modo la resolución de proteínas de abundancia inferior. Se usa una columna de microcentrifugación a través de la cual se eluye la proteína no unida.
Se llevó a cabo el empobrecimiento según las instrucciones del fabricante usando un volumen de partida de 15 \mul de muestra de plasma bruta. La muestra empobrecida resultante se precipitó con acetona (tal como se recomienda en las instrucciones del kit) y se resuspendió en tampón de lisis 2DE (tal como se indicó en la sección 2.2 anterior) convencional.
1.3 Espectrometría de masas mediante desorción/ionización por láser de superficie (SELDI)
Se realizó el perfilado de las muestras de plasma empobrecido usando una serie de chips de proteínas de intercambio aniónico fuerte de ocho manchas (Q10) y se realizó el perfilado del plasma no empobrecido usando las series de chips de proteínas de intercambio catiónico débil (CM10) y Q10 de ocho manchas. Se ejecutaron todas las muestras por duplicado y de manera aleatorizada. Esencialmente, se equilibraron todos los chips Q10 y CM10 cuatro veces en el tampón de lavado apropiado. Para los chips Q10, se usó Tris HCl 100 mM pH 9,0 como tampón de lavado y para CM10 el tampón de lavado fue acetato de sodio 50 mM pH 7,5. Se aplicaron 5 \mul de las muestras diluidas a cada mancha y esto se incubó entonces en una cámara de humedad durante 45 minutos. Se retiraron cuidadosamente las muestras y se lavaron los chips cuatro veces en el tampón de lavado apropiado y un lavado con agua 18,2 M\Omega. Se aplicaron dos veces a cada mancha 0,6 \mul de disolución de matriz que contenía ácido sinapínico 20 mg/ml (Ciphergen) en acetonitrilo al 50% (Fisher Scientific) y ácido trifluoroacético al 0,5%. Se realizó la adquisición de datos usando un lector PBS-II (Ciphergen Biosystems). Se adquirieron los espectros usando una suma de 155 disparos con una intensidad de láser de 200, una sensibilidad del detector de 8 y una masa focal m/z de 25000. La resta del valor inicial y la normalización respecto al recuento iónico total se realizaron en todos los espectros. Se acometió la calibración interna de cada espectro usando un mínimo de 2 picos en cada espectro.
Se muestran los rastros de SELDI para el conjunto de datos Q10 SAX2 de plasma empobrecido en las figuras 6 y 7. La figura 6 muestra espectros de SELDI que muestran picos en la región de m/z 4100-4500. La figura 7 muestra espectros de SELDI que muestran picos en la región de m/z 8600-9400. Los paneles superior e inferior muestran espectros superpuestos que pertenecen a los grupos control (CTRL) y vCJD, respectivamente. Los asteriscos (*) marcan los picos de interés.
Se muestran rastros de SELDI para el conjunto de datos CM10 WCX de plasma no empobrecido en las figuras 8 a 13.
1.4 Análisis de los datos de SELDI
El enfoque de análisis de datos adoptado para este estudio comprende varios módulos tal como se describe a continuación. Para ser considerado como candidato de interés, cada biomarcador debe satisfacer los siguientes tres criterios, cuyos valores se derivan o bien del proceso de modelado multivariado o bien de pruebas univariadas.
\bullet
La posición del pico de interés dentro de las gráficas de cargas indica una contribución obvia a la separación de los grupos en el proceso de modelado de datos y esto sobrevive también a un ejercicio de validación cruzada.
\bullet
Se logra un valor de p <0,05 usando una prueba univariada de Mann-Whitney.
\bullet
La magnitud del cambio en abundancia del marcador entre dos grupos es > 1,5 veces regulado o bien por incremento o bien por disminución.
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Preprocesamiento: Se importaron todos los datos al paquete de software SIMCA-P (Umetrics). Se excluyeron variables correspondientes a masas inferiores a m/z 2.500 debido al considerable ruido químico en esta región. Las variables restantes correspondientes a masas entre m/z 2.500 y m/z 100.000 se centraron al valor medio y se convirtieron a escala de Pareto.
Análisis de componentes principales (ACP): Se ajustaron modelos de ACP a los conjuntos de datos con tantos componentes (A) como se ajustarían siguiendo las reglas internas que SIMCA-P usa para determinar la significación de los componentes (Eriksson et al. 2001). Se usaron los parámetros de bondad del ajuste (R^{2}) y bondad de la predicción (Q^{2}) para evaluar la utilidad de cada uno de los componentes posteriores ajustados en el modelo. Se inspeccionaron los componentes ajustados automáticamente y se mantuvieron siempre que el parámetro Q^{2} fuese creciente. El parámetro R^{2} acumulativo para el componente aceptado final dio la proporción total de varianza en los datos explicada por el modelo. Se produjeron gráficas que presentaban las puntuaciones de observaciones (t) y las cargas de variables (p) para pares de componentes principales (a). Se inspeccionaron las gráficas de las puntuaciones para buscar patrones de variación sistemática y observaciones de valor extremo que pudiesen dificultar los esfuerzos de clasificación posteriores. En particular, se examinaron las posiciones de observaciones analizadas en cada chip para comprobar la existencia de chips poco habituales. Se comprobó también la reproducibilidad de análisis de muestras duplicadas usando las gráficas de puntuaciones. La elipse mostrada en las gráficas de puntuaciones corresponde a la T^{2} de Hotelling al 95%, una adaptación multivariada de una región de confianza. Para un conjunto de datos con una distribución normal multivariada, se esperaría que el 95% de las observaciones se encontrara dentro de la región abarcada por la elipse, por tanto las observaciones que están una gran distancia fuera de la elipse pueden representar problemas que han de investigarse y abordarse.
Se interpretaron las tendencias encontradas a través de la inspección de las gráficas de puntuaciones a través de la inspección de las variables encontradas en las correspondientes gráficas de cargas. Se consideró que los valores de m/z individuales representados gráficamente en los extremos de la gráfica eran los más influyentes en la separación de los grupos. De manera interesante, tales gráficas tienden a mostrar varios puntos de datos de m/z consecutivos, que describen eficazmente el pico original observado en los propios perfiles de SELDI.
Modelado y análisis de datos por mínimos cuadrados parciales (PLS-DA): Se ajustaron componentes (A) de los modelos de PLS-DA a los conjuntos de datos siempre que cumplieran los criterios usados por SIMCA-P para determinar la significación de los componentes (Eriksson et al. 2001). Como para el modelado de ACP, se inspeccionaron los parámetros R^{2} y Q^{2} para determinar qué componentes deben incluirse en el modelo. A diferencia del modelado de ACP, los modelos de PLS-DA presentan valores de R^{2} que describen el ajuste del modelo tanto a las variables X (medición) como a las variables Y (clase). Se produjeron gráficas que presentaban las puntuaciones de observaciones (t) y los pesos de variables (w*c) para pares de componentes de PLS (a). Debido a que cada componente de PLS se ajusta de modo que ambos se aproximan bien a los datos de X e Y y maximizan la correlación entre los datos X e Y, en la práctica los primeros uno o dos componentes habitualmente separan bien las observaciones cuando hay pocos grupos presentes en el conjunto de datos. La interpretación de las puntuaciones de PLS y las gráficas de pesos es similar a la usada para interpretar un modelo de ACP, siendo los pesos de PLS análogos a las cargas de ACP. Se calculó la T^{2} de Hotelling y se presentó en todas las gráficas de puntuaciones de PLS para ayudar a identificar las observaciones que se desviaban.
Se usaron los dos parámetros denominados influencia de las variables sobre la proyección (VIP) y coeficientes de PLS (COEFF) para determinar cuál de todas las masas medidas en los datos espectrales de SELDI era la más importante en la definición de los parámetros del modelo y la explicación de los grupos. Se determinaron umbrales específicos empíricamente y se usaron para excluir aquellas variables con valores de VIP y COEFF inferiores al umbral. Se determinó la capacidad de los modelos de PLS-DA generados para predecir correctamente la clase de (nuevas) muestras mediante validación cruzada 2 veces. Se realizó la validación cruzada dividiendo el conjunto de datos en un conjunto de entrenamiento y un conjunto de prueba. Se ajustó un modelo de PLS-DA a la parte de entrenamiento del conjunto de datos y se usó posteriormente para predecir las clases de la parte de prueba del conjunto de datos. Se intercambiaron entonces los conjuntos de datos de prueba y entrenamiento y se repitió el proceso. Se registró el número de clasificaciones correctas e incorrectas de ambas rondas de prueba y se usó para calcular las sensibilidades y especificidades de las predicciones. Se usó el método de validación cruzada para someter a prueba ambos modelos construidos usando el conjunto de datos que contenía todas las variables y aquellos construidos tras la selección de variables (tal como se describió anteriormente).
Métodos univariados: Se realizaron pruebas de significación estadística usando el software Protein Chip (Ciphergen Biosystems). Se usaron pruebas de Mann-Whitney (Wilcoxon) para dos muestras independientes. El apareamiento y detección de los picos se realizaron usando el software Protein Chip y se sometieron estos datos al módulo Biomarker Wizard para su análisis. Se tomó el valor de p como el resultado de la prueba. Se exportaron también los datos de cada uno de los picos marcados a Excel (Microsoft) como intensidades de pico para calcular el criterio de cambio en veces para cada pico. Debido a la distribución sesgada observada para las áreas o intensidades de cada conjunto de picos apareados, se sometieron los datos a transformación log_{10} antes del cálculo de los valores medios y mediana de las distribuciones así como las desviaciones estándar. Se transformaron entonces de nuevo los parámetros de las distribuciones a las escalas originales con el fin de calcular los cambios en veces y los tamaños de efecto. Se calcularon los cambios en veces dividiendo el mayor de los valores medios (o mediana) por el valor más pequeño de dos grupos, produciendo un valor mayor que o igual a uno. Se calculó el tamaño de efecto (D de Cohen) como la diferencia entre los valores medios de los dos grupos divididos entre la desviación estándar agrupada.
1.5 Identificación de candidatos
Habiendo producido/creado una lista de picos de interés candidatos correspondientes a cada superficie de chip, se determinó la identidad de las proteínas responsables de cada pico de diferenciación.
Se extrajo material directamente de la superficie del chip y tras la separación electroforética y la digestión enzimática se identificaron las proteínas mediante espectrometría de masas en tándem por electropulverización (CL/EM/EM).
Hay varias ventajas inherentes a esta estrategia:
\bullet
El agrupamiento de material de varias posiciones diana supera los desafíos de trabajar con un bajo nivel de proteína y se logra un aumento de sensibilidad.
\bullet
La SDS-PAGE proporciona un estadio adicional de visualización de la muestra así como sirve como una importante etapa de separación y concentración.
\bullet
La CL/EM/EM de las proteínas digeridas es una metodología de rutina en el laboratorio.
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Se cortaron bandas de interés del gel teñido con plata y se realizaron la reducción, alquilación y digestión en el gel con tripsina antes del análisis posterior mediante CL/EM/EM. Se extrajeron péptidos de los trozos de gel mediante una serie de lavados con acetonitrilo y bicarbonato de amonio. Se agrupó el extracto con el sobrenadante inicial y se liofilizó. Se resuspendió entonces cada muestra en 23 \mul de bicarbonato de amonio 50 mM. Se realizaron separaciones cromatográficas usando un sistema Ultimate LC (Dionex, RU). Se resolvieron los péptidos mediante cromatografía de fase inversa en una columna C18 PepMap de 75 \mum. Se suministró un gradiente de acetonitrilo en ácido fórmico al 0,05% para eluir los péptidos a una velocidad de flujo de 200 nl/min. Se ionizaron los péptidos mediante ionización por electropulverización usando una fuente de pulverización Z montada en un instrumento QTof-micro (Waters Corp.). Se ajustó el instrumento para que funcionase en un modo de conmutación automatizado, seleccionando iones precursores basándose en su m/z e intensidad, para su secuenciación mediante fragmentación inducida por colisión.
Se procesaron los datos espectrales de masas en listas de picos (que contenían la m/z del ión precursor y el estado de carga y la m/z e intensidad de los iones de fragmentos). Se acometió la búsqueda en bases de datos para establecer la identidad de la(s) proteína(s) presente(s). Se realizó esto usando el algoritmo de búsqueda Mascot en las bases de datos SWISS-PROT y no redundante (nr) del NCBI.
Una vez identificadas las proteínas, se extrapoló el peso molecular esperado de las proteínas maduras a partir de la información contenida dentro de la entrada de la base de datos y se correlacionó con el peso molecular determinado experimentalmente en los perfiles de SELDI originales. De este modo, fue posible en la mayoría de los casos asignar especies relacionadas a una secuencia de proteína individual.
2.1 Análisis de datos de SELDI
Tras el análisis extenso usando técnicas multivariadas y pruebas de Mann-Whitney, el estudio en plasma empobrecido (chip Q10 SAX) reveló variación en varios picos, que diferenciaban entre muestras de vCJD y control (véase la tabla 3 a continuación). De manera similar, para el plasma no empobrecido, los perfiles de CM10 WCX revelaron picos diferenciadores adicionales (véase la tabla 4 a continuación).
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TABLA 3 Picos de SELDI de interés que diferencian entre muestras de vCJD y control (estudio en plasma empobrecido usando el chip Q10 SAX chip)
5
TABLA 4 Picos de SELDI de interés que diferencian entre muestras de vCJD y control (estudio en plasma no empobrecido usando el chip CM10 WCX)
6
Notas:
a)
Valores de p calculados para una prueba de Mann-Whitney (no corregida para pruebas múltiples).
b)
Se estimaron los valores de intensidad de pico medio y mediana para cada grupo tras una transformación log_{10} de los datos. Se transformaron de nuevo las estimaciones a la escala original antes del cálculo de los cambios en veces.
c)
Se calcula el tamaño de efecto (D de Cohen) como la diferencia entre las medias dividida entre la desviación estándar agrupada.
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2.2 Identificación de candidatos
En la figura 14 se muestra el gel teñido con plata del material extraído de chips Q10 de plasma empobrecido. Aunque se cortaron un total de 36 secciones, se consideró que 9 secciones eran importantes para el objetivo clave de la identificación de las proteínas responsables de los picos indicados en la tabla 3. De hecho, se dio prioridad al análisis de CL/EM/EM de estas bandas particulares, concretamente las bandas 2, 3, 4, 5, 7 y 8 del carril control y las bandas 9, 10 y 11 del carril de vCJD. En la tabla 5 se proporciona un resumen de los resultados. De manera similar, se acometió CL/EM/EM sobre el material extraído del chip CM10 WCX. En la figura 15 se muestra el gel teñido con plata del material extraído de los chips WCX CM10 de plasma empobrecido y en la tabla 6 se muestran las proteínas identificadas en los análisis.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 5 Resumen de los resultados de CL/EM/EM para bandas extraídas de los chips Q10
7
Nota: * Los pesos moleculares indicados en Swiss Prot generalmente se refieren a las proteínas precursoras en lugar de a las proteínas maduras, que existen tras su procesamiento. Obsérvese también que la interpretación adicional de los datos de CL/EM/EM para las bandas 9, 10 y 11 puede revelar la presencia de fragmentos proteolíticos inesperados.
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TABLA 6 Resumen de los resultados de CL/EM/EM para bandas extraídas de los chips CM10
8
Los resultados sugieren existe una colección de fragmentos de albúmina humana en los perfiles de SELDI y que éstos difieren en abundancia cuando se comparan casos de vCJD con los controles. Es evidente que éstos se refieren a la región N-terminal de la proteína en particular. Por tanto, se reivindica que seis picos de candidatos están relacionados con fragmentos N-terminales de albúmina humana y la base de esta reivindicación se ilustra en la tabla 7 a continuación.
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TABLA 7 Lista de biomarcadores candidatos emparejados con fragmentos dentro de la región N-terminal de la albúmina humana
9 
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Se recuperó la secuencia del precursor de albúmina humana de la base de datos Swiss Prot (P02768) y se exportó al paquete de software Biolynx dentro de MassLynx para su examen. La secuencia de albúmina madura se crea eliminando los primeros 18 aminoácidos como péptido señal así como 5 aminoácidos adicionales que se refieren a una secuencia de propéptido. Los números de residuos indicados se refieren a la proteína madura de 585 aminoácidos en total. Cada valor de Mr promedio observada se encuentra dentro del 0,1% de error de masa del valor predicho.
Para la cadena beta de hemoglobina (P02025) puede emparejarse un fragmento que se extiende desde los residuos 4-43 hasta el pico a m/z 4490 (P5) y esto abarca dos péptidos observados en los datos de CL/EM/EM. Estos resultados se resumen a continuación. Por tanto, se reivindica que es posible que el número de referencia de candidato P5 sea los residuos 4-43 de la cadena beta de hemoglobina.
El procesamiento potencial de la cadena beta de hemoglobina se muestra tal como sigue:
11
La secuencia de aminoácidos de la cadena beta de hemoglobina se muestra con la ubicación del fragmento potencial, residuos 4-43 (P5), indicados mediante la flecha. El recuadro indica la ubicación de los péptidos observados en los datos de CL/EM/EM.

Claims (14)

1. Método de diagnóstico de vCJD en una muestra diagnóstica de un tejido o fluido corporal válido tomado de un sujeto humano, que comprende detectar una concentración aumentada de beta-actina en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra de un sujeto humano de control.
2. Método según la reivindicación 1, que comprende detectar una concentración aumentada de dos o más proteínas en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra de un sujeto humano normal de control, siendo las proteínas:
beta-actina y
precursor de apolipoproteína A-IV.
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3. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la detección se realiza sobre la muestra diagnóstica mediante un ensayo de unión para la beta-actina.
4. Método según la reivindicación 3, en el que el ensayo de unión comprende provocar que la beta-actina de la muestra diagnóstica interaccione con una pareja de unión específica respectiva y detectar la interacción.
5. Método según la reivindicación 4, en el que la pareja de unión específica marcada es un anticuerpo marcado que reconoce la beta-actina.
6. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la muestra diagnóstica se somete a electroforesis en gel bidimensional para producir un gel teñido y se detecta la concentración aumentada o disminuida de la beta-actina mediante una intensidad aumentada o disminuida de una mancha que contiene proteína sobre el gel teñido, en comparación con un gel control correspondiente.
7. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la vCJD se diagnostica con cualquier otra enfermedad.
8. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la muestra diagnóstica es un fluido corporal.
9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el tejido corporal válido es de cerebro, nervio, amígdala, bazo u otro tejido linforreticular.
10. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que otra enfermedad, que puede o no ser neurológica, se diagnostica en la misma muestra del tejido corporal, mediante un método que comprende detectar una concentración aumentada de otra proteína en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra de un sujeto humano normal de control.
11. Uso para el diagnóstico de vCJD de un material de pareja que reconoce, se une a o tiene afinidad por la beta-actina según la reivindicación 1.
12. Uso según la reivindicación 11, en el que el material de pareja es un anticuerpo.
13. Uso según la reivindicación 12, en el que el anticuerpo se inmoviliza sobre una fase sólida.
14. Uso según la reivindicación 12, en el que el anticuerpo se inmoviliza sobre perlas o como un chip.
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