ES2344118T3 - Diagnostico de enfermedades neurodegenerativas. - Google Patents
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Abstract
Método de diagnóstico de vCJD en una muestra diagnóstica de un tejido o fluido corporal válido tomado de un sujeto humano, que comprende detectar una concentración aumentada de beta-actina en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra de un sujeto humano de control.
Description
Diagnóstico de enfermedades
neurodegenerativas.
Esta invención se refiere al diagnóstico de
enfermedades neurodegenerativas, concretamente la variante de la
enfermedad de Creutzfeld-Jakob (vCJD).
La neuropatología de la enfermedad de
Creutzfeld-Jakob, como de otras enfermedades
priónicas, se manifiesta por sí misma como un aspecto espongiforme
característico del tejido cerebral, muerte de células neuronales en
el sistema nervioso central, acompañado por proliferación de
astrocitos y en algunos casos la deposición de placas amiloides.
Característico de todas las enfermedades priónicas es la acumulación
en el cerebro de una forma alterada, asociada a enfermedad, de la
proteína priónica normal (PrP^{c}) representada como PrP^{Sc}.
Cuatro tipos de PrP^{Sc} están asociados con enfermedad priónica
humana. De éstas, el tipo 4 está asociado sólo con la variante de
CJD (vCJD) que salió a la luz en el RU en 1996. Se cree que ha
surgido del consumo por los seres humanos de carne de ternera
infectada con BSE. Ninguna muestra de otras enfermedades priónicas
ha mostrado un perfil de tipo 4.
Las dificultades del diagnóstico de la vCJD han
conducido a la necesidad de que se desarrollen métodos
adicionales.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona el uso de
beta-actina y el precursor de apolipoproteína
A-IV en o para el diagnóstico de la vCJD. Se ha
encontrado que estas proteínas marcadoras se expresan de manera
diferencial en electroforesis bidimensional y/o perfilado de plasma
por espectrometría de masas en tiempo de vuelo mediante
desorción-ionización por láser de superficie
(SELDI).
La descripción identifica las proteínas
marcadoras y sus características de expresión diferencial tal como
sigue:
- IA.
- Proteínas presentes en una concentración aumentada en una muestra de vCJD en comparación con controles neurológicos y/o sin enfermedad: cadena beta de haptoglobina que consiste en los residuos 162-406 (n.º de registro de SwissProt P00738); cadena beta de hemoglobina (n.º de registro de SwissProt P02023), alfa-1-antitripsina (n.º de registro de SwissProt P0l009), beta-actina (n.º de registro de SwissProt P60709), cadena beta de hemoglobina (n.º de registro de SwissProt P02023) y precursor de apolipoproteína A-IV (n.º de registro de SwissProt P06727);
- IB.
- Proteína presente en una concentración disminuida en una muestra de vCJD, en comparación con un control: precursor de alfa-fibrinógeno (n.º de registro de SwissProt P02671); proteína IGHG4 (n.º de registro de SwissProt Q8TC63); cadena pesada lambda de inmunoglobulina; precursor del inhibidor de proteasa plasmática (C1) (n.º de registro de SwissProt P05155); componente 1 del complemento, subcomponente s (n.º de registro de SwissProt P09871), precursor de butirilcolinesterasa (n.º de registro de SwissProt P06276), componente C4B del complemento (n.º de registro de SwissProt P0l028) y lumicano (n.º de registro de SwissProt P51884).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
2. Proteínas presentes en una concentración
aumentada o disminuida en una muestra de vCJD en comparación con un
control:
La invención se define en las
reivindicaciones.
La proteína marcadora puede está presente en el
tejido corporal en cualquier forma biológicamente relevante, por
ejemplo en una forma glicosilada, fosforilada, multimérica o
precursora.
Aunque hay un alto grado de confianza en la
identificación de las proteínas marcadoras especificadas
anteriormente, las proteínas pueden definirse alternativamente en
cuanto a ser manchas expresadas de manera diferencial en un gel
electroforético bidimensional, concretamente los identificados en
las figuras 2 a 5 en el presente documento, independientemente de
los nombres y las identificaciones de bases de datos facilitados
anteriormente.
La expresión "expresado de manera
diferencial" en el contexto de electroforesis en gel
bidimensional significa que las manchas que portan proteína teñida
están presentes a una densidad óptica superior o inferior en el gel
de la muestra tomada para el diagnóstico (la "muestra
diagnóstica") que en el gel de una muestra control u otra
muestra comparativa, y en el contexto de SELDI-TOF
significa que el pico de proteína es a una intensidad superior o
inferior en el espectrograma de masas de la muestra tomada para el
diagnóstico (la "muestra diagnóstica") que el espectrograma de
masas de una muestra control u otra muestra comparativa. Se deduce
que las proteínas están presentes en el plasma de la muestra
diagnóstica a una concentración superior o inferior que en la
muestra control u otra muestra comparativa en la misma dirección de
expresión diferencial observada en la electroforesis en gel
S-dimensional y SELDI-TOF.
El término "control" se refiere a un sujeto
humano que no padece vCJD.
La terminología "concentración
aumentada/disminuida... en comparación con una muestra de un
control" no implica que se acometa realmente una etapa de
comparación, puesto que en muchos casos será obvio para el experto
que la concentración es anómalamente alta. Además, cuando el
estadio de la evolución de la vCJD está monitorizándose
progresivamente, la comparación realizada puede ser con la
concentración anteriormente observada en el mismo sujeto más
temprano en la evolución de la enfermedad.
La expresión "pareja de unión" incluye una
sustancia que reconoce o tiene afinidad por la proteína marcadora.
Puede estar o no marcada por sí misma.
La expresión "proteína marcadora" incluye
todas las formas biológicamente relevantes de la proteína
identificada.
El término "diagnóstico", tal como se usa
en el presente documento, incluye determinar si está presente o
ausente la vCJD y también incluye determinar el estadio hasta el que
ha evolucionado. El diagnóstico puede servir como base de un
pronóstico en cuanto al desenlace futuro para el paciente.
La expresión "tejido corporal válido"
significa cualquier tejido en el que puede esperarse razonablemente
que se acumule una proteína marcadora en relación con la vCJD.
Aunque será principalmente un fluido corporal, también incluye
tejido del cerebro o de los nervios, la amígdala, el bazo u otro
tejido linforreticular, se entiende que el diagnóstico puede
realizarse o bien pre mortem o bien post mortem.
La figura 1 es una fotografía de un gel
bidimensional típico realizado para fines analíticos, mediante el
método descrito en el ejemplo 1 a continuación, en una muestra
derivada de un paciente con vCJD. El peso molecular (masa molecular
relativa) se muestra en la ordenada en kiloDaltons. Los marcadores
de peso molecular se muestran en el lado izquierdo. El punto
isoeléctrico (pI) se muestra en la ordenada, aumentando de izquierda
a derecha.
La figura 2 es una fotografía de un gel similar,
pero marcado con las manchas 1713, 1893, 1960, 2730 y 2732,
explicados en detalle en el ejemplo 1. La mancha 1960, aunque es una
proteína marcadora para HD (no para vCJD), se muestra aquí por
conveniencia, puesto que aparece en pacientes con vCJD, a
aproximadamente el mismo nivel que en un control.
La figura 3 es una fotografía ampliada para
mostrar una parte del gel de la figura 1 y las manchas 846 y
1526.
La figura 4 es una fotografía ampliada para
mostrar otra parte del gel de la figura 1 y la mancha 1488. Las
manchas 1293 y 2885 se muestran también, pero no se continuó más con
ellos, tal como se explica en el ejemplo 1.
La figura 5 es similar a la figura 2, pero
mostrando las manchas 1713 y 1960 en una muestra derivada de un
paciente con HD.
Las figuras 6 a 13 son rastros de SELDI, tal
como se describe más completamente en el ejemplo 2.
La figura 14 es una imagen de un gel teñido con
plata del material extraído de chips Q10 de plasma empobrecido, tal
como se describe en el ejemplo 2.
La figura 15 es una imagen de un gel teñido con
plata del material extraído de chips WCX CM10 de plasma empobrecido,
tal como se describe en el ejemplo 2.
Un método de diagnóstico preferido comprende
realizar un ensayo de unión para la proteína marcadora. Puede
usarse cualquier pareja de unión razonablemente específica.
Preferiblemente, la pareja de unión está marcada. Preferiblemente,
el ensayo es un inmunoensayo, especialmente entre el marcador y un
anticuerpo que reconoce la proteína, especialmente un anticuerpo
marcado. Puede ser un anticuerpo producido contra parte o la
totalidad de la misma, lo más preferiblemente un anticuerpo
monoclonal o un antisuero anti-ser humano policlonal
de alta especificidad para la proteína marcadora.
Por tanto, las proteínas marcadoras descritas
anteriormente son útiles para el fin de producir anticuerpos frente
a las mismas que pueden usarse para detectar la concentración
aumentada o disminuida de las proteínas marcadoras presentes en una
muestra de diagnóstico. Tales anticuerpos pueden producirse mediante
cualquiera de los métodos bien conocidos en el campo del
inmunodiagnóstico.
Los anticuerpos pueden ser contra/frente a
cualquier estado biológicamente relevante de la proteína. Por tanto,
por ejemplo, podrían producirse contra la forma no glicosilada de
una proteína que existe en el cuerpo en una forma glicosilada,
contra una forma más madura de una proteína precursora, por ejemplo
menos su secuencia señal, o contra un péptido que porta un epítopo
relevante de la proteína marcadora.
La muestra puede tomarse de cualquier tejido
corporal válido, especialmente fluido corporal, de un sujeto
(humano), pero preferiblemente sangre, plasma o suero. Otros fluidos
corporales que pueden usarse incluyen líquido cefalorraquídeo
(LCR), orina y lágrimas.
Según otro ejemplo, el diagnóstico se lleva a
cabo pre o post mortem en un tejido corporal de origen
neurológico relevante para la vCJD tal como del cerebro o de los
nervios, la amígdala, el bazo u otro tejido linforreticular. El
tejido se trata previamente para extraer proteínas del mismo,
incluyendo las que estarían presentes en la sangre del fallecido,
de modo que se garantiza que las proteínas marcadoras relevantes
especificadas anteriormente estarán presentes en una muestra
positiva. Para los fines de esta memoria descriptiva de patente, un
extracto de este tipo es equivalente a un fluido corporal.
A modo de ejemplo, se disecciona el tejido
cerebral y se solubilizan subsecciones mediante métodos bien
establecidos en la técnica tales como rotura mecánica en una
solución salina tamponada con fosfato, en una razón de
aproximadamente 100 mg de tejido con respecto a 1 ml de tampón.
Cuando sea deseable pueden incluirse sales caotrópicas tales como
clorhidrato de guanidinio o dodecilsulfato de sodio para inactivar
el agente priónico infeccioso siempre que esto no interfiera con la
posterior detección de los biomarcadores de la vCJD.
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El inmunoensayo preferido se lleva a cabo
midiendo el grado de la interacción proteína/anticuerpo. Puede
usarse cualquier método de inmunoensayo conocido. Se prefiere un
ensayo tipo "sandwich". En este método, se une un primer
anticuerpo frente a la proteína marcadora a la fase sólida tal como
un pocillo de una placa de microtitulación de plástico, y se incuba
con la muestra y con un segundo anticuerpo marcado específico frente
a la proteína que va a someterse a ensayo. Alternativamente, podría
usarse un ensayo de captura de anticuerpos. En este caso, la
muestra de prueba se deja unir a una fase sólida, y entonces se
añade el anticuerpo anti-proteína marcadora y se
deja unir. Tras eliminar por lavado el material no unido, se
determina la cantidad de anticuerpo unido a la fase sólida usando
un segundo anticuerpo marcado, frente al primero.
En otro ejemplo, se realiza un ensayo de
competición entre la muestra y una proteína marcadora marcada o un
péptido derivado de la misma, estando estos dos antígenos en
competición por una cantidad limitada de anticuerpo
anti-proteína marcadora unido a un soporte sólido.
La proteína marcadora marcada o péptido de la misma podría
incubarse previamente con el anticuerpo en la fase sólida, mediante
lo cual la proteína marcadora en la muestra desplaza parte de la
proteína marcadora o péptido de la misma unido al anticuerpo.
Aún en otro ejemplo, se deja que los dos
antígenos compitan en una única incubación conjunta con el
anticuerpo. Tras la eliminación del antígeno no unido del soporte
mediante lavado, se determina la cantidad de marcador unido al
soporte y se mide la cantidad de proteína en la muestra en
referencia a curvas de titulación patrón establecidas
previamente.
El marcador es preferiblemente una enzima. El
sustrato para la enzima puede ser, por ejemplo, formador de color,
fluorescente o quimioluminiscente.
La pareja de unión en el ensayo de unión es
preferiblemente una pareja de unión específica marcada, pero no
necesariamente un anticuerpo. Por ejemplo, cuando la proteína
marcadora es alfa-1-antitripsina, la
pareja de unión específica puede ser tripsina. La pareja de unión
habitualmente estará marcada por sí misma, pero alternativamente
puede detectarse mediante una reacción secundaria en la que se
genera una señal, por ejemplo a partir de otra sustancia
marcada.
Es sumamente preferible usar una forma de ensayo
amplificado, mediante la cual se produce una "señal" potenciada
a partir de un nivel relativamente bajo de proteína que va a
detectarse. Una forma particular de inmunoensayo amplificado es el
ensayo de quimioluminiscencia potenciada. De manera conveniente, el
anticuerpo se marca con peroxidasa del rábano, que participa en una
reacción quimioluminiscente con luminol, un sustrato de peróxido y
un compuesto que potencia la intensidad y duración de la luz
emitida, normalmente 4-yodofenol o ácido
4-hidroxicinámico.
Otra forma preferida de inmunoensayo amplificado
es la inmuno-PCR. En esta técnica, el anticuerpo se
une covalentemente a una molécula de ADN arbitrario que comprende
cebadores de PCR, mediante lo cual el ADN con el anticuerpo unido
al mismo se amplifica mediante la reacción en cadena de la
polimerasa. Véase E. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids
Research 23: 522-529 (1995). La señal se lee como
anteriormente.
Alternativamente, la muestra diagnóstica puede
someterse a electroforesis en gel bidimensional para producir un
gel teñido y detectarse la concentración aumentada o disminuida de
la proteína mediante una intensidad aumentada o disminuida de una
mancha que contiene proteína en el gel teñido, en comparación con un
control correspondiente o gel comparativo. Las manchas relevantes,
enfermedades identificadas y expresión diferencial son los
enumerados en la tabla 1 a continuación. La invención incluye un
método de este tipo, independientemente de la identificación de la
proteína marcadora facilitada anteriormente y en la tabla 2.
El diagnóstico no requiere necesariamente una
etapa de comparación de la concentración de la proteína con un
control, pero puede llevarse a cabo con referencia o bien a una
muestra control o bien una muestra comparativa. Por tanto, la
invención puede usarse para determinar el estadio de la evolución de
la vCJD si se desea mediante la comparación de los niveles de
proteína con los resultados obtenidos anteriormente del mismo
paciente o mediante referencia a valores patrón que se consideran
típicos del estadio de la enfermedad. De este modo, la invención
puede usarse para determinar si, por ejemplo tras el tratamiento del
paciente con un fármaco o fármaco candidato, la enfermedad ha
evolucionado o no. El resultado puede conducir a un pronóstico del
desenlace de la enfermedad.
La descripción incluye además el uso para un fin
terapéutico o de diagnóstico (y por tanto posiblemente de
pronóstico) de un material de pareja que reconoce, se une a o tiene
afinidad por una proteína marcadora especificada anteriormente y/o
representada por una mancha electroforética de gel bidimensional
expresado de manera diferencial mostrado en cualquiera de las
figuras 2 a 5 en el presente documento, o los picos de SELDI
expresados de manera diferencial a PM 3223 Da, PM 4132 Da, PM 4340
Da, PM 4490 Da, PM 6243 Da, PM 7533 Da, PM 8644 Da, PM 8856 Da, PM
8868 Da, PM 14257 Da, PM 27202 Da. Por tanto, por ejemplo, pueden
usarse anticuerpos frente a las proteínas marcadoras,
apropiadamente humanizados cuando sea necesario, para tratar la vCJD
y HD. El material de pareja será habitualmente un anticuerpo y se
usará en cualquier formato compatible con el ensayo, de manera
conveniente un formato inmovilizado, por ejemplo, perlas de micro o
nanopartículas o un chip de vidrio, silicona o nitrocelulosa. O
bien el material de pareja estará marcado o bien podrá interaccionar
con un marcador.
La descripción incluye además un kit para su uso
en un método de diagnóstico, que comprende un material de pareja,
tal como se describió anteriormente, en un formato compatible con el
ensayo, tal como se describió anteriormente, para su interacción
con una proteína presente en la muestra diagnóstica.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El diagnóstico puede basarse en la expresión
diferencial de una, dos, tres o más de las proteínas marcadoras.
Además, puede ser parte de un diagnóstico más amplio en el que se
diagnostican una o más enfermedades adicionales además de la vCJD.
Por consiguiente, la vCJD puede diagnosticarse junto con al menos
otra enfermedad, que puede ser o no neurológica, en la misma
muestra de fluido corporal, mediante un método que incluye detectar
una concentración aumentada de otra proteína en la muestra
diagnóstica, en comparación con una muestra de un sujeto humano
normal de control. Esta(s) otra(s)
enfermedad(es) puede(n) ser cualquiera que pueda
diagnosticarse en un fluido corporal. Pueden ser neurológicas, por
ejemplo otra encefalopatía espongiforme transmisible, enfermedad de
Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson,
meningitis, pero no son necesariamente neurológicas, por ejemplo
síndrome de choque tóxico, MRSA o enfermedad celíaca.
Por tanto, en particular, se contempla usar un
chip de anticuerpos o serie de chips que pueden diagnosticar una o
más proteínas que interaccionan con ese anticuerpo.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomaron diez muestras de plasma de pacientes
(4 mujeres, 6 hombres) a los que se les había diagnosticado la
variante de CJD (vCJD), diez de pacientes (7 mujeres, 3 hombres) a
los que se les había diagnosticado mediante pruebas genéticas que
tenían la enfermedad de Huntington ("Huntington's
disease", HD) que servían como control de enfermedad
neurológica y diez de controles sin enfermedad, es decir, pacientes
normales (8 mujeres, 2 hombres) que no tenían ningún síntoma
neuropatológico.
Se eliminaron la albúmina e IgG de las muestras
usando un kit suministrado por Amersham Biosciences UK Ltd. Este
kit contiene una resina de afinidad que contiene un anticuerpo que
elimina específicamente albúmina e IgG directamente de muestras de
plasma y suero humano completo. Se reivindica que puede lograrse una
eliminación de más del 95% de la albúmina y más del 90% de la IgG a
partir de 15 \mul de suero/plasma humano, aumentando de ese modo
la resolución de las proteínas de abundancia inferior en la
electroforesis posterior. Se usa una columna de
microcentrifugación, a través de la cual se eluye la proteína no
unida.
Se llevó a cabo el empobrecimiento según las
instrucciones del fabricante usando un volumen de partida de 15
\mul de muestra de plasma bruta. Se añadió la resina al plasma, se
incubó la mezcla con agitación, se transfirió a una columna de
microcentrifugación, se centrifugó y se recogió el filtrado. Se
concentró la muestra empobrecida resultante y se desaló mediante
precipitación con acetona (tal como se recomienda en las
instrucciones del kit). Se decantó la acetona y se resuspendieron
los sedimentos en tampón de lisis de gel 2-D
convencional (urea 9,5 M, CHAPS al 2%, DTT al 1%, Pharmalyte al
0,8%, pH 3-10, inhibidores de proteasas (1
comprimido/10 ml de tampón de lisis) (Roche). Se usó esta
suspensión para la electroforesis en gel bidimensional
Se realizó la electroforesis en gel
bidimensional según J. Weekes et al., Electrophoresis 20:
898-906 (1999) y M. Y. Heinke et al.,
Electrophoresis 20: 2086-2093 (1999), usando tiras
de gradiente no lineal de pH 3-10 inmovilizado de
18 cm (IPG). Se realizó la segunda dimensión usando electroforesis
en gel de T SDS-poliacrilamida al 12%. Para el
análisis inicial, se cargaron los geles con 75 microgramos de
proteína. Se tiñeron los geles con plata con la tinción de plata
analítica OWL (Insight Biotechnologies, RU).
Ser realizó el análisis de imagen cuantitativo y
cualitativo usando el software ProgenesisTM Workstation, versión
2003.02 (Nonlinear Dynamics Ltd.). Se procesaron las imágenes a
través del asistente automático para la detección, alabeo y
apareamiento de manchas. Después de eso, se sometieron todas las
imágenes a una edición manual extensa y un apareamiento óptimo con
el gel de referencia (>80% por gel). Tras la resta del fondo y
la normalización respecto al volumen de mancha total, se exportaron
los datos de manchas de proteína a Excel para realizar el análisis
estadístico cuantitativo y las comparaciones de cambios
cualitativos.
Se realizó la prueba de la t de Student, al
intervalo de confianza del 95%, para cada mancha de proteína que
pudiera compararse entre las muestras de los pacientes enfermos y
los controles y que estuviese presente en al menos el 60% de los
geles de cada grupo, es decir, al menos 6. Se realizó una
transformación logarítmica, puesto que ésta dio una distribución
más normal, que cumple así mejor las suposiciones de esta prueba tal
como se aplica a muestras independientes.
Las manchas para las que se observó una
disminución o un aumento significativo en comparaciones entre los
tres grupos se muestran en las figuras 2 a 5 y se enumeran en la
tabla 1.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se observaron cambios cuantitativos en otras dos
manchas (1293 y 2885) en los geles analíticos, pero no en los geles
preparativos (véase a continuación). Ambos estaban en la comparación
de vCJD frente al control neurológico (HD). La mancha 1293
disminuyó y 2885 aumentó en vCJD frente al control neurológico
(HD).
Se observará que la mancha 1713 es uno al que
puede atribuirse una confianza particularmente alta en los
resultados en relación con el aumento en su intensidad en las
muestras control neurológico (HD) frente a los controles. Esta
mancha mostró también un aumento en la comparación de vCJD frente al
control.
Las manchas 1893, 2732, 1526 y 2730 mostraron
aumentos en la comparación de vCJD frente a los controles. La
mancha 2732 también mostró un aumento en las muestras de vCJD en
comparación con el control neurológico (HD).
La mancha 846 disminuyó en las muestras de vCJD
en comparación con el control neurológico (HD).
Para fines preparativos, se prepararon luego
geles bidimensionales adicionales mediante el mismo método,
agrupando todas las muestras dentro de cada grupo experimental y
cargando los geles con 400 microgramos de proteína. Se prepararon
por tanto tres geles, uno para cada grupo, que estaban teñidos con
plata, usando la tinción de plata PlusOne (Amersham Pharmacia
Biosciences UK Ltd.).
Normalmente, se cortaron las manchas de los
geles preparativos en los que tenían una intensidad elevada, pero
cuando esto no era posible, es decir, cuando las manchas
disminuyeron en intensidad en la vCJD, se cortaron de otro gel.
Tras la reducción, alquilación y digestión en el gel del material
cortado con tripsina, se extrajeron los péptidos producidos y se
analizaron posteriormente mediante CL/EM/EM. Este procedimiento
implica la separación de los péptidos mediante HPLC de fase
inversa, seguido por electropulverización para ionizar la muestra, a
medida que entra en un espectrómetro de masas en tándem. El
espectrómetro de masas registra la razón de masa con respecto a
carga de los iones de precursores peptídicos, que entonces se
seleccionan individualmente para su fragmentación mediante
disociación inducida por colisión (CID). Esta denominada exploración
de EM/EM permite que se determine la secuencia del péptido. Para
cada muestra, por tanto, el conjunto de datos incluye pesos
moleculares determinados con precisión para múltiples péptidos
presentes, acompañados por la correspondiente información de
secuencia. Se usa entonces ésta para identificar la proteína
mediante bases de datos de búsqueda. En el presente caso, se usó el
algoritmo de búsqueda Mascot en las bases de datos
SWISS-PROT y de proteína no redundante (nr) del
Centro Nacional de Información biotecnológica ("National Center
for Biotechnology Information") (NCBI).
Los resultados de la identificación se muestran
en la tabla 2. Todas las manchas de la tabla 1 que se expresaban de
manera diferencial en el gel se identificaron como proteínas
conocidas. La tabla muestra los números de geninfo (gi) de la base
de datos del NCBI y los números de registro de SwissProt.
En algunos casos, se identificó más de una
proteína, lo que significa que la mancha cortada contenía una mezcla
de proteína, al menos una de las cuales se expresaba de manera
diferencial en el gel. Las proteínas identificadas en la base de
datos tenían pesos moleculares y puntos isoeléctricos diferentes,
inferiores o superiores, a los aparentes en el gel. Esto es
totalmente habitual y puede explicarse porque la proteína dentro de
la mancha del gel ha experimentado escisión química o enzimática o
se ha modificado postraduccionalmente tal como mediante
glicosilación, fosforilación o la adición de lípidos.
Como entre las manchas 2730 y 2732, que se
refieren a formas de la misma proteína, 2732 tiene un pI ligeramente
superior y por consiguiente debe entenderse que se haga referencia
a la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
* La cadena beta de haptoglobina que consiste en
los residuos 162-406 de la secuencia de la base de
datos, que se forma por escisión enzimática del precursor; esta
proteína se glicosila en el plasma
** Incluyendo 2 péptidos únicos
Ejemplo de referencia
2
Se reveló un segundo conjunto de biomarcadores
de vCJD usando espectrometría de masas en tiempo de vuelo mediante
desorción/ionización por láser de superficie (SELDI). Se describen
también experimentos para establecer la identidad de estos nuevos
candidatos.
Se recogieron las muestras de plasma usadas en
el ejemplo 1 de casos clínicamente confirmados de vCJD (n=10),
controles neurológicos (HD) (n=10) y pacientes de control sin
enfermedad (n=10) de la unidad de priones MRC. Se diluyeron dos
microlitros de cada una de las muestras empobrecidas en 3 \mul de
tampón de lisis que contenía urea 9,5 M, CHAPS al 2%, Pharmalyte al
0,8% pH 3-10, DTT al 1% e inhibidor de proteasas y
se diluyeron las muestras no empobrecidas en la misma razón usando
el tampón de lisis anterior sin Pharmalyte.
De manera consecuente con el estudio 2DE
anterior, se eliminaron albúmina e IgG del plasma usando una resina
comercialmente disponible (GE Healthcare). Este kit está basado en
anticuerpos y contiene una resina que elimina específicamente
albúmina e IgG directamente de muestras de plasma y suero humano. Se
reivindica que puede lograrse > 95% de la albúmina y > 90% de
la IgG a partir de 15 \mul de suero/plasma humano, aumentando de
ese modo la resolución de proteínas de abundancia inferior. Se usa
una columna de microcentrifugación a través de la cual se eluye la
proteína no unida.
Se llevó a cabo el empobrecimiento según las
instrucciones del fabricante usando un volumen de partida de 15
\mul de muestra de plasma bruta. La muestra empobrecida resultante
se precipitó con acetona (tal como se recomienda en las
instrucciones del kit) y se resuspendió en tampón de lisis 2DE (tal
como se indicó en la sección 2.2 anterior) convencional.
Se realizó el perfilado de las muestras de
plasma empobrecido usando una serie de chips de proteínas de
intercambio aniónico fuerte de ocho manchas (Q10) y se realizó el
perfilado del plasma no empobrecido usando las series de chips de
proteínas de intercambio catiónico débil (CM10) y Q10 de ocho
manchas. Se ejecutaron todas las muestras por duplicado y de manera
aleatorizada. Esencialmente, se equilibraron todos los chips Q10 y
CM10 cuatro veces en el tampón de lavado apropiado. Para los chips
Q10, se usó Tris HCl 100 mM pH 9,0 como tampón de lavado y para
CM10 el tampón de lavado fue acetato de sodio 50 mM pH 7,5. Se
aplicaron 5 \mul de las muestras diluidas a cada mancha y esto se
incubó entonces en una cámara de humedad durante 45 minutos. Se
retiraron cuidadosamente las muestras y se lavaron los chips cuatro
veces en el tampón de lavado apropiado y un lavado con agua 18,2
M\Omega. Se aplicaron dos veces a cada mancha 0,6 \mul de
disolución de matriz que contenía ácido sinapínico 20 mg/ml
(Ciphergen) en acetonitrilo al 50% (Fisher Scientific) y ácido
trifluoroacético al 0,5%. Se realizó la adquisición de datos usando
un lector PBS-II (Ciphergen Biosystems). Se
adquirieron los espectros usando una suma de 155 disparos con una
intensidad de láser de 200, una sensibilidad del detector de 8 y
una masa focal m/z de 25000. La resta del valor inicial y la
normalización respecto al recuento iónico total se realizaron en
todos los espectros. Se acometió la calibración interna de cada
espectro usando un mínimo de 2 picos en cada espectro.
Se muestran los rastros de SELDI para el
conjunto de datos Q10 SAX2 de plasma empobrecido en las figuras 6 y
7. La figura 6 muestra espectros de SELDI que muestran picos en la
región de m/z 4100-4500. La figura 7 muestra
espectros de SELDI que muestran picos en la región de m/z
8600-9400. Los paneles superior e inferior muestran
espectros superpuestos que pertenecen a los grupos control (CTRL) y
vCJD, respectivamente. Los asteriscos (*) marcan los picos de
interés.
Se muestran rastros de SELDI para el conjunto de
datos CM10 WCX de plasma no empobrecido en las figuras 8 a 13.
El enfoque de análisis de datos adoptado para
este estudio comprende varios módulos tal como se describe a
continuación. Para ser considerado como candidato de interés, cada
biomarcador debe satisfacer los siguientes tres criterios, cuyos
valores se derivan o bien del proceso de modelado multivariado o
bien de pruebas univariadas.
- \bullet
- La posición del pico de interés dentro de las gráficas de cargas indica una contribución obvia a la separación de los grupos en el proceso de modelado de datos y esto sobrevive también a un ejercicio de validación cruzada.
- \bullet
- Se logra un valor de p <0,05 usando una prueba univariada de Mann-Whitney.
- \bullet
- La magnitud del cambio en abundancia del marcador entre dos grupos es > 1,5 veces regulado o bien por incremento o bien por disminución.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Preprocesamiento: Se importaron todos los
datos al paquete de software SIMCA-P (Umetrics). Se
excluyeron variables correspondientes a masas inferiores a m/z
2.500 debido al considerable ruido químico en esta región. Las
variables restantes correspondientes a masas entre m/z 2.500 y m/z
100.000 se centraron al valor medio y se convirtieron a escala de
Pareto.
Análisis de componentes principales
(ACP): Se ajustaron modelos de ACP a los conjuntos de datos con
tantos componentes (A) como se ajustarían siguiendo las reglas
internas que SIMCA-P usa para determinar la
significación de los componentes (Eriksson et al. 2001). Se
usaron los parámetros de bondad del ajuste (R^{2}) y bondad de la
predicción (Q^{2}) para evaluar la utilidad de cada uno de los
componentes posteriores ajustados en el modelo. Se inspeccionaron
los componentes ajustados automáticamente y se mantuvieron siempre
que el parámetro Q^{2} fuese creciente. El parámetro R^{2}
acumulativo para el componente aceptado final dio la proporción
total de varianza en los datos explicada por el modelo. Se
produjeron gráficas que presentaban las puntuaciones de
observaciones (t) y las cargas de variables (p) para pares de
componentes principales (a). Se inspeccionaron las gráficas de las
puntuaciones para buscar patrones de variación sistemática y
observaciones de valor extremo que pudiesen dificultar los
esfuerzos de clasificación posteriores. En particular, se examinaron
las posiciones de observaciones analizadas en cada chip para
comprobar la existencia de chips poco habituales. Se comprobó
también la reproducibilidad de análisis de muestras duplicadas
usando las gráficas de puntuaciones. La elipse mostrada en las
gráficas de puntuaciones corresponde a la T^{2} de Hotelling al
95%, una adaptación multivariada de una región de confianza. Para
un conjunto de datos con una distribución normal multivariada, se
esperaría que el 95% de las observaciones se encontrara dentro de
la región abarcada por la elipse, por tanto las observaciones que
están una gran distancia fuera de la elipse pueden representar
problemas que han de investigarse y abordarse.
Se interpretaron las tendencias encontradas a
través de la inspección de las gráficas de puntuaciones a través de
la inspección de las variables encontradas en las correspondientes
gráficas de cargas. Se consideró que los valores de m/z
individuales representados gráficamente en los extremos de la
gráfica eran los más influyentes en la separación de los grupos. De
manera interesante, tales gráficas tienden a mostrar varios puntos
de datos de m/z consecutivos, que describen eficazmente el pico
original observado en los propios perfiles de SELDI.
Modelado y análisis de datos por mínimos
cuadrados parciales (PLS-DA): Se ajustaron
componentes (A) de los modelos de PLS-DA a los
conjuntos de datos siempre que cumplieran los criterios usados por
SIMCA-P para determinar la significación de los
componentes (Eriksson et al. 2001). Como para el modelado de
ACP, se inspeccionaron los parámetros R^{2} y Q^{2} para
determinar qué componentes deben incluirse en el modelo. A
diferencia del modelado de ACP, los modelos de
PLS-DA presentan valores de R^{2} que describen el
ajuste del modelo tanto a las variables X (medición) como a las
variables Y (clase). Se produjeron gráficas que presentaban las
puntuaciones de observaciones (t) y los pesos de variables (w*c)
para pares de componentes de PLS (a). Debido a que cada componente
de PLS se ajusta de modo que ambos se aproximan bien a los datos de
X e Y y maximizan la correlación entre los datos X e Y, en la
práctica los primeros uno o dos componentes habitualmente separan
bien las observaciones cuando hay pocos grupos presentes en el
conjunto de datos. La interpretación de las puntuaciones de PLS y
las gráficas de pesos es similar a la usada para interpretar un
modelo de ACP, siendo los pesos de PLS análogos a las cargas de
ACP. Se calculó la T^{2} de Hotelling y se presentó en todas las
gráficas de puntuaciones de PLS para ayudar a identificar las
observaciones que se desviaban.
Se usaron los dos parámetros denominados
influencia de las variables sobre la proyección (VIP) y coeficientes
de PLS (COEFF) para determinar cuál de todas las masas medidas en
los datos espectrales de SELDI era la más importante en la
definición de los parámetros del modelo y la explicación de los
grupos. Se determinaron umbrales específicos empíricamente y se
usaron para excluir aquellas variables con valores de VIP y COEFF
inferiores al umbral. Se determinó la capacidad de los modelos de
PLS-DA generados para predecir correctamente la
clase de (nuevas) muestras mediante validación cruzada 2 veces. Se
realizó la validación cruzada dividiendo el conjunto de datos en un
conjunto de entrenamiento y un conjunto de prueba. Se ajustó un
modelo de PLS-DA a la parte de entrenamiento del
conjunto de datos y se usó posteriormente para predecir las clases
de la parte de prueba del conjunto de datos. Se intercambiaron
entonces los conjuntos de datos de prueba y entrenamiento y se
repitió el proceso. Se registró el número de clasificaciones
correctas e incorrectas de ambas rondas de prueba y se usó para
calcular las sensibilidades y especificidades de las predicciones.
Se usó el método de validación cruzada para someter a prueba ambos
modelos construidos usando el conjunto de datos que contenía todas
las variables y aquellos construidos tras la selección de variables
(tal como se describió anteriormente).
Métodos univariados: Se realizaron
pruebas de significación estadística usando el software Protein Chip
(Ciphergen Biosystems). Se usaron pruebas de
Mann-Whitney (Wilcoxon) para dos muestras
independientes. El apareamiento y detección de los picos se
realizaron usando el software Protein Chip y se sometieron estos
datos al módulo Biomarker Wizard para su análisis. Se tomó el valor
de p como el resultado de la prueba. Se exportaron también los
datos de cada uno de los picos marcados a Excel (Microsoft) como
intensidades de pico para calcular el criterio de cambio en veces
para cada pico. Debido a la distribución sesgada observada para las
áreas o intensidades de cada conjunto de picos apareados, se
sometieron los datos a transformación log_{10} antes del cálculo
de los valores medios y mediana de las distribuciones así como las
desviaciones estándar. Se transformaron entonces de nuevo los
parámetros de las distribuciones a las escalas originales con el fin
de calcular los cambios en veces y los tamaños de efecto. Se
calcularon los cambios en veces dividiendo el mayor de los valores
medios (o mediana) por el valor más pequeño de dos grupos,
produciendo un valor mayor que o igual a uno. Se calculó el tamaño
de efecto (D de Cohen) como la diferencia entre los valores medios
de los dos grupos divididos entre la desviación estándar
agrupada.
Habiendo producido/creado una lista de picos de
interés candidatos correspondientes a cada superficie de chip, se
determinó la identidad de las proteínas responsables de cada pico de
diferenciación.
Se extrajo material directamente de la
superficie del chip y tras la separación electroforética y la
digestión enzimática se identificaron las proteínas mediante
espectrometría de masas en tándem por electropulverización
(CL/EM/EM).
Hay varias ventajas inherentes a esta
estrategia:
- \bullet
- El agrupamiento de material de varias posiciones diana supera los desafíos de trabajar con un bajo nivel de proteína y se logra un aumento de sensibilidad.
- \bullet
- La SDS-PAGE proporciona un estadio adicional de visualización de la muestra así como sirve como una importante etapa de separación y concentración.
- \bullet
- La CL/EM/EM de las proteínas digeridas es una metodología de rutina en el laboratorio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cortaron bandas de interés del gel teñido con
plata y se realizaron la reducción, alquilación y digestión en el
gel con tripsina antes del análisis posterior mediante CL/EM/EM. Se
extrajeron péptidos de los trozos de gel mediante una serie de
lavados con acetonitrilo y bicarbonato de amonio. Se agrupó el
extracto con el sobrenadante inicial y se liofilizó. Se resuspendió
entonces cada muestra en 23 \mul de bicarbonato de amonio 50 mM.
Se realizaron separaciones cromatográficas usando un sistema
Ultimate LC (Dionex, RU). Se resolvieron los péptidos mediante
cromatografía de fase inversa en una columna C18 PepMap de 75
\mum. Se suministró un gradiente de acetonitrilo en ácido fórmico
al 0,05% para eluir los péptidos a una velocidad de flujo de 200
nl/min. Se ionizaron los péptidos mediante ionización por
electropulverización usando una fuente de pulverización Z montada
en un instrumento QTof-micro (Waters Corp.). Se
ajustó el instrumento para que funcionase en un modo de conmutación
automatizado, seleccionando iones precursores basándose en su m/z e
intensidad, para su secuenciación mediante fragmentación inducida
por colisión.
Se procesaron los datos espectrales de masas en
listas de picos (que contenían la m/z del ión precursor y el estado
de carga y la m/z e intensidad de los iones de fragmentos). Se
acometió la búsqueda en bases de datos para establecer la identidad
de la(s) proteína(s) presente(s). Se realizó
esto usando el algoritmo de búsqueda Mascot en las bases de datos
SWISS-PROT y no redundante (nr) del NCBI.
Una vez identificadas las proteínas, se
extrapoló el peso molecular esperado de las proteínas maduras a
partir de la información contenida dentro de la entrada de la base
de datos y se correlacionó con el peso molecular determinado
experimentalmente en los perfiles de SELDI originales. De este modo,
fue posible en la mayoría de los casos asignar especies
relacionadas a una secuencia de proteína individual.
Tras el análisis extenso usando técnicas
multivariadas y pruebas de Mann-Whitney, el estudio
en plasma empobrecido (chip Q10 SAX) reveló variación en varios
picos, que diferenciaban entre muestras de vCJD y control (véase la
tabla 3 a continuación). De manera similar, para el plasma no
empobrecido, los perfiles de CM10 WCX revelaron picos
diferenciadores adicionales (véase la tabla 4 a continuación).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Notas:
- a)
- Valores de p calculados para una prueba de Mann-Whitney (no corregida para pruebas múltiples).
- b)
- Se estimaron los valores de intensidad de pico medio y mediana para cada grupo tras una transformación log_{10} de los datos. Se transformaron de nuevo las estimaciones a la escala original antes del cálculo de los cambios en veces.
- c)
- Se calcula el tamaño de efecto (D de Cohen) como la diferencia entre las medias dividida entre la desviación estándar agrupada.
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En la figura 14 se muestra el gel teñido con
plata del material extraído de chips Q10 de plasma empobrecido.
Aunque se cortaron un total de 36 secciones, se consideró que 9
secciones eran importantes para el objetivo clave de la
identificación de las proteínas responsables de los picos indicados
en la tabla 3. De hecho, se dio prioridad al análisis de CL/EM/EM
de estas bandas particulares, concretamente las bandas 2, 3, 4, 5, 7
y 8 del carril control y las bandas 9, 10 y 11 del carril de vCJD.
En la tabla 5 se proporciona un resumen de los resultados. De
manera similar, se acometió CL/EM/EM sobre el material extraído del
chip CM10 WCX. En la figura 15 se muestra el gel teñido con plata
del material extraído de los chips WCX CM10 de plasma empobrecido y
en la tabla 6 se muestran las proteínas identificadas en los
análisis.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Nota: * Los pesos moleculares indicados
en Swiss Prot generalmente se refieren a las proteínas precursoras
en lugar de a las proteínas maduras, que existen tras su
procesamiento. Obsérvese también que la interpretación adicional de
los datos de CL/EM/EM para las bandas 9, 10 y 11 puede revelar la
presencia de fragmentos proteolíticos inesperados.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados sugieren existe una colección de
fragmentos de albúmina humana en los perfiles de SELDI y que éstos
difieren en abundancia cuando se comparan casos de vCJD con los
controles. Es evidente que éstos se refieren a la región
N-terminal de la proteína en particular. Por tanto,
se reivindica que seis picos de candidatos están relacionados con
fragmentos N-terminales de albúmina humana y la base
de esta reivindicación se ilustra en la tabla 7 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se recuperó la secuencia del precursor de
albúmina humana de la base de datos Swiss Prot (P02768) y se exportó
al paquete de software Biolynx dentro de MassLynx para su examen.
La secuencia de albúmina madura se crea eliminando los primeros 18
aminoácidos como péptido señal así como 5 aminoácidos adicionales
que se refieren a una secuencia de propéptido. Los números de
residuos indicados se refieren a la proteína madura de 585
aminoácidos en total. Cada valor de Mr promedio observada se
encuentra dentro del 0,1% de error de masa del valor predicho.
Para la cadena beta de hemoglobina (P02025)
puede emparejarse un fragmento que se extiende desde los residuos
4-43 hasta el pico a m/z 4490 (P5) y esto abarca dos
péptidos observados en los datos de CL/EM/EM. Estos resultados se
resumen a continuación. Por tanto, se reivindica que es posible que
el número de referencia de candidato P5 sea los residuos
4-43 de la cadena beta de hemoglobina.
El procesamiento potencial de la cadena beta de
hemoglobina se muestra tal como sigue:
La secuencia de aminoácidos de la cadena beta de
hemoglobina se muestra con la ubicación del fragmento potencial,
residuos 4-43 (P5), indicados mediante la flecha. El
recuadro indica la ubicación de los péptidos observados en los
datos de CL/EM/EM.
Claims (14)
1. Método de diagnóstico de vCJD en una muestra
diagnóstica de un tejido o fluido corporal válido tomado de un
sujeto humano, que comprende detectar una concentración aumentada de
beta-actina en la muestra diagnóstica, en
comparación con una muestra de un sujeto humano de control.
2. Método según la reivindicación 1, que
comprende detectar una concentración aumentada de dos o más
proteínas en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra
de un sujeto humano normal de control, siendo las proteínas:
- beta-actina y
- precursor de apolipoproteína A-IV.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que la detección se realiza sobre la muestra
diagnóstica mediante un ensayo de unión para la
beta-actina.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
el ensayo de unión comprende provocar que la
beta-actina de la muestra diagnóstica interaccione
con una pareja de unión específica respectiva y detectar la
interacción.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
la pareja de unión específica marcada es un anticuerpo marcado que
reconoce la beta-actina.
6. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que la muestra diagnóstica se somete a electroforesis en gel
bidimensional para producir un gel teñido y se detecta la
concentración aumentada o disminuida de la
beta-actina mediante una intensidad aumentada o
disminuida de una mancha que contiene proteína sobre el gel teñido,
en comparación con un gel control correspondiente.
7. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que la vCJD se diagnostica con cualquier otra
enfermedad.
8. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que la muestra diagnóstica es un fluido
corporal.
9. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el tejido corporal válido es de
cerebro, nervio, amígdala, bazo u otro tejido linforreticular.
10. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que otra enfermedad, que puede o no ser neurológica,
se diagnostica en la misma muestra del tejido corporal, mediante un
método que comprende detectar una concentración aumentada de otra
proteína en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra
de un sujeto humano normal de control.
11. Uso para el diagnóstico de vCJD de un
material de pareja que reconoce, se une a o tiene afinidad por la
beta-actina según la reivindicación 1.
12. Uso según la reivindicación 11, en el que el
material de pareja es un anticuerpo.
13. Uso según la reivindicación 12, en el que el
anticuerpo se inmoviliza sobre una fase sólida.
14. Uso según la reivindicación 12, en el que el
anticuerpo se inmoviliza sobre perlas o como un chip.
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