KR20220111630A - 폐암 혈액 바이오마커의 검출 방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 폐암 혈액 바이오마커의 검출 방법 및 키트를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4 및/또는 SERPINF1를 검출하기 위한 방법 및 키트에 관한 것으로 이들 검출 결과는 의사 등의 의료 전문가에 의한 폐암 이환의 유무, 폐암의 진행 정도, 폐암의 치료 경과를 판별하기 위해서 유용하게 이용될 수 있으며, 특히 폐암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 폐암 혈액 바이오마커의 검출 방법 및 키트에 관한 것이다.
여러 암 종 중에서 폐암은 전 세계적으로 사망률이 2위이고 국내에서는 사망 원인이 1위로 알려져 있다. 폐암은 초기증상이 없고 대부분 암의 전이가 진행된 후에 발견되어 5년 생존률이 15%로 매우 낮다. 폐암이 암 사망률이 높은 원인은 폐의 내부에는 신경이 없기 때문에 자각 증상이 거의 없고, 외관상 건강하게 보이고 운동 능력에도 별다른 변화가 없을 수 있다. 또한 조금 진행이 되거나 발생한 위치에 따라 기침, 객담, 호흡곤란의 증상이 나타난다. 그러나, 이런 증상은 다른 폐 질환에서 흔히 볼 수 있는 증상이어서 심각한 증상 없이 말기까지 진행되는 경우가 상당수이지만 조기 진단이 되면 생존율을 80%이상 획기적으로 증대시킬 수 있다.
폐암은 폐에서 발생하는 가장 흔한 악성 종양으로서 크게 비소세포폐암(non-small cell lung carcinoma, NSCLS)과 소세포폐암(small cell lung carcinoma, SCLC)으로 분류되며, 이 중 비소세포폐암(NSCLS)은 다시 평편상피세포암(squamous cell carcinoma, SCC), 선암(adenosquamous carcinoma, AC), 대세포암(large cell carcinoma, LCC)으로 나눌 수 있다. 이들 중 가장 흔한 유형은 평편상피세포암(SCC)으로 알려져 있다.
폐암의 진단은 조직 생검을 통해 이루어지나, 조직 생검시 15% 정도로 합병증의 위험이 있으므로 항상 조직 표본을 얻을 수는 없다. 폐암 환자의 혈액에서 이용한다면 비침습적 진단이 가능하며, 조기 진단이 가능하다면 폐암의 사망률을 줄일 수 있는 가능성이 있다.
본 발명은 폐암의 조기 진단에 유용할 뿐만 아니라 혈액을 통한 비침습적 진단에 유용할 수 있는 3가지의 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L(CD5 antigen-like), ITIH4(Inter-Alpha-Trypsin Inhibitor Heavy Chain 4) 및 SERPINF1(Serpin Family F Member 1)를 개시한다.
본 발명의 목적은 폐암 혈액 바이오마커의 검출 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 폐암 혈액 바이오마커의 검출 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 기타의 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명자들은 폐암 환자 264명과 정상인 100명으로부터 얻은 총 365개의 혈액 시료를 이용한 시험에서, 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4 및 SERPINF1의 혈중 농도가 정상인 그룹에 비해서 환자 그룹에 더 높음을 확인하였고 상기 3가지 폐암 바이오마커에 대해 ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선 분석 통해 폐암에 대한 진단력을 평가하였을 때, 진단 정확도(AUC, area under curve)가 CD5L1는 0.818, ITIH4는 0.713, SERPINF1는 0.759로 나타남을 확인하였으며, 이들 마커를 조합하거나 이들 마커는 폐암 상용화 바이오마커인 CYFRA21-1((Serum cytokeratin fragment 21-1)와 조합하였을 때 그 진단력이 상승함을 확인하였다.
본 발명의 폐암 바이오마커의 검출 방법은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 구체적으로 (a) 피검자에서 채취된 혈액 시료 또는 그것의 가공 시료와 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4 및 SERPINF1 각각에 특이적인 결합 분자를 반응시켜, 상기 시료 중에 존재하는 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4 및 SERPINF1 각각과 이에 특이적인 결합 분자의 결합체를 형성시키는 단계, 및 (b) 상기 결합체를 검출하여 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4 및 SERPINF1 중 하나 이상의 폐암 혈액 바이오마커의 혈중 농도를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 본 발명의 폐암 바이오마커의 검출 방법은 폐암 진단에 유용한 정보를 제공하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명은 다른 측면에 있어서 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법은 (a) 피검자에서 채취된 혈액 시료 또는 그것의 가공 시료와 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4 및 SERPINF1 각각에 특이적인 결합 분자를 반응시켜, 상기 시료 중에 존재하는 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4 및 SERPINF1 각각과 이에 특이적인 결합 분자의 결합체를 형성시키는 단계, (b) 상기 결합체를 검출하여 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4 및 SERPINF1 중 하나 이상의 폐암 혈액 바이오마커의 혈중 농도를 검출하는 단계, 및 (c) 상기 피검자의 폐암 바이오마커의 혈중 농도를 정상인의 폐암 바이오마커 혈중 농도나 그것의 가공 값 또는 폐암 환자의 폐암 바이오마커의 혈중 농도나 그것의 가공 값와 비교하여 피검자를 폐암을 가지거나 또는 가지지 않는 것으로 분류하는 단계를 포함하여 구성된다. 여기서 피검자의 폐암 바이오마커의 혈중 농도가 정상인의 폐암 바이오마커 혈중 농도보다 높거나 폐암 환자의 폐암 바이오마커의 혈중 농도와 비슷할 경우(통계적으로 유의성이 없을 경우) 피검자를 폐암을 가진 것으로 분류되게 된다.
본 발명의 방법에서, 상용화된 기존의 폐암 바이오마커인 CYFRA21-1의 혈중 농도가 상기 바이오마커와 함께 검출되는 것이 바람직할 수 있다. 그것은 아래의 실시예는 CYFRA21-1의 혈중 농도가 상기 CD5L, ITIH4의 혈중 농도와 조합될 때 더 높은 폐암의 진단력을 보여주기 때문이다. 상용화된 기존의 폐암 바이오마커인 CYFRA21-1와 관련해서는 문헌[Lab Med Online Vol 5, No 3: 143-148, July 2015] 등을 참조할 수 있다.
본 발명의 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4 및 SERPINF1는 모두 이미 공지된 단백질로 그 유전자 서열과 아미노산 서열은 GeneBank 등에서 확인할 수 있다. 구체적으로 CD5L은 그 유전자 서열이 GeneBank Accession number: NM_005894, 그 아미노산 서열이 GeneBank Accession number: NP_005885에서 확인할 수 있고, ITIH4는 그 유전자 서열이 GeneBank Accession number: AB209388, 그 아미노산 서열이 GeneBank Accession number: BAD92625에서 확인할 수 있으며, 그리고 SERPINF1는 그 유전자 서열이 GeneBank Accession number: BC013984, 그 아미노산 서열이 GeneBank Accession number: AAH13984에서 확인할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여 검출된 폐암 혈액 바이오마커의 혈중 농도는 의사 등의 의료 전문가에 의한 폐암 이환(罹患)의 유무, 폐암의 진행 정도 및/또 폐암의 치료 경과를 판별하기 위해서 유용하게 이용될 수 있다.
또 본 명세서에서, "폐암"은 비소세포폐암(non-small cell lung carcinoma, NSCLS)과 소세포폐암(small cell lung carcinoma, SCLC)을 포함하는 의미이다. 비소세포폐암(NSCLS)이라면 평편상피세포암(squamous cell carcinoma, SCC), 선암(adenosquamous carcinoma, AC), 대세포암(large cell carcinoma, LCC)인지를 불문한다.
본 명세서에서, "혈액의 가공 시료"는 혈장 또는 혈청을 말한다.
또 본 명세서에서, "폐암 혈액 바이오마커"는 정상인에 비해서 폐암 환자에서 그 혈중 농도가 높은 것으로서 정상인과 폐암 환자의 구분에 유용하게 이용될 수 있는, CD5L, ITIH4, SERPINF1 또는 CYFRA21-1을 말한다. 이들 폐암 바이오마커의 검출된 혈중 농도는 단일로 사용되거나 2가지 이상 조합되어 정상인과 폐암 환자의 구분에 이용될 수 있다.
또 본 명세서에서, "폐암 혈액 바이오마커에 특이적인 결합 분자"는 다른 단백질과는 실질적으로 결합하지 않으면서 폐암 혈액 바이오마커에만 특이적으로 결합하여 그 특이적인 결합의 검출을 가능하게 하는 임의의 결합 분자를 말하는데, 구체적으로 항체 또는 압타머이며, 바람직하게는 항체이다. 여기서 "실질적으로"란 정도는 낮지만 비특이적인 결합체가 형성될 수 있다는 의미이며, 이러한 비특이적인 결합은 후술하는 바와 같이 특이적 결합의 검출 이전에 세척 용액에 의하여 세척·제거될 수 있다.
본 명세서에서, "항체"는 본 발명의 폐암 혈액 바이오마커에 특이적으로 결합하는 것이면 모든 형태의 것을 포함하는 의미이다. 따라서 모노클로날항체 또는 폴리클로날항체, 다중특이적 항체(즉 두 개 이상의 항원 또는 두 개 이상의 에피토프를 인식하는 항체로서 예컨대 이특이적 항체 등을 말함)를 포함하는 것 이외에, 본 발명의 폐암 혈액 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 단편, 재조합 항체, 화학적으로 수식된 항체를 포함한다. 여기서 항체의 단편의 예로서는 Fab, F(ab')2, scFv(중쇄나 경쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 항체), Fv, Fab/c(1개의 Fab와 완전한 Fc를 가지는 항체), 항체를 단백질 절단 효소 예컨대, 파파인, 펩신으로 처리하여 얻어진 항체 단편을 포함하는 의미이다. 상기 항체의 글로불린 유형도 본 발명의 폐암 혈액 바이오마커에 특이적으로 결합하는 것이면 특별히 한정되지 않는데, 그 글로불린 유형은 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 중 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 폐암 혈액 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있는데, 이러한 폴리클로날 항체나 모노클로날 항체의 제조 방법은 모두 당업계에 공지되어 있다. 예컨대 폴리클로날 항체는 조류(예를 들면, 닭 등), 포유동물(예를 들면, 토끼, 염소, 말, 양, 쥐 등) 등의 동물에게 본 발명의 폐암 혈액 바이오마커를 항원으로 하여 면역화시키고 면역된 동물의 혈액으로부터 황산암모늄 분획법, 이온교환크로마토그래피법, 친화도-크로마토그래피법 등 당업계에 공지된 방법을 통하여 목적하는 항체를 회수함에 의해 얻을 수 있으며, 모노클로날 항체는 본 발명의 폐암 혈액 바이오마커를 항원으로 면역화시킨 동물에서 비장세포, 림프절세포 등 항체 생산 세포를 채취하고 이를 불멸화 세포인 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 제조한 후에 그 하이브리도마 또는 그 배양액으로부터 생산된 항체를 회수하여 얻을 수 있다. 폴리클로날 항체나 모노클로날 항체의 제조 방법과 관련하여 더 구체적인 것은 문헌[Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519, 1976], 미국 특허 제4,816,56호, 문헌[Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991], 문헌[Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991], 문헌[Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999], 문헌[Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984], 문헌[Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991] 등을 참조할 수 있으며, 이들 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 방법에 있어서, 폐암 마커와 항체의 결합체를 검출하는 단계는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법, 샌드위치면역분석법, 형광면역분석법, 방사면역분석법, 발광면역분석법 등 다양한 당업계의 공지·관용된 면역학적 분석 방법에 의해서 가능하다.
예컨대 ELISA법에서는 효소와 결합된 이차항체가 사용될 수 있으며, 이때 효소는 퍼옥시다제(POD), 알칼린포스파타제, β-갈락토시다제, 호시 래디쉬 퍼옥시다아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스옥시다제, 락트산 탈수소 효소, 아밀라제 등을 들 수 있고, 또한 예컨대 형광면역분석법에서는 플루오레세인이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트, 치환 로다민이소티오시아네이트, 디클로로트리아진이소티오시아네이트, 알렉사(Alexa) 또는 알렉사플루오로(AlexaFluoro) 등의 형광성 물질 또는 형광단과 결합된 항체가 사용될 수 있으며, 또한 예컨대 방사 면역 측정법에는 트리티움, 요오드(131I,125I,123I,121I), 인(32P), 황(35S), 금속류(예를 들면, 68Ga, 67Ga, 68Ge, 54Mn, 99Mo, 99Tc, 133Xe 등) 등의 방사성 동위원소와 결합된 항체가 사용될 수 있다. 발광면역분석법에는 루시퍼라제 방법, 루미놀 퍼옥시다제 방법 등이 디옥세탄 화합물 등의 발광성 물질 등과 함께 사용될 수 있다.
보다 구체적인 것은 문헌[Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980], 문헌[Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984], 문헌[Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999]를 참조할 수 있다.
바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 방법은 샌드위치면역분석법으로 수행되는 경우이다. 본 발명의 방법이 샌드위치면역분석법으로 수행될 경우 상기 (a) 단계의 폐암 혈액 바이오마커와 이에 특이적인 결합 분자의 결합체를 형성시키는 단계는 (a-i) 포획 항체(capturing antibody)로서 폐암 혈액 바이오마커에 대한 특이적인 항체를 지지체의 표면에 고정시키는 단계 및 (a-ii) 상기 포획 항체가 고정된 지지체에 혈액 시료 또는 그것의 가공 시료를 처리하여 상기 포획 항체와 폐암 혈액 바이오마커의 결합체의 형성을 유도하는 단계를 포함하여 구성되며, 상기 (b) 단계의 결합체의 검출 단계는, (b-i) 상기 시료 처리 후에 시그널 측정을 매개하거나 제공하는(즉 가능하게 하는) 표지체나 효소와 결합된 검출 항체(detection antibody)를 처리하는 단계, 및 (b-ii) 상기 표지체 또는 효소가 매개하거나 제공하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
상기에서 지지체로는 예컨대 미소구(microsphere)(수지 비드(bead), 자기 비드 등), 입자(금속 미립자, 금 콜로이드 등), 기판(마이크로타이터 플레이트, 유리 기판, 실리콘 기판, 수지제 기판, 전극 기판, 막 등) 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 지지체의 재료로서는 (i) 유리, 석영 유리, 알루미나, 사파이어, 포스테라이트(forsterite), 산화규소 등의 무기 재료나 (ii) 폴리에틸렌, 폴리비닐아세탈, 아크릴 수지, 폴리카보네이트, 페놀 수지, 우레아 수지, 에폭시 수지, 멜라민 수지, 실리콘 수지, 폴리페닐렌옥시드, 폴리술폰, 폴리에틸렌글리콜, 아가로스, 아크릴아미드, 니트로셀룰로오스, 나일론, 라텍스 등의 유기 재료가 사용될 수 있다.
또 상기에서 상기 포획 항체를 지지체에 고정하는 방법은 흡착(예컨대 니트로셀룰로오스 막에의 코팅) 등의 방법으로 비공유적으로 직접 고정될 수 있으며, 단백질과 지지체 모두에 결합하는 링커 등을 사용하여 공유적으로 간접적으로 고정될 수도 있다.
상기 포획 항체를 지지체에 흡착시켜 사용할 경우, 이러한 흡착은 예컨대 pH 9.5인 0.06M 탄산염 완충용액 또는 중탄산염 완충용액으로 상기 포획 항체를 희석시키고 하고 그 희석액을 지지체에 일정 온도에서 일정 시간 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다. 여기서 흡착에 필요한 시간과 온도는 충분한 흡착이 이루어지는 한 특별한 제한이 없는데, 예컨대 4℃에서 흡착이 이루어질 경우 72시간 동안 수행될 수 있으며, 또한 예컨대 37℃에서 흡착이 이루어질 경우 2시간 동안 수행될 수 있다. 흡착된 후에는 증류수나 에탄올 등으로 세척할 수 있으며, PBS 등의 용액에 함유된 소 혈청 알부민(BSA) 등의 차단제로 코팅할 수도 있다. 차단제로 코팅한 후에는 증류수나 차단제를 함유하지 아니한 완충용액 등으로 세척할 수도 있다.
지지체에 흡착 또는 결합한 포획 항체는 지지체에 혈액 시료 또는 그 가공 시료를 처리할 경우 그 시료 중의 폐암 혈액 바이오마커와 결합체를 형성하게 된다. 결합체가 형성된 후에는 비특이적으로 결합된 항체를 제거하거나 오염물질 등을 제거하기 위한 목적으로 Tween 20과 같은 세척 완충액이나 증류수 등의 세척제로 세척하는 것이 바람직할 수 있다.
또 상기에서 표지체는 비오틴(biotin) 등의 화학물질, 플루오레세인이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트 등의 형광물질, 요오드(131I,125I,123I,121I), 인(32P), 황(35S) 등의 방사능 물질 등일 수 있으며, 상기 효소는 퍼옥시다제(POD), 알칼린포스파타제, β-갈락토시다제, 호시 래디쉬 퍼옥시다아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스옥시다제, 락트산 탈수소 효소, 아밀라제, 루시퍼라제 등 발색 반응, 형광 반응, 발광 반응 등을 촉매하는 효소일 수 있다. 보다 구체적인 사항은 문헌 [Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999] 등을 참조할 수 있으며, 이 문헌도 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
상기 표지체나 효소는 바람직하게는 항체와 공유결합될 수 있다.
또 상기에서 검출 항체의 예로서는 항체(포획 항체)의 Fc 부분을 인식하는 것일 수 있으며, 이러한 검출 항체는 Fc 부분을 조류, 포유 동물 등의 동물에 면역화시켜 그 동물의 혈액으로부터 분리·정제하여 얻어질 수 있다.
또 상기에서 시그널의 측정 방법은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 얻어질 수 있는데, 예컨대 표지체로서 비오틴을 사용한 경우 시그널과 결합된 아비딘(avidin)이나 스트렙타아비딘(streptavidin)을 사용하여 시그널을 측정할 수 있으며, 또 효소를 사용할 경우에는 그 효소의 기질을 첨가하여 시그널을 측정할 수 있다. 예컨대 효소로서 루시퍼라제를 사용한 경우 루시페린을 사용하는 경우이다.
또 상기에서 상기 (a-ii) 단계의 폐암 혈액 바이오마커와 포획 항체의 결합을 유도한 후에, 및/또는 (b-1) 검출 항체를 처리한 후에는 비특이적으로 결합된 항체 등을 제거하거나 오염물질 등을 제거하기 위하여, 전술한 바와 같이 Tween 20과 같은 세척 완충액이나 증류수 등의 세척제로 세척하는 단계가 추가로 포함되는 것이 바람직할 수 있다.
또 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 방법은 ELISA법으로 수행될 수 있다. ELISA법으로 수행될 경우 상기 (a) 단계의 폐암 혈액 바이오마커와 이에 특이적인 결합 분자의 결합체를 형성시키는 단계는, (a-i) 혈액 시료 또는 그것의 가공 시료를 지지체의 표면에 고정시키는 단계, 및 (a-ii) 1차 항체로서 폐암 혈액 바이오마커에 대한 항체를 처리하는 단계를 포함하여 구성되며, 상기 (b) 단계의 결합체의 검출 단계는 (b-i) 상기 1차 항체 처리 후 효소가 결합된 2차 항체를 처리하는 단계, 및 (b-ii) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 지지체에 시료를 고정(예컨대 코팅)시키는 방법에 대해서는 전술한 바의 설명이 그대로 유효하다.
상기에서 효소는 전술한 바와 같이 발색 반응, 형광 반응, 발광 반응 등을 촉매하는 효소가 사용될 수 있다.
또 상기에서 2차 항체는 상기 검출 항체와 관련하여 설명한 바와 마찬가지로, 1차 항체를 항원으로 사용하여 포유동물 등에 면역화시켜 그 동물의 혈액으로부터 분리·정제하여 얻어질 수 있다.
또 상기에서 효소의 활성을 측정하는 단계는 그 효소의 기질을 첨가하고 그 반응 정도를 측정함에 의하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법은 다른 양태에 있어서는, 상기 폐암 혈액 바이오마커에 특이적인 결합 분자는 항체 대신에 본 발명의 폐암 혈액 바이오마커에 특이적으로 결합하는 압타머를 이용할 수도 있다. 압타머는 항체와 마찬가지로 폐암 혈액 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 리간드를 의미하는데, 이 바이오마커와 특이적으로 결합할 수 있다면, 압타머는 이중가닥 DNA 또는 RNA 압타머일 수도 있다. 이러한 표적분자와의 특이적 결합할 수 있는 압타머의 제조, 선별 방법 등은 모두 당업계에 공지되어 있으며, 특히 SELEX 기술을 이용할 수 있다. 이 SELEX 기술은 "Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment"의 준말로 이름 붙여진 기술로, 해당 기술에 대해서는 문헌[Science 249 (4968):505-510, 1990], 미국 등록특허 제5,475,096, 미국 특허등록 제5,270,163호, 국제특허공개 WO 91/19813 등을 참조할 수 있으며, 압타머의 선별을 위한 구체적인 방법이나 적절한 시약, 재료 등의 사용에 대해서는 문헌[Methods Enzymol 267:275-301, 1996], 문헌[Methods Enzymol 318:193-214, 2000] 등을 참조할 수 있다.
이러한 압타머를 이용한 폐암 혈액 바이오마커의 혈중 농도의 검출은 각 폐암 혈액 바이오마커에 특이적인 압타머를 시료와 반응시켜 각 폐암 혈액 바이오마커와 압타머의 결합체를 형성시키고 그 결합체를 검출함으로써 이루어질 수 있는데, 그 결합체의 검출과 관련해서는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 결합체에서 가열이나 카오트로픽 염(chaotropic salt)을 사용하여 압타머를 분리하고 그 압타머를 정량 PCR, 질량 분석기(mass spectroscopy), 차세대 시퀀싱(next-generation sequencing), 특이적 프로브와의 혼성화(hybridizatioin) 방법으로 정량하여 이루어질 수 있다. 이와 관련하여 구체적인 것은 한국 공개특허 제2015-0030655호, 한국 등록특허 제10-0670799호, 문헌[PLoS One. 2010 5(12) e15004] 등을 참조할 수 있다.
본 발명은 다른 측면에 있어서, 폐암 혈액 바이오마커의 검출 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 (a) 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L에 특이적인 결합 분자, 폐암 혈액 바이오마커인, ITIH4에 특이적인 결합 분자 및 폐암 혈액 바이오마커인SERPINF1에 특이적인 결합 분자를 포함하며, (b) 이들 폐암 혈액 바이오마커로 검출하여 얻어진 CD5L, ITIH4 및 SERPINF1 각각의 혈중 농도를 폐암 진단에 사용하는 방법을 교시한 설명서를 포함하여 구성된다.
본 발명의 키트는 폐암 상용화 바이오마커인 CYFRA21-1에 대한 결합 분자를 추가로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 키트에서, 폐암 혈액 바이오마커에 특이적인 분자는 항체 또는 압타머이며, 바람직하게는 항체이다.
상기 본 발명의 키트에는, 상기 폐암 혈액 바이오마커에 특이적인 분자로서 항체는 지지체에 고정된 형태로 또는 지지체와 분리된 형태로 본 발명의 키트에 포함될 수 있다. 항체가 지지체에 분리된 형태로 포함될 경우라면 본 발명의 키트에는 지지체가 추가로 포함될 수 있다. 여기서 지지체는 미소구, 입자, 기판 등일 수 있으며, 바람직하게는 미소구이며, 더 바람직하게는 미소구 중에서도 수지 비드이다.
상기 본 발명의 키트에는, 2차 항체 또는 검출 항체가 시그널의 측정을 가능하게 하는 표지체 또는 효소와 결합된 형태로 또는 그 표지체 또는 효소와 유리된 형태로 추가적으로 포함될 수 있으며, 유리된 형태로 포함될 경우 표지체 또는 효소가 추가적으로 본 발명의 키트에 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 키트에는, 또한 기타 세척 버퍼, 시료 또는 항체 희석액, 효소 기질, 반응 정지액 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
상기 설명서에 교시되는, 폐암 혈액 바이오마커로 검출하여 얻어진 CD5L, ITIH4, SERPINF1 및 CYFRA21-1의 혈중 농도를 폐암 진단에 사용하는 방법은, 다양한 방법이 가능하며, 예컨대 아래의 실시예에서와 같이 ROC 곡선 분석을 이용한 방법이 가능할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 폐암 혈액 바이오마커 CD5L, ITIH4, SERPINF1 등의 검출 방법, CD5L, ITIH4, SERPINF1 등을 활용한 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법 그리고 그 검출 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 방법과 검출 키트는 혈액 중의 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4, SERPINF1 등의 정량을 가능하게 하며, 그럼으로써 의사 등의 의료 전문가에 의한 폐암 이환의 유무, 폐암의 진행 정도 및/또 폐암의 치료 경과의 판별에 유용한 정보를 제공할 수 있다. 특히 본 발명의 검출 방법 및 검출 키트는 임상 시료의 대부분(~94%)이 Ia~IIb사이의 조기 폐암 환자를 대상으로 한 평가 결과에 기초하여 제공되는 것이기 대문에 폐암의 조기 진단 등에도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4, SERPINF1 및 CYFRA 21-1의 혈중 농도의 검출 결과를 정상인 그룹과 폐암 그룹에 대해 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4, SERPINF1 및 CYFRA 21-1의 ROC 곡선이다.
도 3은 폐암 혈액 바이오마커 CYFRA21-1 단독, CD5L 단독, CD5L와 CYFRA21-1의 조합 그리고 ITIH4와 CYFRA21-1의 조합의 ROC 곡선이다.
도 2는 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4, SERPINF1 및 CYFRA 21-1의 ROC 곡선이다.
도 3은 폐암 혈액 바이오마커 CYFRA21-1 단독, CD5L 단독, CD5L와 CYFRA21-1의 조합 그리고 ITIH4와 CYFRA21-1의 조합의 ROC 곡선이다.
이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
> 폐암 마커의 폐암
진단력의
분석
1. 실험 방법
1.1 혈액 시료의 준비
모든 혈액 시료 채취는 서면 동의하에 경북대학교 의과대학의 임상시험심사위원회(IRB)의 승인된 절차에 따라 이루어졌다. 폐암 환자의 시료는 영상학적 진단 방법과 세포병리학적 방법을 통해 확진된 환자 264명으로부터 얻었고, 정상인 시료는 101명으로부터 얻었다. 폐암 환자 그룹의 평균 나이는 69세였고, 정상인 그룹은 평균 나이가 42세였다. 폐암 유형에 따라 분류하면, 평편상피세포암(squamous cell carcinoma, SCC) 환자는 87명, 선암(adenosquamous carcinoma, AC) 환자는 116명, 대세포암(large cell carcinoma, LCC) 환자는 2명, 소세포폐암(small cell lung carcinoma) 환자는 41명, 비소세포성폐암(non-small cell lung carcinoma) 환자는 11명, 미분류 폐암((unclassified/other) 환자는 7명이었다.
폐암 환자 264명을 폐암 진행 단계에 따라 구분하면, 81명의 환자가 Ia/Ib 단계, 168명의 환자가 Ⅱa/Ⅱb단계, 4명의 환자가 Ⅲa/Ⅲb단계, 1명의 환자가 인한 Ⅳ단계였으며, 나머지 환자는 진행 단계가 확인되지 않았다.
아래의 표 1에 시료의 전체적인 내용을 정리하였다.
혈액 시료는 혈청분리용 5㎖ 멸균 진공 채혈관(Plain Tube)을 이용하여 채취하였으며, 상온에서 30분 방치후 10분 동안 2,500rpm의 속도로 원심분리하고, 상층액의 혈청을 분리하여 실험 전까지 -80℃에 보관하였다.
1. 2 비드 기반 샌드위치 면역 분석법에 의한 혈중 폐암 바이오바커의 정량
1.2.1 시약의 준비
항체 제조를 위한, 바이오마커인 항원은 각각 CD5L(accession number: NP_005885.1), ITIH4(accession number: BAD92625.1)와 SERPIN F1(accession number: AAH13984.1)의 전장 cDNA를 이용하여 재조합 방법으로 자체 제조, 분리, 정제하여 사용하였다.
항체도 포유동물(토끼 또는 마우스)을 이용하여 자체적으로 제조, 분리, 정제하여 사용하였다(항혈청 제조는 순천향대학교 의뢰 제작). 즉 포유동물에 항원을 주입하여 면역화시키고 항형청을 분리한 후 역가를 확인하고 Protein G 또는 Protein A 친화성 수지(affinity resin을 사용하여 분리, 정제하여 준비하였다.
대조군 폐암 바이오마커로서, 사용화된 바이오마커인 Cyfra21-1에 대한 항체는 구입하여 사용하였다(Eastcoast Bio 미국).
1.2.2 포획 항체 결합 비드의 제조
폐암 바아커마커 정량을 위한 비드 기반 샌드위치 면역 분석법은 비드(Bead; Luminex Corp.)를 지지체로 사용하는 분석법으로, 포획 항체(Capture antibody)가 결합된 비드와 시료를 반응시켜 그 포획 항체에 폐암 바아커마커가 결합되도록 한 후 여기에 비오틴(biotin)에 결합된 2차 항체(검출 항체)를 처리하여 반응시키고 여기에 형관단백질인 피코에리트린(phycoerythrin, PE)이 결합된 스트렙타아비딘(streptavidin)를 반응시켜 PE를 형광 정도를 측정하는 방법이다. 여기서 포획 항체 결합 비드는 각 다른 비드에 각 폐암 바이오마커를 결합시킨 것을 사용하였으며, 구체적으로 anti-CD5L IgG가 결합된 58번(제조사가 부여한 비드 고유번호임) 비드, anti-ITIH4 IgG가 결합된 11번 비드, anti-SERPIN IgG가 결합된 50번 비드, 대조군 바이오마커인 Cyfra21-1에 대한 항체가 결합된 65번 비드를 사용하였다.
포획 항체가 결합된 비드는 제조사(Luminex Corp.)의 프로토콜에 따라 제조하였다. 구체적으로 1×106개의 비드를 포함하는 500ul의 튜브를 원심분리하여 상층액을 제거하고 dH2O로 2회 세척하였다. 여기에 80㎕의 100mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.2), 10㎕의 sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide; Thermo Scientific)와 10㎕의 EDC(1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride; Sigma)를 첨가한 후 orbital shaker를 이용하여 실온에서 500rpm으로 20분간 반응시키고 50mM MES (pH 5.0)로 2회 세척하였다. 여기에 항체 5ug을 첨가한 뒤, 실온에서 500rpm으로 2시간 반응시켰다. 상층액을 제거하고, PBS-BN(1% BSA, 0.05% sodium azide/PBS (pH7.4))을 첨가한 후, 실온에서 500rpm으로 30분간 다시 반응시켰다. 상층액를 제거한 후, PBS-TBS(1% BSA, 0.02% Tween, 0.05% sodium azide/PBS (pH7.4))으로 bead를 여러 번 세척하고 최종적으로 PBS-BN으로 비드를 풀어준 후, 헤마사이토미터(hemacytometer)를 이용하여 각 비드를 계수하였다.
1.2.3 2차 항체 결합 비오틴의 제조
형광물질과 결합된 스트렙타비딘에 반응하여 폐암 바이오마커의 검출에 사용될 2차 항체(검출 항체)가 결합된 비오틴은 다음과 같이 제조하였다.
표지화 버퍼(Labeling buffer; 10mM Sodium phosphate(pH 7.5))에 녹여져 있는 항체(2mg/ml)에 100mM 활성화 비오틴(Activated biotin) DMSO 용액을 첨가하고 orbital shaker를 이용하여 실온에서 500rpm으로 1시간동안 반응시켰다. 4M 인산 칼륨 버퍼(Potassium phosphate buffer)를 첨가하고 가볍게 볼텍스한 후 4℃에서 30분간 정치상태로 반응시켰다. 원심분리하여 상층액를 제거하고 침전물을 표지화 버퍼에 녹이는 작업을 반복하였다. Bradford 단백질 정량법으로 최종 농도를 1mg/ml 로 정량하였다.
1.2.4 비드 기반 샌드위치 면역 분석 - Luminex assay
비드 기반 샌드위치 면역 분석은 위해서 먼저 모든 시약과 시료를 실온(25℃~30℃)에서 예열하여 준비하였다. 준비된 96 웰 플레이트의 각 웰에 희석한 포획 항체 결합 비드액을 20ul씩 분주하고, 검사하고자 하는 시료(혈청)를 각 웰에 20ul씩 분주하였다. 플레이트를 교반기를 이용하여 30분간 반응시킨 다음, 2차 항체 결합 비오틴 용액을 각 웰당 10ul씩 첨가하고, 다시 20분간 반응시켰다. PE 결합 스트렙타비딘 용액을 각 웰에 10ul씩 첨가한 후, 다시 25분간 반응시켰다. 희석액) 100ul 추가하고 교반기로 5분 동안 용액을 혼합한 후 Luminex 기기(Luminex100)로 형광 정도를 측정하고 표준물질을 이용하여 검량선(standard curve)과 대비하여 정량하였다. 검량선 작성은 표준물질을 소 혈청(Bovine serum) 또는 인간 혈청에 혼입하고 순차적 희석(serial dilution)을 통해 24,000 ~ 33pg/mL의 농도 범위로 준비하여 상기 검출 방법과 동일한 방법을 사용하여 이루어졌다.
1.2.5 자료 분석
통계 분석은 MedCalc software(Ver.9.6.4.0; http://www.medcalc.be)을 이용하여 수행하였다. 검량선을 얻기 위해 선형 회귀 분석을 사용하였으며, 검량선의 선형성을 평가하는데 피어슨 상관 계수(R2)를 사용하였다. Student t-test 또는 Mann Whitney test를 사용하여 정상인 혈청의 마커 농도와 폐암 환자 혈청의 마커 농도 차이의 유의성을 확인하였다(p<0.0001). ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선 분석을 수행하여 특이도, 민감도 및 정확도(AUC)를 산출하였다.
2. 실험 결과
총 365개의 임상 시료(정상인 시료 101개 및 환자 시료 264개)에서 각 단일 마커의 혈중 농도를 측정하여 그 측정 결과를 도 1 및 아래 표 2에 나타내었다.
도 1 및 표 2를 참조하여 보면, CD5L의 평균 혈중 농도는 정상인 시료에 비해 환자 시료에서 2.0배 높은 것으로 나타났고, ITIH4와 SERPIN F1는 각각 1.72배, 1.48배 높은 것으로 나타났으며, 대조군 마커인 CYFRA21-1은 1.61배 높은 것으로 나타났다.
한편 각 단밀 마커의 ROC 분석을 통해 진단력(AUC, area under curve)을 평가하였을 때, 아래 표 3 및 도 2에서 확인되는 바와 같이 CD5L1는 AUC가 0.818로 나타났고, ITIH4는 AUC가 0.713, SERPIN F1는 AUC가 0.759로 나타났다. 대조군 마커인 CYFRA 21-1는 AUC가 0.703나 나타나 각 단일 마커는 모두 상용화된 대조군 마커보다 높은 AUC를 나타냈다.
또 상용화 대조군 마커를 포함한 4 가지 마커의 조합의 AUC를 아래 표 3에 함께 나타내었는데, CD5L와 대조군 마커인 CYFRA21-1 마커 조합이 가장 높은 AUC 0.895를 보였고, 다음으로 ITIH4와 대조군 마커인 CYFRA21-1 마커 조합 등이 높은 AUC 0.818을 보였다. 이 때의 마커 조합은 혈중농도을 단계적 로지스틱 회귀분석 방법으로 산출한 확률데이터를 기반으로 이루어졌다.
그리고 도 3에서 확인되는 바와 같이, 상기 AUC와 높은 단일 마커와 조합 마커의 95%의 특이도(specificity)에서 민감도(sensitivity)는, CD5L이 51.3%, CD5L와 CYFRA21-1의 조합이 38.7%, ITIH4와 CYFRA21-1의 조합이 50.0%로, 기존 상용화 대조군 마커의 CYFRA21-1 단독검사의 95% 특이도에서의 민감도인 38.1%에 비해 우수한 성능을 보였다.
특히 상기 마커의 진단력은 임상 시료의 대부분(~94%)이 Ia~IIb사이의 조기 암 환자를 대상으로 평가되었기 때문에 폐암 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
| 마커 | CD5L | ITIH4 | SERPIN F1 | CYFRA21-1 |
| 정상군 | 2946 | 6088 | 5844 | 2072 |
| 환자군 | 5917 | 10502 | 6846 | 3343 |
| t test | p<0.0001 | p=0.0001 | p=0.0161 | p=0.0011 |
| Mann Whitney test | p<0.0001 | p<0.0001 | p<0.0001 | p<0.0001 |
| 마커 | AUC |
| CD5L | 0.818 |
| ITIH4 | 0.713 |
| SERPIN F1 | 0.759 |
| CYFRA21-1 | 0.703 |
| CD5L & CYFRA21-1 | 0.895 |
| ITIH4 & CYFRA21-1 | 0.81 |
| CD5L & ITIH4 | 0.818 |
| CD5L & SERPIN F1 | 0.818 |
| CD5L & CYFRA21-1 | 0.713 |
| ITIH4 & SERPIN F1 | 0.713 |
| SERPIN F1 & CYFRA21-1 | 0.771 |
| CD5L & ITIH4 & SERPIN F1 | 0.818 |
| CD5L & SERPIN F1 & CYFRA21-1 | 0.895 |
| CD5L & ITIH4 & SERPIN F1 & CYFRA21-1 | 0.895 |
Claims (15)
- 폐암 진단에 유용한 정보를 제공하기 위하여,
(a) 피검자에서 채취된 혈액 시료 또는 그것의 가공 시료와 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4 및 SERPINF1 각각에 특이적인 결합 분자를 반응시켜, 상기 시료 중에 존재하는 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4 및 SERPINF1 각각과 이에 특이적인 결합 분자의 결합체를 형성시키는 단계, 및 (b) 상기 결합체를 검출하여 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4 및 SERPINF1 중 하나 이상의 폐암 혈액 바이오마커의 혈중 농도를 검출하는 단계를
포함하여 구성되는 폐암 혈액 바이오마커의 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 혈액 가공 시료는 혈장 또는 혈청인 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 폐암 혈액 바이오마커에 특이적인 결합 분자는 항체인 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 폐암 혈액 바이오마커 이에 특이적인 결합 분자의 결합체를 형성시키는 단계는,
(a-i) 포획 항체(capturing antibody)로서 폐암 혈액 바이오마커에 대한 특이적인 항체를 지지체의 표면에 고정시키는 단계, 및
(a-ii) 상기 포획 항체가 고정된 지지체에 혈액 시료 또는 그것의 가공 시료를 처리하여 상기 포획 항체와 폐암 혈액 바이오마커의 결합체의 형성을 유도하는 단계를 포함하고,
상기 (b) 단계의 결합체의 검출 단계는,
(b-i) 상기 시료 처리 후에 시그널 측정을 매개하거나 제공하는 표지체 또는 효소와 결합된 검출 항체(detection antibody)를 처리하는 단계, 및
(b-ii) 상기 표지체 또는 효소가 매개하거나 제공하는 시그널을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제4항에 있어서,
상기 지지체는 미소구(microsphere)이고 그 미소구는 수지 비드인 방법.
- 제4항에 있어서,
상기 시그널 측정을 매개하거나 제공하는 표지체는 비오틴인 방법.
- 제4항에 있어서,
상기 시그널 측정을 매개하거나 제공하는 표지체는 비오틴이고,
상기 (b-ii) 단계는 상기 (b-i) 단계 후에 시그널과 결합된 아비딘(avidin)이나 스트렙타아비딘(streptavidin)을 처리하고 아비딘(avidin)이나 스트렙타아비딘(streptavidin)에 결합된 시그널을 측정하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 폐암 혈액 바이오마커 이에 특이적인 결합 분자의 결합체를 형성시키는 단계는
(a-i) 혈액 시료 또는 그것의 가공 시료를 지지체의 표면에 결합시키는 단계, 및 (a-ii) 1차 항체로서 폐암 혈액 바이오마커에 대한 항체를 처리하는 단계를 포함하고,
상기 (b) 단계의 결합체의 검출 단계는,
(b-i) 상기 1차 항체 처리 후 효소가 결합된 2차 항체를 처리하는 단계, 및
(b-ii) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
- (a) 피검자에서 채취된 혈액 시료 또는 그것의 가공 시료와 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4 및 SERPINF1 각각에 특이적인 결합 분자를 반응시켜, 상기 시료 중에 존재하는 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4 및 SERPINF1 각각과 이에 특이적인 결합 분자의 결합체를 형성시키는 단계, (b) 상기 결합체를 검출하여 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L, ITIH4 및 SERPINF1 중 하나 이상의 폐암 혈액 바이오마커의 혈중 농도를 검출하는 단계, 및 (c) 상기 피검자의 폐암 바이오마커의 혈중 농도를 정상인의 폐암 바이오마커 혈중 농도 또는 폐암 환자의 폐암 바이오마커의 혈중 농도와 비교하여 피검자를 폐암을 가지거나 또는 가지지 않는 것으로 분류하는 단계를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 혈액 가공 시료는 혈장 또는 혈청이고,
상기 폐암 혈액 바이오마커에 특이적인 결합 분자는 항체인 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 (a) 단계의 폐암 혈액 바이오마커 이에 특이적인 결합 분자의 결합체를 형성시키는 단계는,
(a-i) 포획 항체(capturing antibody)로서 폐암 혈액 바이오마커에 대한 특이적인 항체를 지지체의 표면에 고정시키는 단계, 및
(a-ii) 상기 포획 항체가 고정된 지지체에 혈액 시료 또는 그것의 가공 시료를 처리하여 상기 포획 항체와 폐암 혈액 바이오마커의 결합체의 형성을 유도하는 단계를 포함하고,
상기 (b) 단계의 결합체의 검출 단계는,
(b-i) 상기 시료 처리 후에 시그널 측정을 매개하거나 제공하는 표지체 또는 효소와 결합된 검출 항체(detection antibody)를 처리하는 단계, 및
(b-ii) 상기 표지체 또는 효소가 매개하거나 제공하는 시그널을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제11항에 있어서,
상기 지지체는 미소구(microsphere)이고 그 미소구는 수지 비드이고,
상기 시그널 측정을 매개하거나 제공하는 표지체는 비오틴이고,
상기 (b-ii) 단계는 상기 (b-i) 단계 후에 시그널과 결합된 아비딘(avidin)이나 스트렙타아비딘(streptavidin)을 처리하고 아비딘(avidin)이나 스트렙타아비딘(streptavidin)에 결합된 시그널을 측정하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 (a) 단계의 폐암 혈액 바이오마커 이에 특이적인 결합 분자의 결합체를 형성시키는 단계는
(a-i) 혈액 시료 또는 그것의 가공 시료를 지지체의 표면에 결합시키는 단계, 및 (a-ii) 1차 항체로서 폐암 혈액 바이오마커에 대한 항체를 처리하는 단계를 포함하고,
상기 (b) 단계의 결합체의 검출 단계는,
(b-i) 상기 1차 항체 처리 후 효소가 결합된 2차 항체를 처리하는 단계, 및
(b-ii) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
- 폐암 혈액 바이오마커인 CD5L에 특이적인 결합 분자, 폐암 혈액 바이오마커인 ITIH4에 특이적인 결합 분자 및 폐암 혈액 바이오마커인 SERPINF1에 특이적인 결합 분자를 포함하는 폐암 혈액 바이오마커 검출 키트.
- 제14항에 있어서,
상기 키트는 폐암 혈액 바이오마커인 CYFRA21-1에 대한 결합 분자를 추가로포함하는 키트.
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