ES2333892T3

ES2333892T3 - Monitorizacion de la enfermedad de huntintong.

Info

Publication number: ES2333892T3
Application number: ES05820667T
Authority: ES
Inventors: Nicola Louise Leeds; Malcolm Andrew Ward; Emma Mcgregor; Sarah Joanna Tabrizi; Annette Dalrymple; James Campbell; Jules Arthur Westbrook; Helen Louise Byers
Original assignee: University College London; Medical Research Council; Electrophoretics Ltd
Current assignee: University College London; Medical Research Council; Proteome Sciences PLC
Priority date: 2004-12-07
Filing date: 2005-12-07
Publication date: 2010-03-02
Anticipated expiration: 2025-12-07
Also published as: DE602005017819D1; ATE471519T1; US8506957B2; US9028801B2; ES2344118T3; DE602005021912D1; GB0426859D0; US20080213802A1; GB0521762D0; US20080286263A1; ATE449345T1

Abstract

Método de monitorización de la evolución de la enfermedad de Huntington en una muestra diagnóstica de un tejido corporal válido tomada de un sujeto humano vivo, que comprende detectar la concentración de precursor de clusterina en la muestra diagnóstica y compararla con una muestra anterior del mismo sujeto o con un valor patrón típico de un estadio de la enfermedad.

Description

Monitorización de la enfermedad de Huntington.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere a un método de monitorización de la evolución de la enfermedad de Huntington (EH).

Descripción de la técnica relacionada

La enfermedad de Huntington es una enfermedad hereditaria autosómica dominante y está provocada por una expansión de la repetición CAG en el gen IT15 del cromosoma 4, dando como resultado la producción de un largo tramo de poliglutamina. La enfermedad está asociada con una degeneración grave y progresiva del cuerpo estriado y la corteza del cerebro, y se caracteriza clínicamente por un trastorno del movimiento, problemas de comportamiento y demencia. La edad media de aparición es de 40 años y la esperanza de vida es de 15-20 años.

La enfermedad es clínicamente heterogénea y existen dificultades en la evaluación de la evolución de la enfermedad en esta dolencia que han conducido a la necesidad de que se desarrollen métodos adicionales para ayudar al desarrollo de ensayos terapéuticos para esta enfermedad.

Singhrao et al. dieron a conocer niveles de clusterina elevados en muestras de cerebro post mortem de pacientes con EH (1999).

Sumario de la invención

La invención proporciona el uso de precursor de clusterina en o para la monitorización de la evolución de la EH. Se ha encontrado que esta proteína marcadora se expresa de manera diferencial en electroforesis dimensional de muestras de plasma y experimentos de obtención de perfil de espectrometría de masas en tiempo de vuelo mediante desorción-ionización por láser de superficie (SELDI).

Las proteínas marcadoras y sus características de expresión diferencial son tal como sigue:

1. Proteína presente en una concentración aumentada en una muestra de EH, en comparación con un control: precursor de clusterina (número de registro de SwissProt P 10909);

2. Proteínas adicionales presentes en una concentración aumentada o disminuida en una muestra de EH, en comparación con un control, tal como se enumera a continuación;

3. Proteínas presentes en una concentración aumentada en muestras de EH, en comparación con un control: beta-actina (número de registro de SwissProt P60709) y precursor de apolipoproteína A-IV (número de registro de SwissProt P06727).

La invención se define mediante las reivindicaciones.

La proteína marcadora puede estar presente en el tejido corporal en cualquier forma biológicamente relevante, por ejemplo, en forma glicosilada, fosforilada, multimérica o de precursor.

Definiciones

La expresión "expresado de manera diferencial" significa que los puntos que llevan proteína están presentes a una densidad óptica superior o inferior en el gel de la muestra tomada para el diagnóstico ("la muestra diagnóstica") que el gel de un control u otra muestra comparativa. Se deduce que las proteínas están presentes en el plasma de la muestra diagnóstica a una concentración superior o inferior que en el control u otra muestra comparativa.

El término "control" se refiere a un sujeto humano normal, es decir, uno que no padece una enfermedad neurodegenerativa, y también a una muestra tomada del mismo sujeto humano que proporcionó la muestra diagnóstica, pero en un momento anterior.

La terminología "concentración aumentada/disminuida...en comparación con una muestra de un control" no implica que se acometa realmente una etapa de comparación, dado que en muchos casos será obvio para el experto que la concentración es anómalamente alta. Además, cuando están monitorizándose los estadios de la EH de manera progresiva, la comparación realizada puede ser con la concentración observada previamente en el mismo sujeto en la evolución anterior de la enfermedad.

La expresión "pareja de unión" incluye una sustancia que reconoce o tiene afinidad por la proteína marcadora. Puede estar o no marcada en sí misma.

La expresión "proteína marcadora" incluye todas las formas biológicamente relevantes de la proteína identificada.

El término "diagnóstico", tal como se usa en el presente documento, incluye la determinación de si la enfermedad relevante está presente o ausente y también incluye, en relación con la enfermedad de Huntington, la determinación del estadio al que ha evolucionado. El diagnóstico puede servir como la base de un pronóstico respecto al desenlace futuro para el paciente y para monitorizar la eficacia del tratamiento.

La expresión "tejido corporal válido" significa cualquier tejido en el que puede esperarse razonablemente que una proteína marcadora se acumule en relación con la EH. Aunque será principalmente un fluido corporal, también incluye tejido cerebral o nervioso.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una fotografía de un gel bidimensional típico realizada para fines analíticos, mediante el método descrito en el ejemplo 1 más adelante. Se muestra el peso molecular (masa molecular relativa) en la ordenada en kiloDaltons. Se muestran los marcadores de peso molecular en el lado izquierdo. Se muestra el punto isoeléctrico (pI) en la ordenada, aumentando de izquierda a derecha.

La figura 2 es similar a la figura 1, pero mostrando los puntos 1713 y 1960 en una muestra derivada de un paciente con EH.

Las figuras 3, 4 y 5 muestran gráficas de caja y bigote de los resultados de inmunotransferencias de tipo Western para un marcador para la EH, tal como se explica más completamente en el ejemplo 2.

La figura 6 muestra gráficas de dispersión de espectros duplicados del conjunto de datos Q10-Tris tal como se explica en el ejemplo 3.

La figura 7 es un diagrama de Venn que presenta el número y el solapamiento de picos estadísticamente diferentes en tres conjuntos de datos experimentales, tal como se explica en el ejemplo 3.

La figura 8 muestra gráficas de caja y bigote de intensidades de pico significativamente diferentes, tal como se explica en el ejemplo 3.

Descripción

Un método de diagnóstico preferido comprende realizar un ensayo de unión para detectar la proteína marcadora. Puede usarse cualquier pareja de unión razonablemente específica. Preferiblemente, la pareja de unión está marcada. Preferiblemente, el ensayo es un inmunoensayo, especialmente entre el marcador y un anticuerpo que reconoce la proteína, especialmente un anticuerpo marcado. Puede ser un anticuerpo producido contra parte o todo de la misma, lo más preferiblemente un anticuerpo monoclonal o un antisuero policlonal anti-ser humano de alta especificidad para la proteína marcadora.

Por tanto, las proteínas marcadoras descritas anteriormente son útiles para el fin de producir anticuerpos frente a las mismas que pueden usarse para detectar la concentración aumentada o disminuida de las proteínas marcadoras presentes en una muestra diagnóstica. Tales anticuerpos pueden producirse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en el campo del inmunodiagnóstico.

Los anticuerpos pueden ser frente a cualquier estado biológicamente relevante de la proteína. Por tanto, por ejemplo, podrían producirse contra la forma no glicosilada de una proteína que existe en el organismo en una forma glicosilada, contra una forma más madura de una proteína precursora, por ejemplo, menos su secuencia señal, o contra un péptido que porta un epítopo relevante de la proteína marcadora.

La muestra puede tomarse de cualquier tejido corporal válido, especialmente fluido corporal, de un sujeto (humano), pero preferiblemente sangre, plasma o suero. Otros fluidos corporales que pueden usarse incluyen líquido cefalorraquídeo (LCR), orina y lágrimas.

Según otro método, el diagnóstico se lleva a cabo post mortem en un tejido corporal de origen neurológico relevante para la EH, tal como a partir del cerebro o los nervios. El tejido se trata previamente para extraer proteínas del mismo, incluyendo las que estarían presentes en la sangre del fallecido, de modo que se garantice que las proteínas marcadoras relevantes especificadas anteriormente estarán presentes en una muestra positiva. Para los fines de esta memoria descriptiva de patente, un extracto de este tipo es equivalente a un fluido corporal.

A modo de ejemplo, se disecciona tejido cerebral y se solubilizan las subsecciones en tampón de lisis de gel 2-D (por ejemplo tal como se describe más adelante), en una razón de aproximadamente 100 mg de tejido con respecto a 1 ml de tampón.

El inmunoensayo preferido se lleva a cabo midiendo el grado de la interacción proteína/anticuerpo. Puede usarse cualquier método de inmunoensayo conocido. Se prefiere un ensayo de tipo "sándwich". En este método, se une un primer anticuerpo frente a la proteína marcadora a la fase sólida tal como un pocillo de una placa de microtitulación de plástico, y se incuba con la muestra y con un anticuerpo secundario marcado específico frente a la proteína que va a someterse a ensayo. Alternativamente, podría usarse un ensayo de captura de anticuerpos. En este caso, se deja que la muestra de prueba se una a una fase sólida, y entonces se añade el anticuerpo anti-proteína marcadora y se deja que se unan. Tras eliminar por lavado cualquier material no unido, se determina la cantidad de anticuerpo unido a la fase sólida usando un anticuerpo secundario marcado, frente al primero.

En otro método, se realiza un ensayo de competición entre la muestra y una proteína marcadora marcada o un péptido derivado de la misma, estando estos dos antígenos en competición por una cantidad limitada de anticuerpo anti-proteína marcadora unido a un soporte sólido. La proteína marcadora marcada o el péptido de la misma podrían incubarse previamente con el anticuerpo en la fase sólida, mediante lo cual la proteína marcadora en la muestra desplaza parte de la proteína marcadora o el péptido de la misma unidos al anticuerpo.

Aún en otro método, se deja que los dos antígenos compitan en una única incubación conjunta con el anticuerpo. Tras la eliminación del antígeno no unido del soporte mediante lavado, se determina la cantidad de marcador unido al soporte y se mide la cantidad de proteína en la muestra mediante referencia a curvas de titulación estándar establecidas previamente.

El marcador es preferiblemente una enzima. El sustrato para la enzima puede ser, por ejemplo, formador de color, fluorescente o quimioluminiscente.

La pareja de unión en el ensayo de unión es preferiblemente una pareja de unión específica marcada, pero no necesariamente un anticuerpo. Por ejemplo, cuando la proteína marcadora es alfa-1-antitripsina, la pareja de unión específica puede ser tripsina. La pareja de unión estará habitualmente marcada en sí misma, pero alternativamente puede detectarse mediante una reacción secundaria en la que se genera una señal, por ejemplo a partir de otra sustancia marcada.

Es sumamente preferible usar una forma amplificada de ensayo, mediante lo cual se produce una "señal" potenciada a partir de un nivel relativamente bajo de proteína que va a detectarse. Una forma particular de inmunoensayo amplificado es el ensayo quimioluminiscente potenciado. De manera conveniente, el anticuerpo está marcado con peroxidasa del rábano, que participa en una reacción quimioluminiscente con luminol, un sustrato de peroxido y un compuesto que potencia la intensidad y duración de la luz emitida, normalmente 4-yodofenol o ácido 4-hidroxicinámico.

Otra forma preferida de inmunoensayo amplificado es inmuno-PCR. En esta técnica, el anticuerpo está unido covalentemente a una molécula de ADN arbitrario que comprende cebadores de PCR, mediante lo cual el ADN con el anticuerpo unido al mismo se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Véase E. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids Research 23: 522-529 (1995). La señal se lee como anteriormente.

Alternativamente, la muestra diagnóstica puede someterse a electroforesis en gel bidimensional para producir un gel teñido y detectarse la concentración aumentada o disminuida de la proteína detectada mediante una intensidad aumentada o disminuida de un punto que contiene proteína en el gel teñido, en comparación con un control correspondiente o gel comparativo. Los puntos relevantes, las enfermedades identificadas y la expresión diferencial son los enumerados en la tabla 1 a continuación. La descripción incluye un método de este tipo, independientemente de la identificación de la proteína marcadora facilitada anteriormente en la tabla 2.

El diagnóstico no requiere necesariamente una etapa de comparación de la concentración de la proteína con un control, sino que puede llevarse a cabo con referencia o bien a un control o bien a una muestra comparativa. Por tanto, en relación con la enfermedad de Huntington, la invención puede usarse para determinar el estadio de la evolución, si se desea con referencia a los resultados obtenidos anteriormente del mismo paciente o mediante referencia a valores estándar que se consideran típicos del estadio de la enfermedad. De este modo, la invención puede usarse para determinar si, por ejemplo tras el tratamiento del paciente con un fármaco o fármaco candidato, la enfermedad ha evolucionado o no. El resultado puede conducir a un pronóstico del desenlace de la enfermedad.

La descripción incluye además el uso para un fin diagnóstico (y por tanto posiblemente pronóstico) o terapéutico de un material de pareja que reconoce, se une a o tiene afinidad por una proteína marcadora especificada anteriormente y/o representada por un punto electroforético de un gel bidimensional expresado de manera diferencial mostrado en la figura 2 en el presente documento. Por tanto, por ejemplo, pueden usarse anticuerpos frente a las proteínas marcadoras, apropiadamente humanizados cuando sea necesario, para tratar la EH. El material de pareja será habitualmente un anticuerpo y se usará en cualquier formato compatible con el ensayo, de manera conveniente un formato inmovilizado, por ejemplo como perlas o un chip. O bien el material de pareja estará marcado o bien podrá interaccionar con un marcador.

La descripción incluye además un kit para su uso en un método de diagnóstico, que comprende un material de pareja, tal como se describió anteriormente, en un formato compatible con el ensayo, tal como se describió anteriormente, para su interacción con una proteína presente en la muestra diagnóstica.

El diagnóstico puede basarse en la expresión diferencial de una, dos, tres o más de las proteínas marcadoras. Además, puede ser parte de un diagnóstico más amplio en el que se diagnostican dos o más enfermedades diferentes. Pueden diagnosticarse juntas tanto vCJD como la enfermedad de Huntington y cualquiera o ambas de éstas junto con al menos otra enfermedad, que puede ser o no neurológica, en la misma muestra de fluido corporal, mediante un método que incluye detectar un aumento de la concentración de otra proteína en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra de un sujeto humano normal, control. Esta(s) otra(s) enfermedad(es) puede(n) ser cualquiera que pueda diagnosticarse en un fluido corporal. Pueden ser neurológicas, por ejemplo otra encefalopatía espongiforme transmisible, enfermedad de Parkinson, meningitis, pero no son necesariamente neurológicas, por ejemplo síndrome de choque tóxico, MRSA o enfermedad celiaca.

Por tanto, en particular, se contempla dentro de la descripción usar un chip de anticuerpos o serie de chips, que pueden diagnosticar una o más proteínas que interaccionan con ese anticuerpo.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1

Se tomaron diez muestras de plasma de pacientes (4 mujeres, 6 hombres) a los que se les diagnosticó CJD variante (vCJD) que servían como control de enfermedad neurológica, diez de pacientes (7 mujeres, 3 hombres) a los que se les diagnosticó mediante pruebas genéticas que tenían la enfermedad de Huntington (EH) y diez de controles, es decir, pacientes normales (8 mujeres, 2 hombres) que no tenían ningún síntoma neuropatológico.

Se eliminaron la albúmina y la IgG de las muestras usando un kit suministrado por Amersham Biosciences UK Ltd. Este kit contiene una resina de afinidad que contiene anticuerpo que elimina específicamente la albúmina y la IgG directamente de muestras de plasma y suero humano completo. Se reivindica que puede lograrse una eliminación de más del 95% de la albúmina y más del 90% de la IgG a partir de 15 \mul de plasma/suero humano, aumentando de ese modo la resolución de proteínas de inferior abundancia en una electroforesis posterior. Se usa una columna Microspin, a través de la que se eluye la proteína no unida.

El empobrecimiento se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante usando un volumen de partida de 15 \mul de muestra de plasma bruto. Se añadió la resina al plasma, se incubó la mezcla con agitación, se transfirió a una columna Microspin, se centrifugó y se recogió el filtrado. Se concentró la muestra empobrecida resultante y se desaló mediante precipitación con acetona (tal como se recomienda en las instrucciones del kit). Se decantó la acetona y se resuspendió el sedimento en tampón de lisis de gel 2-D convencional (urea 9,5 M, CHAPS al 2%, DTT al 1%, Pharmalyte al 0,8%, pH 3-10, inhibidores de proteasas (1 comprimido/10 ml de tampón de lisis) (Roche). Se usó esta suspensión para la electroforesis en gel bidimensional.

Dado que el kit de empobrecimiento no proporciona al usuario un protocolo para "desprender" las proteínas unidas a la columna, se adoptó un método de cromatografía convencional para realizar esto, que es usar un tampón de glicina 0,1 M-HCl, pH 2,5. Se almacenaron todas las fracciones unidas correspondientes a -80ºC para su uso posterior en otro experimento.

Se realizó la electroforesis en gel bidimensional según J. Weekes et al., Electrophoresis 20: 898-906 (1999) y M. Y. Heinke et al., Electrophoresis 20: 2086-2093 (1999), usando tiras de gradiente no lineal pH 3-10 inmovilizadas de 18 cm (IPG). Se realizó la segunda dimensión usando electroforesis en gel de T SDS al 12%-poliacrilamida. Para el análisis inicial, se cargaron los geles con 75 microgramos de proteína. Se tiñeron los geles con plata con la tinción de plata OWL analítica (Insight Biotechnologies, RU).

Se realizaron análisis de imágenes cuantitativos y cualitativos usando el software Progenesis^{TM} Workstation, versión 2003.02 (Nonlinear Dynamics Ltd.). Se procesaron las imágenes a través del asistente automático para la detección, distorsión y apareamiento de puntos. Después de eso, se sometieron todas las imágenes a una edición manual extensa y un apareamiento óptimo con el gel de referencia (>80% por gel). Tras restar el fondo y normalizar con respecto al volumen de puntos total, se exportaron los datos de puntos de proteínas a Excel para un análisis estadístico cuantitativo y comparaciones de cambios cualitativos.

Se realizó la prueba de la t de Student, al intervalo de confianza del 95%, para cada punto de proteína que podía compararse entre las muestras de los pacientes enfermos y los controles y que estaba presente en al menos el 60% de los geles de cada grupo, es decir, al menos 6. Se realizó una transformación logarítmica, dado que ésta proporcionaba una distribución más normal, cumpliendo así mejor las suposiciones de esta prueba tal como se aplica a muestras independientes.

Los puntos para los que se observó un aumento o una disminución significativos en comparaciones entre los tres grupos se muestran en las figuras 2 y se enumeran en la tabla 1.

TABLA 1

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Se observará que el punto 1713 es uno al que se le puede atribuir una confianza particularmente alta en los resultados en relación con el aumento en su intensidad en las muestras de EH frente a los controles.

Para fines preparativos, se prepararon entonces geles bidimensionales adicionales mediante el mismo método, reuniendo todas las muestras dentro de cada grupo experimental y cargando los geles con 400 microgramos de proteína. Había por tanto tres geles preparados, uno para cada grupo, que se tiñeron con plata, usando la tinción de plata PlusOne (Amersham Pharmacia Biosciences UK Ltd.).

Normalmente, se cortaron los puntos de los geles preparativos en los que tenían una intensidad elevada, pero cuando esto no era posible, se cortaron de otro gel. Tras una reducción, alquilación y digestión en el gel del material cortado con tripsina, se extrajeron los péptidos producidos y se analizaron posteriormente mediante CL/EM/EM. Este procedimiento implica la separación de los péptidos mediante HPLC en fase inversa, seguida por electropulverización para ionizar la muestra, a medida que entra en un espectrómetro de masas en tándem. El espectrómetro de masas registra la razón de masa con respecto a carga de los iones del precursor peptídico, que entonces se seleccionan individualmente para determinar su fragmentación por medio de disociación inducida por colisión (CID). Esta denominada exploración de EM/EM permite que se determine la secuencia del péptido. Por tanto, para cada muestra, el conjunto de datos incluye pesos moleculares determinados de manera precisa para múltiples péptidos presentes, acompañados por información de secuencia correspondiente. Se usa esto entonces para identificar la proteína buscando en bases de datos. En el presente caso, se usó el algoritmo de búsqueda Mascot en las bases de datos de SWISS-PROT y de proteínas no redundantes (nr) del Centro Nacional de Información Biotecnológica ("National Center for Biotechnology Information") (NCBI).

Los resultados de la identificación se muestran en la tabla 2. Todos los puntos de la tabla 1 que se expresaban de manera diferencial en el gel se identificaron como proteínas conocidas. La tabla muestra los números GenInfo (GI) de la base de datos del NCBI y los números de registro de SwissProt.

En algunos casos se identificó más de una proteína, lo que significa que el punto cortado contenía una mezcla de proteínas, al menos una de las cuales se expresaba de manera diferencial en el gel. Las proteínas identificadas en la base de datos tenían diferentes pesos moleculares y puntos isoeléctricos, inferiores o superiores, de los evidentes en el gel. Esto es completamente habitual y puede explicarse porque la proteína dentro del punto del gel ha experimentado escisión enzimática o química o porque se ha modificado postraduccionalmente tal como mediante glicosilación, fosforilación o la adición de lípidos.

TABLA 2

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Ejemplo 2

Se realizaron los siguientes experimentos de inmunotransferencia de tipo Western para mostrar el uso de la invención para monitorizar la evolución de la enfermedad de Huntington.

Se obtuvieron muestras de plasma, con el consentimiento apropiado, de 55 pacientes que tenían diversos estadios de la enfermedad de Huntington y de 15 pacientes normales, como controles. Los grupos experimentales eran: control, presintomáticos (PST o P), temprano (T), moderado (M), 15 muestras de cada uno y avanzado (A), 10 muestras. Se diluyeron las muestras 1 en 300 con PBS estéril (Sigma) y se determinó la concentración de proteína por triplicado, usando BSA como patrón y el kit de ensayo de proteínas DC (Bio-Rad Laboratories Ltd, Herts, RU). Se prepararon posteriormente mezclas madre de proteínas plasmáticas para limitar el error por pipeteo y la congelación-descongelación y para permitir que se procesasen muestras idénticas en varios geles.

Se desnaturalizaron las muestras a 95ºC durante 10 min. en tampón de muestra Laemmli (Sigma) y se separaron por tamaño usando geles de Tris al 12% o al 16%-glicina-acrilamida de 20 cm x 10 cm (depósito de gel: Sci-Plas,. Southam, GB). Se cargaron muestras de plasma en grupos de 2-4 (véase la tabla 3) para distribuir las muestras sobre el gel y limitar las diferencias en el procesamiento del gel y la eficacia de transferencia. Se transfirieron las proteínas a membranas de poli(difluoruro de vinilideno) (Amersham Pharmacia Biotech Ltd, Buckinghamshire, GB) durante 30 min. a 25 voltios usando un aparato de transferencia en semiseco, Trans-Blot SD (Bio-Rad Laboratories Ltd).

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TABLA 3

3

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Se evaluaron la eficacia de transferencia y la igual carga de muestras de proteínas incubando membranas con disolución rojo Ponceau (Sigma).

Tras la transferencia, se lavaron las membranas con PBS-T (PBS, Tween-20 al 0,1%, Sigma), se incubaron (durante la noche, 4ºC) en tampón de bloqueo (PBS-T, Marvel al 5%) y se incubaron posteriormente (2 h, temperatura ambiente) con el anticuerpo primario requerido (véase la tabla 4). Tras la incubación con el anticuerpo primario, se incubaron adicionalmente las membranas (1 h, temperatura ambiente, dilución 1 en 5000) con un anticuerpo secundario de conejo anti-cabra (Jackson laboratories, Maine, EE.UU.) o de oveja anti-ratón conjugado con peroxidasa del rábano (clusterina y beta-actina, Amersham Pharmacia Biotech Ltd). Después de eso, se lavaron las membranas en PBS-T (6 x 15 min.), se incubaron con el reactivo de ensayo de quimioluminiscencia potenciado ECL-plus (Amersham Pharmacia Biotech Ltd) y se visualizó la señal luminiscente de las bandas de proteína usando un explorador Storm 860 (Amersham Pharmacia Biotech Ltd).

TABLA 4

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Análisis estadístico y de datos

Se trazaron cajas de igual tamaño alrededor de cada banda en imágenes de inmunotransferencia de tipo Western usando ImageQuant (Amersham Pharmacia Biotech Ltd). Se calculó el volumen de todos los píxeles de cada caja, se restó el valor de fondo y se analizó estadísticamente el valor restante, usando las pruebas apropiadas (tabla 5). Se determinó el valor de Levene (que evalúa si las muestras tienen igual varianza) para cada grupo de datos. Si el valor de Levene era inferior a 0,05 (las muestras tienen varianza desigual), entonces se comprobó el estadístico Welch y se usó la prueba post hoc de Tamhane. Si el valor de Levene era superior a 0,05, entonces se usó ANOVA con la prueba post hoc de Tukey HSD (diferencia honestamente significativa). Tras aplicar la prueba post hoc apropiada, se obtuvo un valor de probabilidad (P), considerándose significativo menor de 0,05.

Se observará que se obtuvo un número sustancial de resultados significativos o casi significativos (marcados con asterisco) al nivel de P <0,05, incluyendo muchos entre el grupo moderado y el grupo control y entre el grupo moderado y el grupo presintomático.

Se analizaron adicionalmente los resultados para un día particular mediante gráficas de caja y bigote, para el gel 1 (35 resultados), el gel 2 (35 resultados) y los geles 1 y 2 (los 70 resultados). Véanse las figuras 3 a 5, en las que C = control, P = presintomático, T = temprano, M = moderado y A = EH avanzada. Las cajas representan los cuartiles superior e inferior por encima de la mediana, indicada mediante la línea gruesa, mientras que los bigotes se extienden hasta las observaciones que están a 1,5 veces o menos la distancia intercuartílica desde la caja. Los valores atípicos, a más de 1,5x y hasta 3x la amplitud intercuartílica, se muestran como un círculo, los casos extremos, a más de 3x, mediante un asterisco. Se incluyeron los casos extremos y atípicos en el análisis de datos estadístico en la tabla 5. Se observará que había una correlación sustancial entre el estadio de la enfermedad hasta el moderado y la densidad de la banda de precursor de clusterina en el gel.

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TABLA 5 Análisis estadístico de inmunotransferencias de tipo Western de precursor de clusterina

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Se encontró que el precursor de apolipoproteína A4 aumentaba significativamente en muestras de EH moderada en comparación con los controles en un gel de seis (n = 3, experimentos de gel 1 y gel 2).

Beta-actina: las inmunotransferencias de tipo Western preliminares sugieren que la beta-actina es la proteína que está cambiando en el punto 1713 del gel 2D. Sin embargo, los puntos tenían un fondo extremadamente alto que inhibía la cuantificación.

Ejemplo 3 Introducción

Se obtuvo el perfil de componentes dentro del plasma de pacientes con enfermedad de Huntington (EH) y controles sanos (CON; no apareados por edad-sexo) usando espectrometría de masas en tiempo de vuelo mediante desorción-ionización por láser de superficie (SELDI). Se realizaron tres experimentos, participando en cada uno el mismo conjunto de muestras de plasma pero difiriendo en el chip o tampón de lavado usado. El grupo de EH se subdividió adicionalmente en previo a la enfermedad (PRE), enfermedad temprana (TEM), enfermedad moderada (MOD) o enfermedad avanzada (AVA). Los grupos de enfermedad y control consistieron todos en 15 muestras de pacientes excepto para el grupo de AVA, que contenía 10 muestras.

Se obtuvieron los perfiles de proteínas del plasma usando chips de proteínas (Ciphergen Biosystems) con o bien una superficie de intercambio aniónico fuerte (SAX, Q10) o bien una superficie de intercambio catiónico débil (WCX, CM10). Se equilibraron los chips CM10 y se lavaron en un único tipo de tampón mientras que los chips Q10 se analizaron tras el tratamiento con dos tampones alternativos. El experimento que usaba chips Q10 lavados en Tris HCl 100 mM (pH 9,0) se denomina "Q10-Tris". El experimento en el que participaban chips Q10 lavados en acetato de sodio 50 mM (pH 6,5) se denomina Q10-NaAc. El experimento en el que participaban chips CM10 lavados en acetato de amonio 50 mM (pH 7,5) se denomina CM10-AmAc.

Preparación de los datos

Calibración: se calibró el espectrómetro de masas SELDI-TOF usando una mezcla de residuos 18-39 de hormona adrenocorticotrópica (ACTH), citrocromo C3, mioglobina y albúmina sérica bovina (BSA). Tras la adquisición de los espectros para los experimentos de obtención del perfil de proteínas, se eligió un espectro como espectro de referencia (muestra TEM 8117 en la posición de punto E) y se recubrió el punto correspondiente con 1 \mul de una disolución acuosa que contenía las moléculas calibradoras. Se añadió al punto 1 \mul adicional de una disolución 20 mg/ml de matriz de ácido sinapínico (ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico) en acetonitrilo acuoso al 50% con ácido trifluoroacético al 0,1% y se dejó secar durante aproximadamente 10 min. Se adquirieron los espectros usando los parámetros aplicados a las muestras originales y se usaron para crear ecuaciones de calibración que se aplicaron a los espectros, incluyendo el espectro de referencia. Los iones usados para calibrar los espectros fueron: ACTH cargada de manera única, m/z = 2.466,72; citocromo C doblemente cargado, m/z = 6.181,05; mioglobina doblemente cargada, m/z = 8.476,78; citocromo C cargado de manera única, m/z = 12.361,10; mioglobina cargada de manera única, m/z = 16.952,56; BSA doblemente cargada, m/z = 33.216,00; BSA cargada de manera única, m/z = 66.560,00). En todos los casos, se usaron valores de m/z promedio porque el espectrómetro de masas no podía resolver especies isotópicas individuales. Se produjeron ecuaciones de calibración separadas para las regiones de m/z baja (2.467-16.952) y alta (16.952-66.560) de los espectros y se asignaron los valores de m/z de los picos de los espectros usando los valores de m/z del espectro de referencia, calibrado en el intervalo de m/z apropiado. Las masas a las que se hace referencia en el informe son las derivadas de los espectros de referencia calibrados. Se facilitan también en la tabla 9 los intervalos de confianza (IC) del 95% de las masas promedio para todo el conjunto de muestras clínicas. Se estimaron los intervalos de los IC del 95% de los valores de m/z como el valor de m/z medio de todos los picos apareados \pm dos desviaciones estándar. Este intervalo tiene una probabilidad del 95% de abarcar el verdadero valor de m/z medio de la población y es un método válido de estimación debido al gran número de muestras (>100) usado para derivar los parámetros de la media y la desviación estándar.

Marcado de los picos: se marcaron los picos manualmente usando las herramientas proporcionadas por el software ProteinChip (Ciphergen Biosystems). Antes marcar los picos, se realizó una resta del nivel inicial usando una anchura de pico ajustada de 5 veces la anchura de pico esperada. Para el conjunto de datos Q10-Tris, se marcaron un total de 71 picos a lo largo del intervalo de m/z 2.505-66.544. Para el conjunto de datos CM10-AmAc, se detectaron 67 picos en el intervalo de m/z 2.509-65.587. Para el conjunto de datos Q10-NaAc, había 66 picos marcados en la región 2.628-66.703. Tras el marcado de los picos, se realizó una inspección visual de todos los espectros y se exportaron los datos de intensidad de los picos a Excel (Microsoft). Se comprobaron las masas de los picos apareados en Excel y se encontró que todos tenían coeficientes de variación inferiores al 0,90%. Hubo un pequeño número de valores que faltaban en los conjuntos de datos en los que no pudieron marcarse picos. Estos valores no se convirtieron en ceros sino que en su lugar se dejaron como valores que faltaban.

Procesamiento previo: se realizó la normalización cuantílica según el método de Bolstad et al. (2003) usando un programa escrito en el lenguaje de programación estadístico R (www.r-project.org). Antes de la normalización, se sustituyeron los valores que faltaban por la intensidad de pico media para espectros del mismo grupo para proporcionar un valor sustitutivo durante la normalización. Tras la normalización, se convirtieron de nuevo los valores sustitutivos en valores que faltaban. Se transformaron mediante log_{10} los datos de intensidad de pico para picos que presentaban distribuciones positivamente sesgadas (sesgo > 0,7) antes del análisis de todos los datos.

Análisis de correlación

Se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson para espectros duplicados. En el conjunto de datos Q10-Tris, se analizaron muchas de las muestras por duplicado aunque algunas se analizaron tres veces y algunas una única vez. Cuando existían duplicados, se calculó el coeficiente de correlación para el par. Cuando existían triplicados, se calcularon los coeficientes de correlación por parejas. Cuando existían singletes, se calculó el coeficiente de correlación medio de ese espectro en comparación con todos los espectros a partir de la matriz de correlación generada en el entorno R. Para los conjuntos de datos restantes (CM10-AmAc y Q10-NaAc), se analizaron las muestras por duplicado y se calcularon los coeficientes de correlación sólo para espectros duplicados. Antes del cálculo de los coeficientes de correlación, se transformaron mediante log_{10} los datos. Se hizo esto porque había muchos más picos de baja intensidad que picos de alta intensidad, de modo que la correlación es más representativa de la relación entre pares de espectros tras la transformación logarítmica. Los datos de correlación se muestran en la tabla 6.

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TABLA 6 Correlación de Pearson de muestras duplicadas en el conjunto de datos Q10-Tris

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TABLA 6 (continuación)

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Los resultados del análisis de correlación del conjunto de datos Q10-Tris indicaron que la mayoría de los espectros duplicados eran muy similares. De hecho, 63 de las 80 comparaciones dieron como resultado valores de r \geq 0,9. De las 17 comparaciones de espectros duplicados que dieron valores de r < 0,9, siete eran valores medios de r para los espectros no duplicados (singlete) en comparación con los otros espectros en la matriz de correlación y se esperaría quizá que éstos fuesen inferiores a las comparaciones directas de espectros duplicados. De los 10 espectros duplicados restantes que se correlacionaron con r < 0,9, sólo uno era particularmente sospechoso. Se correlacionaron los duplicados de la muestra 13271 con r = 0,54. Una inspección más cercana de este par sugirió que el espectro adquirido de la posición H del chip 5000 era visualmente distinto a los otros espectros del experimento, y por tanto se excluyó este espectro. El valor medio de r a lo largo de la matriz de correlación para la muestra 13271 restante era de 0,75, en línea con los valores medios de las otras muestras no duplicadas. La figura 6 muestra gráficas de dispersión de los tres espectros duplicados en el conjunto de datos Q10-Tris con coeficientes de correlación de 0,98 (1a), 0,90 (1b) y 0,54 (1c). En particular, las gráficas son: a) Espectros duplicados de la muestra 13342. El coeficiente de correlación de este par es de 0,98. b) Espectros duplicados de la muestra 11924. El coeficiente de correlación de este par es de 0,90. c) Espectros duplicados de la muestra 13271. El coeficiente de correlación de este par es de 0,54.

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Las correlaciones de los espectros duplicados en los conjuntos de datos CM10-AmAc y Q10-NaAc implicaron sólo espectros duplicados y los valores de correlación de Pearson se facilitan en las tablas 7 y 8, respectivamente.

TABLA 7 Correlación de Pearson de muestras duplicadas en el conjunto de datos CM10-AmAc

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TABLA 7 (continuación)

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TABLA 8 Correlación de Pearson de muestras duplicadas en el conjunto de datos Q10-NaAc

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TABLA 8 (continuación)

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En el conjunto de datos CM10-AmAc, los valores de correlación de Pearson para los espectros duplicados oscilaron desde 0,98 hasta 0,84, correlacionándose 56 de los 70 duplicados con r \geq 0,90. En el conjunto de datos Q10-NaAc, los valores de correlación de Pearson oscilaron desde 0,99 hasta 0,83, correlacionándose 63 de los 69 duplicados con r \geq 0,90. No se excluyeron espectros de estos conjuntos de datos basándose en el análisis de correlación.

Determinación del promedio: para mejorar la fiabilidad de las mediciones de los picos en los perfiles de SELDI, se calcularon promedios (medias) a partir de los duplicados disponibles. Se ha demostrado anteriormente en el laboratorio que esto mejora las correlaciones entre un conjunto de espectros que comprenden duplicados biológicos cuando se toman promedios de los pares para representar la muestra. Para el análisis de datos, se usaron los datos promediados en lugar de los duplicados originales. Esto es particularmente importante porque evita dar una sobreestimación de los grados de libertad en las pruebas de hipótesis estadísticas, tal como se produciría cuando se usan muestras duplicadas como si fuesen muestras biológicas independientes.

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Pruebas de hipótesis estadísticas

Se usaron varios métodos relacionados para el análisis de datos univariantes del conjunto de datos promediado y normalizado para cuantiles. Éstos pueden dividirse ampliamente en las pruebas para la suposición de que todas las medias son iguales, y procedimientos de comparaciones múltiples que someten a prueba la igualdad de las medias de pares individuales de los grupos. Adicionalmente, se realizó una prueba para determinar la homogeneidad de las varianzas antes de someter a prueba las medias para determinar el conjunto de pruebas apropiado que va realizarse.

Con el fin de someter a prueba la importante suposición del ANOVA de que los grupos tienen igual varianza, se usó la prueba de Levene al nivel del 95%. Si la prueba de Levene daba un valor de p > 0,05, se rechazó la hipótesis alternativa y se supuso que los grupos tenían igual varianza. Cuando se supuso igual varianza, se usó el ANOVA de una vía para someter a prueba la igualdad de las medias de los grupos. Cuando no pudo suponerse igual varianza (es decir, cuando la prueba de Levene daba un valor de p de < 0,05), se usó la prueba de Welch para la igualdad de las medias como una alternativa más robusta. Tanto el ANOVA de una vía como la prueba de Welch se realizaron al nivel del 95%.

Cuando se encontró que las medias de los grupos eran desiguales, se usó una de las dos pruebas para someter a prueba todos los pares de grupos en los conjuntos de datos. Si se encontró que las medias eran desiguales usando la prueba de ANOVA de una vía, se usó la diferencia honestamente significativa de Tukey (HSD) para comparar todos los grupos. Si se encontró que las medias eran desiguales usando la prueba de Welch, entonces se empleó la T2 de Tamhane para comparar todos los grupos. Se realizaron ambos métodos de comparaciones múltiples al nivel del 95%.

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La tabla 9 muestra información referente a los picos que se encontró que tenían diferencias estadísticamente significativas en las medias de los cinco grupos (CON, PRE, TEM, MOD y AVA).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 9 Picos que se encontró que eran estadísticamente diferentes en los conjuntos de datos Q10-Tris, Q10-NaAc o CM10-AmAc usando pruebas univariantes

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: a. Se encontró que las medias de los grupos eran desiguales mediante ANOVA de una vía. b. Se encontró que las medias de los grupos eran desiguales mediante la prueba de Welch. c. Las medias de los grupos eran desiguales mediante la prueba de Welch pero ningún grupo {}\hskip0.2cm individual era diferente al nivel del 95% mediante la prueba de Tamhane.

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Se notifican los grupos significativos al nivel del 80% para la prueba de Tamhane.

En total, se encontró que 32 picos tenían diferencias estadísticamente significativas en las medias de todos los grupos en los tres conjuntos de datos. En el conjunto de datos Q10-Tris, había ocho picos que mostraban diferencias estadísticamente significativas en la intensidad de pico media de los grupos como un todo. En el conjunto de datos Q10-NaAc, había 16 picos que presentaban diferencias estadísticamente significativas en la intensidad de pico media de los grupos. En el conjunto de datos CM10-AmAc, había 12 picos que mostraban diferencias estadísticamente significativas en la intensidad de pico media de los grupos. De estos picos que diferían entre los grupos, había algunos que se solapaban entre los tres conjuntos de datos. Concretamente, los picos 8 y 31 mostraron ambos una diferencia estadísticamente significativa entre la intensidad de pico media de los grupos tanto en el conjunto de datos Q10-Tris como en el Q10-NaAc. Algunas comparaciones de grupos en el conjunto de datos Q10-NaAc encontradas usando la prueba de Welch no mostraron ninguna diferencia significativa usando la T2 de Tamhane al nivel del 95%, presumiblemente debido a la naturaleza conservadora de esta prueba de comparación múltiple. Cuando éste era el caso, los grupos que diferían al nivel del 80% se facilitaron como los grupos que más probablemente producían la diferencia detectada mediante la prueba de Welch.

Para cada diferencia de grupo estadísticamente significativa, se calculó un cambio en veces entre las medias de los grupos y se presentó en la tabla 9. Había un total de 59 diferencias de grupo individuales con cambios en veces de la intensidad de pico media superiores a 1,5 y éstas se derivaban de 29 picos distintos. Por tanto, estos cambios representan probablemente las diferencias más robustas e importantes entre los grupos.

Una característica destacada de las diferencias de grupo enumeradas en la tabla 9 es que el grupo AVA es el grupo estadísticamente diferente con la mayor frecuencia en comparación con los otros grupos. Había un total de 82 diferencias de grupo individuales encontradas y de éstas, 78 eran una comparación del grupo AVA con uno de los otros grupos. Este resultado no implica necesariamente que los cambios observados se produzcan solamente en los estadios avanzados de la EH, sólo que si los cambios evolucionaban con la enfermedad, no eran lo suficientemente grandes para que fuesen de significación estadística mediante las pruebas usadas. La figura 8 muestra gráficas de caja y bigote que resumen las distribuciones de las intensidades de pico de los picos estadísticamente diferentes en cada grupo. Para cada pico, se facilitan el conjunto de datos y el valor de m/z junto con una gráfica de caja y bigote que muestra la distribución de los valores dentro de cada grupo. Los grupos están marcados como 1 (CON), 2 (PRE), 3 (TEM), 4 (MOD) y 5 (AVA).

Resumen

El análisis de SELDI de muestras de los grupos CON y EH detectó por encima de 200 picos a lo largo de los tres conjuntos de datos. De estos picos, se encontró que 36 eran estadísticamente diferentes entre uno o más grupos y se encontró que dos de estos picos diferían tanto en el conjunto de datos Q10-Tris como en el Q10-NaAc, dando 34 picos que cambiaban individualmente. El número y el solapamiento de los picos estadísticamente diferentes en los tres conjuntos de datos experimentales se presentan gráficamente en forma de un diagrama de Venn en la figura 7. De estos 34 picos distintos, 29 mostraron cambios en veces entre uno o más grupos superiores a 1,5 veces.

Se muestran resultados adicionales a continuación en la tabla 10. Ésta es un resumen de todas las proteínas que se han identificado en el material extraído de los chips de SELDI. Cualquiera de los picos que se ha observado en los perfiles de SELDI se originan a partir de cualquiera de las proteínas enumeradas en la tabla, o bien como las proteínas maduras esperadas o bien como fragmentos de las proteínas. La lista de proteínas y cualquier fragmento de las mismas constituyen por tanto secuencias que generarían de forma verosímil los valores de m/z que se observan en los espectros de SELDI.

TABLA 10

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Se han correlacionado 6 de los 34 m/z de los picos observados en SELDI con las secuencias indicadas a continuación. La siguiente tabla 11 se refiere a los números de picos madre indicados en la tabla 9 y correlaciona los m/z de picos de SELDI con la información de la secuencia de proteína a partir de los resultados de CL/EM/EM.

TABLA 11

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Claims

1. Método de monitorización de la evolución de la enfermedad de Huntington en una muestra diagnóstica de un tejido corporal válido tomada de un sujeto humano vivo, que comprende detectar la concentración de precursor de clusterina en la muestra diagnóstica y compararla con una muestra anterior del mismo sujeto o con un valor patrón típico de un estadio de la enfermedad.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende detectar un aumento de la concentración de precursor de clusterina en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra anterior del mismo sujeto.

3. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la detección se realiza en la muestra diagnóstica mediante un ensayo de unión para detectar el precursor de clusterina.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el ensayo de unión comprende provocar que el precursor de clusterina de la muestra diagnóstica interaccione con una pareja de unión específica y detectar la interacción.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la pareja de unión específica es un anticuerpo marcado que reconoce al precursor de clusterina.

6. Método según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo está inmovilizado sobre una fase sólida.

7. Método según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo está inmovilizado sobre perlas o como un chip.

8. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la muestra diagnóstica se somete a electroforesis en gel bidimensional para producir un gel teñido y se detecta una concentración alterada del precursor de clusterina mediante un aumento o una disminución de la intensidad de un punto que contiene proteína en el gel teñido, en comparación con un gel control correspondiente.

9. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el tejido corporal válido es un fluido corporal.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el tejido corporal válido es de tejido cerebral o nervioso.

11. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que se diagnostica un estadio particular de la enfermedad de Huntington.

12. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que un aumento del nivel de precursor de clusterina en comparación con el nivel previo en una muestra anterior del mismo individuo indica un aumento en la gravedad de la enfermedad.

13. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la evolución de la enfermedad de Huntington en un sujeto se monitoriza midiendo el nivel de precursor de clusterina, y opcionalmente beta actina y/o precursor de apolipoproteína A-IV, por lo cual un aumento del nivel de una o más de estas proteínas en comparación con el nivel previo respectivo de una o más proteínas en una muestra anterior del mismo individuo indica un aumento en la gravedad de la enfermedad.

14. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la monitorización de la evolución de la enfermedad de Huntington se usa para monitorizar la eficacia del tratamiento.

15. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que otra enfermedad, que puede ser neurológica o no, se diagnostica en la misma muestra de tejido corporal, mediante un método que comprende detectar un aumento de la concentración de otra proteína en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra de un sujeto humano normal, control.