CN110201188B - 一种地肤花粉变应原浸提物、其浸提液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了本发明涉及一种地肤花粉变应原浸提物、其浸提液及其制备方法，地肤花粉变应原浸提物其含有致敏蛋白Koc S1’，其含有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。该地肤花粉变应原浸液，其含有治疗有效量或诊断有效量的地肤花粉变应原。该浸液还可经地肤花粉收集、干燥、脱脂、提取、超滤浓缩、冷冻干燥、复溶等工艺方法制得。该地肤花粉变应原浸液具有特异性高的特点，地肤致敏蛋白组分提取充分，总生物效价稳定，有效期长，无菌效果好；可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断、体外嗜碱性粒细胞活化试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由地肤花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。

Description

一种地肤花粉变应原浸提物、其浸提液及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种地肤花粉变应原浸提物、其浸提液及其制备方法。

背景技术

人们对变态反应疾病的认识始于“花粉热”，花粉热又称过敏性鼻炎。1911年Noon和Freeman首次利用花粉提取液来治疗花粉热，变态原疾病治疗的历史从此开始。目前，变态反应性疾病是全球性重大卫生问题之一。工业化国家超过25％的人口被变应性哮喘、变应性鼻结膜炎及变应性皮炎困扰，其中以变应性哮喘最为常见。吸入致敏花粉是引发变应性哮喘及其他呼吸道变态反应性疾病的最重要因素。VRTA—L.A等调查发现近50％的变态反应性疾病患者对草类花粉过敏。

叶筱燕的《130例慢性荨麻疹点刺试验结果分析》指出130例慢性荨麻疹对吸入物抗原测试反应结果中，地肤花粉阳性率为17.69％；郝玉琴的《皮肤点刺试验检测慢性荨麻疹、湿疹变应原的临床意义》指出186例慢性荨麻疹、湿疹病人吸入物变应原检测阳性结果，地肤占7.5％；潘武林的《63例慢性荨麻疹变应原皮肤检测分析》得出63例慢性荨麻疹患者吸入变应原检测阳性结果，地肤花粉占7.1％。

以上地肤花粉流行病学调查研究显示，地肤花粉过敏广泛分布在我国各地，在北方地区地肤花粉是花粉过敏的主要致敏原。

地肤(Kochia scoparia(L.)Schrad.)属中央种子目地肤属，地肤适应性较强，喜温、喜光、耐干旱，不耐寒，对土壤要求不严格，较耐碱性土壤。肥沃、疏松、含腐殖质多的壤土利于地肤旺盛生长原产于欧洲及亚洲中部和南部地区。分布在亚洲、欧洲以及中国大陆的大部分地区。国外分布：北非、非洲、欧洲、亚洲、中欧、俄罗斯西伯利亚地区、俄罗斯西西伯利亚地区、俄罗斯远东地区、乌苏里、则亚-布列亚、中亚地区。

现在变应原特异免疫治疗的方法主要分为皮下注射给药免疫治疗和舌下给药免疫治疗。皮下注射给药免疫治疗已有100多年历史，其安全性和有效性已经被得到证明。上世纪90年代初，变应原舌下滴剂疫苗诞生，1998年，WHO宣布了变应原舌下滴剂疫苗安全和有效。

但是舌下给药免疫脱敏的方式相比皮下注射免疫给药，治疗周期长，短时间内疗效不显著，平均脱敏周期3-5年。在一个治疗周期中，舌下给药方式免疫脱敏给药量是皮下注射给药量的100倍。所以皮下注射给药免疫脱敏的方式相比舌下给药，虽然病人依从性差，但是治疗周期短，见效快，治疗费用低。目前，用于地肤花粉变应原的作为皮下注射免疫制剂的稳定性差，蛋白含量和生物效价都会随时间下降，成分不确定试剂存放一定时间后用于诊断地肤花粉诱发的变态反应疾病时，阳性率降低，准确性低。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种含地肤花粉变应原浸物，该浸物具有于特异性高，地肤致敏蛋白组分提取充分且比例恒定，总生物效价稳定，有效期长的特点。其可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由地肤花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种地肤花粉变应原浸物，其含有致敏蛋白Koc S1’；所述Koc S1’含有如SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列。

一种地肤花粉变应原浸液，其含有治疗有效量或诊断有效量的地肤花粉变应原、体积比为0.2～0.4％的苯酚，体积比为45～55％的甘油和4.5～5.5g/L的NaCl，其pH值为6.0～8.0。

如上所述的地肤花粉变应原浸液，优选地，所述地肤花粉变应原的活性浓度为50000～200000BAU/ml，所述地肤花粉变应原浸液的总蛋白浓度0.28～1.12mg/ml。

进一步地，通过SDS-PAGE和Western Blotting检测，所述地肤花粉变应原的蛋白分布主要在11kDa、14.5kDa、18kDa、28kDa、42kDa、68kDa、72kDa、85kDa和115kDa。

如上所述的地肤花粉变应原浸液，优选地，通过全蛋白质谱或经SDS-PAGE分离后将对应分子量胶条分别取样进行质谱检测，所述地肤花粉变应原浸提物主要含且不限于如SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.17所示的特征性肽段。

如上所述的地肤花粉变应原浸液的制备方法，其包括如下步骤：

S1、采集地肤花粉，常温干燥真空干燥或流化床干燥；

S2、对干燥后的花粉脱脂、干燥；

S3、将脱脂干燥后的地肤花粉按重量g体积ml比1:50～1:10加入pH为7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2～8℃搅拌22～26h进行浸提；

S4、取步骤S3后的浸提液，离心取上清液；将上清液过滤及除菌过滤；

S5、将过滤后的上清液进行超滤浓缩，获得超滤浓缩液；

S6、将所述超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，真空冻干获得地肤花粉变应原冻干品；

S7、将所述地肤花粉变应原冻干品用pH 6.5～7.5磷酸盐—盐水缓冲液复溶配置为地肤花粉变应原原液，2～8℃放置，与等体积灭菌的甘油混匀，调节溶液pH值至6.0～8.0。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，所述花粉脱脂采用花粉与丙酮以1：5～1:1的重量g体积ml比进行脱脂处理，重复脱脂至上层液体澄清。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S4中，所述离心的条件为8000～12000g，离心温度2～8℃，时间为15～20min；所述过滤及除菌过滤为先用4000目滤布过滤后，再通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S5中，所述超滤浓缩用3KD超滤膜超滤，当超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml，停止超滤；当超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，更换超滤膜之后对超滤透过液重复超滤，直至超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml为止。

如上所述的制备方法，优选地，在步骤S6中，所述真空冻干的条件为-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％。

如上所述的制备方法，优选地，所述步骤S1还包括对原料地肤花粉进行镜检鉴别和/或DNA鉴定的步骤，其中DNA鉴定方法为，以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2为引物，对鉴别地肤花粉原料进行PCR扩增，并检测扩增产物。

如上所述的制备方法，优选地，所述磷酸盐—盐水缓冲液的终浓度包括4.5～5.5g/L的氯化钠、0.03％～0.05％的磷酸二氢钾、1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠和0.2％～0.4％的苯酚。

在制备地肤花粉变应原进行浸提时，发明人尝试了多种浸提液，并且比较了它们的浸提效率。所使用的浸提液包括：0.8％的氯化钠、pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH8.2的coca’s液、pH8.9的Tris-盐酸缓冲液、pH为7.9～8.2的含有4.5～5.5g/L的氯化钠及重量百分比含量为0.03％～0.05％的磷酸二氢钾，1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠，0.2％～0.4％的苯酚等。实验结果证实，使用pH为7.9～8.2的含有4.5～5.5g/L的氯化钠及0.03％～0.05％的磷酸二氢钾，1.5％～2％十二水合磷酸氢二钠，0.2％～0.4％的苯酚的浸提效率较高，且制备的地肤花粉变应原浸液可长期有效的保存，稳定性高。

本发明还提供一种地肤花粉变应原冻干品，其由包括地肤花粉收集-干燥-脱脂-提取-超滤浓缩-冻干的步骤制得：

(1)收集：用自然脱落法收集地肤花粉；

(2)干燥：常温干燥真空干燥或流化床干燥，直至花粉不再粘附，将干燥后的花粉过150～250目分样筛；

(3)脱脂：将(2)所得到的花粉与丙酮分别按g与ml计，以1：5～1:1的重量体积比进行脱脂处理，振荡脱脂30分钟后，静置分层，倒出上层液，加入新的丙酮，重复脱脂至上层液体澄清，将脱脂后的花粉均匀摊开，室温下干燥48小时至72小时；

(4)提取：将脱脂干燥后的地肤地肤花粉按重量体积比1:50～1:10加入10L，pH7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2-8℃搅拌22～26h进行浸提；取提取后的浸提液，在离心力8000～12000g，离心温度2～8℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清；先用4000目滤布过滤后，将滤液依次通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；

(5)超滤浓缩：将过滤后的浸提液，用3KD超滤膜超滤，取样超滤浓缩液、超滤透过液，检测其总蛋白含量；其中，当超滤透过液中总蛋白含量≤0.02mg/ml，则直接排弃透过液；超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，则对超滤膜进行完整性测试，超滤膜未破损，则排弃透过液；若超滤膜破损，则更换超滤膜之后对透过液重复超滤；

(6)冻干：将超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，按照冻干工艺条件，-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％，获得地肤花粉变应原冻干品。

如上所述地肤花粉变应原浸液的应用及所述地肤花粉变应原冻干品的应用，用于在制备诊断变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗制剂中的应用，所述诊断变态反应疾病包括过敏性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和慢性荨麻疹。

进一步，所述地肤花粉变应原浸提物冻干品用于制备成片剂、口崩片，所述地肤花粉变应原浸液用于制备注射液、舌下滴剂、变应原斑贴剂、变应原浸液稀释液。

本发明提供的地肤花粉变应原浸液用于制备治疗地肤花粉过敏性疾病的药物使用。

具体而言，采用本发明提供的地肤花粉变应原浸液或冻干品按治疗有效量或诊断有效量的地肤花粉变应原、以及药学上可接受的载体可制备用于治疗地肤花粉过敏性疾病的药物。

用于治疗地肤花粉过敏性疾病的药物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者年龄、体重和大致疾病状况等因素确定对病人有益的剂量进行施用。用于治疗地肤花粉过敏性疾病的药物的剂型选自口服剂、(皮下)注射剂、舌下含服剂、气雾剂、鼻腔剂、或皮肤点刺剂等液体剂型；优选(皮下)注射剂、舌下含服剂、或皮肤点刺剂。其中，(皮下)注射剂、舌下含服剂一般是作为特异性免疫治疗时常用的剂型，而皮肤点刺剂是作为体内变应原检测时常用的剂型。

当采用本发明地肤花粉变应原浸液应用于诊断由地肤花粉引起的过敏性疾病时(即变应原皮肤点刺诊断试验)，除了本发明地肤花粉变应原浸液外，一般还应包括阴性对照液、阳性对照液、以及点刺针。阴性对照液一般为对人体无过敏性反应的液体(例如甘油与盐溶液的混合物等)，阳性对照液一般为1.0～5.0mg/ml的磷酸组胺/盐酸组胺溶液。

本发明制备的地肤花粉变应原浸液可应用于斑贴试验中。其原理为：将可疑致敏物质(变应原)敷贴于患者皮肤上，通过皮肤或粘膜进入机体后由抗原呈递细胞将抗原呈递给T淋巴细胞，使特异性T淋巴细胞活化，诱发炎症反应。

本发明的有益效果在于：

1、地肤作为北方地区主要花粉过敏原，本发明提供的地肤花粉标准化变应原浸液可以有效诊断由地肤花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。

2、加入稳定剂甘油，提高了稳定性和缓释作用，提高了用药的有效性和安全性。

3、变态反应疾病皮下注射免疫脱敏给药方式，相比舌下含服滴剂给药方式，见效快，周期短。整个治疗周期给药剂量远小于舌下滴剂给药量(约100倍)，其治疗费用远小于舌下滴剂给药免疫脱敏，减轻患者的医疗负担。

4、本发明通过使用制备的应变原浸液以原液做点刺试验分别与变态反应专科医生临床综合特异性诊断和血清特异性IgE(specific IgE，sIgE)诊断进行对比，评价皮内试验结果与临床综合特异性诊断及与血清sIgE诊断的结果一致、具有较好的灵敏度和特异度，安全性好。

5、本发明通过使用制备的变应原浸液以1：10³～10⁸稀释后做体外嗜碱性粒细胞活化试验，能临床特异性诊断地肤过敏患者，避免部分体外sIgE检测假阳性，同时也能避免变应原皮肤试验(点刺或皮内)给部分地肤花粉过敏患者带来过敏性休克的风险。

本发明提供的地肤花粉变应原浸液具有特异性高的特点，地肤致敏蛋白组分提取充分，总生物效价稳定，有效期长，无菌保证好；可有效用于变态反应疾病的皮肤点刺试验诊断及特异性免疫治疗，可有效诊断由地肤花粉诱发的变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗。可实现标准化控制，使用有效期有效延长，能带来较好的经济效益。

本发明方法通过冻干复溶后得到的浸液，相比北京协和医院研制的地肤花粉变应原注射原液更稳定，生物效价和蛋白含量都比较稳定，且效期为3年。

附图说明

图1为地肤花粉原料ITS2序列PCR电泳结果。

图2为不同批次地肤花粉不同脱脂时间脂肪含量变化趋势。

图3为地肤花粉浸液总蛋白含量与浸提时间的关系。

图4为地肤花粉变应原浸液为SDS-PAGE蛋白电泳结果(示意成分鉴别)。

图5为地肤花粉变应原浸液为western与地肤过敏患者血清Western-

Blotting混合血清池反应检测结果。

图6为地肤花粉变应原浸液产品pH值在长期稳定性试验中pH值的测试结果。

图7为地肤花粉变应原浸液产品苯酚含量在长期稳定性试验中测试结果。

图8为地肤花粉变应原浸液产品甘油含量在长期稳定性试验中测试结果。

图9为地肤花粉变应原浸液产品氯化钠含量在长期稳定性试验中测试结果。

图10为地肤花粉变应原浸液产品蛋白含量在长期稳定性试验中测试结果。

图11为地肤花粉变应原浸液产品总变应原活性在长期稳定性试验中测试结果。

图12、地肤花粉变应原浸液产品应用于临床地肤花粉过敏患者体外嗜碱性粒细胞活化试验结果示例。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1地肤花粉的鉴别

由于原料的鉴别和纯度对于后续变应原诊断及治疗制剂极为重要，本实施例采用DNA特异性序列检测加显微镜检对地肤原料进行双重鉴别及质控。

1、地肤花粉DNA提取

采用天根快速DNA提取扩增试剂盒(天根生化KG203)。

提取方法：称取5mg地肤花粉样品置于1.5mL离心管中，加入Buffer 1100μl后用一次性研磨杵将样品彻底研碎后加入Buffer 2 100μl后震荡混匀，离心机12000r/min离心5min后取上清液于新的离心管中作为DNA模版备用。

2、引物设计及合成

引物序列如下：

1.引物设计引物序列如下：

Koc ITS2-F(SEQ ID NO.1)：

5'-CCTGGTGCTGGTATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'

Koc ITS2-R(SEQ ID NO.2)：

5'-AGTCAGTCAGCCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

2、PCR反应体系

PCR扩增试剂盒(天根生化)。对提取的DNA采用如下25μl体系的配制PCR反应体系见表1：

对实施例1中制备地肤花粉变应原冻干品，进行DNA的提取，对提取的DNA采用如下25μl体系的配制PCR反应体系如表1：

表1.地肤花粉ITS2序列PCR反应体系

3、PCR反应条件见表3.

表2.地肤花粉ITS2序列PCR反应条件

1％琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳观察。电泳结果如图1所示。其中L1、L2、L3为3批地肤花粉PCR产物，Lmix是上述3批地肤花粉混合原料PCR产物，DNA Marker如图1所示。

4、测序

利用PCR产物纯化回收试剂盒(生工SK1141)，回收PCR产物进行测序，测序结果如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.3：

TGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAACCTTCGGGTCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTCTCCCCCTACCCACCTTGTGTGGGAAGGGGGAGGAGGATGGCTTCCCGTGCCTCACCGGGCGTGGTTGGCCTAAAAAAGGAGCCTCAAGTTATGCACTGTTGCGGCAATTGGTGGTAGACAAGGCCTTGGCCTCGAATGCAATCTTGTGTCGTGCAGTACATGACAATTGTGGGCTCGTAGGACCCTGAGTTGTTCCCAATTGGAAACAAACCGTTGCGACCCCAGGTCAGGCGGGGTTACCCGCTGAGTTTAA

5、地肤的显微镜检

地肤花粉显微镜下形态学鉴别：花粉球形～近球形。直径约28微米。具散孔，孔圆形～近圆形，分布均匀；具孔膜，膜上有颗粒状纹饰。外壁两层，形成颗粒状纹饰。

实施例2地肤花粉脱脂及浸提关健工艺步重要参数的确定

1、地肤花粉脱脂工艺步参数确定

(1)将地肤花粉(g)与丙酮(ml)以1：2的重量体积比(w/v)进行脱脂处理。对不同批次(不同采集时间)的地肤花粉不同脱脂时间样品进行脂肪含量进行检测，以确定最优的脱脂时间。

采用海能SOX500脂肪测定仪测定地肤花粉中脂肪含量，通过索式萃取及干燥称重的方法，对比萃前后花粉重量的变化，得到相对应的脂肪含量，并根据脂肪含量结果对之后脱脂后花粉进行质量控制.

结果见图2，可见丙酮脱脂时间为30min后，脂肪含量几乎不随脱脂时间延长而下降，因此脱脂时间确定为30min。

(2)脱脂参数的验证：对不同批次(不同采集时间)的地肤花粉进行30min脱脂后检测脂肪含量，结果如表3所示。

表3.不同批次地肤花粉脱脂30min后脂肪含量降低百分比

结果得知，地肤花粉中脂肪含量在3％-5％左右，故在之后脱脂过程中，脱脂后的地肤花粉在脂肪含量上应该下降3-5％左右，也就是花粉总重同比也应该下降0.2-5％左右。

2、地肤花粉蛋白浸提工艺步重要参数确定

(1)将地肤花粉(g)与丙酮(ml)以1：2的重量体积比(w/v)进行搅拌或振荡脱脂30分钟处理，静置分层，观察上层液体澄清情况，重复脱脂至上层液体澄清后，将脱脂后的花粉均匀摊开，室温下干燥48小时以上。

(2)将脱脂干燥后的地肤花粉按重量体积比1:10加入10L，pH 7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2～8℃，在搅拌速度为250rpm条件下，在搅拌时间分别为3h、6h、9h、12h、18h、24h、48h、72h等提取点时，将提取后的提取液，将浸提液全部加入到离心桶内，调节平衡，离心力8000～12000g，离心温度4℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清。

(3)将离心分离后的上清液先用4000目滤布过滤后，通过纸板过滤，0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；得到地肤花粉粗提取液。

取样以Bradford法测定蛋白含量，结果见图3。

如图3结果表明，在蛋白提取过程中，随搅拌提取时间延长，蛋白提取含量增大，提取时间24h含量达到最高1200.09±8.33μg/ml，可见蛋白类物质提取时间过长会影响其蛋白含量，故提取时间优选为22～26h左右。

实施例3地肤花粉原料工艺

1、花粉采集

自然脱落法，收集地肤花粉。常温或真空或流化床干燥，直至花粉不再粘附。将干燥后的花粉过150～250目分样筛，本实施例中优选为180目分样筛。

2、干燥

将花粉摊放于通风干燥处自然干燥，或真空干燥、或流化床干燥6-48h，直至花粉不再粘附。

3、脱脂

将上述所得花粉(g)与丙酮(ml)以1：5～1:1的重量体积比(w/v)进行脱脂处理。本实施例中优选为1：2。搅拌或振荡脱脂30分钟后，静置分层，观察上层液体澄清情况。倒出上层液，加入新的丙酮，重复脱脂至上层液体澄清。

4、再干燥

将脱脂后的花粉均匀摊开，室温干燥、或真空干燥、或流化床干燥6-48h。

5、杂质控制

(1)显微镜下用颗粒计数法测定，其中的杂质颗粒含量应满足如下标准：孢子含量≤1％，无关花粉含量≤2％，其它杂质含量≤10％。

(2)重金属及有害元素

总重金属≤50mg/kg；砷≤5mg/kg。

(3)丙酮残留

丙酮残留量≤0.5％(体积分数)。

实施例4地肤花粉变应原原液(冻干品)制备工艺

1、按实施例3地肤花粉原料工艺制备地肤花粉原料。

2、浸提

将脱脂干燥后的地肤花粉按重量体积比1:50～1:10加入10L，本实施例中优选为1：20，以pH 7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2-8℃搅拌22～26h进行浸提。其中以配制1000ml磷酸盐—盐水缓冲液(pH 8.2)为例的配方如表4。磷酸盐—盐水缓冲液充分溶解后除菌过滤，2～8℃放置，保存期不超过30天。

表4磷酸盐—盐水缓冲液(pH 8.2)配方

3、固液分离

取提取后的浸提液，将浸提液全部加入到离心桶内，调节平衡，离心力8000～12000g，离心温度2～8℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清；

4、澄清

将离心分离后的上清液先用4000目滤布过滤后，将滤液依次通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；

5、超滤、透析、浓缩

过滤后的浸提液，用3KD或1KD超滤膜切向流超滤，优选地，本实施例中用3KD超滤膜超滤。透析液选用25-125mM的NH₄HCO₃，本实施例中优选为50mM的NH₄HCO₃。根据蛋白含量质量标准，超滤浓缩至适当体积，检测蛋白含量至质量标准的总蛋白含量区间。取样超滤浓缩液、超滤透过液，检测其总蛋白含量。当超滤透过液中总蛋白含量≤0.02mg/ml，则直接排弃透过液；超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，则对超滤膜进行完整性测试，超滤膜未破损，则排弃透过液；若超滤膜破损，则更换超滤膜之后对透过液重复超滤。

6、无菌过滤

用0.22μm膜除菌过滤。

7、冻干

按照冻干工艺条件，-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％；获得地肤花粉变应原冻干品。

实施例5地肤花粉变应原浸液成品制备工艺

1、复溶

将地肤花粉变应原冻干品用磷酸盐—盐水缓冲液(pH 6.5～7.5，配方见表5)复溶，至总蛋白含量位于质量标准2倍范围区间。2～8℃放置。

表5.磷酸盐—盐水缓冲液(pH值6.5～7.5)配制

2、半成品配制

原液复溶后，在净化车间内A级洁净条件下，将复溶液与等体积预先湿热灭菌(121℃、30分钟)并冷却的甘油混匀，调节溶液pH值至6.0～8.0。

3、半成品除菌过滤、无菌分装为成品

在净化车间内A级洁净条件下，将半成品通过0.22μm滤膜除菌过滤，无菌分装为成品，得到pH6.0～8.0浅黄色至棕色液体即为地肤花粉标准化变应原浸液成品。

实施例6地肤花粉变应原浸液成品质量控制

1、地肤花粉标准化变应原浸液总蛋白成分SDS-PAGE法鉴别

采用还原型SDS-PAGE法，通过上样-跑胶-染色-脱色四步，其中分离胶浓度为4～12％，考马斯亮蓝染色。通过SDS-PAGE检测，结果如图4，M为Genstar Marker，R为内部参考品，L₁，L₂和L₃为不同批次地肤花粉标准化变应原浸液，其蛋白主要分布在10kDa和20kDa左右。其中鉴定的致敏蛋白分子量、过敏血清阳性率、对应全蛋白质谱鉴定肽段概览见表6。

2、地肤花粉标准化变应原浸总变应原成分Western Blotting法鉴别

采用还原型SDS-PAG电泳，分离胶浓度为4～12％，0.2μm PVDF ImmobilonR-PSQ转印膜，一抗血清反应稀释度1：3，室温杂交2h，随后置于4℃冰箱杂交过夜，1×PBST洗3次，10min/次。二抗Ms mAb to Hu IgE(ab99806)1：1000室温杂交2h，1×PBST洗3次，10min/次。将ECL显影液A液和B液1:1混匀后曝光显色。

结果见图5所示。其中，M为蛋白分子量Marker(Genstar Marker)，R为内部参考品，N为浸液与健康受试者血清反应条带，P₁-P₂₀分别为浸液与22例临床确诊的地肤过敏阳性患者(sIgE≥3级，皮试≥+++，典型的夏秋季花粉症病史)血清反应条带结果，其中致敏KocS1’，Koc S2’，Koc SX₁-X₇及的分子量及过敏血清阳性率汇总如表6，由此确定血清阳性率最高Koc S2’(14.5kDa)为地肤花粉的主要致敏蛋白。

表6地肤花粉致敏蛋白分子量、过敏血清阳性率情况概览

3、致敏蛋白序列测定

本发明产品对相应致敏蛋白(见表6)进行了全蛋白序列测定，并对大籽蒿花粉原料中每一致敏蛋白对应mRNA进行了核苷酸全长测序，致敏蛋白代码、序列标识及氨基酸全长序列、对应mRNA全长序列结果详见表6。

其中本发明所含地肤花粉致敏蛋白Koc S1’的全序列为SEQ ID NO.4：

MVYCDTCRIQFMTRISTIMEGATVKLECRNITAGTQTFKAEAVTDKVGQYSIPVNGDFEDDICEIELVKSPNSECSEVSHDVYAKQSAKVSLTSNNGEASDIRSANALGFMRKEPLKECPEVLKELDLYDVKAN

通过对地肤花粉原料中Koc S1’致敏蛋白对应mRNA进行了核苷酸全长测序后，其mRNA对应序列如下

Koc S1’致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.5：

ATGGTGTACTGTGACACTTGCCGTATCCAATTTATGACCCGCATTAGTACAATAATGGAAGGGGCAACTGTGAAGTTGGAATGCAGGAACATTACTGCAGGAACTCAGACCTTCAAAGCTGAAGCTGTAACTGATAAGGTAGGACAGTACAGCATCCCTGTTAATGGTGATTTCGAAGACGATATCTGTGAAATCGAGTTGGTTAAGAGCCCGAACAGCGAATGCTCTGAGGTTTCACATGATGTTTATGCCAAGCAAAGTGCTAAGGTTAGTCTAACATCTAACAATGGTGAAGCTTCAGACATTCGCAGCGCCAATGCTCTCGGCTTCATGAGGAAGGAGCCCCTTAAAGAGTGCCCTGAGGTTCTCAAGGAGTTGGATCTTTATGATGTTAAAGCTAATTAA

4、质谱检测

对地肤变应原浸液进行全蛋白质谱分析以及对地肤变应原经SDS-PAGE分离后对应的胶条分别取样进行质谱鉴定，其主要包含且不限于以下肽段如：

Koc S1’质谱鉴定的肽段：

SEQ ID NO.6：MVYCDTCR

SEQ ID NO.7：IQFMTR

SEQ ID NO.8：ISTIMEGATVK

SEQ ID NO.9：LECRNITAGTQTFK

SEQ ID NO.10：AEAVTDK

SEQ ID NO.11：VGQYSIPVNGDFEDDICEIELVK

SEQ ID NO.12：SPNSECSEVSHDVYAK

SEQ ID NO.13：VSLTSNNGEASDIR

SEQ ID NO.14：SANALGFMR

SEQ ID NO.15：SANALGFMRK

SEQ ID NO.16：ECPEVLK

SEQ ID NO.17：ELDLYDVK

5、理化性质检测

该地肤变应原浸液经理化性质检验后，其质量标准如表7：

表7地肤花粉变应原浸液理化性质质量标准

6、总变应原活性测定

当变应原浸液包含治疗有效量或诊断有效量的地肤花粉变应原时，用竞争性ELISA法测定相对生物效价为50000BAU/ml-200000U/ml。

7、无菌检查

不得有菌生长。

实施例7评价应用评价应用1

通过皮肤点刺试验(skin prick test,SPT)评价地肤花粉变应原浸液诊断地肤花粉过敏症的有效性和安全性。方法：选取2015年8月10日至2016年10月20日在北京协和医院变态(过敏)反应科就诊,患有过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性结膜炎、特应性皮炎、荨麻疹等过敏性疾病的门诊患者。对所有受试者进行协和地肤花粉变应原SPT,15min后测定平均风团直径(mean wheal diameter,MWD)。以地肤花粉血清特异性免疫球蛋白E specificimmunoglobulin E,sIgE)作为确认地肤花粉过敏症的诊断标准,进行受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)分析,判断不同诊断界值下,协和地肤花粉变应原临床诊断地肤花粉过敏症的准确性；同时记录不良事件,评价协和地肤花粉变应原的安全性。结果本研究共计入组1026例,无脱落病例。全分析集(full analysisset,FAS)991例,平均年龄(31.26±14.58)岁。FAS的ROC曲线下面积(area under curve,AUC)为0.782(95％可信区间0.754～0.811)。据FAS的ROC估算SPT诊断地肤花粉过敏的MWD最佳诊断界值为3.75mm,特异度达95％时的MWD诊断界值为6.75mm。分别以MWD3.00、4.75和6.75mm为诊断界值,协和地肤花粉变应原SPT诊断地肤花粉过敏的敏感度依次降低,分别为0.7639(95％可信区间0.7281～0.7998)、0.6264(95％可信区间0.5855～0.6673)、0.2993(95％可信区间0.2606～0.3380)；而特异度依次升高,分别为0.6402(95％可信区间0.5960～0.6844)、0.8322(95％可信区间0.7978～0.8666)、0.9625(95％可信区间0.5820～0.6329)。安全集(save set,SS)1029例,7例出现8次不良事件,不良事件发生率0.68％(7/1026),主要表现为SPT后鼻痒、喷嚏、流涕、鼻塞、眼痒以及点刺部位局部皮肤出现较大风团反应。所有受试者均未出现严重不良事件。结论地肤花粉变应原浸液对于地肤花粉过敏症具有良好的诊断价值,安全性好。结合病史和不同的SPT诊断界值,可以提高诊断的准确度。

结论：本发明地肤花粉变应原浸液用于诊断地肤花粉过敏，诊断价值较高，安全性好，可作为地肤花粉过敏原特异性体内诊断的临床检查方法。

实施例8评价应用2

本发明的制备的地肤花粉变应原浸液对地肤花粉过敏患者全血进行嗜碱性粒细胞活化试验，能进行临床特异性过敏体外诊断。这个检测方法在IgE或非IgE介导的过敏反应中均适用，可以用于部分sIgE体外诊断存在假阴性、假阳性患者的确诊及部分过敏性休克患者不适于进行皮试诊断的情况。

试验原理：变应原与患者全血细胞反应可以模拟人体内变态反应过程：即特异性IgE抗体通过与相应的变应原桥联结合到细胞表面，激活细胞内信号级联导致嗜碱性粒细胞(CCR3持续表达于嗜碱性粒细胞，是其特异性标记)的活化脱颗粒。在这个脱颗粒的过程中，细胞内复合物影响跨膜蛋白CD63(gp53)，使其外表达于细胞表面，并暴露于细胞外基质中，因此可以依赖流式细胞术原理(使用抗人趋化因子受体CCR3-藻红蛋白(anti-CCR3-PE)对嗜碱性粒细胞进行标记，使用抗人CD63单克隆抗体-异硫氰酸荧光素(anti-CD63-FITC)对活化状态的嗜碱性粒细胞进行标记，非特异性细胞活化剂fMLP作为一种阳性质控)，并以嗜碱性粒细胞脱颗粒的百分数变化来判断受试者是否对特定变应原过敏。方法：选择健康受试者、地肤过敏患者，取其EDTA抗凝全血样本，以刺激缓冲液(阴性对照)、地肤变应原浸液(对1：10³～10¹⁰稀释比例进行优化，本实施例中取1：10⁸)、fMLP刺激液(阳性质控)作为嗜碱性粒细胞的激活物，加入到全血中，然后加入anti-CD63-FITC、anti-CCR3-PE染色，48h内上流式细胞仪进行检测。结果如图12所示，表明健康受试者以阴性对照、地肤变应原浸液、阳性对照为嗜碱性粒细胞活化物时，其嗜碱性粒细胞活化率分别应＜15％、＜15％、≥15％，地肤花粉过敏患者以阴性对照、地肤变应原浸液、阳性对照为嗜碱性粒细胞活化物时，其嗜碱性粒细胞活化率分别应＜15％、≥15％、≥15％。结论：该地肤变应原浸液能有效作为活化物运用于嗜碱性粒细胞活化试验，并依据其判断标准有效做出临床诊断。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国医学科学院北京协和医院

<120> 一种地肤花粉变应原浸提物、其浸提液及其制备方法

<130>

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctggtgctg gtatgcgata cttggtgtga at 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtcagtcag cctcctccgc ttattgatat gc 32

<210> 3

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcagaatcc cgtgaaccat cgagtctttg aacgcaagtt gcgcccgaaa ccttcgggtc 60

gagggcacgt ctgcctgggc gtcacgcatc gcgtctcccc ctacccacct tgtgtgggaa 120

gggggaggag gatggcttcc cgtgcctcac cgggcgtggt tggcctaaaa aaggagcctc 180

aagttatgca ctgttgcggc aattggtggt agacaaggcc ttggcctcga atgcaatctt 240

gtgtcgtgca gtacatgaca attgtgggct cgtaggaccc tgagttgttc ccaattggaa 300

acaaaccgtt gcgaccccag gtcaggcggg gttacccgct gagtttaa 348

<210> 4

<211> 134

<212> PRT

<213> 地肤花粉致敏蛋白(Koc S1’)

<400> 4

Met Val Tyr Cys Asp Thr Cys Arg Ile Gln Phe Met Thr Arg Ile Ser

1 5 10 15

Thr Ile Met Glu Gly Ala Thr Val Lys Leu Glu Cys Arg Asn Ile Thr

20 25 30

Ala Gly Thr Gln Thr Phe Lys Ala Glu Ala Val Thr Asp Lys Val Gly

35 40 45

Gln Tyr Ser Ile Pro Val Asn Gly Asp Phe Glu Asp Asp Ile Cys Glu

50 55 60

Ile Glu Leu Val Lys Ser Pro Asn Ser Glu Cys Ser Glu Val Ser His

65 70 75 80

Asp Val Tyr Ala Lys Gln Ser Ala Lys Val Ser Leu Thr Ser Asn Asn

85 90 95

Gly Glu Ala Ser Asp Ile Arg Ser Ala Asn Ala Leu Gly Phe Met Arg

100 105 110

Lys Glu Pro Leu Lys Glu Cys Pro Glu Val Leu Lys Glu Leu Asp Leu

115 120 125

Tyr Asp Val Lys Ala Asn

130

<210> 5

<211> 405

<212> DNA

<213> 地肤花粉致敏蛋白(Koc S1’)

<400> 5

atggtgtact gtgacacttg ccgtatccaa tttatgaccc gcattagtac aataatggaa 60

ggggcaactg tgaagttgga atgcaggaac attactgcag gaactcagac cttcaaagct 120

gaagctgtaa ctgataaggt aggacagtac agcatccctg ttaatggtga tttcgaagac 180

gatatctgtg aaatcgagtt ggttaagagc ccgaacagcg aatgctctga ggtttcacat 240

gatgtttatg ccaagcaaag tgctaaggtt agtctaacat ctaacaatgg tgaagcttca 300

gacattcgca gcgccaatgc tctcggcttc atgaggaagg agccccttaa agagtgccct 360

gaggttctca aggagttgga tctttatgat gttaaagcta attaa 405

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 6

Met Val Tyr Cys Asp Thr Cys Arg

1 5

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 7

Ile Gln Phe Met Thr Arg

1 5

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 8

Ile Ser Thr Ile Met Glu Gly Ala Thr Val Lys

1 5 10

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 9

Leu Glu Cys Arg Asn Ile Thr Ala Gly Thr Gln Thr Phe Lys

1 5 10

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 10

Ala Glu Ala Val Thr Asp Lys

1 5

<210> 11

<211> 23

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 11

Val Gly Gln Tyr Ser Ile Pro Val Asn Gly Asp Phe Glu Asp Asp Ile

1 5 10 15

Cys Glu Ile Glu Leu Val Lys

20

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 12

Ser Pro Asn Ser Glu Cys Ser Glu Val Ser His Asp Val Tyr Ala Lys

1 5 10 15

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 13

Val Ser Leu Thr Ser Asn Asn Gly Glu Ala Ser Asp Ile Arg

1 5 10

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 14

Ser Ala Asn Ala Leu Gly Phe Met Arg

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 15

Ser Ala Asn Ala Leu Gly Phe Met Arg Lys

1 5 10

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 16

Glu Cys Pro Glu Val Leu Lys

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> amino acid

<400> 17

Glu Leu Asp Leu Tyr Asp Val Lys

1 5

Claims (15)

1.一种地肤花粉变应原浸物，其含有致敏蛋白Koc S1’；所述Koc S1’含有如SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列。

2.一种地肤花粉变应原浸液，其特征在于，所述变应原浸液中含有治疗有效量或诊断有效量的权利要求1所述地肤花粉变应原浸物、体积比为0.2～0.4％的苯酚、体积比为45～55％的甘油和4.5～5.5g/L的NaCl，其pH值为6.0～8.0。

3.根据权利要求2所述的地肤花粉变应原浸液，其特征在于，所述地肤花粉变应原的活性浓度为50000～200000BAU/ml。

4.根据权利要求2所述的地肤花粉变应原浸液，其特征在于，所述地肤花粉变应原浸液的总蛋白浓度0.28～1.12mg/ml。

5.根据权利要求2所述的地肤花粉变应原浸液，其特征在于，通过SDS-PAGE和WesternBlotting检测，所述地肤花粉变应原的蛋白分布主要在11kDa、14.5kDa、18kDa、28kDa、42kDa、68kDa、72kDa、85kDa和115kDa。

6.根据权利要求2所述的地肤花粉变应原浸液，其特征在于，通过全蛋白质谱或经SDS-PAGE分离后将对应分子量胶条分别取样进行质谱检测，所述地肤花粉变应原包含SEQ IDNO.6-SEQ ID NO.17所示的特征性肽段。

7.一种根据权利要求2-6中任一项所述地肤花粉变应原浸液的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1、采集地肤花粉，常温干燥真空干燥或流化床干燥；

S2、对干燥后的花粉脱脂、干燥；

S3、将脱脂干燥后的地肤花粉按重量g体积ml比1:50～1:10加入pH为7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2-8℃搅拌22～26h进行浸提；

S4、取步骤S3后的浸提液，离心取上清液；将上清液过滤及除菌过滤；

S5、将过滤后的上清液进行超滤浓缩，获得超滤浓缩液；

S6、将所述超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，真空冻干获得地肤花粉变应原冻干品；

S7、将所述地肤花粉变应原冻干品用pH 6.5～7.5磷酸盐—盐水缓冲液复溶配置为地肤花粉变应原原液，2～8℃放置，与等体积灭菌的甘油混匀，调节溶液pH值至6.0～8.0。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述花粉脱脂采用花粉与丙酮以1：5～1:1的重量g体积ml比进行脱脂处理，重复脱脂至上层液体澄清。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，所述离心的条件为8000～12000g，离心温度2～8℃，时间为15～20min；所述过滤及除菌过滤为先用4000目滤布过滤后，再通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述超滤浓缩用3KD超滤膜超滤，当超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml，停止超滤；当超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，更换超滤膜之后对超滤透过液重复超滤，直至超滤透过液总蛋白含量≤0.02mg/ml为止。

11.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤S6中，所述真空冻干的条件为-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％。

12.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1还包括对原料地肤花粉进行镜检鉴别和/或DNA鉴定的步骤，其中DNA鉴定方法为，以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2为引物，对鉴别地肤花粉原料进行PCR扩增，并检测扩增产物。

13.一种权利要求2-6任一项所述地肤花粉变应原浸液的冻干品，其特征在于，其由包括地肤花粉收集-干燥-脱脂-提取-超滤浓缩-冻干的步骤制得：

(1)收集：用自然脱落法收集地肤花粉；

(2)干燥：常温干燥或真空干燥或流化床干燥，直至花粉不再粘附，将干燥后的花粉过150-250目分样筛；

(3)脱脂：将(2)所得到的花粉与丙酮分别按g与ml计，以1：5～1:1的重量体积比进行脱脂处理，搅拌或振荡脱脂30分钟后，静置分层，倒出上层液，加入新的丙酮，重复脱脂至上层液体澄清，将脱脂后的花粉均匀摊开，室温干燥或真空干燥或流化床干燥48小时至72小时；

(4)提取：将脱脂干燥后的地肤花粉按重量体积比1:50～1:10加入10L，pH 7.9～8.2磷酸盐—盐水缓冲液，2-8℃搅拌22～26h进行浸提；取提取后的浸提液，在离心力8000～12000g，离心温度2～8℃，时间设定为15～20分钟，进行离心，收取上清；先用4000目滤布过滤后，将滤液依次通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤；

(5)超滤浓缩：将过滤后的浸提液，用3KD超滤膜超滤，取样超滤浓缩液、超滤透过液，检测其总蛋白含量；其中，当超滤透过液中总蛋白含量≤0.02mg/ml，则直接排弃透过液；超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml，则对超滤膜进行完整性测试，超滤膜未破损，则排弃透过液；若超滤膜破损，则更换超滤膜之后对透过液重复超滤；

(6)冻干：将超滤浓缩液经过二次过滤和除菌过滤后，按照冻干工艺条件：-50～-35℃冻结，2～8mbar真空压力下，-25℃干燥，控制水分含量≤3％，获得地肤花粉变应原冻干品。

14.根据权利要求2-6中任一项所述地肤花粉变应原浸液及权利要求13所述地肤花粉变应原冻干品的应用，用于在制备诊断变态反应疾病并对其进行特异性免疫治疗制剂中的应用，所述诊断变态反应疾病包括过敏性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和慢性荨麻疹。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述地肤花粉变应原浸提物冻干品用于制备成片剂、口崩片，所述地肤花粉变应原浸液用于制备注射液、舌下滴剂、变应原斑贴剂、变应原浸液稀释液。

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