TWI467017B - 蟎過敏原之變體及其用途 - Google Patents
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Description
本發明係關於家塵蟎Der p 2過敏原之新穎變體及其用途。
長久以來,已知家塵蟎係諸多疾病之肇因,諸如,氣喘、鼻炎、鼻竇炎、溼疹、過敏性皮炎、過敏、結膜炎、及/或血管性水腫[1]
。特定言之,歐洲塵蟎(Dermatophagoides pteronyssinus
)是一種主要的家塵蟎,且已進行了許多研究辨識其所產生之過敏原。於此,Der p 2已被認定為歐洲塵蟎所產生的代表性過敏原。超過80%之過敏病患皆會與Der p 2產生反應[3,4]
。
Der p 2在天然環境下具有長期安定性[6]
,且其對熱、pH、及各種化學變性處理皆具有抗性[7]
。Der p 2之三維結構已由NMR[8]
及X光結晶學[9]
判定。特定言之,Der p 2具有免疫球蛋白(Ig)折疊結構,含兩個反平行β-摺板。此外,Der p 2缺乏可連接似Ig區域中的B鍊及F鏈之間的摺板間雙硫鍵;而是在殘基8與119、殘基21與27、以及殘基73與78之間存在有三個雙硫鍵。此在,殘基8與119之間的雙硫鍵使A'鍊及G'鍊彼此連結,而另外兩個雙硫鍵則是位在環區域。
Der p 2之cDNA序列已完成鑑定,而其推導出來的胺基酸序列顯示Der p 2具有146個胺基酸殘基,並具有一段含17個殘基的信號肽。此外,已經發現Der p 2之DNA序列中存在大量的多型性[10,11]
。目前為止,已鑑別出八種Der p 2變體,其在所述多型性殘基處各自具有獨特的胺基酸取代[12]
。此等變體可用於研究塵蟎過敏之免疫發病機制,以及研發用以診斷及治療塵蟎過敏之試劑。
本發明藉由篩選歐洲塵蟎λgt11 cDNA庫,分離出新穎過敏原「Der p 2變體T」之cDNA。在此,本發明鑑定出Der p 2變體T cDNA之核苷酸序列,且在大腸桿菌(E.coli
)及畢赤酵母(Pichia pastoris
)中製造重組Der p 2變體T多肽。Der p 2變體T可用於疾病之診斷及治療。
在第一態樣中,本發明提供一種聚核苷酸,其係由編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 1之核苷酸序列構成。
在第二態樣中,本發明提供一種重組核酸,其包含編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 1之核苷酸序列。
在第三態樣中,本發明提供一種轉殖基因生物,其包含上述之聚核苷酸或重組核酸。
在第四態樣中,本發明提供一種多肽,其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1。
在第五態樣中,本發明提供一種診斷個體對家塵蟎之過敏的方法,其包含偵測該個體是否會與上述多肽產生反應。
在第六態樣中,本發明提供一種診斷個體對家塵蟎之過敏的組合物,其包含上述多肽以及稀釋劑。
在本發明之第七態樣中,其提供一種治療或預防個體之過敏性疾病的方法,其包含對該個體投與上述多肽。
在第八態樣中,本發明提供一種醫藥組合物,其包含上述多肽以及醫藥可接受之賦形劑或載體。
在第九態樣中,本發明提供一種DNA疫苗,其包含上述聚核苷酸或重組核酸。
除非另外定義,本文中所用之所有技術及科學辭彙具有熟習本文所屬技藝者所通常明瞭之相同意義。在本文中,除非另有明示,下列之術語具有其所述意義。
在本文中,冠詞「一」係指一個或一個以上(亦即,至少一個)該冠詞在文法上之受詞。舉例而言,「一元件」意謂一個元件或一個以上之元件。
術語「聚核苷酸」或「核酸」係指由核苷酸單元所構成之聚合物。聚核苷酸包括天然存在之核酸,諸如,去氧核糖核酸(「DNA」)或核糖核酸(「RNA」),以及核酸類似物,包括具有非天然存在之核苷酸者。聚核苷酸可由合成產生,例如,使用自動化DNA合成儀。術語「核酸」一般而言係指大型聚核苷酸。應明瞭的是,當一核苷酸序列係由DNA序列表示(亦即,A、T、G、C),其亦包括RNA序列(亦即,A、U、G、C),其中以「U」取代「T」。術語「cDNA」係指與mRNA互補或相同之DNA,其可為單股或雙股形式。
術語「互補」係指兩聚核苷酸交互作用表面有拓樸相容性或相互配對。因此,該兩分子可被視為互補,兩者的接觸表面特徵彼此互補。如第一聚核苷酸的核苷酸序列與第二聚核苷酸之聚核苷酸結合配對物的核苷酸序列相同,則可稱為第一聚核苷酸與第二聚核苷酸互補。因此,序列為5'
-TATAC-3'
之聚核苷酸係與序列為5'
-GTATA-3'
之聚核苷酸互補。
術語「編碼」係指聚核苷酸(如,基因、cDNA、或mRNA)中之特定核苷酸序列的固有特性,其可在在生物作用中作為模板,以合成其他具有指定核苷酸序列(亦即,rRNA、tRNA、及mRNA)或指定胺基酸序列以及其由其所產生之生物特性的聚合物或巨分子。因此,如由一基因所產生之mRNA的轉錄及轉譯可在細胞或其他生物系統中產生一蛋白,則稱該基因編碼該蛋白。熟習技藝者可明瞭的是,由於遺傳密碼之簡併性,不同的聚核苷酸及核酸可編碼相同的多肽。亦可明瞭的是,使用常規技術,熟習技藝者可製造出核苷酸取代,其不影響本文所述聚核苷酸所編碼之多肽序列,而反映出用以表現該等多肽之任何特定宿主生物的密碼子使用偏好。因此,除非另有明示,「編碼一胺基酸序列之核苷酸序列」包括所有互為彼此簡併版本且編碼相同胺基酸序列之核苷酸序列。編碼蛋白及RNA之核苷酸序列可包括內含子。
術語「重組核酸」係指具有非天然彼此連結之序列的聚核苷酸或核酸。重組核酸可以載體之形式存在。「載體」可含有想要的指定核苷酸序列以及調控序列。載體可用於表現該指定核苷酸序列或是維持該指定核苷酸序列以進行複製、操縱、或在不同位置間傳輸(如,在不同之生物間)。可將載體導入適當的宿主細胞,以進行上述目的。
載體之實例包括,但不限於,質體、黏接質體(cosmid)、噬菌體、YACs或PACs。一般而言,在載體中,指定的核苷酸序列是以可操作之方式與調控序列連結,因而使得載體在被導入宿主細胞中時,指定核苷酸序列可受調控序列之控制而在宿主細胞中表現。調控序列可包含,例如但並不限於,啟動子序列(如,巨細胞病毒(CMV)啟動子、猴病毒40(SV40)早期啟動子、T7啟動子、及醇氧化酶基因(AOX1
)啟動子)、起始密碼子、複製起點、增強子、操作子序列、分泌信號序列(如,α-交配因子信號)、以及其他控制序列(如,Shine-Dalgarno序列及終止序列)。較佳者,載體可進一步包含標記序列(如,抗生素抗性標記序列),以進行後續之篩選流程。更佳者,在載體中,指定的核苷酸序列可與另一非上述調控序列之核苷酸序列連結,以產生一融合多肽,其有利於後續之純化流程。融合多肽包括,但不限於,融合His-標記之多肽,以及融合GST之多肽。
術語「多肽」係指由經肽鍵連結之胺基酸殘基所構成的聚合物。多肽可由合成產生,例如,使用自動化多肽合成儀。術語「蛋白」一般而言係指大型之多肽。術語「肽」一般而言係指短型之多肽。
胺基酸可由三個字母或一個字母表示。表1列述標準之胺基酸縮寫。
術語「疫苗」係指一種試劑或組合物,其含有可在個體體內有效誘發治療程度之免疫力以對抗特定病原體或疾病之活性組成份。傳統上,疫苗之活性組成份係衍生自該疫苗目標病原體之多肽。術語「DNA疫苗」係指其中該活性組成份為DNAs之疫苗。
術語「醫藥組合物」係指適於在個體體內作為醫藥用途之組合物。醫藥組合物包含醫藥有效量之活性試劑以及醫藥可接受之載體。「醫藥有效量」係指可有效產生想要的藥學結果之試劑量。「醫藥可接受之載體」係指任何標準之醫藥載體、緩衝劑、及賦形劑,諸如,磷酸緩衝鹽水溶液、5%葡萄糖水溶液,以及乳液,諸如,油/水或水/油乳液,以及各種不同類型之溼潤劑及/或佐劑。較佳的醫藥載體取決於該活性試劑想要進行的投與模式。典型之投與模式包括腸內(如,口服)或腸外(如,皮下、肌內、靜脈、或腹膜注射;或是局部、穿皮、或穿黏膜投與)。
須要診斷或治療之「個體」係指人類或非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括,但不限於,靈長類、有蹄類、犬科動物、及貓科動物。
本發明分離出一種編碼Der p 2新穎變體「Der p 2變體T」之cDNA分子,其可用於診斷及治療過敏性疾病,特別是與Der p 2相關者。
圖1顯示Der p 2變體T之cDNA核苷酸序列以及推導的胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)。本發明之Der p 2變體T具有顯著不同於其他已知Der p 2變體之核苷酸及胺基酸序列變異。表2顯示在Der p 2變體T多型性區域之胺基酸取代與其他已知Der p 2變體者間的比較。
如表2所示,本發明之Der p 2變體T首次揭示兩個分別位於-1及26位置的新穎多型性胺基酸殘基,其未曾在其他已知Der p 2變體出現。在-1位置,本發明Der p 2變體T之胺基酸殘基由其他已知變體中之Arg變化為Ala,而在26位置,本發明Der p 2變體T之胺基酸殘基由其他已知變體中之Pro變化為Ser。更特定言之,相較於Der p 2.0101(1989年所分離的第一種Der p 2),本發明之Der p 2變體T包含四個胺基酸變化,亦即,Arg(-1)至Ala(-1)、Pro 26至Ser 26、Thr 47至Ser 47、以及Asp 114至Asn 114。圖2顯示Der p 2.0101之核苷酸序列(登錄號:AF276239)及胺基酸序列(登錄號:P49278)。本發明Der p 2變體T之胺基酸取代使其等電點(7.10)理論值高於Der p 2.0101(6.56)。
在一方面中,本發明提供一種聚核苷酸,其係由編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 1之核苷酸序列構成。本發明之聚核苷酸可用於製備Der p 2 T,其可用於診斷及治療如上所述之過敏性疾病。在一具體實例中,該聚核苷酸係由核苷酸序列SEQ ID NO: 2構成。
本發明之聚核苷酸可為DNA或RNA,雙股或單股。當該聚核苷酸為雙股時,該雙鏈體之兩股(編碼及互補股)皆包括在本發明中,不論其為單獨或結合。當該聚核苷酸係單股時,應明瞭的是,其互補股亦包括在內。本發明亦涵括聚核苷酸之簡併版本,其中該聚核苷酸之核苷酸序列中的至少一個密碼子係由一不同之密碼子取代,而該至少一個密碼子以及該不同之密碼子編碼相同之胺基酸殘基。
本發明之聚核苷酸可使用重組方法、合成方法、或熟習技藝者可用之任何方法製備。亦可由標準技術進行選殖。關於分離及製備聚核苷酸之細節描述於下文之實例中。
此外,本發明之聚核苷酸可與另一聚核苷酸接合以建構重組核酸,其可用於,例如,擴增該聚核苷酸。
因此,本發明提供一種重組核酸,其包含編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 1之核苷酸序列,如上所述者。特定言之,該重組核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO: 2。
在一具體實例中,本發明之重組核酸係一載體,其係用於表現或維持該核苷酸序列,如上所述者。可為達成上述目的而將本發明之載體導入適當的宿主細胞。
較佳者,本發明之重組核酸係表現載體,其可用於產生Der p 2變體T。特定言之,本發明之表現載體可經改造,藉由包括適當的啟動子、複製序列、標記等以進行mRNA之轉錄及轉譯,而使其在原核細胞或真核細胞中產生作用。
此外,本發明之表現載體尚可在其啟動子區域中包括操作子,以控制該核苷酸序列表現之啟動。操作子序列之實例為技藝中所熟知。在本發明之具體實例中,該操作子係異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)或甲醇誘導性操作子。
此外,本發明之表現載體尚可包含標記序列,以產生融合蛋白而有利於該蛋白之純化。舉例而言,可將聚組胺酸標記序列(如,六個組胺酸殘基)納入該表現載體中,以產生融合His-標記之蛋白。該His-標記可藉由鎳螯合層析而有利於該蛋白之分離。就另一實例而言,可在該表現載體中包括麩胱甘肽硫轉移酶(GST)序列,以產生融合GST之蛋白,而後續之蛋白純化即可藉著使用麩胱甘肽(GSH)親和管柱而進行。此種標記序列係技藝中所熟知。可視需要地,例如,可進行酶性反應而將融合於該目標多肽之標記移除,以取得該多肽本身。
本發明之重組核酸可由習知的基因工程技術建構。關於建構本發明重組核酸之細節述於下文之實例中。
可將本發明之聚核苷酸或本發明之重組核酸導入生物體中,該生物可因此轉形而具有想要的功能,例如,維持或表現如上所述之核苷酸序列。
因此,在另一態樣中,本發明提供一種轉殖基因生物,其包含聚核苷酸或重組核酸,該聚核苷酸或重組核酸各包含編碼胺基酸序列SEQ ID NO: 1之核苷酸序列,如上所述者。特定言之,該核苷酸序列係SEQ ID NO: 2。該生物可用於,例如,維持該核苷酸序列或是產生包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1之多肽。此等生物亦可作為,例如,用以分析本發明過敏原之作用的模型。
本文所用之術語「轉殖基因生物」包括其中導入上述聚核苷酸或重組核酸之任何適當生物。該生物之實例範圍包括低等生物(諸如,細菌)至高等生物(諸如,植物及非人類哺乳動物)。
在本發明之具體實例中,轉殖基因生物係宿主細胞,其可為原核或真核細胞。原核細胞之實例包括,但不限於,細菌,諸如,大腸桿菌、乳酸桿菌(lactobacilli)、及雙歧桿菌(bifidobacteria)。真核細胞可為,例如,昆蟲、真菌、哺乳動物、或植物細胞,較佳為酵母菌細胞,更佳為畢赤酵母。
宿主細胞可在適當的條件下培養,以表現目標多肽。多肽之表現可為經常型,可持續產生,或誘導型,須刺激以起動表現。就誘導型表現而言,蛋白之生成可在須要時才起動,例如,藉著在培養基中添加誘導劑物質,例如,IPTG或甲醇。多肽可以多種技藝中已知的技術而由宿主細胞中回收及純化,例如,層析,如,HPLC或親和管柱。
在本發明之另一具體實例中,轉殖基因生物係植物,其包括,但不限於,農作物,諸如,稻米、小麥、大麥、高粱、玉米、及燕麥,以及經濟植物,諸如,番茄及香蕉。
在本發明之另一具體實例中,轉殖基因生物係多細胞真菌,其包括,但不限於,蘑菇,較佳係可食性蘑菇,諸如,金針菇。
在本發明之另一具體實例中,轉殖基因生物係非人類轉基因動物,特別係哺乳動物,其生殖細胞(亦即,卵或精子)包含上述之本發明聚核苷酸或重組核酸。轉基因動物之實例包括,但不限於,小鼠、天竺鼠、兔、豬、綿羊、及牛。
本發明核酸進入該生物體之導入(轉形)原則上可由熟習技藝者所熟悉之所有方法進行。
將核酸導入宿主細胞之方法,諸如,氯化鈣處理、電穿孔、DEAE-葡聚糖-介導性轉染、脂質轉染(lipofection)、及微注射,皆係技藝中所熟知者,已描述於,例如,Int Arch Allergy Appl Immunol 1990;91(2):118-23[5]
。
就植物而言,可利用已知用於自植物組織或植物細胞進行植物之轉形或再生的方法,進行暫時或穩定的轉形。適當的方法係基因槍(biolistic)法,或是藉由原生質體轉形、電穿孔、微注射、及土壤桿菌(agrobacterium)介導性基因轉移。上述之方法亦可應用於真菌之轉形。此等方法述於,例如,Methods Mol Biol. 2004;267:329-50。[25]
就本發明之轉基因動物而言,其可,例如,藉著將該重組核酸分子導入受精卵或胚胎幹(ES)細胞中而產生,一般而言係藉由微注射、電穿孔、脂質轉染、粒子介導性基因轉移而達成。轉殖基因生物在組織中表現異源核苷酸序列取決於啟動子是否可受給予細胞的信號誘導,或是否為經常型表現。上述方法述於,例如,Curr Drug Deliv. 2004;1(2):165-93。[26]
在又另一態樣中,本發明提供一種純化的多肽,其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1(亦即,Der p 2變體T)。如上所述,可在本發明之表現載體中納入標記序列(如,GST序列)以表現融合蛋白。
本發明之多肽可以重組方法予以製備,如,在適當的條件下培養包含本發明表現載體之宿主細胞,再回收及純化如上所述之多肽。本發明之多肽亦可以化學合成方法製備,其係藉著使一胺基酸之羧基(C端)與另一胺基酸之胺基(N端)偶合而進行。化學合成方法之實例包括,但不限於,固相合成,諸如,t
-Boc固相肽合成及Fmoc固相肽合成。
本發明之多肽含有129個胺基酸殘基(位置1至129)以及位在胺端具有17的殘基的信號肽(位置-17至-1)。特定言之,位在本發明多肽位置-1之胺基酸殘基係Ala,其與其他已知Der p 2變體中的Arg不同,而位在本發明多肽位置26之胺基酸殘基係Ser,其與其他已知變體中的Pro不同。更特定言之,在與特定已知變體Der p 2.0101相較時,本發明之多肽包含四個胺基酸變化,亦即,Arg(-1)至Ala(-1)、Pro 26至Ser 26、Thr 47至Ser 47、及Asp 114至Asn 114。
用於本文中之基因工程相關技術,諸如,聚核苷酸合成、聚合酶連鎖反應(PCR)、選殖、載體建構、細胞轉形、蛋白表現、肽合成及純化,皆係技藝中所熟知者,已描述於,例如,Int Arch Allergy Appl Immunol 1990;91(2):118-23[5]
。
本發明在下列實例中顯示,過敏病患對於本發明之多肽具有相較於習知Der p 2變體之較高反應性。本發明之多肽因此可用於診斷及治療針對家塵蟎之過敏。
因此,在另一態樣中,本發明提供一種診斷個體對家塵蟎之過敏的方法,其包含偵測該個體是否會與本發明之多肽產生反應。特定言之,該個體係罹患氣喘、鼻炎、鼻竇炎、溼疹、過敏性皮炎、過敏、結膜炎、及/或血管性水腫。
在一具體實例中,該偵測係使用活體外之免疫分析進行。術語「免疫分析」係指一種生物化學試驗,其可根據抗體與其抗原間特定交互作用之反應,測定物質在生物樣本中之濃度或存在。該等分析之方法係技藝中所習知。免疫分析之典型實例包括,但不限於,點漬免疫分析、放射免疫分析(RIA)、酵素免疫分析(EIA)、以及顆粒凝集免疫分析。
特定言之,根據本發明,該免疫分析係在取自該個體之樣本上進行,測定該樣本是否帶有對本發明多肽具有反應性之抗體。更特定言之,該樣本係取自該個體之血清。又更特定言之,待測定之抗體係IgE。
在一特定實例中,本發明之方法包含將本發明之多肽施用至一硝基纖維素膜上,將取自人類之血清加至該膜並使其共置一段時間,清洗該膜,將放射標記之抗人類IgE加至該膜並使其再共置一段時間,清洗該膜,自該膜發展出信號並以適當裝置測量之,再根據所測量之信號判定該個體是否可與該多肽產生反應。如該個體可與該多肽產生反應,則可確認該個體對家塵蟎過敏。
在另一具體實例中,依據本發明所進行的偵測是使用皮膚點刺試驗。皮膚點刺試驗常用於測定過敏,通常是將少量之疑似過敏原置於需要該試驗之個體皮膚上,接著點刺該皮膚以使該過敏原導入皮膚表面下。接著觀察該皮膚之發炎反應,例如,該位點之腫脹及發紅現象。皮膚點刺試驗之方法係技藝中所習知。
在一特定實例中,本發明之方法包含將SEQ ID NO: 1之多肽置於該個體之皮膚上,點刺該個體之皮膚,觀察該皮膚上是否產生發炎反應(如,搔癢、紅斑、丘疹、及發紅反應),測量該發炎反應之面積,以及根據該測量面積之大小而判定該個體是否可與該多肽產生反應。如該個體可與該多肽產生反應,則可確認該個體對家塵蟎過敏。特定言之,可將本發明之多肽溶於正常鹽水中,將一滴多肽溶液加至個體前臂之手掌,並以拋棄式刺血針點刺該皮膚。更特定言之,尺寸大於3mm×3mm之丘疹視為該皮膚點刺試驗之陽性反應。
在又另一方面,本發明提供一種用於上述方法之組合物或試劑,其包含SEQ ID NO: 1之多肽。本發明之組合物或試劑組合物或試劑可被輕易製備,例如,藉著混合該多肽及適當的稀釋劑(諸如,鹽水)。
已知過敏性疾病可用特異性減敏免疫療法(SIT)治療,其包括投與漸增劑量之啟動過敏反應的過敏原,因而可在該病患體內導致對該物質之逐漸減敏。
因此,本發明尚提供一種療或預防個體之過敏性疾病的方法,其包含對該個體投與SEQ ID NO: 1之多肽。較佳者,該過敏性疾病係與家塵蟎有關,其包括,但不限於,氣喘、鼻炎、鼻竇炎、溼疹、過敏性皮炎、過敏、結膜炎、及/或血管性水腫。
因此,另一方面,本發明係關於一種醫藥組合物,其包含有效量之本發明多肽,以及醫藥可接受之賦形劑。本發明之醫藥組合物可用於上述之治療中。
在製備本發明之醫藥組合物時,作為活性成分之本發明多肽通常係以賦形劑稀釋及/或包納於載體中,該載體之形式可為膠囊、小袋、紙、或其他容器。所用之賦形劑一般而言係適於對人類個體或其他哺乳動物進行投與之賦形劑。適當賦形劑之部分實例包括,但不限於,乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素、水、糖漿、及甲基纖維素。此外,本發明之醫藥組合物可為錠劑、丸劑、粉末、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、氣溶膠(呈固體或在液態基質中)、油膏、膠囊、或無菌包裝粉末之形式。再者,本發明之醫藥組合物可以適當途徑投與至個體中,諸如,口服途徑或腸外途徑。
在一特定具體實例中,本發明之醫藥組合物係一種疫苗,其用於針對過敏性疾病之預防性治療。疫苗接種之原則及實施皆為熟習技藝者所熟知,已描述於,例如,Int Arch Allergy Immunol 2006;139:332-345[21]
。
此外,上述本發明之聚核苷酸或重組核酸可以DNA疫苗之形式投與至一個體。因此,本發明尚提供一種DNA疫苗,其包含聚核苷酸,該聚核苷酸係由編碼SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之核苷酸序列構成,或是一重組核酸,該重組核酸包含編碼SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之核苷酸序列,如前所述。較佳者,該核苷酸序列係SEQ ID NO: 2。DNA疫苗之製備及其疫苗接種係技藝中所熟知,已描述於,例如,Nat Med. 1996 May;2(5):540-4[22]
。
本發明現將參照下列之具體實例進行更具體之敘述,該等具體實例係因說明而非限制之目的而提供。
以IgE噬菌斑放射免疫分析,使用台灣氣喘兒童血清篩選歐洲塵蟎(D. pteronyssinus
) λgt11 cDNA庫,分離新穎Der p 2變體T蛋白之cDNA。在37℃下,同時給予劇烈震盪,使宿主大腸桿菌株Y1090在添加2%麥芽糖及10mM MgSO4
之Luria-Bertani(LB)培養液中生長。離心隔夜飽和之培養物,接著溫和地再次懸浮於0.5倍體積之10mM MgSO4
中。就各個含有固化LB瓊脂之150mm培養皿,使300μl之Y1090隔夜飽和培養物與10,000pfus之λ-gt11噬菌體在室溫下共置培育30分鐘(不予震盪),接著以7-7.5ml之0.7%上層瓊脂(top agar)置於LB瓊脂上。在上層瓊脂固化後,將培養皿置於42℃下3小時。在可見噬菌斑時,將浸泡異丙基-β-D
-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)之硝基纖維素膜置於各個培養皿上,並繼續置於37℃下隔夜。自培養皿移除該等膜,並在室溫下以10mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05% Tween-20,pH 7.5(TBST)清洗三次,每次5分鐘。以TBST中之5%脫脂牛奶對該等膜進行阻斷1小時,再以TBST清洗三次。在4℃下,使血清與大腸桿菌萃取物以1:1比例進行隔夜吸附反應,並離心澄清以降低抗大腸桿菌抗體之背景值。在4℃下,使血清與經牛奶阻斷之膜隔夜共置。以經125
I標記之小鼠單株抗人類IgE(Silenus Laboratories,Hawthorn,Victoria,Australia),在室溫下對該等膜進行顯影2小時,接著以TBST清洗四次。在-80℃下,以增強屏板對該等膜進行放射照相兩天。從該等150mm瓊脂盤上切下陽性噬菌斑,再次塗盤於90mm培養皿上,並重複篩選流程,以確認陽性IgE反應性純系。
最後,分離出新穎的Der p 2 cDNA純系。該cDNA分子編碼一種新穎的Der p 2變體蛋白,稱為「Der p 2變體T」(圖1)。相較於Der p 2.0101(1989年所分離的第一種Der p 2)(圖2,登錄號P49278)之參照Der p 2蛋白序列,其含有四個多型性胺基酸。此等多型性殘基包括Arg(-1)至Ala(-1)、Pro 26至Ser 26、Thr 47至Ser 47、以及Asp 114至Asn 114之胺基酸變化,並使其理論等電點由6.56(Der p 2.0101)升高至7.10(Der p 2變體T)。Der p 2變體T之所有多型性與八種已知變體的比較示於表1(參見上文)。
Der p 2變體之相關核苷酸及胺基酸序列以及其位置述於表3。
除Ser26外,其他的殘基變化在其他已知的Der p 2變體中以不同組合出現。Pro26Ser變化是Der p 2的一個新穎多型性殘基,且至今未被揭示。Der p 2變體T之5'未轉譯核苷酸序列與Der p 2.0101者相同。編碼區域(開放讀框)含有數個多型性核苷酸變化,而3'未轉譯核苷酸序列顯示高度之變異(圖3)。
以聚合酶連鎖反應(PCR),使用正向引子pDp2-5'Bam
HI及反向引子pDp2-3'Eco
RI,擴增編碼兩種成熟Der p 2變體之cDNAs。將PCR產物接合於pGEX-2T載體(Pharmacia,Uppsala,Sweden)之Bam
HI及Eco
RI位點,並將該表現構築體轉形至大腸桿菌菌株TG1中。在30℃下,以0.1mM IPTG誘發融合蛋白生產1小時,再以麩胱甘肽瓊脂糖(Sigma,St. Louis,MO,USA)親和層析純化,以先前針對Der p 2.0101所述的方法進行(5)
。重組蛋白係以融合麩胱甘肽硫轉移酶(GST)之融合蛋白形式製備。所有之引子序列示於表3。
將編碼成熟Der p2.0101及Der p2變體T之cDNA次選殖至pGEX-2T之Bam
HI及Eco
RI位點,並在大腸桿菌菌株TG1中以融合GST之融合蛋白形式表現。如所述方法,使用麩胱甘肽瓊脂糖珠由可溶級份中對GST融合蛋白進行親和純化,再以SDS-PAGE及銀染進行檢驗(圖4)。
以聚合酶連鎖反應(PCR),使用正向引子pDp2-5'
KEX2及反向引子pDp2-3'Eco
RI(表3),由質體pGEX-2T-Der p 2(19)
擴增成熟Der p 2變體之cDNAs。使用5'Xho
I及3'Eco
RI位點進行由pPIC9載體中之醇氧化酶基因(AOX1
)啟動子所驅動之α-因子信號序列的定向合框選殖(directional in-frame cloning)。PCR反應係以pfu
DNA聚合酶進行,並對該pPIC9中之插入物進行完整定序。pPIC9載體提供進行分泌用之α-交配因子信號以及進行重組純系選擇用之HIS4
基因。以Bgl
II使pPIC9-Der p 2.0101及pPIC9-Der p 2變體T兩者線性化,再如畢赤酵母表現操作手冊(E版)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中所述,以氯化鋰法轉形至畢赤酵母菌株GS115中。將His+
純系進一步在兩種不同之培養基上進行選擇:一種以甲醇(MM),而另一種則以葡萄糖(MD)作為唯一之碳源。在AOX1
基因處產生同源重組之純系在MM培養基中生長緩慢,且為Muts
(甲醇使用緩慢)表型。選擇該等Muts
純系進行蛋白表現之篩選。
一般而言,在甲醇誘發4小時後,由考馬斯藍(Coomassie blce)染SDS-PAGE,可偵測到可溶性分泌重組Der p 2蛋白。蛋白生成繼續延長至96小時,而最佳產率則在誘發後48小時取得。接著以陽離子交換層析法,將重組Der p 2蛋白純化至勻質。
將含有重組Der p 2.0101或Der p 2變體T之酵母菌培養基加至經20mM醋酸鈉(pH5.5)平衡的Sephadex G25分子篩管柱(5×20cm)。收集含重組Der p 2的級份,將其加至經前述緩衝液平衡的SP-瓊脂糖管柱(2.6×15cm)。以600ml的0至500mM氯化鈉線性梯度溶液對連結的蛋白進行溶析。以透析法將含有三種雙硫鍵經破壞的Der p 2突變物之培養基平衡至20mM醋酸鈉(pH 5.5)。以12,000g離心10分鐘除去沈澱物。使用Hi-Trap SP-瓊脂糖管柱(5ml,Pharmacia)進行突變物之純化。以50ml之0至1M氯化鈉梯度溶液對連結的蛋白進行溶析。以SDS-PAGE及銀染法檢驗重組Der p 2之純度,如圖4所示。以搖瓶培養法所取得之重組Der p 2.0101及Der p 2變體T的終產率大於500mg/L。
此外,以N-端肽定序判定,該兩種重組Der p 2蛋白皆起始於+1位置。這表示在酵母菌信號肽及Der p 2第一殘基之間所設計的接合有產生正確辨識及加工。
本發明中在甲基營養性酵母菌畢赤酵母中成功製備大量優良品質的重組Der p 2變體。相較於釀酒酵母(S. cerevisiae
),使用畢赤酵母具有數種優勢。首先,在畢赤酵母中所製備之蛋白的高糖基化情形較少。第二,在畢赤酵母中添加至蛋白上的寡醣鏈長度較釀酒酵母中者短很多。第三,釀酒酵母之核寡醣具有終端之α-1,3-甘露糖連結,而畢赤酵母則無。由畢赤酵母所製備的蛋白缺乏抗原性α-1,3-甘露糖連結,因此更適於進行診斷及治療應用,並亦適於進行活體外的動物實驗。至今,此種表現已被諸多研究者成功使用,以極高之產率製備異源蛋白(18)
。本發明利用畢赤酵母表現系統,以高產率製備可溶性重組Der p 2,並避免重組蛋白之內毒素污染。大量的重組Der p 2蛋白非常有助於活體內及活體外之免疫研究。
由台大醫院(台北,台灣)小兒科過敏門診之謝貴雄教授提供取自經醫師診斷為氣喘之兒童(年齡為7至15歲)(並未接受免疫治療)的50份血清樣本。
以先前所述之操作流程進行IgE點漬免疫分析[23]
。將2μg純化GST-Der p 2.0101、GST-Der p 2變體T、及GST蛋白(陰性控制組)以雙重試驗加至硝基纖維素膜上。以歐洲塵蟎萃取物(每點5μg)作為陽性控制組。圖5(A)顯示加至膜上的蛋白樣本的位置。接著以TBST清洗膜三次,並在室溫下以TBST中之5%脫脂牛奶對膜進行阻斷1小時。以TBST清洗三次後,以TBS對過敏性氣喘兒童之血清(組1)進行1:5稀釋,再在4℃下與點漬進行共置12-16小時。在室溫下與二級抗體,經125
I-標記之小鼠單株抗人類IgE(Silenus Laboratories),進行共置1小時。在以TBST清洗四次後,以放射照相顯影反應信號。以GS-700光密度計掃描底片,並以分子分析(Molecular Analysis)軟體(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)進行分析。使用SPSS,11.0.1版(SPSS Inc.,Chicago,IL)測定統計差異。使用斯皮爾曼等級法(Spearman’s rank method)分析相關性。將小於0.05之P
-值視為統計顯著性。
如圖5B所示,病患34、31、及31之血清分別與GST-Der p 2.0101、GST-Der p 2變體T、及歐洲塵蟎萃取物有陽性反應。未無記錄到與單獨之GST蛋白的反應性。部分血清(如,病患3及4之血清)顯示與GST-Der p 2變體T有較高反應性;而其他血清(如,病患6及31之血清)則顯示與GST-Der p 2.0101有專一反應性。在此組血清中,光密度分析顯示GST-Der p 2變體T相較於GST-Der p 2.0101有顯著較高的IgE反應性(P
=0.037)(圖5C)。換言之,相較於Der p 2.0101變體,Der p 2變體T顯示與顯著較多數目的試驗血清有較高的IgE反應性。以上結果亦由對氣喘兒童所進行之皮膚點刺試驗獲得驗證(參見下文)。
根據先前所述之流程,對九名氣喘兒童進行皮膚點刺試驗[24]
。將純化的GST-Der p 2.0101及GST-Der p 2變體T蛋白溶於正常鹽水中,並以25μg/ml之濃度進行皮膚點刺試驗。將一滴10μl之蛋白溶液加至個體前臂之手掌,並以拋棄式刺血針點刺該皮膚。以組胺酸(1mg/ml)及正常鹽水作為陽性及陰性控制組。30分鐘後測量丘疹及紅斑之長度及寬度。將減去陰性控制組後尺寸大於3mm×3mm之丘疹反應視為陽性皮膚反應。該等結果示於表4。
如表4所示,試驗個體對於GST-Der p 2變體T之皮膚反應性高於GST-Der p 2.0101的皮膚反應性,且其中四名氣喘兒童(個體5至8)僅與Der p 2變體T產生反應。
本申請案中所引述之所有刊物及專利文件皆為所有目的而以其全文併入作為參考,其範圍如同各刊物或專利文件皆個別標記。
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前述的發明內容以及前述的實施方式,可在結合附呈的圖式閱讀時更為明瞭。就說明本發明之目的而言,圖式顯示的是目前較佳的具體實例。然而,應明瞭的是,本發明並不限於所示的較佳具體實例。
在圖式中:
圖1表示本發明Der p 2變體T之cDNA核苷酸序列以及其推導胺基酸序列。
圖2表示Der p 2.0101之cDNA分子的核苷酸序列(登錄號:AF276239)以及其推導胺基酸序列(登錄號:P49278)。
圖3顯示Der p 2變體T與Der p 2.0101之核苷酸序列間的排列比較,其中在核苷酸序列之上方及下方所指出的胺基酸殘基分別為Der p 2變體T及Der p 2.0101之獨特胺基酸取代;起始及終止密碼子畫有底線;符號“‧”表示相同的核苷酸;符號“-”表示間隔;而陰影部分則表示3’未轉譯核苷酸序列。
圖4顯示SDS-PAGE分析之結果,其中第1道代表取自大腸桿菌表現系統之GST-Der p 2.0101融合蛋白;第2道代表取自大腸桿菌表現系統之GST-Der p 2變體T融合蛋白;第3道代表取自畢赤酵母表現系統之GST-Der p 2.0101蛋白;第4道代表取自畢赤酵母表現系統之GST-Der p 2變體T蛋白;而M代表分子量標記物。
圖5係關於IgE點漬免疫分析,其中(A)顯示加在硝基纖維素膜上的蛋白樣本之位置,包括GST-Der p 2.0101融合蛋白、GST-Der p 2變體T融合蛋白、GST肽、及歐洲塵蟎萃取物;(B)顯示免疫分析之結果,編號1至50各自表示取自所述50名病患之血清樣本;以及(C)顯示由光密度計所定量的蛋白樣本IgE反應性程度。
Claims (28)
- 一種聚核苷酸,其係由編碼SEQ ID NO:1之胺基酸序列的核苷酸序列構成。
- 根據申請專利範圍第1項之聚核苷酸,其中該核苷酸序列為SEQ ID NO:2。
- 一種重組核酸,其包含編碼SEQ ID NO:1之胺基酸序列之核苷酸序列。
- 根據申請專利範圍第3項之重組核酸,其中該核苷酸序列為SEQ ID NO:2。
- 根據申請專利範圍第3項之重組核酸,其為載體。
- 根據申請專利範圍第5項之重組核酸,其為表現載體。
- 根據申請專利範圍第4項之重組核酸,其為載體。
- 根據申請專利範圍第7項之重組核酸,其為表現載體。
- 一種轉殖基因生物,其包含根據申請專利範圍第1或2項之聚核苷酸,或是根據申請專利範圍第3至8項中任一項之重組核酸,其為細菌或真菌。
- 根據申請專利範圍第9項之轉殖基因生物,其為大腸桿菌(Escherichia coli )、乳酸桿菌(lactobacilli)、或雙歧桿菌(bifidobacteria)。
- 根據申請專利範圍第9項之轉殖基因生物,其為酵母菌細胞。
- 根據申請專利範圍第11項之轉殖基因生物,其為畢赤酵母(Pichia pastoris )。
- 根據申請專利範圍第9項之轉殖基因生物,其為多細胞真菌。
- 根據申請專利範圍第13項之轉殖基因生物,其為蘑菇。
- 根據申請專利範圍第14項之轉殖基因生物,其為金針菇。
- 一種多肽,其包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列。
- 一種活體外診斷個體對家塵蟎之過敏的方法,其包含偵測該個體是否會與根據申請專利範圍第16項之多肽產生反應,其中該偵測係使用活體外之免疫分析進行。
- 根據申請專利範圍第17項之方法,其中該個體係罹患氣喘、鼻炎、鼻竇炎、溼疹、過敏性皮炎、過敏、結膜炎、及/或血管性水腫。
- 根據申請專利範圍第17項之方法,其中該免疫分析係在取自該個體之樣本上進行,並用以測定該樣本是否帶有對該多肽具有反應性之抗體。
- 根據申請專利範圍第19項之方法,其中該樣本係取自該個體之血清。
- 根據申請專利範圍第19項之方法,其中該抗體是IgE。
- 一種診斷個體對家塵蟎之過敏的組合物,其包含根據申請專利範圍第16項之多肽以及稀釋劑。
- 一種醫藥組合物,其包含根據申請專利範圍第16項之多肽,以及醫藥可接受之賦形劑或載體。
- 根據申請專利範圍第23項之醫藥組合物,其係用於 治療或預防個體之過敏性疾病。
- 根據申請專利範圍第24項之醫藥組合物,其中該過敏性疾病係與家塵蟎有關。
- 根據申請專利範圍第24項之醫藥組合物,其中該過敏性疾病係氣喘、鼻炎、鼻竇炎、溼疹、過敏性皮炎、過敏、結膜炎、或血管性水腫。
- 根據申請專利範圍第23項之醫藥組合物,其係為疫苗之形式。
- 一種DNA疫苗,其包含根據申請專利範圍第1或2項之聚核苷酸,或是根據申請專利範圍第3至8項中任一項之重組核酸。
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