JP2002542783A - イネ科アレルゲンのｄｎａ配列および組換え体産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、イネ科植物花粉アレルゲンの同定および特徴づけ、並びにこれをコードする組換えＤＮＡ分子、並びに対応するＤＮＡおよびペプチド配列に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、イネ科植物花粉アレルゲンおよびこれをコードする組換えＤＮＡ分
子の同定および特徴づけに関する。オオアワガエリ(Phleum pratense)の花粉は
、天然の原料として作用する。本発明はまた、フラグメント、部分的配列および
突然変異体をも包含する。組換えＤＮＡ分子および誘導されたポリペプチド、フ
ラグメントまたは変種を、花粉アレルギー疾患の療法に用いることができる。さ
らに、組換え方法により産生されたタンパク質およびフラグメントを、花粉アレ
ルギーの診断に用いることができる。

【０００２】 １型アレルギーは、世界中で重要である。工業化された国の人口の２０％まで
が、アレルギー性鼻炎、結膜炎または気管支喘息などの病訴に苦しんでいる。こ
れらのアレルギーは、空気中に存在するアレルゲン（エアロアレルゲン(aeroall
ergen)）により生じ、これは、植物花粉、ダニ、ネコまたはイヌなどの種々のソ
ースにより放出される。これらの１型アレルギー患者の４０％までがまた、イネ
科植物花粉の場合において特異的なＩｇＥ反応性を示す(Friedhoff et al., 198
6, J Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-201)。

【０００３】 １型アレルギーを誘発する物質は、タンパク質、糖タンパク質またはポリペプ
チドである。粘膜を介しての摂取の後に、これらのアレルゲンは、感化されたヒ
ト中の肥満細胞の表面に結合したＩｇＥ分子と反応する。２つのＩｇＥ分子が、
アレルゲンを介して互いに結合した場合には、この結果、エフェクター細胞によ
りメディエイター（例えばヒスタミン、プロスタグランジン）およびサイトカイ
ンが放出され、従って対応する臨床的症状が発生する。

【０００４】 あるアレルゲンに対するＩｇＥ抗体を有するアレルギー患者の相対的頻度に依
存して、メジャーアレルゲンとマイナーアレルゲンとの間に区別をする。チモシ
ー（オオアワガエリ）の場合において、Ｐｈｌ ｐ １(Petersen et al., 1993
, J. Allergy Clin. Immunol. 92, 789-796)、Ｐｈｌ ｐ ５(Matthiesen and
Loewenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21, 297-307; Petersen et al., 1992
)、Ｐｈｌ ｐ ６(Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108
, 49-54)およびＰｈｌ ｐ ２／３(Dolecek et al., 1993, FEBS 335(3), 299-
304)が、これまで、メジャーアレルゲンとして特徴づけられ、Ｐｈｌ ｐ ４(L
oewenstein, 1978, Prog. Allergy 25, 1-62)並びにホソムギ(Lolium perenne)
からの群１０および１１(Ansari et al., 1987, J. Allergy Clin, Immunol. 80
, 229-235)が、マイナーアレルゲンとして特徴づけられた。

【０００５】 本発明に関して、アレルゲンＰｈｌ ｐ ４は、特に重要である。その理由は
、これが、約５５ｋＤａ(Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 9
8 (1), 189-98)の、新規なアレルゲンと類似する分子量を有し、従って本発明に
おいて生成したアレルゲンに最も容易に適合するが、免疫学的および生化学的意
味において顕著に異なるからである。前述の他のアレルゲンとは対照的に、Ｐｈ
ｌ ｐ ４は、ゲノム配列または転写（ｃＤＮＡ）配列が未だ同定されていない
唯一のものである。配列データは、特に、Ｐｈｌ ｐ １(Laffer et al., 1994
, J. Allergy Clin. Immunol. 94, 1190-98; Petersen et al., 1995, J. Aller
gy Clin. Immunol. 95(5), 987-994)、Ｐｈｌ ｐ ５(Vrtala et al., 1993, J
. Immunol. 151(9), 4773-4781)、Ｐｈｌ ｐ ６(Petersen et al., 1995, Int
. Arch. Allergy Immunol. 108(1), 55-59)およびＰｈｌ ｐ ２(Dolecek et a
l., 1993, FEBS 335(3), 299-304)について入手できる。ｃＤＮＡ配列の補助に
より、診断および療法に用いることができる組換えアレルゲンを得ることができ
る(ScheinerおよびKreft, 1995, Allergy 50, 384-391)。

【０００６】 アレルギーの有効な治療処置のための古典的な方法は、特異的免疫療法または
減感作である(Fiebig, 1995, Allergo J. 4(6), 336-339, Bousquet et al., 19
98, J. Allergy Clin. Immunol. 102(4), 558-562)。これらの方法において、天
然のアレルゲン抽出物を、患者に、増大する用量で皮下に注射する。しかし、こ
の方法は、アレルギー反応またはさらにはアナフィラキシーショックの危険を伴
う。これらの危険を最小にするために、アレルゴイド(allergoid)の形態の新規
な製剤が用いられている。これらは、未処理抽出物と比較して、ＩｇＥ反応性が
顕著に低下したが、Ｔ細胞反応性が同一である、化学的に修正されたアレルゲン
抽出物である(Fiebig, 1995, Allergo J. 4(7), 377-382)。

【０００７】 さらに大きい程度の療法の最適化は、組換え方法により産生されるアレルゲン
を用いて可能である。所望により個別の患者に整合させた組換え方法により産生
された高純度のアレルゲンの規定されたカクテルは、天然のアレルゲン源からの
抽出物に取って代わる。その理由は、後者が、種々のアレルゲンに加えて、比較
的大きい数の免疫原性であるが非アレルギー性の随伴タンパク質を含むからであ
る。発現生成物での安全な減感作を生じることができる実際的な見通しは、Ｉｇ
Ｅエピトープが、療法に必須であるＴ細胞エピトープを損なわずに特異的に除去
される、特異的に突然変異した組換えアレルゲンにより提供される(Schramm et
al., 1999, J. Immunol. 162, 2406-2414)。

【０００８】 治療方法によりアレルギー患者中に分布したＴｈ細胞バランスに影響する他の
可能性は、関連するアレルゲンをコードする発現可能なＤＮＡでの処理である。
免疫応答に対するアレルゲン特異性効果の最初の実験的確認は、アレルゲンをコ
ードするＤＮＡの注射により、齧歯動物において得られた(Hsu et al., 1996, N
ature Medicine 2(5), 540-544)。

【０００９】 本発明は、アレルギー性疾患、特に花粉症のインビトロおよびインビボ診断に
おいて有利に用いることができる。このために、クローニングした核酸を、発現
ベクター中で連結し、この構築物を、適切な細胞のタイプにおいて発現させる。
生化学的精製の後に、この組換えアレルゲンは、確立された方法によるＩｇＥ抗
体の除去に有用である。一方、本発明はまた、特定の免疫療法のための組換えア
レルゲン含有または核酸含有製剤における必須の成分として用いることができる
。ここで、多くの可能性が出現する。第１に、修飾されていない一次構造を有す
るタンパク質は、製剤の構成成分であることができる。第２に、全体の分子のＩ
ｇＥエピトープの特異的除去またはＴ細胞エピトープをコードする個別のフラグ
メントの生成により、低アレルゲン(hypoallergenic)（アレルゴイド）形態を、
本発明において、療法に用いて、望まない副作用を回避することができる。最後
に、核酸自体により、これが真核発現ベクターに連結された場合には、直接用い
られた際に、治療的意味でアレルギー免疫状態を修正する製剤が得られる。

【００１０】 本発明は、核酸配列（図１）からなり、アレルゲンをコードする、組換えＤＮ
Ａ分子に関する。イネ科、例えば特にオオアワガエリ、ホソムギ、カモガヤ(Dac
tylis glomerata)、ナガハグサ(Poa pratensis)、ギョウギシバ(Cynodon dactyl
on)、シラゲガヤ(Holcus lanatus)の花粉顆粒は、天然の原料として作用する。

【００１１】 天然のアレルゲンを精製し、単離した後、Ｎ末端タンパク質配列決定を行う。
これから推定される核酸配列に基づいて、プライマーを産生する。このプライマ
ーの補助により、対応するｃＤＮＡを、花粉のｃＤＮＡ集団から、ＰＣＲにより
得、クローニングし、特徴づけした。フラグメントおよび部分的配列を、アレル
ゲンをコードするこのＤＮＡ分子から、本発明に従って産生した。

【００１２】 組換えＤＮＡ分子またはフラグメントおよび部分的配列を、細胞システム中の
適切な発現ベクターにより発現させた後に、アレルゲンまたは低アレルゲン変種
またはフラグメントを精製した。

【００１３】 チモシー花粉からの天然のアレルゲンの精製を、２段階プロセスにおいて行っ
た。花粉の水性抽出の後、得られた抽出物を２つのフラクションに分離し、フラ
クションを、カラムに通して、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより溶出さ
せた。カラムを通過したフラクションは、３種のアレルゲン、Ｐｈｌ ｐ １（
３０〜３５ｋＤａ）、Ｐｈｌ ｐ ２／３（１１〜１４ｋＤａ）および未知のア
レルゲン（５５〜６０ｋＤａ）を含んでいた。これらのタンパク質を、互いにス
ーパーデックス(Superdex)７５を用いたゲル濾過により分離した。

【００１４】 この現在まで未知のアレルゲン（作業名称ｐ５５）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分離除去し、その後ＰＶＤＦ膜上にブロッティングし、精密に定められたフラ
クションを単離した。Ｎ末端アミノ酸配列を、このｐ５５分子から、エドマン分
解により決定した（図２）。

【００１５】 ｐ５５の対応するｃＤＮＡの産生およびクローニングのために、Ｎ末端配列（
図３）に基づく特定のＤＮＡプライマー（２１量体）を、本発明に従って構成し
た。用いた第２のプライマーは、逆転写に用いるオリゴｄＴプライマー中に局在
したアンカー配列であった。ＰＣＲ反応を、オオアワガエリ花粉からの代表的ｍ
ＲＮＡ集団から産生したｃＤＮＡおよび本発明のプライマーおよびアンカープラ
イマーを用いて厳密な条件下で行った。ＰＣＲ反応の分析的ゲル電気泳動におい
て、１．６５ｋｂの大きさを有する増幅したＤＮＡを同定した。この増幅したＤ
ＮＡを、ｐＣＲ２．１ベクターに連結し、うまく形質転換した。２種の異なるク
ローンからの挿入体の配列決定により、同一の配列が得られた。

【００１６】 この一次増幅したＤＮＡにおいて、１４９２ｂｐの読み取り枠（ＯＲＦ）（図
１参照）が同定された。

【００１７】 この核酸から対応する組換えタンパク質（図４）を産生するために、制限酵素
による発現ベクターｐＰｒｏＥｘ ＨｔｂへのｐＣＲ２．１ベクターの再クロー
ニングを、先ず行った。発現および発現生成物の生化学的精製の後に、開発され
たタンパク質のアレルゲン性性質の多くの分析を行った。すべての分析、例えば
ウエスタンブロットおよびドットブロットにおいて、組換えタンパク質は、イネ
科植物花粉アレルギーの臨床的症状を診断した患者からのＩｇＥと特異的に反応
した。用いた対照は、天然のｐ５５であった。従って、組換えタンパク質は、明
らかにアレルゲンである。従って、この発現生成物は、イネ科植物花粉アレルギ
ー患者の高度に特異的な改善された診断に作用する。

【００１８】 改善された治療的使用のための低アレルゲン変種を産生することを意図して、
定められたフラグメントおよび部分的配列の組み合わせを、発現ベクターにおい
てクローニングした核酸から出発して、本発明に従って開発した。さらに、部位
特異的点変異を、主にシステインをコードするトリプレットにおいて導入した。
従って、本発明のこの部分は、減少したかまたは欠乏したＩｇＥ反応性による診
断の目的のために開発された発明から区別される。従って、減少したののために
明らかに低いかまたは欠乏した副作用を有する製剤は、減感作のために有用であ
る。低アレルゲンタンパク質変種をコードする核酸またはｐ５５をコードする修
飾されていない核酸を、ヒト発現ベクターと連結する場合には、これらの製剤を
、同様に、特定の免疫療法用の製剤として用いることができる。

【００１９】 従って、本発明は、以下の通りである。 ａ）アレルゲンとして作用し、好ましくはイネ科(Gramineae(Poaceae))および単
子葉植物により表現されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、
組換えＤＮＡ分子； ｂ）オオアワガエリ由来のヌクレオチド配列を有する、示したＤＮＡ分子； ｃ）図１に示す、示したＤＮＡ分子のヌクレオチド配列； ｄ）図１において定義した、最後に述べたヌクレオチド配列とハイブリッド形成
するヌクレオチド配列を有する、ＤＮＡ分子； ｅ）ｃ）またはｄ）に記載のヌクレオチド配列中に存在する部分的配列および部
分的配列の組み合わせ；

【００２０】 ｆ）個別のコドンの特定的突然変異および除去または付加により修飾された、ヌ
クレオチド配列ａ）〜ｄ）を含むＤＮＡ分子； ｇ）免疫調節性Ｔ細胞反応性フラグメントをコードする、ｃ）に記載のヌクレオ
チド配列； ｈ）免疫調節性Ｔ細胞反応性フラグメントをコードする、ｄ）に記載のヌクレオ
チド配列； ｉ）免疫調節性Ｔ細胞反応性フラグメントをコードする、ｅ）に記載のヌクレオ
チド配列；

【００２１】 ｊ）免疫調節性Ｔ細胞反応性フラグメントをコードする、ｆ）に記載のヌクレオ
チド配列； ｋ）発現制御配列に機能的に結合したａ）〜ｄ）において定義した組換えＤＮＡ
分子からなる、組換えＤＮＡ発現ベクターまたはクローニングシステム； ｌ）ｃ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド； ｍ）ｄ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド； ｎ）ｅ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド； ｏ）ｆ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド； ｐ）ｇ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド；

【００２２】 ｑ）ｈ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド； ｒ）ｉ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド； ｓ）ｊ）に記載の核酸からコードされるポリペプチド； ｔ）請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換した原核細胞または真核細胞の
培養、および培養物からの対応するタンパク質またはポリペプチドの単離により
、ポリペプチド、フラグメントまたはこれらの誘導体を産生する方法； ｕ）ｌ）〜ｎ）に記載のポリペプチドを用いるインビボまたはインビトロでの花
粉アレルギーの診断方法；

【００２３】 ｖ）花粉アレルギーであるヒトまたは動物を治療処置するための、ｌ）〜ｔ）に
記載のポリペプチド、フラグメントまたは誘導体を含む医薬製剤； ｗ）ｖ）において定義した医薬製剤を用いる、花粉アレルギーであるヒトまたは
動物の治療方法； ｘ）ｋ）において定義した構成物でのＤＮＡワクチン接種による、花粉アレルギ
ーの治療方法； ｙ）免疫刺激(immunostimulatory)ＤＮＡフラグメントを含むｋ）において定義
したベクターでＤＮＡワクチン接種することによる、花粉アレルギーの治療方法
。

【００２４】 従って、本発明は、アレルゲン成分を分解する患者特異的感作スペクトルの同
定の一部としてインビトロ診断を改善する作用を有する。本発明は、同様に、イ
ネ科植物花粉アレルギー患者の特異的免疫療法のための顕著に改善された製剤を
製造する作用を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐ５５の核酸配列

【図２】Ｎ末端アミノ酸配列 ｐ５５

【図３】ｐ５５特異的プライマー

【図４】推定されたアミノ酸配列

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年３月２１日（２００１．３．２１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/415 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｑ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． 250， Ｄ−64293 Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄ ｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅ ｒｍａｎｙ (71)出願人 ピーターセン，アルント ドイツ連邦共和国 デー−23795 バード ゼーゲベルク、キークア ８ (72)発明者 ズック，ローラント ドイツ連邦共和国 デー−22303 ハンブ ルク、ミューレンカンプ 19 (72)発明者 フィービィヒ，ヘルムート ドイツ連邦共和国 デー−21493 シュバ ルツェンベック、バッカーヴェーク 10 (72)発明者 クロムウェル，オリバー ドイツ連邦共和国 デー−21465 ヴェン トルフ、ロョーンスヒューエ ２ (72)発明者 ピーターセン，アルント ドイツ連邦共和国 デー−23795 バート ゼーゲベルク、キークア ８ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA31 CA04 HA01 HA17 4B064 AG31 CA19 CC24 DA01 DA13 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA22 CA53 NA14 ZA34 ZB13 ZC78 4C085 AA03 BB03 BB11 DD62 EE01 HH15 KA01 KB82 LL09 4H045 AA11 AA20 AA30 BA09 CA31 DA86 EA22 EA31 EA50 FA74

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アレルゲンとして作用し、好ましくはイネ科および単子葉植
   物により発現されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組換え
   ＤＮＡ分子。
2. 【請求項２】 オオアワガエリ由来のヌクレオチド配列を有する、請求項１
   に記載のＤＮＡ分子。
3. 【請求項３】 図１に示す、請求項２に記載のヌクレオチド配列。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のヌクレオチド配列とハイブリッド形成する
   ヌクレオチド配列を有する、ＤＮＡ分子。
5. 【請求項５】 請求項３または請求項４に記載のヌクレオチド配列中に存在
   する部分的配列および部分的配列の組み合わせ。
6. 【請求項６】 個別のコドンの特定の突然変異および除去または付加により
   修飾された、請求項１〜４のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分
   子。
7. 【請求項７】 免疫調節性Ｔ細胞反応性フラグメントをコードする、請求項
   ３に記載のヌクレオチド配列。
8. 【請求項８】 免疫調節性Ｔ細胞反応性フラグメントをコードする、請求項
   ４に記載のヌクレオチド配列。
9. 【請求項９】 免疫調節性Ｔ細胞反応性フラグメントをコードする、請求項
   ５に記載のヌクレオチド配列。
10. 【請求項１０】 免疫調節性Ｔ細胞反応性フラグメントをコードする、請求
    項６に記載のヌクレオチド配列。
11. 【請求項１１】 発現制御配列に機能的に結合した請求項１〜４のいずれか
    に記載の組換えＤＮＡ分子からなる、組換えＤＮＡ発現ベクターまたはクローニ
    ングシステム。
12. 【請求項１２】 請求項３に記載の核酸からコードされるポリペプチド。
13. 【請求項１３】 請求項４に記載の核酸からコードされるポリペプチド。
14. 【請求項１４】 請求項５に記載の核酸からコードされるポリペプチド。
15. 【請求項１５】 請求項６に記載の核酸からコードされるポリペプチド。
16. 【請求項１６】 請求項７に記載の核酸からコードされるポリペプチド。
17. 【請求項１７】 請求項８に記載の核酸からコードされるポリペプチド。
18. 【請求項１８】 請求項９に記載の核酸からコードされるポリペプチド。
19. 【請求項１９】 請求項１０に記載の核酸からコードされるポリペプチド。
20. 【請求項２０】 請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換した原核細胞
    または真核細胞の培養および培養物からの対応するタンパク質またはポリペプチ
    ドの単離によって、ポリペプチド、フラグメントまたはこれらの誘導体を産生す
    る方法。
21. 【請求項２１】 請求項１２〜１４のいずれかに記載のポリペプチドを用い
    るインビボまたはインビトロでの花粉アレルギーの診断方法。
22. 【請求項２２】 花粉アレルギーであるヒトまたは動物を治療処置するため
    の、請求項１２〜１９のいずれかに記載のポリペプチド、フラグメントまたは誘
    導体を含む医薬製剤。
23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の医薬製剤を用いた、花粉アレルギーを
    有するヒトまたは動物の治療方法。
24. 【請求項２４】 請求項１１に記載の構成物でＤＮＡワクチン接種すること
    による、花粉アレルギーの治療方法。
25. 【請求項２５】 免疫刺激ＤＮＡフラグメントを含む請求項１１に記載のベ
    クターでＤＮＡワクチン接種することによる、花粉アレルギーの治療方法。