PT1171604E - Sequência de dna e preparação recombinente de um alergénio de gramíneas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

“SEQUÊNCIA DE DNA E PREPARAÇÃO RECOMBINANTE DE UM ALERGÉNIO DE GRAMÍNEAS" A invenção refere-se à identificação e caracterização de um alergénio de pólenes de gramíneas, assim como à molécula de DNA recombinante que codifica o mesmo. Como matéria-prima natural servem os pólenes de Phleum pratense. A molécula de DNA recombinante e os polipéptidos derivados podem ser utilizados para a terapia de doenças alérgicas provocadas por pólenes. Para além disso, as proteínas produzidas de forma recombinante podem ser utilizadas para o diagnóstico de alergias a pólenes.

As alergias do tipo 1 possuem um significado mundial. Até 20% da população de países industrializados sofre de perturbações, como renite alérgica, conjuntivite ou asma bronquial. Estas alergias são provocadas por alergénicos existentes no ar (aeroalergénicos), os quais são libertados de fontes de diferentes origens, como pólenes de plantas, ácaros, gatos ou cães. Até 40% destes alérgicos do tipo 1 apresentam, por sua vez, uma reactividade específica à IgE no caso de pólenes de gramíneas (Freidhoff et al., 1986, J. Allergy Clin Immunol 78, 1190-201).

No caso das substâncias que provocam alergias do tipo 1, trata-se de proteínas, glicoproteínas ou polipéptidos. Estes alergénios reagem, após a absorção através das mucosas, com moléculas de IgE ligadas à superfície de mastócitos de pessoas sensibilizadas. Caso duas moléculas de IgE sejam reticuladas mutuamente por acção de um alergénio, então, isto conduz à libertação de mediadores (por exemplo, histamina, prostaglandinas) e citoquinas, por 2 meio da célula efectora e, consequentemente, aos sintomas clínicos correspondentes.

Dependendo da frequência relativa de alérqicos, que apresentam anticorpos IgE contra determinados alergénios, distingue-se entre alergénios major e alergénios minor. No caso do fléolo (Phleum pratense) foram até ao presente caracterizados como alergénios major o Phl p 1 (Petersen et ai., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92, 789-796), Phl p 5 (Matthiesen e Lõwenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21, 297— 307; Petersen et al., 1992), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54) e Phl p 2/3 (Dolecek et al.r 1993, FEBS 335 (3), 299-304) e Phl p 4 (Lõwenstein, 1978, Prog. Allergy 25, 1-62), bem como o grupo 10 e 11 de Lolium perenne (Ansari et al., 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 80, 229-235) como alergénios minor.

No contexto na presente invenção, o alergénio Phl p 4 é de especial significado, uma vez que possui uma massa molecular semelhante, de cerca de 55 kDa (Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin Immunol. 98 (1), 189-98), ao novo alergénio e, por conseguinte, é o mais comparável com o alergénio preparado de acordo com a invenção, distinguindo-se, no entanto, nitidamente em termos imunológicos e bioquímicos. Ao contrário dos outros alergénios acima mencionados, o Phl p 4 é o único, cuja sequência genómica ou de transcrição (cDNA) ainda não está identificada. Existem, entre outros, dados da sequência de Phl p 1 (Laffer et al. , 1994, J. Allergy Clin. Immunol. 94, 1190-98; Petersen et al., 1995, J. Allergy Clin. Immunol. 95(5), 987-994), Phl p 5 (Vrtala et al., 1993, J. Immunol. 151 (9), 4773-4781), Phl p 6 (Peterson et ai., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108 (1), 55-59) e Phl p 2 (Dolecek et al., 3 1993, FEBS 335 (3), 299-304). Com auxílio das sequências de cDNA é possível produzir alergénios recombinantes, os quais podem ser utilizados em diagnóstico e na terapia (Scheiner e Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391).

Um complemento clássico para o tratamento terapêutico eficaz de alergias corresponde à imuno-terapia especifica ou à hipossensibilização (Fiebig, 1995, Allergo J. 4(6), 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin Immunol. 102(4), 558-562). Neste caso são injectadas subcutaneamente ao paciente doses crescentes de extractos naturais de alergénio. Contudo, neste método existe o perigo de reacções alérgicas ou até de um choque anafilático. Para minimizar estes riscos, são utilizados preparados inovadores sob a forma de alergóides. Trata-se, neste caso, de extractos de alergénios quimicamente modificados, os quais apresentam uma reactividade IgE nitidamente reduzida, mas uma reactividade de células T idêntica, comparativamente ao extracto não tratado (Fiebig, 1995, Allergo J. 4(7), 377-382).

Uma ainda maior optimização da terapia seria possível com alergénios preparados de forma recombinante. Cocktails de alergénios definidos, altamente puros, produzidos de forma recombinante, eventualmente, dirigidos para pacientes individuais, poderiam substituir os extractos de fontes de alergénios naturais, já que estes, para além dos diferentes alergénios, compreendem um maior número de imunogénios, mas não proteínas alergénias associadas. Perspectivas realistas que podem conduzir a uma hipossensibilização segura com produtos de expressão, requerem alergénios recombinantes mutados de forma dirigida, nos quais os epítopos IgE são especificamente eliminados, sem prejudicar os epítopos de 4 células T, essenciais para a terapia (Schramm et ai., 1999, J. Immunol. 162, 2406-2414).

Outra possibilidade para a influência terapêutica do equilíbrio de células Th, perturbado em alérgicos, é o tratamento com DNA com capacidade de expressão, o qual codifica para alergénios relevantes. Os primeiros documentos experimentais que suportam a influência alergénia específica da resposta imune puderam ser realizados em Nagem, por meio da injecção de DNA que codifica para alergénios (Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2(5), 540-544). A invenção pode ser aplicada com vantagem no diagnóstico in-vitro e in-vivo de doenças alérgicas, em particular, de polinose. Para tal, o ácido nucleico clonado é ligado num vector de expressão, sendo esta estrutura expressa num tipo celular apropriado. Após purificação bioquímica este alergénio recombinante encontra-se disponível para a detecção de anticorpos IgE em processos estabelecidos. Por outro lado, a invenção pode ser aplicada como um componente essencial numa preparação compreendendo um alergénio recombinante ou um ácido nucleico, para a imunoterapia específica. Neste caso, existem mais possibilidades. Por um lado, pode ser componente na estrutura primária do preparado a proteína não modificada. Por outro, o ácido nucleico em si, quando ligado com um vector de expressão eucariota, pode representar uma preparação, o qual quando aplicado directamente altera, no contexto terapêutico, o estado imunológico alérgico.

No caso da invenção, trata-se de uma molécula de DNA recombinante, a qual consiste de uma sequência de ácidos 5 nucleicos (Fig. 1) e que codifica para um alergénio. Como matéria-prima natural servem grãos de pólen de gramíneas, como por exemplo, Phleum pratense, Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus tanatus, entre outros.

Após purificação e isolamento do alergénio natural foi realizada uma sequenciação proteica N-terminal. Com base na sequência de ácidos nucleicos dai deduzida ocorre a preparação de um primer. Com auxilio deste primer foi obtido, via PCR, o cDNA correspondente, a partir de uma população de cDNA de pólenes, clonado e caracterizado.

Após a expressão da molécula de DNA recombinante, por meio de vectores de expressão apropriados em sistemas celulares, o alergénio foi purificado. A purificação do alergénio natural de pólenes de gramíneas foi realizada num processo de dois passos. Após a extracção aquosa dos pólenes, o extracto obtido foi separado em duas fracções por meio de uma cromatografia de interacção hidrófoba, a fracção de passagem e o eluato. A fracção de passagem continha três alergénios, Phl p 1 (30-35 kDa), Phl p 2/3 (11-14 kDa) e um alergénio desconhecido (55-60 kDa).

Estas proteínas foram separadas umas das outras por meio de uma filtração em gel com Superdex 75.

Este alergénio, até ao presente desconhecido (designação de trabalho p55) , designação final "Phl p 13"; Suck et al., Clin. Exp. Allergy 30(3), 2000, 324-332 foi separado por meio de SDS-PAGE, subsequentemente aplicado sobre uma membrana de PVDF e isolada uma fracção rigorosamente definida. A partir desta molécula p55 foi determinada uma 6 sequência de aminoácidos N-terminal, por meio de uma degradação de Edman (Fig. 2).

Para a preparação e clonagem do cDNA correspondente ao p55 foi, de acordo com a invenção, construído um primer de DNA específico (21mer) , com base na sequência N-terminal (Fig. 3). Como segundo primer foi utilizada uma sequência de ancoragem, a qual estava localizada no primer oligo-dT utilizado para a transcrição reversa. Com um cDNA, o qual foi produzido a partir da população representativa de mRNA de pólenes de Phleum pratense, e o primer de ancoragem, bem como o primer de acordo com a invenção, foi realizada uma reacção de PCR sob condições rigorosas. Na electroforese analítica da reacção de PCR foi identificado um produto amplificado, com um tamanho de 1,65 kb. Este produto amplificado foi ligado num vector pCR2.1 e transformado com sucesso. As sequenciações das inserções de dois clones diferentes originaram a mesma sequência.

Neste produto amplificado primário foi identificada uma grelha de leitura aberta (ORF) de 1492 pb (vide Fig. 1).

Para a preparação da proteína recombinante correspondente (Fig. 4) a partir deste ácido nucleico foi primeiramente realizada uma reclonagem do vector pCR2.1, por meio de enzimas de restrição, no vector de expressão pProEx Htb. Após a expressão e a purificação bioquímica do produto de expressão tiveram lugar várias análises relativas às características alergénias da proteína desenvolvida. Em várias análises, por exemplo, Western Blot e Dot Blot, a proteína recombinante reagiu de forma específica com IgE de pacientes, que apresentavam os sintomas clínicos diagnosticados de uma alergia aos pólenes de gramíneas. 7

Como controlo foi utilizado o p55 natural. Por conseguinte, no caso da proteína recombinante, trata-se nitidamente de um alergénio. Este produto de expressão serve, assim, para um diagnóstico melhorado, altamente específico de alérgicos a pólenes de gramíneas. Caso o ácido nucleico, que codifica para o p55, seja ligado com um vector de expressão humano, então, estas estruturas podem, igualmente, ser utilizadas como preparações para a imunoterapia específica.

Objecto da invenção é consequentemente (a) uma molécula de DNA recombinante, a qual compreende uma sequência nucleotídica do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense de acordo com a SEQ ID NO 1, a qual codifica para um polipéptido, que apresenta a actividade do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense, (b) uma molécula de DNA recombinante, a qual possui uma sequência nucleotídica, que é complementar à sequência nucleotídica do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense definida em (a), (c) um vector de expressão de DNA recombinante ou um sistema de clonagem consistindo da molécula de DNA recombinante, a qual compreende uma sequência nucleotídica do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense de acordo com a SEQ ID NO 1, como definido em (a), funcionalmente ligado com uma sequência de controlo da expressão, (d) alergénio Phl p 13 de Phleum pratense natural, o qual é codificado pelo ácido nucleico de acordo com (a), (e) um polipéptido, que apresenta a actividade do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense, o qual é codificado pelo ácido nucleico de acordo com (a), (f) um método para a preparação de um polipéptido, o qual apresenta a actividade do alergénio Phl p 13 de Phleum 8 pratense, por cultura de células procariotas ou eucariotas, as quais são transformadas com um vector de expressão de acordo com (c) , e a obtenção da correspondente proteína ou polipéptido a partir da cultura (g) um método para o diagnóstico de alergias a pólenes in vitro, mediante a utilização dos polipéptidos de acordo com (d) ou (e), (h) uma composição farmacêutica, a qual compreende um polipéptido, que apresenta a actividade do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense, de acordo com (d) ou (e) , para o tratamento terapêutico de pessoas ou animais alérgicos a pólenes, (i) a utilização de um polipéptido, o qual apresenta a actividade do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense, de acordo com (d) ou (e), para a preparação de um medicamento para o tratamento de pessoas ou animais alérgicos a pólenes, (j) a utilização de estruturas como definidas em (c), as quais compreendem uma sequência nucleotídica do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense de acordo com a SEQ ID NO 1, para a preparação de um medicamento para a vacinação de DNA de pessoas ou animais alérgicos a pólenes, (k) a utilização dos vectores definidos em (c) , os quais compreendem um sequência nucleotídica do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense, de acordo com a SEQ ID NO 1, a qual compreende secções de DNA imunoestimuladoras, para a preparação de um medicamento para a vacinação de DNA de pessoas ou animais alérgicos a pólenes. A invenção serve, assim, para o melhoramento do diagnóstico in vitro no âmbito da identificação resolvente de um componente alergénio do espectro de sensibilização específico para o paciente. A invenção serve, igualmente, 9 para a produção de preparações nitidamente melhoradas para a imunoterapia especifica de alergias a pólenes de gramineas.

PROTOCOLO DE SEQUENCIA

<110> Merck Patent GmbH <120> Sequência de DNA e produção recombinante de um alergénio de gramineas <130> Sequência de DNA <14Q> <141 > <160>4 <170> Patentm Ver, 2.1 <210> 1

<211> 1187 <212=- DNA <213> Granmneae <400> 1 gggaegeagg aggagaagaa ggaggagaag asggagagtg gagatgctgc gtccggggcc 60 gacggaacet âegacatcac eaagctcgge geeaaaeccg acggcaagae ggactgcacc 120 aagg&ggtgg aggaggcatg ggcttcggct tgcggtggta ccgggaagaa tacgatcgtc ISO atccccaagg gtgatttcct gaccgggcct ctgaatttca ccgggccatg caagggegac 240 •gegtcacca fccaagctgga eggcaãCCtg ctgafctcca acgacctgge caagtacaag 300 gctaactgga tcgagatcat geggatcaag aaactcactã tcaceggcaa aggcãcgctc 360 gacggccâag gcaaggccgt gtggggcaag aaeagctgeg ccaagaacta caactgcaag 420 atcttgccaa acacattggt gctçgactte: tgtgacgacg ctctcatcgã aggcatcacc 480 ctcctaaacg ccaagttctt ccatatgaac atctacgagt geaagggcgt gaccgtcaag 540 gacgtgaeca tcaccgcgcc cggggacagc cccaacaccg acggcatcca catcggcgac 600 tcgtecaagg tcaccafcac cgacaccacc atçggcaeeg gcgacgactg catctecatc 660 ggccccgçjaa gcaccggcct caacatcace ggcgtgacet gcggtccagg ccacggcatc 720 agcqttggca gcctgggscg gtacaaggae gagaaggacg tgaccgacat caccgtaaag 780 10 aactgcgtgc teaagaagtc caccaacçgc etccggatce agtcgtacga ggacgccasg 840 tcgccgctga cggcgtsgaa gctgacctac gagaacgtga agatggagga cgtgggctae 900 cccatcatca fccgaccagaa gtactgcccc aacaagatct gcacotccaa çggagacfccc 960 gcCagggtca ccgtcaagga cgtcaccttc cgcaacafcca ccggcaccte ctceaccccc 1020 gaggeegtca gcctgctctg cfcccgacaag cagccctgca atggtgtcac catgaacgac 1080 gtcaagatcg agtacagcgg caccaacaac aãgaccatgg cfcgtctgcac çaacgccaag 1140 gtcaccgcca agggfgtcag cgaggctaao acctgcgceg cctgatg 118?

<21Q> 2 <211 >20 <212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: primer especifico para o p55 <4C0>£ G1 y Lys Lys Gin Glu Lys Dys A-sp Glu Lys Lys Glu Sar vsly Asp Ala 1 5 10 15

Ala Ser Xaa Ala 20

<210> 3 <211 >26 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: primer especifico para o p55 <220> <221> variação <222> (3) <223> n = inosina 11 <320> <221> variação <222> |6} <223> η = inosina <320> <221> variação <£££> (9) <223> η = inosina <;so> <221> variação <222> {12) <223> η = inosina <220> <221> variação <222>(15) <223> η = inosina <aso> <221> variação <â2â>(iô) <223> η = inosina <22Q> <221> variação <Ζ22> (21) <223> η = inosina <£20> <221> variação <222> {24} <223> η = inosina 12 <40Q>3 ggnaanaang anganaanaa nganga 28 <210> 4 <211 >394 <212> PRT <213> Qmmsneae <400> 4

Gly Lys Lys Glu GIu Lys Lys Glu Glu Lys Lys Glu Ser Gly Asp Ala 15 10 15

Ala Ser Gly Ala Asp Gly Thr Tyr Asp Ile Thr Lys Leu Gly Ala Lys 20 25 30

Fro Asp Gly Lys Thr Asp Cys Thr Lys GIu Vai GIu Glu Ala Trp Ala 35 40 45

Ser Ala Cys Gly Gly Thr Gly Lys Asn Thr Ile Vai Ile Fro Lys Gly 50 55 60

Asp Phe Leu Thr Gly Fro Leu AsA Phe Thr Gly Pro Cys Lys Gly Asp 65 70 75 S0

Ser Val Thr Ile Lys Leu Asp Gly Asn Leu Leu Ser Ser Asn Asp Leu 85 90 95

Ala Lys Tyr Lys Ala Asn Trp lie Glu lie Het Arg Ile Lys Lys Leu 100 105 110

Thr ile Thr Gly Lys Gly Thr Leu Asp Gly Gin Gly Lys Ala Val Trp 115 120 125

Gly Lys Asn Ser cys Ala Lys Asn Tyr Asn Cys Lys Ile Leu Pro Asn "130..... 135 - 140

Thr Leu Val Leu Asp Phe Cys Asp Asp Ala Leu lie Glu Gly Ile Thr 1<5 150 155 160 13 Leu LeO Asn Ala Lys Phe Phe Mis Met Asa Xle Tyr Glu Cy» Ay® Gly 165 170 175

Vai Thr Vai Lys Asp Vai Thr He Thr Ala Pro Gly 180 185

Ser Pro Asa ISO

Thr Asp Gly lie Bis I» 195 GXy Asp Ser Ser Lys Vai Thr lie Thr Asp 200 205

Thr Thr 11e 210 f Thr Gly Asp Asp Cye lie Ser ile Gly Pro Gly Ser 21.5 220

Thr Gly Lau Asn 11« Thr Gly 225 230

Aiâ Cys Gly :Pro Gly Kis Gly Ile 235 240

Vai Thr Asp 255

Ser Vai Gly Ser Leu Gly Arg Tyr Lys Asp Glu Lys 245 250

Ser Thr Asn. Gly Leu Arg 270

Ile Thr Vai Lys Asa Cys Vai Leu Lys 2&Q 265 lie Lys Ser 275

Glu Asp Ma Lys Ser Pro Leu Thr Ala Ser Lys Leu 280 285

Thr Tyr Glu Asa Vai Lys Met Glu Asp Vai Gly Tyr Pro lie 11« He 290 295 300

Asp Gin Lys fyr Cys Pro Asm Lys Ile Cys Thr Ser Lys Gly Asp Ser 305 310 315 320

Alâ Arg Vai Thr Vai Lys 325 p Vai Thr Phe Arg Asn He Thr Gly Thr 330 335

Ser Ser Thr Pro Glu Alá Vai Ser Leu Leu Cys Ser Asp Lys Gin Pro 340 345

Cys Asn Gly Vai Thr Met Asít Aáp Vál Lys 11* Glu Tyr Ser Gly Thr 355 360 365

Asn Asn Lys Thr Mat Ala Vai Cys Thr Asn Ala Lys Vai Thr Ala Lys 370 375 380 14 14 Ala

Gly Vai Sçr GIu Ala Ãsn. Thr Cys Ala 38S 390

Lisboa, 27 de Novembro de 2006

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma molécula de DNA recombinante, que compreende uma sequência nucleotídica do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense de acordo com a SEQ ID NO 1, a qual codifica para um polipéptido, que apresenta a actividade do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense.

2. Uma molécula de DNA, a qual possui um sequência nucleotídica, que é complementar à sequência nucleotídica do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense definida na reivindicação 1.

3. Um vector de expressão de DNA recombinante ou um sistema de clonagem consistindo da molécula de DNA recombinante, a qual compreende uma sequência nucleotídica do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense de acordo com a SEQ ID NO 1, como definido na reivindicação 1, funcionalmente ligado com uma sequência de controlo da expressão.

4. Alergénio Phl p 13 de Phleum pratense natural, o qual é codificado pelo ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1.

5. Um polipéptido, que apresenta a actividade do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense, o qual é codificado pelo ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1.

6. Um método para a preparação de um polipéptido, o qual apresenta a actividade do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense, por cultura de células procariotas ou 2 eucariotas, as quais são transformadas com um vector de expressão de acordo com a reivindicação 3, e a obtenção da correspondente proteína ou polipéptido a partir da cultura.

7. Um método para o diagnóstico de alergias a pólenes in vitro, mediante a utilização dos polipéptidos de acordo com as reivindicações 4 ou 5.

8. Uma composição farmacêutica, a qual compreende um polipéptido, que apresenta a actividade do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense, de acordo com as reivindicações 4 ou 5, para o tratamento terapêutico de pessoas ou animais alérgicos a pólenes.

9. Utilização de um polipéptido, o qual apresenta a actividade do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense, de acordo com as reivindicações 4 ou 5, para a preparação de um medicamento para o tratamento de pessoas ou animais alérgicos a pólenes.

10. Utilização de estruturas definidas na reivindicação 3, as quais compreendem uma sequência nucleotídica do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense de acordo com a SEQ ID NO 1, para a preparação de um medicamento para a vacinação de DNA de pessoas ou animais alérgicos a pólenes.

11. Utilização dos vectores definidos na reivindicação 3, os quais compreendem um sequência nucleotídica do alergénio Phl p 13 de Phleum pratense, de acordo com a SEQ ID NO 1, assim como secções de DNA imunoestimuladoras, para a preparação de um 3 3 ou medicamento para a vacinaçao de DNA de pessoas animais alérgicos a pólenes. Lisboa, 27 de Novembro de 2006