PL201818B1 - Sekwencja DNA oraz sposób rekombinacyjnego otrzymywania alergenów graminae - Google Patents

Sekwencja DNA oraz sposób rekombinacyjnego otrzymywania alergenów graminae

Info

Publication number
PL201818B1
PL201818B1 PL356055A PL35605500A PL201818B1 PL 201818 B1 PL201818 B1 PL 201818B1 PL 356055 A PL356055 A PL 356055A PL 35605500 A PL35605500 A PL 35605500A PL 201818 B1 PL201818 B1 PL 201818B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
allergen
phl
phleum pratense
recombinant
nucleotide sequence
Prior art date
Application number
PL356055A
Other languages
English (en)
Other versions
PL356055A1 (pl
Inventor
Roland Suck
Helmut Fiebig
Oliver Cromwell
Arnd Petersen
Original Assignee
Merck Patent Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent Gmbh filed Critical Merck Patent Gmbh
Publication of PL356055A1 publication Critical patent/PL356055A1/pl
Publication of PL201818B1 publication Critical patent/PL201818B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1. Rekombinowana moleku la DNA, znamienna tym, ze zawiera sekwencj e nukleotydow a aler- genu Phl p 13 z Phleum pratense jak przedstawiono na rysunku fig. 1 (SEQ ID No. 1) i koduje alergen Phl p 13 z Phleum pratense. 2. Moleku la DNA, znamienna tym, ze ma sekwencj e nukleotydowa, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej alergenu Phl p 13 z Phleum pratense zdefiniowanej w zastrz. 1. 3. Rekombinowany wektor ekspresyjny DNA lub system klonowania zawieraj acy rekombinowa- n a molekule DNA, znamienny tym, ze zawiera sekwencj e nukleotydow a alergenu Phl p 13 z Phleum pratense przedstawion a na rysunku fig. 1 (SEQ ID No. 1) i zdefiniowana w zastrz. 1, funkcjonalnie po laczon a z kontroln a sekwencj a ekspresyjn a. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest identyfikacja oraz charakterystyka alergenów pyłków traw jak również kodujących ich rekombinantów DNA. Jako naturalnego surowca używa się pyłków Phleum pratense. Wynalazek obejmuje także fragmenty i części sekwencji oraz mutacje. Rekombinanty DNA oraz wywodzące się z nich polipeptydy, ich fragmenty oraz warianty mogą być stosowane w terapii chorób, których przyczyną jest uczulenie na pyłki kwiatowe. Rekombinacyjnie otrzymywane białka oraz ich fragmenty mogą być ponadto stosowane w diagnostyce alergii na pyłki kwiatowe.
Alergie typu 1 stanowią istotny problem o skali światowej. Do 20% ludności krajów uprzemysłowionych cierpi na dolegliwości związane z alergicznym katarem, zapaleniem spojówek lub astmą oskrzelową. Alergie te wywoływane są przez alergeny znajdujące się w powietrzu (aeoroalergeny), które uwalniane są z różnych źródeł takich jak pyłki roślinne, roztocza, koty lub psy. W przypadku pyłków traw do 40% alergików typu 1 wykazuje specyficzną reaktywność względem immunoglobuliny lgE (Freidhoff et al., 1986, J Allergy Clin Immunol 78, 1190-201).
W przypadku substancji wyzwalających alergie typu 1 chodzi o białka, glikoproteiny lub polipeptydy. Alergeny te po wniknięciu do organizmu przez błony śluzowe u osób uczulonych reagują na powierzchni komórek tucznych ze związanymi molekułami immunoglobuliny IgE.
W wypadku kiedy alergen doprowadzi do utworzenia połączenia między dwoma molekułami IgE, komórki efektorowe uwalniają mediatory (np. histaminę lub prostaglandyny) oraz cytokiny, doprowadzając do powstawania symptomów klinicznych.
W zależności od względnej częstości występowania poszczególnych grup alergików, czego dowodzą przeciwciała IgE względem określonych alergenów, zalicza się je do alergenów głównych (majorallergen) lub alergenów rzadkich (minorallergen). W wypadku traw tymotki (Phleum pratense) jako główne alergeny scharakteryzowano dotychczas Phl p 1 (Peterson et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92, 789-796), Phl p 5 (Matthiesen und Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21,297-307, Petersen et al., 1992), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54) oraz Phl p 2/3 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3), 299-304), a jako alergeny rzadkie-Phl p 4 (Lowenstein, 1978, Prog. Allergy 25, 1-62) jak również grupa 10 i 11 z Lolium perenne (Ansari et al., 1987, J. Allergy Clin Immunol. 80, 229-235).
W związku z omawianym wynalazkiem szczególne znaczenie ma alergen Phl p 4, ponieważ posiada on podobną masę cząsteczkową ok. 55 kDa (Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin Immunol. 98(1), 189-98) jak nowy alergen i ze względu na to jest najbardziej zbliżony do nowego alergenu otrzymanego według wynalazku, przy czym jednak biochemicznie i immunologicznie wyraźnie różnią się one od siebie. W przeciwieństwie do innych alergenów w/w Phi p 4 jest jedynym, którego genomiczna i traskrypcyjna sekwencja (c-DNA) nie została dotąd zidentyfikowana. Dane dotyczące sekwencji przedstawione zostały między innymi dla Phl p 1 (Laffer et al., 1994, J. Allergy Clin Immunol. 94, 1190-98; Petersen et al., 1995, J. Allergy Clin Immunol. 95(5), 987-994), Phl p 5 (Vrtala et al., 1993, J. Immunol. 151(9), 4773-4781), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108(1), 55-59) oraz Phl p 2 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335(3), 299-304). Za pomocą sekwencji c-DNA możliwe jest otrzymanie rekombinowanych alergenów, które mogą znaleźć zastosowanie w diagnostyce i terapii (Scheiner i Kraft, 1995, Allergy 50, 384-391).
Klasycznym punktem wyjściowym aktywnego leczenia alergii jest specyficzna immunoterapia lub odczulanie (Fiebig, 1995, Allergo J. 4(6), 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin Immunol. 102(4), 558-562). W takim wypadku pacjentom podaje się rosnące dawki podskórnych iniekcji naturalnych ekstraktów alergenów. Jednakże w metodzie takiej występuje zagrożenie reakcji alergicznych lub nawet szoku anafilaktycznego. W celu zminimalizowania tego ryzyka stosuje się nowe preparaty alergoidów. Chodzi w tym wypadku o chemicznie modyfikowane ekstrakty alergenów, które w porównaniu do niemodyfikowanych ekstraktów wykazują oczywiście obniżoną reaktywność względem IgE, przy czym posiadają identyczną reaktywność względem komórek T (Fiebig, 1995, Allergo J. 4(7), 377-382).
Dalsza optymalizacja terapii możliwa jest z zastosowaniem alergenów otrzymywanych technikami rekombinacyjnymi. Określone koktajle z wysoko oczyszczonych rekombinowanych alergenów ustalone dla indywidualnych pacjentów zastąpić mogą ekstrakty z naturalnych źródeł alergenów, ponieważ zawierają one poza różnymi alergenami dużą liczbę towarzyszących immunogenicznych lecz nie alergenicznych białek. Realne perspektywy niezawodnego odczulania produktami ekspresji dają poddane mutacji rekombinowane alergeny o ściśle określonym celu działania, w których epitopy IgE
PL 201 818 B1 poddaje się specyficznej delecji bez naruszania, posiadającego podstawowe znaczenie dla terapii, epitopu komórki T (Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162, 2406-2414).
Inną możliwością terapeutycznego oddziaływania na zakłóconą równowagę komórki Th u alergików jest leczenie DNA, które wykazuje zdolność ekspresji, kodując przy tym odpowiednie alergeny. Pierwsze eksperymentalne dowody alergospecyficznego wpływu na odpowiedź immunologiczną otrzymano u gryzoni przez podanie iniekcji DNA kodującego alergen (Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2(5), 540-544).
Wynalazek może być korzystnie stosowany w diagnostyce chorób alergicznych in vitro oraz in vivo, a w szczególności kataru siennego. W tym celu klonowane kwasy nukleinowe umieszcza się w wektorze ekspresji (ligacja), a konstrukt taki poddaje się ekspresji w odpowiednim typie komórki. Po oczyszczeniu biochemicznym rekombinowany alergen używany może być do wykrywania przeciwciał IgE. Z drugiej strony podstawowe zastosowania według wynalazku w postaci rekombinowanych preparatów zawierających alergeny lub kwasy nukleinowe mogą być stosowane w specyficznej immunoterapii. W omawianym aspekcie występuje wiele różnych możliwości. Z jednej strony część białka stanowić może niezmieniona pierwszorzędowa struktura białka. Z drugiej zaś strony w celu uniknięcia działań ubocznych w terapii stosowane mogą być hipoalergiczne (alergoidalne) formy według wynalazku, otrzymane przez specyficzną delecję w epitopach IgE całej cząsteczki lub konstrukcję pojedynczych fragmentów, które kodują epitopy komórki T. W końcu stosując kwasy nukleinowe jako takie, w wypadku kiedy umieszczane są one poprzez ligację w eukariotycznym wektorze ekspresji, otrzymuje się preparaty, których bezpośrednie zastosowanie zmienia w sensie terapeutycznym alergiczny stan immunologiczny.
Przedmiotem wynalazku jest rekombinowana molekuła DNA, która składa się z sekwencji kwasu nukleinowego przedstawionej na rysunku fig. 1 i koduje alergen. Jako naturalny surowiec służą ziarna pyłków graminae, jak np. Phleum pratense, Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus i inne. Po oczyszczeniu i wyizolowaniu naturalnych alergenów przeprowadza się N-terminalne sekwencjonowanie białka. W oparciu o wydedukowaną na tej podstawie sekwencję kwasu nukleinowego konstruuje się primer. Za pomocą tego primeru z populacji c-DNA techniką PCR otrzymuje się odpowiednie c-DNA, klonuje się je oraz charakteryzuje. Według wynalazku fragmenty i częściowe sekwencje otrzymuje się z molekuły DNA kodującej ten alergen. Po ekspresji rekombinowanej molekuły DNA względnie fragmentu i częściowej sekwencji za pomocą odpowiedniego wektora ekspresji w systemie komórkowym oczyszcza się alergen względnie warianty hipoalergiczne względnie fragmenty.
Oczyszczanie naturalnych alergenów z pyłków traw tymotki przeprowadza się w procesie dwuetapowym. Ekstrakt otrzymany po wodnej ekstrakcji pyłku rozdziela się za pomocą chromatografii z oddział ywaniami hydrofobowymi na dwie frakcje; frakcj ę przesą czu oraz eluat. Przesą cz zawiera trzy alergeny, Phl p1 (30-35 kDa), Phl p 2/3 (11-14 kDa) oraz nieznany alergen (55-60 kDa). Białka te rozdziela się od siebie techniką chromatograficzną przez filtrację żelową, stosując wypełnienie Superdex 75.
Wymieniony nowy alergen Phl p 13 (roboczo oznaczony p55) wydziela się za pomocą SDSPAGE, nanosi się na błonę z difluorku poliwinylu (PVDF) oraz izoluje się w postaci ściśle zdefiniowanej frakcji. Następnie molekułę poddaje się N-terminalnemu sekwencjonowaniu aminokwasów metodą degradacji Edmana (rysunek fig. 2).
W celu otrzymania i klonowania c-DNA odpowiadają cego p55 wedł ug wynalazku w oparciu o sekwencję N-terminalną (rysunek fig. 3) konstruuje się specyficzny primer DNA (21 członowy mer). Jako drugi primer używa się sekwencji kotwiczącej, która zlokalizowana jest w primerze oligo-dT używanym do odwrotnej transkrypcji.
Stosując c-DNA, które otrzymuje się z reprezentatywnej populacji m-RNA z pyłków Phleum pratense oraz primerów według wynalazku oraz primerów kotwiczących przeprowadza się reakcję PCR w ściśle kontrolowanych warunkach. Amplifikat otrzymany w reakcji PCR poddany analizie w analitycznym urządzeniu do elektroforezy żelowej wykazuje rozmiar 1,65 kb. Amplifikat ten umieszcza się (przez ligację) w wektorze pCR2.1 oraz poddaje się transformacji. Sekwencjonowanie insercji przez dwa różne klony dają identyczne wyniki sekwencji. W wymienionym pierwszorzędowym amplifikacie zidentyfikowano ramkę odczytu (ORF) o rozmiarze 1492 bp (por. rysunek fig. 1).
W celu otrzymania z wymienionego kwasu nukleinowego odpowiedniego rekombinowanego białka (rysunek fig. 4) przeprowadza się następnie klonowanie wektora pCR2.1 za pomocą enzymów restrykcyjnych do wektora ekspresji pProEx Htb. Po ekspresji oraz oczyszczaniu biochemicznym produktów ekspresji przeprowadza się wiele analiz otrzymanych białek pod kątem ich właściwości alergo4
PL 201 818 B1 logicznych. Przeprowadzone analizy np. Western Blot i Dot blot wykazały, że rekombinowane białka reagują specyficznie z IgE pacjentów, u których stwierdzono kliniczne symptomy alergii na pyłki traw. Jako kontrolę stosuje się naturalne p55. Tak więc bez wątpienia w przypadku rekombinowanego białka chodzi o alergen. Ten produkt ekspresji stosowany może być w ulepszonej wysoce specyficznej diagnostyce alergii pyłków traw.
Ściśle zdefiniowane fragmenty oraz kombinacje częściowych sekwencji opracowano według wynalazku wychodząc z kwasów nukleinowych klonowanych w wektorach ekspresji. Celem było otrzymanie hipoalergicznych wariantów do ulepszonych zastosowań terapeutycznych. Ponadto wprowadzano selektywne względem miejsca punktowe mutacje, przeważnie w tryplecie kodującym cysteinę. Preparaty według tej części wynalazku wyróżniają się więc względem części wynalazku, która dotyczy celów diagnostycznych, obniżoną reaktywnością względem IgE lub też całkowitym brakiem takiej reaktywności. Tak więc opracowano preparaty do odczulania, w których w oczywisty sposób obserwuje się niższe efekty uboczne, lub też efektów takich w ogóle nie obserwuje się. W wypadku kiedy hipoalergiczne warianty białek kodujących kwasy nukleinowe lub niemodyfikowane kwasy nukleinowe, które kodują p55, podda się ligacji z ludzkim wektorem ekspresji, otrzymane konstrukty mogą również być stosowane jako preparaty do specyficznej immunoterapii.
Istotą wynalazku jest:
a) Rekombinowana molekuła DNA, charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową alergenu Phl p 13 z Phleum pratense jak przedstawiono na rysunku fig. 1 (SEQ ID No. 1) i koduje alergen Phl p 13 z Phleum pratense;
b) Molekuła DNA, charakteryzująca się tym, że ma sekwencję nukleotydową, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej alergenu Phl p 13 z Phleum pratense zdefiniowaną powyżej;
c) Rekombinowany wektor ekspresyjny DNA lub system klonowania zawierający rekombinowaną molekułę DNA, charakteryzujący się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową alergenu Phl p 13 z Phleum pratense przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID No. 1), funkcjonalnie połączoną z kontrolną sekwencją ekspresyjną;
d) Naturalny alergen Phl p 13 z Phleum pratense, charakteryzujący się tym, że jest kodowany przez kwas nukleinowy zdefiniowany w punkcie a);
e) Rekombinowany alergen Phl p 13 z Phleum pratense, charakteryzujący się tym, że jest kodowany przez kwas nukleinowy zdefiniowany w punkcie a);
f) Sposób otrzymywania rekombinowanego alergenu Phl p 13 z Phleum pratense, charakteryzujący się tym, że hoduje się komórki prokariotyczne lub eukariotyczne, które poddano transformacji z wykorzystaniem wektora ekspresyjnego zdefiniowanego w punkcie c), a rekombinowany alergen Phl p 13 wyodrę bnia się z kultury komórek;
g) Sposób diagnozy alergii na pyłki kwiatowe in vitro, charakteryzujący się tym, że obejmuje zastosowanie naturalnego bądź rekombinowanego alergenu Phl p 13 z Phleum pratense zdefiniowanego w punkcie d) lub e);
h) Preparat farmaceutyczny, charakteryzujący się tym, że zawiera naturalny bądź rekombinowany alergen Phl p 13 z Phleum pratense, do terapii alergii na pyłek u ludzi lub zwierząt zdefiniowanego w punkcie d) lub e);
i) Zastosowanie rekombinowanego wektora ekspresyjnego DNA lub systemu klonowania zdefiniowanego w punkcie c) do wytwarzania leku do przeprowadzania szczepienia DNA w terapii alergii na pyłek u ludzi lub zwierząt.
Wynalazek odnosi się więc do ulepszenia diagnostyki in vitro w ramach identyfikacji (wraz z wyjaśnieniem komponentów alergenowych) widma uczuleniowego specyficznego dla pacjenta. Ponadto wynalazek odnosi się do otrzymywania zdecydowanie ulepszonych preparatów do specyficznej immunoterapii alergii na pyłki traw.
PL 201 818 B1
SEGUENZPROTOKOLL
[0020] <110> Merck Patent GmbH <120> DNA-Sequenz und rekombinante Herstellung eines Graminaen-Allergens <130> DNA-Sequenz <140>
<141 >
<160>4 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211>1187 <212> DNA <213> Gramineae <400> 1
PL 201 818 B1 gggaagaagg aggagaagaa ggaggagaag aaggagagtg gagatgctgc gtccggggcc 60 gacggaacct acgacatcac caagctcggc gccaaacccg acggcaagac ggactgeacc 120 aaggaggtgg aggaggcatg ggcttcggct tgcggtggta ccgggaagaa tacgatcgtc 180 atccccaagg gtgatttcct gaccgggcct ctgaatttca ccgggccatg caagggcgac 240 agcgtcacca tcaagctgga cggcaacctg ctgagctcca acgacctggc caagtacaag 300 gctaactgga tcgagatcaŁ gcggatcaag aaactcacta tcaccggcaa aggcacgctc 360 gacggccaag gcaaggccgt gtggggcaag aacagctgcg ccaagaacta caactgcaag 420 atcttgccaa acacattggt gctggacttc tgtgacgacg ctctcatcga aggcatcacc 480 ctcctaaacg ccaagttctt ccatatgaac atctacgagt gcaagggcgt gaccgtcaag 540 gacgtgacca tcaccgcgcc cggggacagc cocaacaccg acggcatcca catcggcgac 600 tcgtccaagg tcaccatcac cgacaccacc atcggcaccg gcgacgactg catctccatc 660 ggccccggaa gcaccggcct caacatcacc ggcgtgacct gcggtccagg ccacggcatc 720 agcgttggca gcctgggacg gtacaaggac gagaaggacg tgaccgacat oaccgtaaag 780 aactgcgtgc tcaagaagto caccaacggc ctccggatca agtcgtacga ggacgccaag 840 tcgccgctga cggcgtcgaa gctgacctac gagaacgtga agatggagga cgtgggctac 900 cccatcatca tcgaccagaa gtactgcccc aacaagatct gcacctccaa gggagactcc 960 gccagggtca ccgtcaagga cgtcaccttc cgcaacatca ccggcacctc ctccaccccc 1020 gaggccgtca gcctgctctg ctccgacaag cagccctgca atggtgtcac catgaacgac 1080 gtcaagatcg agtacagcgg caccaacaac aagaccatgg ctgtctgcac caacgccaag 1140 gtcaccgcca agggtgtcag cgaggctaac acctgcgccg cctgatg 1187 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Kijnstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kiinstlichen Seguenz; p55 spezifischer primer <400> 2
Gly Lys Lys Glu Glu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Glu Ser Gly Asp Ala 15 10 15
Ala Ser Xaa Ala 20 <210> 3 <211> 26 <212>DNA <213> Kijnstliche Sequenz <220>
<223> Beschreibung der kiinstlichen Sequenz:p55 spezifischer primer <220>
<221 > variation <222> (3) <223> rt = Inosine
PL 201 818 B1 <220>
<221 > variation <222> (6) <223> π = Inosine <220 <221 > variation <222>(9) <223> η = Inosine <220 <221 > variation <222> (12) <223> η - Inosin <220>
<221 > variation <222> (15) <223> η - Inosin <220 <221 > variation <222> (18) <223> η = Inosine <220 <221 > variation <222> (21) <223> η = Inosine <220 <221 > variation <222> (24) <223> η = Inosine <400> 3 ggnaanaang anganaanaa nganga 26 <2104 <211> 394 <212> PRT <213> Gramineae <400 4
PL 201 818 B1
PL 201 818 B1
Gly Lys ' 130 Asn Ser Cys Ala Lys 135 Asn Tyr Asn Cys Lys 140 Ile Leu Pro Asn
Thr Len Val Leu Asp Phe cys Asp Asp Ala Leu Ile Glu Gly Ile Thr
14 5 150 155 160
Leu Leu Asn Ala Lys Phe Phe His Met Asn Ile Tyr Glu Cys Lys Gly
165 170 175
Val Thr Val Lys Asp Val Thr Ile Thr Ala Pro Gly Asp Ser Pro Asn
180 185 190
Thr Asp Gly Ile His Ile Gly Asp Ser Ser Lys Val Thr Ile Thr Asp
195 200 205
Thr Thr Ile Gly Thr Gly Asp Asp Cys Ile Ser Ile Gly Pro Gly Ser
210 215 220
Thr Gly Leu Asn Ile Thr Gly Gly Ala Cys Gly Pro Gly His Gly Ile
225 230 235 240
Ser Val Gly Ser Leu Gly Arg Tyr Lys Asp Glu Lys Asp Val Thr Asp
24 5 250 255
Ile Thr Val Lys Asn Cys Val Leu Lys Lys Ser Thr Asn Gly Leu Arg
2 60 265 270
Ile Lys Ser Tyr Glu Asp Ala Lys Ser Pro Leu Thr Ala Ser Lys Leu
275 280 285
Thr Tyr Glu Asn Val Lys Met Glu Asp Val Gly Tyr Pro Ile Ile Ile
2 30 235 300
Asp Gin Lys Tyr Cys Pro Asn Lys Ile Cys Thr Ser Lys Gly Asp Ser
305 310 315 320
Ala Arg Val Thr Val Lys Asp Val Thr Phe Arg Asn Ile Thr Gly Thr
325 330 335
Ser Ser Thr Pro Glu Ala Val Ser Leu Leu Cys Ser Asp Lys Gin Pro
340 345 350
Cys Asn Gly Val Thr Met Asn Asp Val Lys Ile Glu Tyr Ser Gly Thr
355 360 365
Asn Asn Lys Thr Met Ala Val Cys Thr Asn Ala Lys Val Thr Ala Lys
370 375 380
Gly Val Ser Glu Ala Asn Thr Cys Ala Ala 385 390 .

Claims (9)

1. Rekombinowana molekuła DNA, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową alergenu Phl p 13 z Phleum pratense jak przedstawiono na rysunku fig. 1 (SEQ ID No. 1) i koduje alergen Phl p 13 z Phleum pratense.
2. Molekuła DNA, znamienna tym, że ma sekwencję nukleotydową, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej alergenu Phl p 13 z Phleum pratense zdefiniowanej w zastrz. 1.
3. Rekombinowany wektor ekspresyjny DNA lub system klonowania zawierający rekombinowaną molekułę DNA, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową alergenu Phl p 13 z Phleum pratense przedstawioną na rysunku fig. 1 (SEQ ID No. 1) i zdefiniowaną w zastrz. 1, funkcjonalnie połączoną z kontrolną sekwencją ekspresyjną.
4. Naturalny alergen Phl p 13 z Phleum pratense, znamienny tym, że jest kodowany przez kwas nukleinowy zdefiniowany w zastrz. 1.
5. Rekombinowany alergen Phl p 13 z Phleum pratense, znamienny tym, że jest kodowany przez kwas nukleinowy zdefiniowany w zastrz. 1.
6. Sposób otrzymywania rekombinowanego alergenu Phl p 13 z Phleum pratense, zdefiniowanego w zastrzeżeniu 5, znamienny tym, że hoduje się komórki prokariotyczne lub eukariotyczne, które poddano transformacji z wykorzystaniem wektora ekspresyjnego zdefiniowanego w zastrz. 3, a rekombinowany alergen Phl p 13 wyodrębnia się z kultury komórek.
7. Sposób diagnozy alergii na pyłki kwiatowe in vitro, znamienny tym, że obejmuje zastosowanie naturalnego bądź rekombinowanego alergenu Phl p 13 z Phleum pratense zdefiniowanego w zastrz. 4 lub 5.
8. Preparat farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera naturalny bądź rekombinowany alergen Phl p 13 z Phleum pratense zdefiniowany w zastrz. 4 lub 5, do terapii alergii na pyłek u ludzi lub zwierząt.
9. Zastosowanie rekombinowanego wektora ekspresyjnego DNA lub systemu klonowania zdefiniowanego w zastrz. 3 do wytwarzania leku do przeprowadzania szczepienia DNA w terapii alergii na pyłek u ludzi lub zwierząt.
PL356055A 1999-04-23 2000-04-12 Sekwencja DNA oraz sposób rekombinacyjnego otrzymywania alergenów graminae PL201818B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19918682A DE19918682A1 (de) 1999-04-23 1999-04-23 DNA-Sequenz und rekombinante Herstellung eines Graminaen-Allergens
PCT/EP2000/003259 WO2000065060A2 (de) 1999-04-23 2000-04-12 Dna-sequenz und rekombinante herstellung eines graminaen-allergens

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL356055A1 PL356055A1 (pl) 2004-06-14
PL201818B1 true PL201818B1 (pl) 2009-05-29

Family

ID=7905749

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL356055A PL201818B1 (pl) 1999-04-23 2000-04-12 Sekwencja DNA oraz sposób rekombinacyjnego otrzymywania alergenów graminae

Country Status (15)

Country Link
US (1) US7241450B1 (pl)
EP (1) EP1171604B1 (pl)
JP (1) JP4588888B2 (pl)
CN (1) CN1203179C (pl)
AT (1) ATE338126T1 (pl)
AU (1) AU781275B2 (pl)
CA (1) CA2370393C (pl)
CZ (1) CZ20013796A3 (pl)
DE (2) DE19918682A1 (pl)
ES (1) ES2270828T3 (pl)
HU (1) HUP0200883A2 (pl)
PL (1) PL201818B1 (pl)
PT (1) PT1171604E (pl)
RU (1) RU2238321C2 (pl)
WO (1) WO2000065060A2 (pl)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19939982A1 (de) 1999-08-24 2001-03-01 Merck Patent Gmbh Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Gräserpollenallergenen
AUPR779201A0 (en) * 2001-09-20 2001-10-11 University Of Melbourne, The Immunotherapeutic and immunoprophylactic reagents
SE0200946D0 (sv) * 2002-03-27 2002-03-27 Pharmacia Diagnostics Ab Novel Allergen
EP2272863B1 (de) 2003-06-04 2012-10-31 Merck Patent GmbH Poa p 5-Derivate mit reduzierter Allergenität und erhaltener T-Zellrealktivität
JP5871818B2 (ja) * 2010-01-14 2016-03-01 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ プロリン残基の突然変異誘発により低減したアレルゲン性を有するイネ科のグループ６アレルゲンの変異体

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5736362A (en) * 1990-10-26 1998-04-07 The University Of Melbourne Ryegrass pollen allergen

Also Published As

Publication number Publication date
RU2238321C2 (ru) 2004-10-20
WO2000065060A3 (de) 2001-03-01
US7241450B1 (en) 2007-07-10
CN1351664A (zh) 2002-05-29
HUP0200883A2 (hu) 2003-07-28
CN1203179C (zh) 2005-05-25
JP2002542783A (ja) 2002-12-17
WO2000065060A2 (de) 2000-11-02
AU781275B2 (en) 2005-05-12
AU4547700A (en) 2000-11-10
ATE338126T1 (de) 2006-09-15
PT1171604E (pt) 2007-01-31
PL356055A1 (pl) 2004-06-14
EP1171604A2 (de) 2002-01-16
EP1171604B1 (de) 2006-08-30
CZ20013796A3 (cs) 2002-01-16
CA2370393A1 (en) 2000-11-02
ES2270828T3 (es) 2007-04-16
JP4588888B2 (ja) 2010-12-01
DE50013400D1 (de) 2006-10-12
DE19918682A1 (de) 2000-10-26
CA2370393C (en) 2010-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ferreira et al. Modulation of IgE reactivity of allergens by site‐directed mutagenesis: potential use of hypoallergenic variants for immunotherapy
US9789178B2 (en) DNA sequence, and recombinant preparation of the grass pollen allergen Lol p 4
JP5363441B2 (ja) 低減したアレルギー誘発性および保持されたＴ細胞反応性を有するＰｈｌｐ５ａ誘導体
US20170246317A1 (en) Dna sequence, and recombinant preparation of group 4 major allergens from cereals
PL201818B1 (pl) Sekwencja DNA oraz sposób rekombinacyjnego otrzymywania alergenów graminae
RU2409589C2 (ru) ВАРИАНТ АЛЛЕРГЕНА ГРУППЫ I ИЗ Роасеае, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИЙСЯ СНИЖЕННОЙ АЛЛЕРГЕННОСТЬЮ И СОХРАНЕННОЙ Т-КЛЕТОЧНОЙ РЕАКТИВНОСТЬЮ (ВАРИАНТЫ), КОДИРУЮЩАЯ ЕГО МОЛЕКУЛА ДНК И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
RU2327739C2 (ru) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК И ПОЛУЧЕНИЕ АЛЛЕРГЕНА ПЫЛЬЦЫ ТРАВ Phl p 4 С ПОМОЩЬЮ РЕКОМБИНАНТНЫХ СПОСОБОВ
AU2012205288B2 (en) DNA-sequence and recombinant production of group 4 major allergens from cereals
JP2008504004A5 (pl)
AU2013204574B2 (en) DNA-sequence and recombinant production of group 4 major allergens from cereals