JP5542685B2 - 新規な小麦アレルゲン - Google Patents
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Description
テーブルIは、パン屋喘息に苦しむ患者の個体群統計学的、臨床的および血清学的特徴を示す。
下記の実施例は、本発明のポリペプチドの単離および使用を含む本発明を例示する。その実施例は単に例示であり、添付された特許請求の範囲によって定義される本発明の制限と考えられるべきでない。実施例に言及したクローン番号123は、例えば、米国第7,214,786号から公知のプロフィリンである。
実施例1は、他のプロテアーゼインヒビターと一緒に、病変形成関連タンパク質(PR)のファミリーPR6と呼ばれるセリンプロテアーゼインヒビターのあるファミリーのジャガイモインヒビターファミリーに属する、新規な小麦種子アレルゲンのクローン番号10の同定およびキャラクタリゼーションを示す。クローン番号10は、PR6ファミリーにつき同定および記載された最初のアレルゲンである。さらに、実施例1は、組換えクローン10由来アレルゲンの発現および精製を示す。
生体物質、患者の血清および抗体
トリーティクム・アエスティウム栽培品種マイケルからの小麦種子をOsterreichische Agentur fur Gesundheit und Ernahrungssicherheit GmbHから得て、温室で植えた。未成熟種子は、受粉開始7、10、15、20、25、30および35日後に直接的に液体窒素に収集し、使用まで−80℃で貯蔵した。小麦花粉はAllergon (Valinge, Sweden)から得た。米、トウモロコシ、豆およびジャガイモは地方市場で購入した。組換えPhl p 1、Phl p 5、Phl p 7およびPhl p 12は、BIOMAY (Vienna, Austria)から、ヒト血清アルブミン(HSA)は、Behring (Marburg, Germany)から購入した。血清はパン屋喘息に苦しむ22名の患者から得た。パン屋喘息は、陽性の病歴、CAP−FEIA System (Phadia, Uppsala, Sweden)による小麦およびライ麦粉に特異的なIgE、および臨床的に関連する感作の確認のために含まれた特定の吸入負荷試験に基づいて診断された(1)。これらの患者の個体群統計学的、臨床的によび血清学的データをテーブルIに要約する。加えて、非アレルギー性の個体からの血清、小麦に対する食物アレルギーに苦しむ4名の患者からの血清、およびパン屋喘息はないが、小麦およびライ麦粉に対する血清IgEがある4名の草花粉アレルギー患者からの血清を実験に含んだ(テーブルII)。草花粉アレルギー患者からの血清をCAP-FEIA System (Phadia)により合計の血清IgEレベルおよびIgE特異的オオアワガエリ花粉につき分析し、小麦に対する食物アレルギーを持つ患者を従前に記載されたように特徴付けした(2)。パン屋喘息についてのクローン10由来アレルゲンの特異性は、セリアック病患者からのさらなる20の血清、食物アレルギーの患者からの119、草花粉アレルギー患者からの23の血清、およびパン屋喘息患者からの25の血清をチップ分析(Constantinら、未発表)によりテストすることにより確認した。クローン10由来アレルゲンに対する特異的なウサギ抗体は、1回のフロイト完全アジュバントおよび2回のIFA(Charles River, Kisslegg, Germany)を用いて、精製したクローン10由来アレルゲン(1注入当たり200μg)で毎月の間隔でウサギの免疫処置により産生させた。前免疫血清は免疫処置前にウサギから得た。対照目的では、イエダニ・アレルゲンに特異的なウサギ免疫血清、および小麦プロフィリンに特異的なウサギ抗血清を用いた。
総RNAを小麦種子からYeh(3)により抽出し、受粉開始25日後に収集して−80℃で貯蔵した。次いで、RNAペレットをイソチオシアン酸グアニジニウム緩衝液(4Mイソチオシアン酸グアニジニウム、0.83%v/v 3M酢酸ナトリウム、pH 6、11mM β−メルカプトエタノール)に溶解し、塩化セシウム密度勾配超遠心(4)によって精製した。ポリA+RNAは、オリゴ−dTセルロース・アフィニティークロマトグラフィー(Nucleo Trap mRNA; Machery-Nagel)によって単離し、二本鎖cDNAをcDNA合成キット(cDNA synthesis System; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)で合成した。EcoRIメチラーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)でメチル化後、EcoRIリンカー(New England Biolabs)をcDNAに加えた。リンカーcDNAをEcoRI(Roche Diagnostics)で消化した。消化したリンカーをNickカラム(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)で取り出し、そのcDNAをλgt11アーム(Stratagene, La Jolla, CA, USA)に連結した。連結反応生成物をin vitroにて充填し(Gigapack III Gold Cloning Kit, Stratagene)、その結果、2.43×106PFUでλgt11発現cDNAライブラリーを得た。
E.coli Y1090を、組換えファージの7×105 PFUに感染させ、記載のごとく、パン屋喘息に苦しむ4名の患者(番号1、番号2、番号4、番号12)の血清IgEで免疫スクリーニングした(5)。15個のIgE反応性のファージクローンをさらなる再クローニングのために選択し、それらのDNAをλgt11プライマーでPlatinum PCR Supermix (Invitrogen, Life Technolgies)を用いてPCR増幅し、配列決定(MWG, Ebersberg, Germany)した。得られた配列は、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI, National Center for Biotechnology Information)のGenBankデータベースに提出された配列と比較した。複数配列アラインメントをNCBIのGenBankデータベースを用いて行なった。アミノ酸配列同一性について、Clustal Wの複数配列ツールを用いた。モチーフ探索はExPASyプロテオミクスサーバーのPROSITEツールで行い、アミノ酸組成については、ExPASyのProtParamツールを用いた。溶媒露出度および二次構造の予測は、コロンビア大学バイオインフォマティクス・センター(Columbia University Bioinformatics Center)からのPROTソフトウェアを用いて計算した。系統樹は、分子遺伝学用のMax Planck Institute for Molecular Geneticsによって提供された「Multiple Alignment and Phylogenetic Tree Reconstruction」ソフトウェアを用いて、クローン10由来アレルゲンおよび相同蛋白質のアミノ酸配列に基づいて再構築した。
クローン10cDNAのコード領域を以下のプライマー対:
クローン10由来アレルゲンを、5μg/mlの濃度でPBSに溶解し、ELISAプレート(Nunc Maxisorb, Roskilde, Denkmark)上に被覆した。PBS、0.05%(v/v)のTween20(PBST)中の1%(w/v)のBSAでブロックした後、プレートは、(6)記載のごとく、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4の測定のために、PBST、0.5%(w/v)のBSA中で1:50に希釈した血清とインキュベートした。従前に(2)記載のごとく、結合した抗体を、最初にPBST、0.5%(w/v)BSA中で1:1000に希釈したモノクローナルマウス抗ヒトIgGサブクラス抗体(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)で、次いで、PBST、0.5%(w/v)BSA中で1:2000に希釈したホースラディシュ・ペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス抗血清(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)でインキュベートすることにより検出した。全ての測定は、2連として行い、結果を平均値として示す。
成熟および未成熟小麦種子、米(Oryza sativa)、トウモロコシ(Zea mays)、一般的な豆(Phaseolus vulgaris)およびジャガイモ(Solanum tuberosum)からのSDSタンパク質抽出物を32mlの試料緩衝液(6)中の3グラムの組織のホモジナイズ、引き続いて、10分間煮沸により調製した。不溶性粒子を除去するために、抽出物を4℃にて10分間10,000×gで遠心し、上清を−20℃のアリコートとして貯蔵した。加えて、小麦種子からのPBSタンパク質抽出物を従前に(2)記載のごとく調製した。トリーティクム・アエスティウム花粉(500mg)を5mlのPBS、2mM EDTA、1mM PMSF中で一晩4℃で抽出した。13,000×g、4℃の1時間の遠心後、上清のタンパク濃度をMicro BCA Protein Assay Kit (Pierce)で測定し、アリコートを使用まで−20℃で貯蔵した。等量のSDSタンパク質抽出物を14%分取用SDSポリアクリルアミドゲルによって分離した(7)。タンパク質分子量マーカー(Rainbow Marker, GE Healthcare; Precision Plus Protein Standard, BioRad, Herkules, CA; Page Ruler Pre-stained Protein Ladder, Fermentas, Burlington, Ontario)を標準として用いた。電気泳動分離の後、タンパク質をクーマシーブリリアントブルーで染色するか、またはニトロセルロース膜(Schleich & Schuell, Dassel, Germany))上にブロットした(8)。膜を緩衝液A(50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、0.5%w/v BSA、0.5%v/vTween−20、0.05%w/v NaN3)中で10分間で2回および30分間で1回ブロックし、クローン10由来アレルゲンに特異的なウサギ抗血清、対応する前免疫血清、および対照目的のために、無関係の抗原に特異的なウサギ血清または緩衝液単独と4℃にて一晩インキュベートした。ウサギ血清を緩衝液A中で1:50,000に希釈した。結合した抗体を、緩衝液A中で1:2000に希釈した125I標識したロバからの抗ウサギ抗体(GE Healthcare)で2時間室温にて検出し、−70℃で増感紙(Kodak, Heidelberg, Germany)でKodak XOMATフィルムに視覚化した。
レーザー脱離質量スペクトルは、TOF Compact MALDI II instrument (Kratos, Manchester, UK; piCHEM, Research and Development, Graz, Austria)で線形モードで取得した。試料を10%アセトニトリル(0.1%トリフルオロ酢酸)に溶解し、α−シアノ−4ヒドロキシ桂皮酸(60%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸に溶解した)をマトリックスとして用いた。試料調製のために、タンパク質およびマトリックス溶液の1/1の混合物を標的上に沈着させ、空気乾燥した。
IgE Ab媒介即時型反応の定量化のために、huRBL細胞媒介物質放出アッセイを行った。ヒトFcεRI(10)でトランスフェクトしたRBL細胞(クローンRBL−703/21)を、5% FCS、4mM L−グルタミンおよび1mg/mlのG418硫酸塩を補足したRPMI 1640中で培養した。細胞は、トリプシン/EDTAでインキュベーション後に収集し、洗浄し、培地に再懸濁させ、細胞濃度を2×106細胞/mlに調節した。細胞溶液の50μlのアリコートを、96ウェルの平底マイクロプレートのウェルに添加した(細胞密度/ウェルは1×105細胞であった)。ヒト血清を培地中で1:10に希釈し、細胞に添加し、37℃、7% CO2、95%相対湿度で一晩インキュベートした。培地を除去し、プレートをタイロード緩衝液+0.1% BSAの200μl/ウェルで3回洗浄した。IgE架橋では、50%のD2Oおよび0.1%(w/v)のBSAを含有するタイロード緩衝液中で希釈した100μlのクローン10由来アレルゲンまたはrPhl p 1(0.3μg/ml)を細胞に添加した。自発的な放出のために、タンパク質を含まないタイロード緩衝液をウェルに添加した。合計の放出は、10%トリトンX−100を含有するタイロード緩衝液の添加によって決定した。37℃、7% CO2、95%相対湿度での1時間のインキュベーション後に、細胞を遠心により収集し、50μlの上清を新しいプレートに移し、ウェル当たり50μlのアッセイ溶液(0.1Mクエン酸またはクエン酸ナトリウム、pH4.5および160μM 4−メチルウンベリフェリル−N−アセチル−β−D−グルコサミニドグルコサミニド)を添加した。さらにもう1時間のインキュベーション後、反応は、各ウェルに100μlグリシン緩衝液(0.2Mグリシン、0.2% NaCl、pH10.7)を添加することにより停止させた。蛍光をλex:360/λem:465で蛍光マイクロプレート・リーダで測定した。自発的な放出をトリトンX−100により溶解しなかった対照ウェルから決定した。特定の放出は、式:(試料−自発的/合計−自発的)×100を用いて計算した。
小麦の乾燥粒を鋭いカミソリ刀を用いて小片(約0.5mmサイズの立方体)に切った。細胞の乾燥状態を保存するために、その立方体をアクロレイン蒸気中で室温にて5日間無水的に固定した。それらは、いずれの残存する水も除去するために室温にて1日ジメトキシプロパン(DMP)に移し、中間体段階として、上昇系列のDMP:エタノールおよびエタノール:単量体Lowicryl K4Mを用いて、Lowicryl K4M樹脂に組み込んだ。重合は−35℃で行った。
切片は、酢酸ウラニル(5分間)およびクエン酸鉛(10秒間)を用いて染色した。
試料は、透過電顕EM 410(FEI, Eindhoven, The Netherlands)において分析した。
セリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンをコードする小麦cDNAの単離およびキャラクタリゼーション
小麦種子cDNA発現ライブラリーをパン屋喘息に苦しむ4名の患者からのIgE抗体でスクリーニングした。IgE反応性クローン10のcDNAの読み取り枠は、84個のアミノ酸のポリペプチドをコードする262個のヌクレオチドを含んでいた(図1)。9.4kDaの分子量および6.08の等電点(pI)が、クローン10由来アレルゲンにつき推定されたアミノ酸配列によって計算された。アミノ酸組成の分析は、高含量のバリン残基(15.5%)およびシステイン残基の不存在を示した。コンピューター支援二次構造分析により、クローン10由来アレルゲンは、主として、ランダムコイルおよびベータシート、および1つのアルファヘリックス領域から成る。溶媒露出度計算によれば、ほぼ80%のアミノ酸が溶媒露出される。配列モチーフの検索は、1つの潜在的なカゼインキナーゼIIリン酸化部位(アミノ酸32)、2つのN末端ミリストイル化部位(アミノ酸11および55)および1つのジャガイモインヒビターIファミリーサイン(図1:アミノ酸25〜36が箱で囲まれる)の存在を明らかにした。
クローン10由来アレルゲンは、C末端ヘキサヒスチジンタグを用いてE.coli BL21(DE3)中で発現した。セリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンの約25mg/Lの液体培養物をニッケルクロマトグラフィーによって精製できた(図2A)。精製した組換えタンパク質10のMALDI−TOF分析は、9970.8Daの質量ピークを生じた(図2B)。精製した組換えクローン10由来アレルゲンの遠紫外線CDスペクトル(図2C)は、タンパク質が折り畳まれ、相当な量のβ−シートおよび低いα−ヘリックス含量を含むことを示す。そのスペクトルは、204nmでの極小および190nmでの極大により特徴付けられる。参照データセット7でプログラムCDSSTRを用いる二次構造分析は、8%のα−ヘリックス、23%のβ−シート、14%のβ−折返しおよび53%のランダムコイルを与えた。0.033のNRMSD値は、計算したものと実験的に誘導したスペクトル間の良好な適合を示した。95℃への加熱に際して、極小のCDスペクトルのわずかなシフト(204nmから201nmまで)を観察し、これは、タンパク質の部分変性を示す。25℃への冷却に際して、タンパク質は再び折り畳まれた(図2C)。しかしながら、204nmの極小は加熱前より低く、これは、β−シート−の転位を示唆する。要約すると、温度走査中に観察されたスペクトルは、クローン10由来アレルゲンの高い熱安定性を示す。
精製したクローン10由来アレルゲンを、ドットブロット分析によってパン屋喘息、草花粉アレルギーおよび小麦に対する食物アレルギーに苦しむ患者からの血清を用いて、IgE反応性につきテストした(図3)。組換えクローン10由来アレルゲンは、パン屋喘息に苦しむ22名の患者のうち3名の患者(番号1、番号4、番号12)(13.6%)からのIgE抗体と反応した。主な小麦アレルゲン、アルファアミラーゼインヒビターに特異的なIgEの低レベルだけを有した患者番号1は、セリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンに対する強力なIgE反応性を示した。注目すべきことには、クローン10由来アレルゲンは、パン屋喘息の患者からのIgE抗体によって専ら認識されたが、小麦に対するIgE媒介食物アレルギーに苦しむ患者または草花粉アレルギーに苦しむ患者からのものでは認識されなかった。3つの各患者群からのいくつかの血清は、草花粉に対する共同感作により組換えオオアワガエリ花粉アレルゲンに対するIgE反応性を示した。パン屋喘息患者によるクローン10由来アレルゲンの特異的なIgE反応性は、セリアック病患者からのさらなる20の血清、食物アレルギーの患者からの119の血清、草花粉アレルギーの患者からの23の血清、およびパン屋喘息患者からの25の血清を用いて、チップ分析で確認した(Constantinら、未発表、データを示さず)。
クローン10由来アレルゲンに特異的なウサギ抗体を用いて、小麦種子成熟中のタンパク質の発現を調べた(図6)。種子成熟の異なる時点で採取された小麦種子からの抽出物を含有するニトロセルロースシートを、特異的なウサギ抗体および前免疫Igで探索した。クローン10−特異抗体は、セリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンの四量体を表わす40kDaのタンパク質と反応した(図6)(11)。そのタンパク質の発現は、15日齢の種子において検出できるようになり、種子のさらなる成熟中に増加し続けた(図6)。ブロットが、同じウサギからの前免疫Igとインキュベートされた場合には、免疫反応性は見い出されなかった(図6)。
花粉および種子を比較した場合、発明者らはセリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンが、種子中で優先的に発現される(図7)が、弱いシグナルだけが小麦花粉抽出物中の約65kDaにて得られることを見い出した。汎アレルゲンプロフィリンは、小麦種子および花粉中のウサギ抗小麦種子プロフィリン抗体で検出した(図7:番号123)。前免疫Igで反応性は見い出されなかった(図7)。
図9Aは、透過型電子顕微鏡における低倍率での小麦穀粒を介する超薄切片を示す。穀粒の主要な3つの形態成分:穀粒の外部の多層の果実および種皮(C)、デンプン層(AL)および多数の内部の始まり、デンプン質胚乳(SE)が明らかである。長方形は、B中に示された領域に匹敵する領域をマークする。図9Bは、より高倍率でのデンプン細胞および隣接するデンプン質胚乳の間の境界を示す。デンプン細胞は、小さな脂質小胞(L)に囲まれたデンプン穀粒(AG)(タンパク質液胞)で満たされる。双方の成分は細胞の細胞質基質に埋め込まれている。デンプン質胚乳は、無定形の細胞質物質の小さな間隙をまさに残して緊密に充填された可変サイズのデンプン穀粒から成る。長方形は、各々、C、DおよびE、Fにおける高倍率で示された領域を示す。図9Cは、小麦タンパク質10に対して産生されたAbsを用いてデンプン細胞中のクローン10由来アレルゲンの局在を示す。金粒子(矢印)は、細胞小器官間の細胞マトリックス中であるが、脂質小胞(L)の末梢部中での小麦タンパク質10の存在を主に示す。デンプン領域において、小麦タンパク質10は、デンプン粒(SG)間の無定形の細胞質物質(CY)と関連する(図9E)。免疫前Absでの対照実験は、非常に低い程度の非特異性の標識化を示した(図9、DおよびF)。
実施例2は、クローン番号10、番号37、番号38、番号112、番号123および番号126と命名された6種のIgEの反応性小麦種子アレルゲンの同定およびキャラクタリゼーションを示す。さらに、実施例2は、前記のクローンの組換えアレルゲンの発現および精製のための方法を示す。
トリーティクム・アエスティウム栽培品種マイケルからの小麦種子をOsterreichische Agentur fur Gesundheit und Ernahrungssicherheit GmbHから得て、温室で植えた。未成熟種子を受粉開始までの25日の期間の後に直接的に液体窒素に収集し、使用まで−80℃で貯蔵した。血清は、パン屋喘息に苦しむ24名の患者から得た(テーブルIV)。パン屋喘息は、CAP−FEIAシステム(Phadia, Uppsala, Sweden) により、特定の吸入負荷試験(1)後に、病歴、合計の血清IgEレベル、小麦およびライ麦に特異的なIgEに基づき診断した(図10)。草花粉アレルギー患者からの血清をCAP−FEIAシステム(Phadia)による合計血清IgEレベルおよびIgE特異的なオオアワガエリ花粉につき分析し、小麦に対する食物アレルギー患者を従前に記載のごとく特徴付けした(2)(図11)。これらの患者の臨床データをテーブルVにまとめる。対照目的のために、非アレルギー性の個体からの血清を実験に含めた。
Yeh[3]に従い、総RNAを−80℃で貯蔵した小麦種子から抽出した。次いで、RNAペレットをイソチオシアン酸グアニジニウム緩衝液(4Mイソチオシアン酸グアニジニウム、0.83%v/v 3M酢酸ナトリウム、pH6、0.11Mβ−メルカプトエタノール)に溶解し、塩化セシウム密度勾配超遠心によって精製した。ポリA+RNAは、オリゴ−dTセルロース・アフィニティークロマトグラフィー(Nucleo Trap mRNA; Machery-Nagel)によって分離し、二本鎖cDNAはcDNA合成キット(cDNA synthesis System; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を介して合成した。EcoRIメチラーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)でのメチル化の後、EcoRIリンカー(New England Biolabs)をcDNAで消化した。リンカーcDNAは、EcoRI(Roch Diagnostics)で消化した。消化したリンカーは、Nickカラム(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)で取り出し、cDNAをλgt11アーム(Stratagene, La Jolla, CA, USA)に連結した。連結反応生成物をin vitroにて充填し(Gigapack III Gold Cloning Kit, Stratagene)、その結果、2.43×106PFU(プラーク形成単位)のλgt11発現cDNAライブラリーを得た。
E.coli Y1090を組換えファージの7×105PFUで感染させ、記載のごとくパン屋喘息に苦しむ4名の患者(番号1、番号2、番号5、番号13)の血清IgEで免疫スクリーニングした[5]。6つのIgE反応性ファージクローンをさらなる再クローニングのために選択し、それらのDNAをλgt11プライマーでのPlatinum PCR Supermix (Invitrogen, Life Technolgies)を用いてPCR増幅し、配列決定した(MWG, Ebersberg, Germany)。得られた配列は、全米バイオテクノロジー情報センター (NCBI)でのGenBankデータベースに提出された配列と比較した。
そのクローンのコード領域は、テーブルVIにリストしたプライマーを用いるPCRによって増幅した。PCR生成物は、AccepTor Vector (Novagen, Madison, WI) にサブクローンし、再度で配列決定した(MWG)。次いで、挿入断片を含むAccepTorベクターをNdeIおよびEcoRI(Roche Diagnostics)で消化し、挿入断片をゲル精製(Promega, Madison, WI, USA)し、発現プラスミドpET 17b(Novagen)にサブクローンした。DNA配列は双方のDNA鎖を配列決定することにより確認した(Microsynth, Balgach, CH)。pET 17b−挿入断片構築体をE.coli BL21(DE3)(Stratagene)に形質転換し、0.8〜1のOD(600nm)まで、37℃で100mg/lのアンピシリンを含有するLuria Broth (LB)培地中で増殖させた。タンパク質発現は0.5mMの最終濃度までイソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加によって誘導し、さらに3時間細菌を増殖させた。次いで、細菌を遠心分離によって収集し、Ultraturrax (IKA, Stauffen, Germany)で25mMイミダゾール、pH7.5、0.1%(v/v)トリトンX−100中でホモジナイズした。DNAはDNアーゼIの添加によって消化し、20℃でさらに10分間撹拌し、200μlの5M NaClで停止し、次いで、4℃(6000g、20分間)で遠心した。クローン10由来アレルゲンは、QIAexpressionist handbook, protocol 17 (QIAGEN, Hilden, Germany)によるNi−NTA樹脂アフィニティカムでの変性条件下、封入体含有ペレットから精製した。組換えアレルゲンを含む画分をプールし、10mM NaH2PO4 pH7.5に対して透析した。組換えタンパク質番号37、番号38、番号112、番号123および番号126を、QIAexpressionist handbook, protocol 12 (QIAGEN)によるNi−NTA樹脂アフィニティカムでの在来条件下で細菌可溶化液のペレットから精製した。組換えタンパク質を含有する画分をプールし、10mM NaH2PO4 pH7.5に対して透析した。タンパク質試料は14%のSDS−PAGEゲル上での純度につき分析し、クーマシーブリリアントブルー染色によって視覚化した。タンパク濃度は Micro BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL)で決定した。
実施例3は、実施例2に記載のごとく調製したその組換え小麦種子アレルゲンを明らかにするアレルゲンマイクロアッセイが、パン屋喘息患者からの血清IgEによって特異的に認識されるが、小麦に対する食物アレルギーまたは草花粉アレルギーの患者からのものでは特異的に認識されないことを示す。従って、組換えアレルゲンは小麦粉に対する呼吸アレルギーに特異的である。さらに、実施例3は、呼吸アレルギーのin vitro診断の改良のための配列におけるオオアワガエリ花粉のマーカーアレルゲンphl p1およびPhl p 5および小麦花粉の使用を示す、
患者および血清
血清は、パン屋喘息に苦しむスペイン人患者(B1〜B23)、小麦誘発食物アレルギーに苦しむオーストリア人患者(F1〜F26)およびドイツ人患者(F27〜F38)ならびに草花粉アレルギーに苦しむオーストリア人患者(G1〜G17)から得た。患者は、陽性の病歴、パン屋喘息のケースにおける臨床的に関連する感作の確認のための特異的吸入負荷試験(1)、ならびに小麦に対する食物アレルギーの幼児患者における二重盲検プラセーボコントロールされた食物負荷(DBPCFC)によって選択した。すべての患者からの血清は、CAP−FEIAシステム(Phadia, Uppsala, Sweden)による合計の血清IgEレベルならびに小麦粉およびオオアワガエリ花粉に特異的なIgEにつき分析した。これらの患者の個体群統計学的、臨床的および血清学的なデータをテーブルVII、VIIIおよびIXに要約する。対照目的については、健康な個体からの血清をすべての実験に含めた。
パン屋喘息患者からの血清でスクリーニングすることにより、cDNAライブラリーから誘導された組換え小麦タンパク質番号10、番号37、番号38、番号112、番号123および番号126をE.coli中で発現させ、記載のごとく精製した(12)。小麦花粉は、Allergon (Vallinge, Sweden)から購入し、組換えPhl p 1、Phl p 5、Phl p 7、Phl p 12は、BIOMAY (Vienna, Austria)から購入した。
トリーティクム・アエスティウム花粉(500mg)は5ml PBS、2mM EDTA、1mM PMSF中で4℃にて一晩抽出した。13,000×g 4℃にて1時間遠心分離後、上清のタンパク濃度をMicro BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL)で測定し、アリコートは使用まで−20℃で貯蔵した。
小麦花粉抽出物、1〜1.5ng/スポット、組換えでかつ精製した小麦タンパク質および組換え草花粉アレルゲン、0.1〜0.15ng/スポットを、記載のごとく、顕微鏡スライドガラスに付けられたニトロセルロース膜上のNano Plotter NP2(Gesellschaft fuer Silizium-Mikrosysteme mbH, GroBerkmannsdorf, Germany)で点在させた(13)。精製したヒトIgEは、位置マーカーとして用いた(14)。点在させたマイクロアレイは、30μlのアッセイ緩衝液(弱リン酸緩衝液、pH7.5)で予め洗浄させ、アレルギー患者または対照からの30μlの希釈されていない血清とインキュベートした。30μlのアッセイ緩衝液での洗浄後、結合したIgE抗体を20μlのフルオロフォア結合抗IgE抗体で検出し、蛍光強度(FI)を635nm(GenePix 4000B fran Axon)の波長にて測定した。カットオフレベルは、ヒト血清アルブミンで得られた値に基づいてFI=300にセットした。
患者の記載
発明者らは、パン屋喘息、小麦誘発食物アレルギーまたは草花粉アレルギーに苦しむ患者を分析した。パン屋喘息患者の群は、小麦粉に職業的に曝露する23名(4名の女性、19名の男性:平均年齢39歳、22〜60歳の範囲)から成った。パン屋喘息患者の91パーセントは、小麦粉の吸入による喘息に苦しみ、94%は鼻結膜炎の症状を訴えた。他の呼吸アレルゲン源(例えば、ネコ、ゴキブリ、イヌ、草花粉、ウマ、イエダニ、カビおよび/またはオリーブ花粉)に対する感作は、パン屋喘息患者の70%および草花粉アレルギーに苦しむ患者の48%に判明した(テーブルVII)。注目すべきことには、食物に対するアレルギーを示すパン屋喘息患者はなく、症状は呼吸徴候に制限された。
番号10、番号37、番号38、番号112、番号123および番号126として指定した6つの組換え小麦種子アレルゲンを、ニトロセルロースをコーティングしたスライドガラスに点在させた(図12、A)。組換え小麦タンパク質は、記載のごときパン屋喘息患者からの血清で小麦種子cDNAライブラリーから分離したcDNAに基づいた大腸菌中で発現させた(15)。NCBIデータベースに配置した配列との相同性によれば、小麦アレルゲンは以下のように記載できる:番号10は、トリーティクム・アエスティウムサブチリシン−キモトリプシンインヒビターWSCI前駆体(受入番号gi│122065237)に対して96%の相同性を有し、番号37はT.aestivumチオレドキシンH(受入番号gi│27461140)であり、番号38はT.aestivumグルタチオントランスフェラーゼ(受入番号gi│20067419)であり、番号112は、T.aestivum 1−Cys−ペロキシレドキシン(受入番号gi│34539782)と99%の相同性を有し、番号123はT.aestivumプロフィリン(受入番号gi│1346803)と96%の相同性を有し、番号126は、オオムギデヒドリン(Hordeum vulgare dehydrin)11(受入番号gi│4105101)と69%の相同性を有する。
パン屋喘息患者の91パーセントは、小麦粉CAPにおいて陽性であった(テーブルVII)。点在した小麦アレルゲンを用いて、パン屋喘息患者の62%についてのIgE反応性プロフィールを確立した。アレルゲン番号126(30%)、番号10(26%)、番号123(22%)および番号122(17%)は、最も頻繁に検出した成分であったが、番号37および番号38は血清の4%だけで反応した(図13、A)。注目すべきことには、小麦粉CAPにおいて陰性であった2名の患者(B5、B18:テーブルVII)は、アレルゲン番号126と反応した。パン屋喘息患者の48パーセントはオオアワガエリ花粉抽出物に対するIgE反応性を示し、また、これらの患者の各々を点在したrPhl p 1およびrPhl p 5の組合せで診断した。組換えPhl p 12(35%)は常により強く、小麦プロフィリン番号123(22%)よりもよりしばしば認識された。交差反応性の花粉アレルゲンrPhl p 7は13%の血清と反応した。
小麦に対する食物アレルギーの患者のすべては小麦粉CAPにおいて陽性であるが、組換え小麦タンパク質は、ほとんど認識されなかった(5%)(図13、B)。また、交差反応性のオオアワガエリ花粉プロフィリンに陽性であった2名の患者は、マイクロアレイにおける小麦プロフィリン番号123に対して陽性のシグナルを有した。小麦誘発食物アレルギーの患者の55パーセントは、Phleum CAPにおいてIgE反応性を示し、まさに18%はそのチップ上の小麦花粉抽出物に陽性であり、点在させたrPhl p 1およびrPhl p 5の組合せ中では26%が陽性であった。点在させたrPhl p 1およびrPhl p 5単独は、各々、血清の18%および16%だけ認識され、交差反応性アレルゲンrPhl p 7およびrPhl p 12は、血清の13%および26%で反応した。
草花粉アレルギー患者の65パーセントが小麦粉CAPに陽性であった。マイクロアレイ中でテストした組換え小麦タンパク質のうち、組換え小麦タンパク質番号123だけが23.5%の患者によって認識された(図13、C)。また、これらの各患者は、交差反応性オオアワガエリ花粉プロフィリンrPhl p 12に陽性であった。しかし、rPhl p 12は常により強力であり、番号123よりもしばしば(35%)認識された。花粉アレルギーに苦しむすべての患者は、オオアワガエリ花粉CAPに対して、および点在したrPhl p 1およびrPhl p 5の組合せにおいて陽性であった。組換えPhl p 1単独は、花粉アレルギーの患者によるrPhl p 5(88%)よりもよりしばしば認識された(94%)。小麦花粉抽出物は、82%の血清と、交差反応性rPhl p 7は、血清の29%と反応した。
分析物は、ImmunoCAP(Phadia, Uppsala, Sweden)のごとき固体担体に固定する。アレルゲンに感作され、そのアレルゲンにIgE反応性を示す少なくとも3つの代表的なヒト患者からの血清試料を、100μg/mLの最終濃度のアレルゲンと、ならびに平行して陰性対照として、緩衝液単独および大腸菌の非アレルギー性のマルトース結合タンパク質(MBP)と、室温にて3時間インキュベートする。 次いで、試料を固定化分析物を運ぶImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Sweden)テストに対するIgE結合につき分析して、アレルゲンとの予めのインキュベーションがIgE結合を特異的に抑制するか、またはIgEを有意に低下させるかを試験する。
1. Quirce, S., M. Fernandez-Nieto, C. Escudero, J. Cuesta, M. de Las Heras, and J. Sastre. 2006. Bronchial responsiveness to bakery-derived allergens is strongly dependent on specific skin sensitivity. Allergy 61:1202-1208.
2. Constantin, C., W. D. Huber, G. Granditsch, M. Weghofer, and R. Valenta. 2005. Different profiles of wheat antigens are recognised by patients suffering from coeliac disease and IgE-mediated food allergy. Int Arch Allergy Immunol 138:257-266.
3. Yeh, K., R. Juang, and J. Su. 1991. A rapid and efficient method for a RNA isolation from plants with high carbohydrate content. Focus 13:102-103.
4. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
5. Breiteneder, H., K. Pettenburger, A. Bito, R. Valenta, D. Kraft, H. Rumpold, O. Scheiner, and M. Breitenbach. 1989. The gene coding for the major birch pollen allergen Betv1, is highly homologous to a pea disease resistance response gene. Embo J 8:1935-1938.
6. Stern, D. A., J. Riedler, D. Nowak, C. Braun-Fahrlander, I. Swoboda, N. Balic, K. W. Chen, S. Vrtala, H. Gronlund, M. van Hage, R. Valenta, S. Spitzauer, E. Von Mutius, and D. Vercelli. 2007. Exposure to a farming environment has allergen-specific protective effects on TH2-dependent isotype switching in response to common inhalants. J Allergy Clin Immunol 119:351-358.
7. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685.
8. Towbin, H., T. Staehelin, and J. Gordon. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A 76:4350-4354.
9. Whitmore, L., and B. A. Wallace. 2004. DICHROWEB, an online server for protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopic data. Nucleic Acids Res 32:W668-673.
10. Kaul, S., D. Luttkopf, B. Kastner, L. Vogel, G. Holtz, S. Vieths, and A. Hoffmann. 2007. Mediator release assays based on human or murine immunoglobulin E in allergen standardization. Clin Exp Allergy 37:141-150.
11. Richardson, M., and L. Cossins. 1974. Chymotryptic inhibitor I from potatoes: the amino acid sequences of subunits B, C, and D. FEBS Lett 45:11-13.
12. Vrtala S, Fischer S, Grote M, Vangelista L, Pastore A, Sperr WR, et al. 1999. Molecular, immunological, and structural characterization of Phl p 6, a major allergen and P-particle-associated protein from Timothy grass (Phleum pratense) pollen. J Immunol 163:5489-96.
13. Nystrand M. 2006. A multiplexed immunoassay for the rapid detection of specific IgE in allergy diagnosis. IVDT 2006:61.
14. Nilsson K, Bennich H, Johansson SG, Ponten J. 1970. Established immunoglobulin producing myeloma (IgE) and lymphoblastoid (IgG) cell lines from an IgE myeloma patient. Clin Exp Immunol 7:477-89.
15. Constantin C, Quirce S, Grote M, Touraev A, Swoboda I, Stoecklinger A, et al. Molecular and immunological characterization of a wheat serine proteinase-inhibitor as a novel allergen in baker's asthma. Unpublished.
16. Laffer S, Valenta R, Vrtala S, Susani M, van Ree R, Kraft D, et al. 1994. Complementary DNA cloning of the major allergen Phl p I from timothy grass (Phleum pratense); recombinant Phl p I inhibits IgE binding to group I allergens from eight different grass species. J Allergy Clin Immunol 94:689-98.
17. Vrtala S, Sperr WR, Reimitzer I, van Ree R, Laffer S, Muller WD, et al. 1993. cDNA cloning of a major allergen from timothy grass (Phleum pratense) pollen; characterization of the recombinant Phl pV allergen. J Immunol 151:4773-81.
18. Niederberger V, Hayek B, Vrtala S, Laffer S, Twardosz A, Vangelista L, et al. 1999, Calcium-dependent immunoglobulin E recognition of the apo- and calcium-bound form of a cross-reactive two EF-hand timothy grass pollen allergen, Phl p 7. Faseb J 13:843-56.
19. Valenta R, Ball T, Vrtala S, Duchene M, Kraft D, Scheiner O. 1994. cDNA cloning and expression of timothy grass (Phleum pratense) pollen profilin in Escherichia coli: comparison with birch pollen profilin. Biochem Biophys Res Commun 199:106-18.
20. Kazemi-Shirazi L, Niederberger V, Linhart B, Lidholm J, Kraft D, Valenta R. 2002. Recombinant marker allergens: diagnostic gatekeepers for the treatment of allergy. Int Arch Allergy Immunol 127:259-68.
21. Andersson K, Lidholm J. 2003. Characteristics and immunobiology of grass pollen allergens. Int Arch Allergy Immunol 130:87-107.
22. Sampson HA. 1999. Food allergy. Part 2: diagnosis and management. J Allergy Clin Immunol 103:981-9.
23. Radauer C, Willerroider M, Fuchs H, Hoffmann-Sommergruber K, Thalhamer J, Ferreira F, et al. 2006. Cross-reactive and species-specific immunoglobulin E epitopes of plant profilins: an experimental and structure-based analysis. Clin Exp Allergy 36:920-9.
Claims (11)
- 配列番号2、8または10に記載のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
- 小麦から単離された、または組換え生成された請求項1記載のポリペプチド。
- 請求項1または2に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- 配列番号1、7または9に記載のヌクレオチド配列を有する請求項3記載の核酸分子。
- アレルギーのin vitro診断に用いる請求項1もしくは2に記載のポリペプチド。
- IgE媒介アレルギーのin vitro診断に用いる請求項1もしくは2に記載のポリペプチド。
- 配列番号2、4、6、8もしくは10に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを、アレルゲン抽出物および/または少なくとも1つの精製されたアレルゲン成分を含む組成物に添加する工程を含むことを特徴とする、アレルゲン組成物の生成方法。
- 請求項7記載の方法で得られたアレルゲン組成物。
- − IgE媒介アレルギーを有することが疑われる哺乳動物から得た体液試料を、配列番号2、4、6、8もしくは10に記載のアミノ酸配列を含む少なくとも1つのポリペプチドと接触させ;次いで
− 該ポリペプチドまたは複数の該ポリペプチドに特異的に結合しているIgE抗体のその試料中での存在を検出する
工程を含み、ここに、該ポリペプチドまたは複数の該ポリペプチドに特異的に結合しているかかる抗体の存在は、IgE媒介アレルギーを示すことを特徴とする、IgE媒介アレルギーのin vitro検査方法。 - IgE媒介アレルギーが、小麦粉に対する呼吸アレルギーであることを特徴とする請求項9記載の方法。
- 配列番号2、4、6、8もしくは10に記載のアミノ酸を含むポリペプチドを含む、請求項9または10に記載の方法を行なうための診断キット。
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